（药物化学专业论文）雨生红球藻的紫外诱变、抗铵品系筛选及培养条件优化.pdf

青岛科技大学研究生学位论文 1 帆m m w 呲4 0 黜m 姗玳帅 y 17 4 0 4 5 5 雨生红球藻的紫外诱变、抗铵品系筛选及培养条件优化 摘要 虾青素是一种具有强抗氧化能力的色素，被广泛应用于医药、化妆品及饲料 添加剂等领域。雨生红球藻( h a e m a t o c o c c u sp l u v i a l i s ) 在不利条件下能够积累大量 虾青素，是目前已知的自然界中天然虾青素含量最高的生物，是获取天然虾青素 的理想来源，选取适合大规模培养的雨生红球藻藻株成为近年来该领域的研究热 点之一。 在培养过程中主要存在以下问题：首先，雨生红球藻的生长周期长，生长缓 慢；其次，培养过程中易受到敌害生物的污染。 本实验以野生型雨生红球藻为出发株，经过单细胞分离筛选出一株生长速率 快的藻株，使用紫外线处理筛选出的雨生红球藻藻株。根据实验结果确定适合的 诱变时间为5 m i n ，以4 0 0 m g c t , 的n h 4 h c 0 3 作为筛选条件，在此条件下，轮虫等 敌害生物无法生存，经筛选得到可以在含有n h 4 h c 0 3 的浓度为4 0 0 m g l 的培养 基中正常生长并且生长速率快的诱变株。 本实验探讨了雨生红球藻野生型及抗铵品系诱变株诱导积累虾青素的条件。 通过研究光照、n a n 0 3 浓度、n a c i 浓度及温度对两种品系雨生红球藻虾青素积累 诱导作用的单因子实验，得到适宜藻体积累虾青素的光照、n a n 0 3 浓度、n a c i 浓度、温度的范围。根据单因子实验进行四因素三水平的正交实验，得到两种品 系适宜虾青素积累的条件组合均为：光照2 0 0 i ，t m o l m - 2 s - l ，n a n 0 3o i l l l ，n a c i 2 9 l ，温度2 7 1 2 。 本实验研究了培养基组成及培养条件对雨生红球藻野生型及抗铵品系诱变 株生长的影响。通过研究培养基中n a n 0 3 、k h 2 p 0 4 、f e c l 3 6 h 2 0 的浓度及温度、 光照、p h 的大小对两种品系雨生红球藻生长影响的单因子实验，得到适宜藻细胞 生长的各因子范围，然后分别进行三因子三水平的正交实验，得到的两品系优化 后的培养基有所差异，野生型雨生红球藻生长的最适条件为n a n 0 35 0 0 m g l ， k h 2 p 0 41 0 0 m r d l ，f e c l 3 6 h 2 01 0 m g l ，温度1 8 ，光照强度1 0 0 1 , t m o l l n - 2 s ， p h8 ；诱变株生长的最适条件为：n a n 0 31 0 0 m g l ，k h 2 v 0 41 0 m g l ，f e c l 3 6 h 2 0 1 0 m g l ，温度1 8 ，光照强度1 0 0 啦 n o l m - 2 s - 1 ，p h8 。 关键词：雨生红球藻诱变紫外线优化碳酸氢铵 一 青岛科技大学研究生学位论文 n 青岛科技大学研究生学位论文 悄m u t a g e n e s i s ，a m m o n i u m - t o l e r a n ts t r a i n s e l e c t i o na n dc 1 ， 兀7 rec o n d i t i o no p t i m i z a t i o n ( i ) l 娶h a e m 觚o c o c c u sp l u v i a l i s a b s t r a c t a s t a x a n t h i n ，ap i g m e n to fh i g ha n t i o x i d a n ta c t i v i t y , h a si m p o r t a n ta p p l i c a t i o n si n n u t r a c e u t i c a l ，c o s m e t i c sa n df e e di n d u s t r i e s h a e m a t o c o c c u sp l u v i a l i s ，au n i c e l l u l a r g r e e na l g ah a st h ea i l i t yt oa c c u m u l a t ea s t a x a n t h i nu n d e ra d v e r s ec o n d i t i o n sa n di st h e r i c h e s ts o u r c eo fn a t u r a la s t a x a n t h i n t h es e l e c t i o no fh p l u v i a l i sw h i c hs u i t c o m m e r c i a lp r o d u c t i o nh a sb e e no n eo ft h eh o t s p o t si nt h ef i e l di nr e c e n ty e a r s t h ep r o b l e m si nt h ep r o c e s so fc u l t i v a t i o na r ea sf o l l o w s ：o n ei st h a th p l u v i a l i s h a v eal o n gg r o w t hc y c l e ，t h eo t h e ro n ei st h a th p l u v i a l i sa r es u s c e p t i b l et o c o n t a m i n a t i o n w ef i l t r a t e das t r a i n ，a st h ep a r e n ts t r a i n ，b ys i n g l ec l o n em e t h o d t h e nt h es t r a i n w a sr a d i a t e di nu l t r a v i o l e tl i g h t t h el e t h a lr a t e sw e r ec a l c u l a t e da n dt h eo p t i m u md o s e w a s5 m i n w eg o tas t r a i no fm u t a n t sf r o md o n e s c o m p r a e dw i t hp a r e n ts t r a i n ，t h e g r o w t hr a t ew a si n c r e a s e da n di tc a ns u r v i v eu n d e r4 0 0 m g a 。n h 4 h c 0 3 a n dr o t i f e r s c a nn o ts u r v i v eu n d e rt h i sc o n c e n t r a t i o n w eh a v ee x a m i n e dt h el i g h ti n t e n s i t y , n a n 0 3c o n c e n t r a t i o n ，n a c ic o n c e n t r a t i o n a n dt e m p e r a t u r e so na c c u m u l a t i o no fa s t a x a n t h i no fp a r e n ts t r a i na n dm u t a n t s t r a i n h p l u v i a l i s b ya n a l y z i n gt h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t s ，w eg o tt h eo p t i m a lc o m b i n a t i o na s f o l l o w ：l i g h ti n t e n s i t y2 0 0 p m o l i 一8 ，n a n o s c o n c e n t r a t i o no m g l ，n a c l c o n c e n t r a t i o n2 9 l ，a n dt e m p e r a t u r e s2 7 t h em o s ts u i t a b l ef o s t e rs i t u a t i o no fw i l dt y p ea n dm u t a n ts t r a i nh p l u v i a l i sw a s s t u d i e d w eh a v ee x a n i n e dt h ec o n c e n t r a t i o no fn a n 0 3 ，k - h 2 p 0 4 ，f e c l 3 6 h 2 0a n d t e m p e r a t u r e ，l i g h ti n t e n s i t y , p ho nt h eb e s tc u l t u r ec o n d i t i o no ft h eg r o w t ho ft h et w o s t r a i n s i ts h o w e dt h a tt h ew i l dt y p es t r a i nh a sb i g g e s tg r o w t hr a t ea tn a n 0 35 0 0 m g l i i t 青岛科技大学研究生学位论文 k h 2 p 0 4 10 0 r a g l , f e c l 3 6 h 2 0 1 0 m g l ，t e m p e r a t u r e 18 c ，l i g h ti n t e n s i t y 1 0 0 1 a m o l m - 2 f 1 ，p h8 a n dt h em u t a n ta tn a n 0 3 lo o m g l ，k h 2 p 0 41 0 r a g l , f c c l 3 6 h 2 01 0 m g l ，t e m p e r a t u r e1 8 ( 2 ，l i g h ti n t e n s i t y1 0 0 9 m o l m - 2 s ，p h8 k e yw o r d s ：h e a m a t o c o c c u sp l u v i a l i s ；m u t a g e n e s i s ；u l t r a v i o l e t ；o r t h o g o n a lt e s t s ； i v 青岛科技大学研究生学位论文 目录 第一章绪论l 1 1 虾青素的来源、性质及应用1 1 1 1 虾青素的来源1 1 1 1 1 天然虾青素一l 1 1 1 2 人工合成虾青素2 1 1 2 虾青素的结构和性质一2 1 1 3 虾青素的药理作用3 1 1 3 1 超级抗氧化活性3 1 1 3 2 抗高血压一4 1 1 3 3 抗癌4 1 1 3 4 增强机体免疫力5 1 1 3 5 控制炎症5 1 1 4 虾青素的应用5 1 1 4 1 医药化妆品5 1 1 4 2 禽畜饲料6 1 1 4 3 水产养殖6 1 2 雨生红球藻的生物学特性6 1 2 1 雨生红球藻6 1 2 2 雨生红球藻的生活周期7 1 2 3 虾青素积累机制8 1 3 微藻育种的方法9 1 3 1 自然选择育种9 1 3 2 物理学方法育种9 1 3 3 化学方法育种1 0 1 3 4 生物学方法育种1 l 1 3 5 雨生红球藻育种方法的研究进展1 2 1 4 微藻敌害的防治措施一13 1 4 1 敌害生物对单细胞微藻的危害1 3 1 4 2 单胞藻污染途径13 1 4 3 敌害生物的防治措施1 3 雨生红球藻的紫外诱变、抗铵品系筛选及培养条件优化 1 4 3 1 预防措施1 3 1 4 3 2 敌害生物的抑制及杀灭方法1 4 1 5 本课题的提出及研究的目的1 4 第二章紫外线诱变及抗铵品系的筛选1 6 2 1雨生红球藻的分离与纯化1 6 2 1 1 材料与方法1 6 2 1 1 1 藻种。：1 6 2 1 1 2 培养条件1 6 2 1 1 3 仪器- 1 6 2 1 1 4 细胞密度的测定。1 7 2 1 1 5 单细胞分离获得诱变出发株1 7 2 1 1 6 生长速率计算17 2 1 1 7 培养基中添加n a h s 0 3 对雨生红球藻的影响1 7 2 1 1 8 虾青素的提取方法及含量计算1 7 2 1 2 实验结果18 2 1 2 1雨生红球藻细胞密度与o d 6 8 0 关系曲线1 8 2 1 2 2 生长曲线及生长速率1 8 2 1 2 3 亚硫酸氢钠对雨生红球藻生长及虾青素含量的影响1 8 2 1 3 讨论2 0 2 2 紫外线对雨生红球藻的诱变影响及抗铵品系的筛选2 0 2 2 1 材料与方法2 0 2 2 1 1 藻种及培养条件2 0 2 2 1 2 诱变方法21 2 2 1 3 碳铵对雨生红球藻的影响2 1 2 2 1 4 致死率计算2 1 2 2 1 5 突变株的筛选。2 1 2 2 2 实验结果2 1 2 2 2 1紫外线照射的剂量效应2 l 2 2 2 2 抗铵品系的筛选以及碳铵对雨生红球藻野生型及诱变株的致死率2 3 2 2 3 讨论2 5 第三章虾青素积累的诱导条件研究2 6 3 1 材料与方法2 6 l i 青岛科技大学研究生学位论文 3 1 1 藻种2 6 7 3 1 2 培养条件与方法- ：“。2 6 3 13 - 诱导方法2 6 3 1 4 生物量测定山“。j 2 7 3 1 5 虾青素含量测定。2 7 3 2 实验结果。j 2 7 3 2 1 氮饥饿。：j ：一2 7 3 2 2 光照_ k 。j 2 8 3 2 3 温度如2 9 ；3 2 4 盐胁迫2 9 3 2 5 正交实验矗3l 3 2 5 1 野生型雨生红球藻虾青素积累的最佳条件。3 l 3 2 5 2 抗铵品系诱变株虾青素积累的最佳条件3 2 3 3 讨论。3 4 第四章野生型及抗铵品系的培养条件优化3 6 4 1营养盐对雨生红球藻野生型与诱变株生长的影响3 6 4 1 1 材料和方法3 6 4 1 1 1 藻种3 6 4 1 1 2 培养条件- ：- 二：3 6 4 1 1 3 生长速率测定“3 6 4 1 1 4 单因子实验设计3 6 4 1 1 5 正交实验设计。“3 7 4 1 2 实验结果3 7 4 1 2 1 硝酸盐对雨生红球藻野生型及诱变株生长的影响。：3 7 4 1 2 2 磷酸盐对雨生红球藻野生型及诱变株生长的影响3 9 4 1 2 3 铁盐对雨生红球藻野生型及诱变株生长的影响4 l 4 1 2 4 野生型雨生红球藻营养盐的正交实验4 3 4 1 2 5 雨生红球藻抗铵品系营养盐的正交实验“ 4 2 环境因子对雨生红球藻野生型及诱变株生长的影响4 6 4 2 1 材料与方法4 6 4 2 1 1 藻种。4 6 4 2 1 2 培养条件。4 6 4 2 1 3 单因子实验。4 6 m 雨生红球藻的紫外诱变、抗铵品系筛选及培养条件优化 4 2 1 4 正交实验。4 6 4 2 2 实验结果。j ：。4 6 4 2 2 1 温度对雨生红球藻野生型及诱变株生长的影响j ：4 6 4 2 2 2 光照强度对雨生红球藻野生型及诱变株生长的影响一4 8 4 2 2 3 p l - i 对雨生红球藻野生型及诱变株生长的影响：4 8 4 2 2 4 野生型雨生红球藻环境因子正交实验。5 2 4 2 2 5 雨生红球藻诱变株环境因子正交实验5 3 ：4 3 雨生红球藻野生型及诱变株的生长情况及色素含量5 4 4 3 1 材料与方法5 4 4 3 1 1 藻种及培养条件“j 。5 4 4 3 1 2 生长情况的测定o o 。：5 4 。4 3 1 3 光合色素的测定。j ：5 5 4 3 1 4 虾青素的含量测定：。o “，：5 5 一：4 3 2 实验结果5 5 4 3 2 1雨生红球藻野生型及诱变株的生长状况比较“5 5 4 3 2 2 光合色素的含量5 6 4 3 2 ：3 虾青素含量：5 6 4 4 讨论：。：。：5 7 结论。6 0 参考文献：。：。：6 1 致谢6 9 攻读学位期间发表的学术论文目录7 0 独创性声明：而o 。j 。：j j _ j 。：7 1 青岛科技大学研究生学位论文 第一章绪论 虾青素是一种红色的类胡萝卜素，是鲑鱼、鳟鱼及甲壳类动物的主要色素， 具有超强的着色及抗氧化作用，同时能够捕获自由基、抗癌变、抗紫外线辐射及 增强免疫等，被广泛应用于药品、食品和化妆品等生产领域【i - 2 】。目前，国内外市 场虾青素的供应能力远不能满足市场需求，研究发现，雨生红球藻( h a e m a t o c o c c u s p l u v i a l i s ) 是目前发现的天然虾青素含量最高的生物，是获取天然虾青素的理想材 料 3 - 4 ，因此，开发雨生红球藻生产虾青素的技术具有巨大的商业及经济价值。 1 1 虾青素的来源、性质及应用 1 1 1 虾青素的来源 目前，虾青素的获取有两种方式，即分离提取和人工合成。 1 1 1 1 天然虾青素 在自然界中，藻类和浮游生物富含虾青素，一些水生物种，包括虾、蟹在内 的甲壳类动物都会食用这些藻类和浮游生物，然后把这种色素储存在壳中，于是 它们的外表呈现红色。天然虾青素主要来源于甲壳类动物加工废弃物、细菌和藻 类等。 甲壳类动物的甲壳中含有虾青素，但是含量很低，而且灰分和几丁质含量较 高，提取费用也较高，极大的限制了虾青素的提取和再利用，不适于进行大规模 生产【5 1 。红发夫酵母【6 】，深红酵母等可以合成虾青素，研究表明，红法夫酵母生 产虾青素的条件为：以葡萄糖、纤维二糖为碳源，以硫酸铵为氮盐，间断通气， 最适宜的培养温度为2 0 2 2 ；最适p h 值为5 0 ，供氧速率要高于3 0 m m o l h ，低 于此值时，细胞的产量和虾青素的产量都会明显下降【7 1 。由于在真菌当中，红发 夫酵母虾青素积累量较高，目前微生物发酵生产虾青素普遍采用此菌株，但酵母 内虾青素的积累也受发酵时各种环境因子的制约，会随发酵培养基的改变而改 变，受温度、p h 值、溶氧、碳氮源等的影响也比较大。由于野生红法夫酵母总 类胡萝卜素的产量不会超过干重的0 0 5 ，且细胞壁很厚，难以破碎提取，因此 国内外研究工作者主要从菌种的改良、发酵条件的优化和虾青素的提取等三个方 面进行研究。 雨生红球藻是目前所知的天然虾青素含量最高的物种，其积累量可达到细胞 干重的2 , - - 4 ，甚至更高，被看作是天然虾青素的理想来源。此外，衣藻，绿球 雨生红球藻的紫外诱变、抗铵品系筛选及培养条件优化 藻、小球藻、栅藻【8 d o 】等绿藻在环境条件不利的情况下也会积累虾青素，但其虾 青素含量远远低于雨生红球藻。雨生红球藻在生长过程中，若氮源缺乏，其体内 就会开始积累虾青素，在培养过程中添加二价铁离子，虾青素的合成能力则会提 高，另据报道，用蓝光照射时，也可诱导其合成类胡萝卜素和虾青素。目前，国 外优质雨生红球藻体中虾青素的含量占类胡萝卜素总量的9 0 以上，并且其含量 与光的性质与强度有关。实验验证明，光的强度越高，虾青素的产量也越高，而 且持续光照的效果比间断光照好。但这种藻类的生长条件苛刻，容易受到污染， 对水质、环境及光照的要求很高，大规模生产仍然存在难度【1 1 1 。 目前，美国c y a n o t e c h 公司已从雨生红球藻中提取出了虾青素，生产出 b i o a s t i n 天然虾青素胶囊，并通过了美国f d a 认证，达到g m p 标准。该产品在 美国、俄罗斯、澳大利亚、日本等地区已成为人们首选的纯天然补充食品，青岛 森淼实业有限公司也对其进行了代理。在国内，荆州市天然虾青素有限公司是亚 洲地区第一家从事规模化养殖雨生红球藻生产天然虾青素的企业。 1 1 1 2 人工合成虾青素 瑞士h o f f i n a n n - l ar o c h e 公司于8 0 年代末成功地合成了虾青素并投入市场， 商品名为加丽素红( c a r o p h y l lp i n k ) 。人工合成虾青素主要为3 r , 3 r 顺式结构，是 一种石化产品，作为着色剂，用作鲍鱼、三文鱼、鲑鱼、鲟鱼、虹鳟鱼、甲壳类 动物和各种禽类的饲料添加剂。 人工合成虾青素与天然虾青素相比，不仅价格昂贵，而且在结构、功能、应 用及安全性等方面有着显著的差别。人工合成虾青素是3 种异构体的混合物，极 少抗氧化活性，并且由于人工合成虾青素时将不可避免的引入化学杂质，如合成 过程中产生的非天然副产物等，从而降低了其使用的安全性，所以f d a 禁止合 成虾青素用于人类食品中 1 2 】。 1 1 2 虾青素的结构和性质 虾青素( a s t a x a n t h i n ) 又叫虾红素，是类胡萝b 素的一种，其化学名称为3 ，3 二羟基- 4 ，4 t 二酮基夕胡萝卜素，相对分子量为5 9 6 8 6 ，其结构如图1 一l 所示。 虾青素含有两个羟基( 一o h ) 和两个酮基( _ o ) ，是一种含氧的有机化合物，纯品 是暗红棕色粉末，熔点2 2 4 度，不溶于水，易溶于大部分有机溶剂，在酸、氧、 高温及紫外光条件下均不稳定，易氧化降解，其天然产物多数以酯的形式存在。 虾青素在其末端环状结构中各有一个羟基，这种自由羟基可与脂肪酸形成酯。如 果其中一个羟基与脂肪酸成酯，称虾青素单酯，如果两个羟基都与脂肪酸成酯， 则称为虾青素二酯。酯化后，其疏水性增强，双酯比单酯的亲脂性强i l 引。由于两 端的羟基( - o h ) 旋光性原因，自然界中的虾青素存在3 种立体异构体，即3 s ，3 s 、 2 青岛科技大学研究生学位论文 3 r ，3 s 、3 r , 3 r ，也称为左旋、消旋、右旋虾青素，详见图l 一2 【1 4 1 。 o 图1 - 1 虾青素的结构 f i g 1 - 1m o l e c u l a rs t r u c t u r eo f a s t a x a n t h i n o h o 、 h o 、。 o h 、, o h o 3 r 、3 。r 图1 - 2 虾青素的三种结构 f i g i - 2s t r u c t u r eo fa s t a x a n t h i nm o l e c u l e s 1 1 3 虾青素的药理作用 1 1 3 1 超级抗氧化活性 氧化作用是指糖类、蛋白质和脂质等有机物在体内经过一系列的氧化分解， 最终生成二氧化碳和水并且释放出能量的过程。生物体内与氧化作用有关的分子 包括：单线态氧、自由基、过氧化物等。生物体内正常的代谢活动即会产生一些 自由基和活性氧分子，外界环境的压力如空气污染、辐射、农药污染等也会引起 体内自由基的产生【2 1 。自由基具有强氧化性，能损害机体的组织和细胞，进而引 起慢性疾病及衰老。自由基是具有未配对电子的原子，包括超氧化物阴离子自由 基( 0 2 一) 、羟自由基( o h 一) 、氢自由基( h + ) 和甲基自由基( c h 3 ) 等。自由基非常活泼， 3 雨生红球藻的紫外诱变、抗铵品系筛选及培养条件优化 反应性极强，能触发链式反应而致生物膜上的脂质过氧化，从而破坏膜的结构功 能，它能引起蛋白质变性并使酵素及激素失去活性，导致生物体的免疫能力降低， 甚至破坏核酸的结构而导致代谢异常掣1 5 4 引。 大量研究表明，虾青素具有较强的淬灭单线态氧的能力【1 9 1 。n a g u i b t 2 0 】用荧光 测定方法分析了虾青素和其他相关类胡萝卜素的抗氧化活性，发现虾青素清除过 氧化自由基的能力要强于维生素e 、伊胡萝b 素及番茄红素等。m i k i t 2 l 】以含亚铁 离子的血红素蛋白作为自由基产生者，亚油酸为接受者，用硫代巴比妥酸法检测 各受试类胡萝卜素及其衍生物，发现虾青素清除自由基的能力最强，虾青素的抗 氧化能力是伊胡萝卜素的1 0 倍，比维生素e 高1 0 0 倍，并且认为类胡萝卜素及 其衍生物中羟基和酮基的存在与数目对清除自由基的作用非常重要。部分研究者 认为虾青素具有较高的抗氧化活性，可能是由于酮基受羟基激活，从而促进氢转 移到过氧化物自由基上【翻。 虾青素的抗氧化活性，使其具有预防动脉粥样硬化和心肌梗死【2 强4 】，用于局 部缺血再灌注引起的损伤【2 5 1 ，糖尿病及糖尿病肾病【2 6 - 2 7 1 ，保护肝脏、神经以及缓 解肌肉运动损伤的作用【2 睨9 1 。 1 1 3 2 抗高血压 h u s s e i n 3 0 】等使用虾青素喂养自发性高血压大鼠，1 4 d 后可使其动脉血压显著 降低。为了研究虾青素的作用机制，h u s s e i n 等用n g 一硝基l 广精氨酸甲基酯处理大 鼠主动脉，用前列腺素f 2 ( p g f 2 0 使大鼠主动脉收缩，而由虾青素引起n o 为中介 的血管舒张。结果表明，虾青素的抗高血压作用可归结为与n o 相关的机制。另外， 虾青素可以通过降低全血微血管输送时间，改善血液流变性，包括通过交感神经 肾上腺素受体通路，特别是n 肾上腺激素受体敏感的正常化，以及通过减弱血管 紧张素i i 和活性氧引起的血管收缩来逆转血管的紧张状态，从而发挥抗高血压的 作用。 1 1 3 3 抗癌 n i s h i n 0 1 3 l 】等通过对天然类胡萝卜素及其衍生物抗癌作用的研究，发现虾青素 具有较强的抗癌作用。g r a d e l e t 3 2 】等研究了虾青素等类胡萝卜素对黄曲霉素b l 引 发的致癌作用的影响，研究发现，虾青素对体内的黄曲霉素诱导的d n a 的单链断 裂有降低的作用，减少黄曲霉素b l 和肝细胞d n a 及血浆白蛋白的结合，同时促进 体外黄曲霉素b 2 代谢为另一种毒性较弱的黄曲霉毒素m l ，因此能够防止黄曲霉素 b l 的致癌作用。还有研究表明，给由- - 7 , 基亚硝胺或仅硝基丙烷引发肺肿瘤的大 鼠喂饲3 , - 4 星期的虾青素，可显著降低肺肿瘤的大小与数目。 另外，虾青素还可抑制由甲基胆葸诱导的纤维瘤的转移。该作用机制可能与 虾青素抑制纤维瘤细胞增长和刺激免疫应答、抑制纤维瘤抗原有关【3 3 】。氧化应激 4 青岛科技大学研究生学位论文 是引起癌转移的另一因素，氧化应激也可引起肝组织中脂质过氧化物的增加。接 种癌细胞后，处在氧化应激下时，在肝脏中能够很快发现有癌细胞的转移，连续 1 4 d e ij 匣虾青素，可使氧化应激引起的癌转移率下降。由此可以看出，虾青素通 过抑制氧化应激引起的脂质过氧化来提高抗肿瘤免疫应答 3 4 1 。 虾青素作为光保护剂，还可以有效防止光辐射引起的皮肤癌。此外，虾青素 对膀胱癌、舌癌、大肠癌、口腔癌以及由黄曲霉毒素诱发的肝癌等病症的发生均 有一定的预防作用p 扪。 1 1 3 4 增强机体免疫力 j y o n o u c h i l 3 6 】等认为，虾青素可使脾b 和t 淋巴细胞分化增殖能力提高，从而 刺激血细胞产生免疫球蛋白，有利于预防各种类型的流行性感冒。体外实验表明， 虾青素可显著促进小鼠脾细胞对胸腺依赖抗原反应中抗体的产生，提高依赖于t 专一抗原的体液免疫反应。人体血细胞的体外研究中也发现虾青素和类胡萝卜素 均能够显著促进胸腺依赖抗原刺激时的抗体产生，分泌i g g 和i g m 的细胞数增加。 此外，虾青素还能够使老龄小鼠的体液免疫系统恢复，这表明在抗原入侵初期， 虾青素能够增强特异性体液免疫反应【3 7 1 。 1 1 3 5 控制炎症 关节疼痛和关节炎往往是由于自由基导致的氧化损伤所致，虾青素的超强抗 氧化性有助于抑制自由基，减少其对关节的氧化损害 3 8 1 。m a r a 公司研究了虾青素 对人类健康的影响，并与其它二十六种抗炎药物进行了比较，结果显示，服用虾 青素患者的健康状况提高了8 5 ，虾青素与9 2 的抗炎药物有同等的效果或效果 更佳。o h g a m i 等研究了虾青素对体外脂多糖引起炎症的影响，对雌性l e w i s 大鼠 注射脂多糖引起葡萄膜炎，2 4 h 后测定眼房水中渗出的细胞数和蛋白质含量，结 果表明虾青素具有显著的抗炎作用【3 9 1 。此外，天然虾青素所抑制的炎症因子效果 与相同量皮质素作用相当，但却没有皮质素的毒副作用，因此又被誉为没有副作 用的激素。 1 1 4 虾青紊的应用 1 1 4 1 医药化妆品 随着虾青素生物功能研究和药理药效研究的深入，目前国际上已经出现了利 用虾青素制的造高级营养保健品、药品及化妆品，其产品定位主要在抗癌、调节 免疫系统功能、防辐射以及抗炎等 4 0 4 1 1 。 在高级化妆品领域，天然虾青素以其独特的分子结构，可以高效的淬灭紫外 线引起的自由基，防止皮肤的光老化，减少u v a 和u v b 对皮肤的伤害，防止皮肤 癌的产生，可最大限度消除细胞内的有害自由基，延缓细胞衰老，减少皮肤皱纹， 5 雨生红球藻的紫外诱变、抗铵品系筛选及培养条件优化 减少黑色素沉积，减少雀斑产生，并且可以保持水分，使皮肤更有弹性、张力和 润泽感【4 2 1 。 虾青素作为一种功能独特、应用广泛的保健品及化妆品原料，已经引起国内 外学者的普遍关注，其潜在的经济效益是显而易见的。 1 1 4 2 禽畜饲料 对于饲养的禽畜，虾青素在防治疾病方面也有功效。虾青素可提高免疫力和 消炎能力，使动物的活存率大大提高，降低传染病的发生率。提升家禽的产蛋率， 且家禽会将虾青素富集在卵中，不仅增加蛋黄的色泽，其蛋的营养价值也大幅提 高。 1 1 4 3 水产养殖 研究证明，虾青素在对养殖对象的着色作用、提高存活率及促进生长、繁殖、 发育等方面均有重要的意义【4 3 彤】。海洋甲壳类动物和鱼类体内色素主要的类胡萝 卜素即为虾青素，鲑鱼、龙虾等海产品的肉色即是由于虾青素在其体内大量积累， 所以呈现粉红色，但由于养殖对象自身无法合成虾青素，且缺乏天然来源，因此 必须在其饲料中添加虾青素，以起到补充的作用。并且虾青素还可以提高水产动 物的抗病能力，减弱紫外线辐射的伤害。r e h u l k a t 钓】研究了虾青素对虹鳟鱼的生长 速率、血液中的各种指标及部分生理功能的影响，发现通过喂饲虾青素，可以改 善虹鳟鱼的造血功能和类脂及钙的新陈代谢功能。目前，虾青素已被广泛应用于 鲑鱼、鳟鱼等各种鱼类的养殖。 1 2 雨生红球藻的生物学特性 1 2 1 雨生红球藻 雨生红球藻( h a e m a t o c o c c u sp l u v i a l i s ) 在分类学上属于绿藻i 、- ( c h l o r o p h y t a ) ， 绿藻纲( c h l o r o p h y c e a e ) ，团藻目( v o l v o c a l e s ) ，红球藻科( h a e m a t o c o c c e a e ) ，红球藻 属( h a e m a t o c o c c u s ) ，是一种生活在淡水中的单细胞绿犁1 2 】。 在自然界中，雨生红球藻分布在小面积间歇性水体中，藻细胞呈水滴状或椭 圆形，宽1 9 5 1 p m ，长2 8 - q ；3 1 m a ，游动细胞具有两条等长的鞭毛。细胞原生质体 与细胞壁分离，形成一个外周胞质空间，两者通过细胞质连丝相连，细胞核位于 中央位置，细胞核附近的二侧有眼点，叶绿体呈杯状、复杂的网状或颗粒状，部 分细胞的叶绿体内，存在由多处类囊体膜延伸弯曲并分离而形成的网状特殊区 域，具有典型的绿藻蛋白核。个体大小差别较大，直径由1 5 8 0 1 m a 不等【4 7 】。细 胞增值方式主要为无性生殖，少数也会出现出芽和二分裂的情况，如图1 3 ( b ) 和 ( d ) 所示，一般一个母细胞会产生4 8 个游动孢子。 6 青岛科技大学研究生学位论文 不动细胞呈圆形，无鞭毛，不能游动。细胞大小差距较大，如图1 - 3 ( 0 所示， 与游动细胞相比，细胞壁增厚，体积增大，细胞变为红色。 1 2 2 雨生红球藻的生活周期 雨生红球藻的生活周期分为游动和不动两个阶段。在适宜条件下，雨生红球 藻为游动细胞，呈椭圆形，前端有乳突状结构，有鞭毛，可以自由游动，如图1 - 3 ( a ) 所示，游动细胞以有丝分裂的方式进行无性生殖，多产生并释放2 个孢子，为游 动孢子，有鞭毛，可以自由游动，经过一定时间的发育，游动孢子突破孢子囊壁 释放出来，成为新的游动细胞【1 2 】。 abc d ef 图1 - 3 雨生红球藻细胞的不同形态 ( a 为两个对数生长期的藻细胞；b 为二分裂的母细胞；c 为释放小孢子和内容物的母 细胞；d 为出芽生殖；e 为生长末期的厚壁细胞；f 为开始积累虾青素的红色孢子态细胞) f i g 1 - 3d i f f e r e n tm o d a l i t i e so f h p l u v i a l i sc e l l s ( as h o w st w oc e l l su n d e rl o g a r i t h m i cp h a s e ；bs h o w st h em o t h e rc e l ld i v i s i o n ；cs h o w sa m o t h e re e l lw i t hm a n ym i n i s p o r e so u t s i d e ；ds h o w sb u a d 堍r e p r o d u c t i o n ；es h o w sc e l l so f f e l e o h p a s e ；fs h o w sr e ds p o r es t a t ec e l l sw h i c ha c c u m u l a t e da s t a x a n t h i n ) 当环境不适时，游动细胞及游动孢子的鞭毛退去，转为不动细胞阶段，呈圆 形，细胞直径变大，开始时为深绿色，如图卜3 ( e ) ，经过一段时间后，中央部分 7 雨生红球藻的紫外诱变、抗铵品系筛选及培养条件优化 先开始出现红色，最后整个细胞呈鲜红色，如图i - 3 ( 0 。不动细胞表面上呈不游 动的静止状态，但其仍能进行无性生殖，其形成的孢子数为4 或8 个，属于不动 孢子，没有鞭毛，进一步发育成不动细胞。当环境再次适宜时，不动细胞会释放 出游动孢子，成为游动细胞。无论雨生红球藻处于生活周期的何种阶段，都存在 自溶死亡的现象，如图1 3 ( c ) 自溶过程中，细胞内部色素逐渐消失，内含物释放 分解，最后仅残存一透明外壳1 4 t 。 雨生红球藻的生长有三种营养类型，分别为：光合自养型，能够利用光能吸 收c 0 2 进行光合自养生长；异养生长型，能够利用有机碳源在黑暗的条件下进行 异养生长；混合营养型，既能进行光合作用利用二氧化碳，同时利用有机碳源进 行混合营养生长l 删。 刘建国1 4 7 】等初步归纳出了雨生红球藻的细胞周期或生活史如下图所示： 图1 4 雨生红球藻的细胞周期 f i g i - 4c e l lc y c l eo f h a e m a t o c o c c u sp l u v i a l i s 1 2 3 虾青素积累机制 在生长环境适宜条件下，雨生红球藻以绿色游动细胞形态存在，