（有机化学专业论文）酶蛋白直接修复嘧啶二聚体机理的模型研究.pdf

摘要 摘要 生物体d n a 中嘧啶碱基在紫外光( 2 0 0 3 0 0r i m ) 作用下主要生成两种光化学 产物：环丁烷型嘧啶二聚体( c p d ) 和( 6 - 4 ) 光产物。它们会阻止d n a 的复制和转 录，引起细胞变异甚至死亡，是诱发皮肤癌的主要原因。细胞可以通过切除修复 或光解酶参与下的光复活作用来修复这些损伤。因此，研究d n a 光损伤和光复 活过程将有助于揭示生物体内酶促d n a 光复活作用机理。 d n a 光解酶是含有黄素的单体蛋白质，由4 5 4 - 6 1 4 个氨基酸残基组成，其 作用机理大致如下：光解酶识别并特异性地结合底物后，天线辅酶( m t h f 或 8 - h d f ) 吸收i m s ( 3 0 0 5 0 0r i m ) 区光子而被激发并将能量传给催化辅酶 f a d h - ，激发态的f a d 盯向底物分子转移一个电子使二聚体发生开环反应，底 物得以修复，这一过程称为d n a 光复活。 为了更好地研究光复活过程的机理，人们设计了大量发色团一二聚体共价连 接的化合物，作为酶一底物复合物模型来模拟光解酶的作用。这些模型化合物有 助于我们详细地理解，在光驱动下光解酶通过电子转移反应来修复二聚体的作用 机理。但是在整个光复活过程中还有许多光物理一光化学方面的机理问题没有解 决，尤其是去辅基的ec o l i 光解酶活性点处的色氨酸残基( t r p 2 7 7 ) ，在2 8 0 姗 光激发下可以通过电子转移反应来直接高效地修复底物嘧啶二聚体( 由= 0 5 6 ) 。 主要从模型化合物的分子内电子转移来研究酶蛋白的直接高效修复机理，进 一步理解c p d 光解酶的光化学一光物理过程。合成了色氨酸( t r p ) 或和酪氨酸 ( t y r ) 与胸腺嘧啶二聚体共价连接的化合物作为模型物，用来模拟d n a 光解酶的 修复反应。在不同p h 值的缓冲溶液中，这些化合物中二聚体的光敏化裂解效率 受发色团( t r p 或t y r ) 氧化电位的影响很小，主要是因为电荷分离中间体 ( t r ，d 或t y ，矿) 内电荷重合太快，二聚体自由基阴离子( d - ) 的开环速率 无法与其进行有效竞争。另外，由于在蛋白质或多肽中t r p 和t y r 之间可以发生 电子转移反应，我们在色氨酸一二聚体模型中引入了酪氨酸，希望利用t y r 向 t r p + 转移电子来稳定中间体( t r p + d - - t y r ) 从而提高二聚体的裂解效率。结果由 于该化合物( t r p - d t y r ) 在水中的独特构象不利于t y r 向t r p 转移电子，二聚体的 裂解量子产率没能增大。 摘要 由于化合物所处环境的性质对二聚体的裂解量子产率有较大影响，我们用不 同量路易斯酸碱( 三乙胺或三氟化硼) 来研究环境电子云密度对色氨酸一二聚体 模型化合物光敏化裂解性质的影响。发现在t i - i f 中三乙胺或三氟化硼对二聚体 裂解量子产率的影响非常小，主要是因为在模型化合物的电荷分离中间体 ( t r p + d - ) 内与二聚体裂解相竞争的逆向电子转移过程太快。 最后，用咕吨酮、对甲氧基苯乙酮或4 ，4 二甲氧基二苯酮作为敏化剂来研究 三重态色氨酸敏化二聚体裂解的性质。发现将色氨酸一二聚体模型化合物和敏化 剂的甲醇溶液用光照射后，h p l c 表明只在含对甲氧基苯乙酮的模型溶液中二聚 体发生了裂解反应。 关键词：d n a 光解酶环丁烷嘧啶二聚体电子转移色氨酸酪氨酸模型研究 u a b s t r a c t d n ai sd a m a g e db yu l t r a v i o l e tc o m p o n e n t ( 2 0 0 - 3 0 0n m ) o f s u n l i g h tt og i v em a n y p o t e n t i a l l ym u t a g e n i cp h o t o p r o d u c t s t h et w om a j o rl e s i o n sa l et h ec y c l o b u t a n e p y r i m i d i n ed i m e r s ( c p d s ) a n dp y r i m i d i n e - p y r i m i d o n e ( 6 - 4 ) p h o t o p r o d u c t ，w h i c h c o n s t i t u t e7 0 - 8 0 a n d2 0 - 3 0 o ft h et o t a lp h o t o p r o d u c t s ，r e s p e c t i v e l y t h e s el e s i o n s w i l lb l o c kr e p l i c a t i o na n dt r a n s c r i p t i o no fd n a , l e a d i n gt oc y t o t o x i ca n dm u t a g e n i c e f f e c t s i nc e l l ，t h et w op h o t o l e s i o n sc a nb er e p a i r e dt h r o u g hd n a p h o t o r e a c t i v a t i o n c a t a l y z e db yc p dp h o t o l y a s ea n d ( ) p h o t o l y a s e ，r e s p e c t i v e l y , o rb yt h ee x c i s i o n m e c h a n i s m s os t u d yt h ep r o c e s so fd n a p h o t o d a m a g ea n dp h o t o r e a c t i v a t i o ni s h e l p 觚f o ru n d e r s t a n d i n gt h em e c h a n i s mo fd n ap h o t o r e a c t i v a t i o np h e n o m e n o n c a t a l y z e db yp h o t o l y a s e si nv i v o d n ap h o t o l y a s e , u s u a l l yc o n t a i n sf l a v i n e , i sam o n o p r o t e i n c o m p o s e do f 4 5 4 6 1 4a m i n oa c i dr e s i d u e s i t sr e p a i rm e c h a n i s mi s ：a f t e rt h ee n z y m ef i n d sa n d b i n d st oi t ss u b s t r a t e ，t h ep h o t o a n t e n n ac o f a c t o r ( m t h fo r8 - h d f ) a c t i v a t e st h e p r o c e s so fr e p a i rb ya b s o r b i n gn e a ru v v i sr a d i a t i o n0 0 0 5 0 0n m ) a n dt r a n s f e r r i n g t h ee n e r g yt ot h ea c t i v ec o f a c t o rf l a v i n e ( f a d h - ) s u b s e q u e n t l y , t h ee x c i t e df a d i - f t r a n s f e r so n ee l e c t r o nt ot h ec y c l o b u t a i np y r i m i d i n ed i i n e rt of o r mt h ed i l n e rr a d i c a l a n i o n , w h i c hc l e a v e ss p o n t a n e o u s l y , a n dt h e nb a c k - e i c c t r o n - t r a n s f e rr e s t o r e st h e d i p y r i m i d i n ea n dt h ef u n c t i o n a lf o r mo ft h ef l a v i n er e a d yf o ran e wc a t a l y t i cc y c l e s e v e r a lm o d e lc o m p o u n d st h a tm i m i ct h ea c t i o no f p h o t o l y a s eh a v eb e e nd e s i g n e d , s u c ha sac h r o m o p h o r ea t t a c h e dt oap y r i m i d i n ed i m e r s t u d i e sp e r f o r m e dw i t ht h e s e c o m p o u n d sh a v eb e e nh e l p f u lt ou n r a v e lt h em e c h a n i s m so ft h ed n ap h o t o l y a s e si n d e t a i l h o w e v e r , t h e r ea l es t i l lm a n yu n s o l v e dq u e s t i o n s0 1 1t h ep h y s i c a l - c h e m i c a l m e c h a n i s m si n v o l v e di nt h ew h o l ep r o c e s s i np a r t i c u l a r , w h e nt h ea p o e n z y m eo f d n a p h o t o l y a s eb o u n dt oc y c l o b u t a n ep y r i m i d i n ed i m e r , t h er e s i d u et r p 2 7 7i nt h e p h o t o l y a s ea c t i v es i t e ，u p o ne x c i t a t i o nw i t h2 8 0n m , c a nd i r e c t l ys p l i tt h ec y c l o b u t a n e r i n gb ye l e c t r o nt r a n s f e rw i t har e l a t i v e l yh i g hq u a n t u my i e l d ( 妒0 5 6 ) i ti su n c l e a r t a b s t r a c t w h a tf a c t o r sr r er e s p o n s i b l ef o rt h e a p o e r l z y m em e d i a t i n gs oh i g he f f i c i e n c yf o rd n a p h o t o r e a c t i v a t i o ni n c l u d i n gt h ee n e r g ya n de l e c t r o nt r a n s f e r t h ed i r e c ta n de f f e c t i v er e p a i rm e c h a n i s mo fa p o e n z y e mw a si n v e s t i g a t e db y i n t r a m o l e c u l a re l e c t r o nt r a n s f e ri nm o d e lc o m p o u n d s ，s ot h a tt h e r ew i l lb em o r ed e t a i l k n o w l e d g ea b o u tt h ep h o t o c h e m i c a l - p h o t o p h y s i c a lp r o c e s so fc p d sp h o t o l y a s e f o u r m o d e lc o m p o u n d sw e r ep r e p a r e d ，c o v a l e n t l yl i n k i n g 们j p t o p h a no r a n dt y r o s i n et o c y c l o b u t a n et h y m i n ed i m e r , a n dm e a s u r e dt h ec l e a v a g eq u a n t u my i e l do fc y c l o b u t a n e r i n gi nd i f f e r e n tp hv a l u e ss o l u t i o n , u p o ne x c i t i n gt h em o ry y r 埘m2 9 5 眦o r310 眦l i g h t t h ec l e a v a g eq u a n t u my i e l dh a dl i t t l er e l a t i o n s h i pw i t ht h er e d o xp o t e n t i a l s o fa l r i n oa c i dr e s i d u e s ，d u et ot h eb a c ke l e c t r o nt r a n s f e ri n c h a r g e s e p a r a t e d i n t e r m e d i a t e ( t r p + d 。o rr y ：- d 1i s f a s t e rt h a nt h ec l e a v a g eo fd i m e rr a d i c a l a n i o n e i nt h ec o m p o u n d ，c o n t a i n i n gb o t ht r pa n dt y r , t h et y rc o u l dn o tg i v ee l e c t r o n t ot r p a f t e re x c i t i n gt r p ，l e dt on oi n c r e a s eo ft h ed i r t i e r sc l e a v a g ev a l u e t h e r e a s o nt ot h i sr e s u l ti st h es p e c i a lu - s h a p e dc o n f i g u r a t i o no ft h i sc o m p o u n di nw a t e r a n dt h ef a s tc h a r g er e c o m b i n a t i o ni nt h ei n t e r m e d i a t et r p d - - t y r w ea l s o d i s c o v e r e da n da n a l y z e ds o m eo t h e rn e wp h e n o m e n aa f t e rc o m p a r et h ec l e a v a g eo f t h o s ec o m p o u n d s u s i n gn e t 3 o rb f 3 ，t h ei n f l u e n c eo fe l e c t r o nd e n s i t yo fs o l v e n to nt h e p h o t o s e n s i t i z e dc l e a v a g ep r o p e r t yo fm o d e lc o m p o u n dc o n t a i n i n gt r pa n dt h y m i n e d i 如【髓w a si n v e s t i g a t e d t h ec l e a v a g eq u a n t u my i e l do ft h ed i m e rh a dn or e l a t i o n s h i p w i t ht h e q u a n t i t y o fn e t 3o rb f 3i nn 珉b e c a u s ea f t e ri r r a d i a t i o n , t h e b a c k - e l e c t r o n - t r a n s f e rp r o c e s sc o m p e t i t i v ew i t ht h ed i m e rc l e a v a g ep r o c e s s , w a ss o f a s ti nt h ec h a r g e - s e p a r a t e di n t e r m e d i a t e t h ec l e a v a g ep r o p e r t yo fm o d e lc o m p o u n db yt r i p l e ts t a t et r pw a si n v e s t i g a t e d t h r o u g hu s i n gx a n t h o n e 、4 - m e t h o x ya c e t o p h e n o n eo r4 ，4 - d i m e t h o x y b e n z o p h e n o n ea s p h o t o s e u s i t i z e r s a f t e ri r r a d i a t e dt h ec o m p o u n da n dp h o t o s e n s i t i z e r si nm e t h a n o l ，w e o n l yf o u n dt h ed i m e rs p l i t t i n gi nt h es o l u t i o nc o n t a i n e d4 - m e t h o x ya c e t o p h e n o n e k e y w o r d s ：d n ap h o t o l y a s e , c y c l o b u l a n ep y r i m i d i n ed i n l i n e r , e l e c t r o nl x a n s f e r , t r y p t o p h a n , t y r o s i n e ，m o d e ls t u d y 中国科学技术大学学位论文原创性和授权使用声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作 所取得的成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任 何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究 所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。 本人授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权，即：学 校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 作者签名：差鲎盈 历口矽年，月i t 日 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 d n a 是生物体内一种大分子物质，同时它也是生命体遗传信息的载体。它 主要由脱氧核糖、磷酸和碱基组成，其四个碱基分别为：腺嘌呤( a ) 、鸟嘌呤 ( g ) 、胸腺嘧啶( t ) 和胞嘧啶( c ) 。通常a 与t 通过氢键作用而成对，g 与c 也是如此，这便使d n a 具有自我复制和遗传生命信息的特殊功能。上述的嘧啶 碱基在2 0 0 3 0 0l i r a 紫外光照射下可发生二聚化反应，使生物体受到损伤，例如 生长迟缓、死亡甚至癌变。 d n a 在紫外光诱导下所产生的两种主要产物是：环丁烷型嘧啶二聚体 ( c y c l o b u t a n ep y r i m i d i n ed i m e r s ，c p d s ) 和嘧啶( 6 4 ) 嘧啶酮( p y r i m i d i n e ( 6 - 4 ) p y r i m i d o n e , 简称( 6 - 4 ) 光产物) ，并且前者占光产物总量的7 0 - 8 0 ，后者占 2 0 - 3 0 它们的形成过程如下：当d n a 被紫外光照射后，处于激发态的嘧啶 会与同一链中邻近的嘧啶碱基发生【2 + 2 】的环加成反应，生成c p d s 或氧杂环丁烷 体系，后者在一8 0 以上不稳定，发生开环和质子转移反应，形成( 6 4 ) 光产物【l 。 叼( 图1 1 ) 。这两种损伤均能被序列相近、结构和反应机理相似的d n a 光解酶 修复，然而由于酶的专一性，一种光损伤只能被相应的一种光解酶修复，所以光 解酶有两种：环丁烷嘧啶二聚体( c p d ) 光解酶和( 6 - 4 ) 光解酶r 7 1 。光解酶在蓝 光( 3 5 0 - 4 5 0a m ) 作用下自动修复生物体内这些光产物，从而恢复d n a 自我复 制和转录功能的现象叫做d n a 光复活【8 9 1 。 5 3 + t tt o tt 6 - 4 1 t f i g u r e1 1f o r m a t i o no f t h et w om a j o rp h o t o p r o d u c t si nd n a u n d e rl r vl i g h t , c p d sa n d p h o t o p r o d u c t s 光解酶是含有4 5 4 - 6 1 4 个氨基酸残基，分子质量为5 5 - 6 5k d a l 的单体蛋白 一 改 第一章绪论 质。它们广泛地存在于自然界中，如在细菌、蓝绿藻类、真菌、高等植物以及所 有主要脊椎动物体内都有发现，但有胎盘的哺乳动物中可能有例外，至于人体中 有无这种酶仍有争论【刀。到目前为止，所有被完全表征的光解酶都含有两个非共 价键合的发色团辅基：一个总是l ，5 - - - 氢黄素腺嘌呤二核苷酸( f a d h 2 ) ，为第一 发色团，具有催化活性，其活性形式是两电子去质子还原态( n 心h - ) ；另一个是次 甲基四氢叶酸( m 肿) 或者8 一羟基一5 一去氮杂核黄素( 8 h d f ) ，为第二发色团，不具 催化活性，但可以很好地吸收近im m s 区的光子，并将能量转移给f a d i - i - ，具有“光 天线”作用。因此，光解酶又被分为叶酸类和去氮杂核黄素类。在酶结合并修复 d n a 损伤的过程中，第一发色团( f a d ) 都是必需的辅基【1 啦! 3 1 ，而第二发色团 ( m n 或8 h d f ) 通常既不影响酶与底物的结合也不是酶修复底物所必需的辅 基。但是，在蓝光或可见光作用下第二发色团可以大大地增加酶的修复效率，这 是因为它们的消光系数和最大吸收峰波长均比f a d h - 的大。 1 2d n a 光解酶的结构 1 2 1 一级结构 约有5 0 个光解酶的氨基酸序列已被完全表达，这些蛋白质的氨基酸序列显示 它们的同源性在1 5 - - - , 7 0 范围内【4 】。并且比较有意义的几点是：( 1 ) 对于叶酸 类光解酶和去氮杂黄素类光解酶来说，它们c - 端1 5 0 个氨基酸都是高度同源性 的，因此，这一区域应该是酶结合r m 的区域1 4 1 ，后来的蛋白质化学【1 5 】和酶的 i 晶体结构6 _ 1 8 】也证实了这点；( 2 ) 与微生物光解酶相比，植物和动物光解酶只显 示有限的同源性，一般仅限于f a d 结合区域【1 9 2 0 1 ，因此光解酶被分为i 型( 微生 物) 和i i 型( 动物) 序列组，但是随着光解酶家族中更多的基因序列被表达，这 种分类已显示出局限性【4 2 1 】；( 3 ) 光解酶与黄素蛋白氧化还原酶没有明显的同源 性。这可能是因为光解酶既可结合基态黄素又可结合激发态黄素，而氧化还原酶 只能结合基态黄素，由于激发态分子在一定程度上与基态分子不同，可以被认为 是新的物质，所以光解酶结合黄素的活性部位与黄素蛋白氧化还原酶结合黄素的 活性部位应该是不同的圈。 2 第一章绪论 1 2 2 发色团辅基 d n a 光解酶的催化辅基f a d h 和天线辅基8 - h d f 或5 ，1 0 一m t h f 的分子结构 如下图1 2 所示。 5 ，1 0 - m t h f 8 - h d f f i g u r e1 2c h e m i c a ls t r u c t u r e so f d n ap h o t o l y a s ec o f a c t e r s ( 1 ) 黄素 黄素是自然界最常见的辅基，至少有1 5 1 种酶用f a d 和或f m n 作为辅基田】。 f a d 是黄素在酶中最普遍的存在形式，它能发生一次或两次单电子转移氧化还原 反应，在光解酶中黄素活性形式是两电子还原形式嗍，f a d 通过非共价键紧密 地结合到光解酶的酶蛋白上，只有在酶轻微变性后才能被释放出来 2 铀2 7 1 。比较 有趣的是，尽管每个ec o l i 细胞只含有大约1 0 0 2 0 个自由的f a d 分子，但是通过基 因工程将每个ec o l i 细胞内光解酶分子数放大到1 0 5 后，酶中f a d 和脱辅基酶之间 的化学剂量比仍然为1 ：l ，而将光解酶家族中的其他成员在异源体系中培养时则 不含当量比的即山【2 o j 。例如，将彪t h e r m o a u t o t r o p h i c u m g 光解酶放到ec o l i 细 胞内表达后，酶则不含f a d 2 0 。通常f a d 有三种氧化还原态：全氧化态、单电 子还原态( 中性蓝色自由基或阴离子红色自由基) 和双电子还原态( 中性或者阴 离子形式) 。图1 3 显示了含有m t h f 和单电子还原态黄素的ec o l i 光解酶的u v 光谱和e p r 光谱【3 1 1 。尽管生物合成的黄素通常均处于全氧化态，它在酶的催化反 3 i 黔x 。 ，呼，z 器 第一章绪论 应过程中可被转化成单电子和双电子还原态，但是在光解酶中黄素转化成f a d h - 的具体机理仍然还不清楚。f a d h 在光解酶中能通过光化学途径还原成活性形式 【l o 1 3 1 ，但是在暗处生长的细胞或不能通过光还原的变异光解酶中均发现含有两 电子还原态的黄素，因此光还原不是黄素在体内转化为活性形式的唯一机理。 a b f i g u r e1 3d e t e c t i o no ff l a v i nn e u t r a lr a d i c a li ne c o l ip h o t o l y a s eb yw m s a n de p r s p e c t r o s c o w ( a ) a b s o r p t i o ns p e c m z m mp e a l c a t3 8 0 姗i sm o s t l yd u et om n m p e a k sa t 4 8 0a n d5 8 0a n dt h es h o u l d e ra t6 2 5n mo r i g i n a t ef i - o mt h ef a d h 。b l u e - n e t r a lr a d i c a l ) e p r s p e c t r a s p e c t r aw e r er e c o r d e da t - 9 0 a t m i c r o w a v ep o w e r0 5m w , m o d u l a t i o na m p l i t u d e2 5g a n dm i c r o w a v ef r e q u e n c y9 0 7g h 乙t h ep r o m i n e n ts i g n a lw i t hal i n ew i d t ho f1 9gi st y p i c a lo f f l a v i nn e u t r a lr a d i c a l k e y ：t o p , e n z y m e ；m i d d l e ，b u f f e r , b o t t o m , e n z y m e - b u f f e r e a c hd i v i s i o no n t h e x - a x i si s1 0g 除s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 光解酶外，所有光解酶的黄素辅基在提取酶的过 程中都会被氧化成f a d h 蓝色中性自由基或全氧化态f a d 3 2 - 3 5 1 。这种转化在e 疗光解酶中尤其显著，含光解酶( 约占细胞内蛋白质总量的1 5 ) 的细胞小球是 e p r 无信号的，但是当细胞破裂后，便会出现f a d h 。的强e p r 信号，并且f a d h 在4 8 0 、5 8 0 和6 2 5s l n 的特征吸收带也会出现，f a d h 没有催化活性，必须通过化 学或者光化学途径还原成f a d h - 后才能激活酶3 1 , 3 6 - 3 7 。 ( 2 ) 喋呤 大多数光解酶都以喋呤做为“光天线 。在点c o l i 光解酶【3 8 】和其它在ec o l i 细胞中表达的叶酸类光解酶【3 9 】中，喋呤的存在形式是5 ，1 0 一亚甲基四氢喋酰基多 聚谷氨酸酯( 亚甲基四氢叶酸，m t 耶) ，多聚链中含有3 - 6 个谷氨酸，并且谷 4 第一章绪论 氨酸酯含有新颖的如) ( o 键【3 8 】，叶酸谷氨酸酯的o 【- 键合到目前为止只在原核生 物中观察到过。与黄素相比，叶酸辅基很容易从某些光解酶中脱离下来，经几轮 纯化后ec o l i 光解酶只含次当量的叶酸( 2 0 3 0 ) ，主要是因为m t h f s 和3 _ 4 个 g l u 残基在纯化过程中一起被丢失了附删。在酶和辅基浓度均很高时，通过诱导 辅酶蛋白或含发色团的e - f a d 就能产生含等当量的单谷氨酸形式的m t h f 酶【3 8 】。 叶酸的5 ，l o _ 亚甲基桥在3 6 0n m 处有最大吸收，当m t h f 和辅酶蛋白结合后，由于 5 ，1 0 - 亚甲基桥上正电荷与辅酶蛋白的极性相互作用以及结合部位与喋呤环的疏 水相互作用使叶酸的最大吸收红移，如所有叶酸类光解酶的k 觚都比3 6 0n m 波长 更长，& c e r e v i s i a e 光解酶的入m 疆为3 7 7m 【3 2 1 、n e u r o s p o r ac r a s s a 光解酶的为3 9 0 m 【4 3 署1 b a c i l l u s f i r m u s 光解酶1 舳4 1 5n m 4 4 。 ( 3 ) 去氮杂黄素 去氮杂黄素类光解酶的第二发色团是8 一羟基一7 ，8 一二脱甲基一5 一去氮杂核黄 素 4 5 1 ，多年来它被认为是去氮杂黄素类光解酶中唯一的辅基4 7 1 。当在ec o l i 光解酶中发现光天线一光催化剂双发色团序1 2 3 3 - 翊，人们才认识到去氮杂黄素类 光解酶也含有f a d 并且f a d h - 是所有光解酶都有的光催化辅基 3 4 1 。激发态5 一去 氮杂黄素是一个强的单电子还原剂并且经常被用来还原黄素蛋白【鸺】，这使人们 误认为在去氮杂黄素类光解酶中是5 一去氮杂黄素光裂解底物p ) 怜p y r 削。然而 处于e 8 阳) f 形式白铂刀胁切给光解酶既不特异性地结合也不修复p y r p y r 2 7 ， 这才确定8 h d f 是一个光天线。与脚一样，8 - h d f 和辅酶蛋白也有较强的相 互作用并且使它的最大吸收红移2 0 尬而达至u 4 4 0 衄【4 7 ，例。此外，8 - h d f 能紧 密结合到辅酶蛋白上，并且所有去氮杂黄素类光解酶都含有等当量的8 - h d f 和 f a d 4 5 ，4 9 1 。 1 2 3d n a 光解酶的晶体结构 到目前为止，已经被解析了晶体结构的光解酶有三个：ec o l i 1 7 1 、彳 n i d u l a n s i s l 和t h e r m u st h e r o p h i l u s t s o ，尽管第一个属于叶酸类而后两个属于去氮杂 黄素类，并且三者只有约2 5 的氨基酸序列是完全同源性的，但是这三个光解酶 5 第一章绪论 的结构却具有高度相似性。下面主要介绍点_ c o l i y 啪酶的晶体结构。 ec o l i 光解酶是由两个区域组成的：一个n 端“b 区域( 氨基酸残基1 1 3 1 ) 和另一个c 端d 一螺旋区域( 残基2 0 扣4 7 1 ) ，两者之间通过一个长的区域阃环( 残 ：基1 3 2 - 2 0 3 ) 来连接，并且该环包裹在“b 区域周围( 图1 4 ) 。 f i g u r e l 4 c r y s t a ls t n l e t u r eo f 最c o l i p h o t o l y a s e ：( r e m r i b b o nd i a g r a mr e p r e s e n t a t i o ns h o w i n g t h en t e r r a i n a l d o m a i n , m ec - r e t i n a la - h e l l c a ld o m a i n , a n d p o s i l l o n so ft h et w o c o f a c t o m ；( r j 窨l l os t a b a c ep o t e n t i a lr e p r e s e n t a t i o ns h o w i n gt h es o l v e n t - e x p o s e dr e s i d u e st h e s q u a r e m a r k s t h e h o l e i e a d l a g t of a d h l h e o o f l h e h e l i c a ld o m a i n ( 1 ) 光天线辅基 m t h f 光天线位于两区域之间的浅裂缝里，井且分子的一部分伸出酶的表 面，它与辅酶蛋白有两个重要的接触：一个是在c y s 2 9 2 羰基侧链和m t h f 五元 环上正电荷之间，这个相互作用导致m t i - i f 与辅酶蛋白结合后最大吸收红移； 另一个是在l y s 2 9 3 和m t h f 的g i u 部分之间( 光解酶被结晶后m t h f 只含有单 谷氨酸) ，这个作用可通过建立一个盐桥来增加酶对辅基的结合力。可以想象当 m t i - i f 有更长的g l u 尾巴时，它与酶的结合力应该会更高【柚- 4 2 1 ，天然辅基m t h f 的g l u 残基很可能还会形成其它盐桥。 an i d u l a 肿和rt h e r m o p h i l u s 光解酶的8 - h d f ( 后者结晶后丢失了8 - h d f ) 很可能也位于两区域之间的类似裂缝中，与m t h f 不周，在an i d u l a n s 光解酶 中( 而zt h e r m o p h i l u s 光解酶则是假设的) 8 - h d f 被深埋在裂缝内1 0 1 ，这可以 解释8 一h d f 在去氮杂黄紊类光解酶中被结合地更紧密，而m t h f 在大多数叶酸 类光解酶中的结合则较弱。但是这种区别不是普遍的，因为m t h f 与s 第一章绪论 c e r e l ，i s i a e 3 2 1 2 及丑f i r m d 删光解酶酶蛋白的结合和8 - h d f 与相应辅酶蛋白的结合 是一样紧密的。与结合f a d 区域不同的是，结合光天线辅基的区域间裂缝尽管 在结构上是相向的，但是接触光天线的氨基酸无论是在叶酸和去氮杂黄素两类光 解酶中还是在同类光解酶中均是不同源的【5 0 5 1 1 。 ( 2 ) 光催化辅基 f a d 辅基被深埋在o 【- 螺旋区域内并且由于异咯嗪和腺嘌呤环的相互接近使 得f a d 呈现一个独特的u 形构型。在酶中f a d 被与其接触的1 4 个氨基酸固定， 并且在光解酶家族中这些氨基酸多数是同源的【l7 5 0 1 ，这些残基在已知的三种光 解酶结构中相对于f a d 都处在同样位置【5 0 1 ，虽然光解酶中黄素的活性形式是 f a d h - ，但是在晶体结构中则是f a d h 。蓝色中性自由基或f a d o x 形式，因此酶 中结合黄素区域的结构可能与晶体结构中的区域有微小的差别。黄素通过铲螺 旋区域中间的孔来接近该区域表面( f i g u r e l 4 ) ，这个孔太小而使f a d 不能离去， 但是却很容易接纳氧分子。这就解释了为什么在光解酶中f a d 很容易被转化 为f a d h 。尤其是这个孔有适当大小和极性而允许一个胸腺嘧啶二聚体进入并 且在范德华距离内接近f a d 的异咯嗪环。酶的势能面显示沿着分子有一个正电 荷沟并且经过孔的入口，依据这些结构特征人们提出了酶经正电荷沟与d n a 骨 架结合的模型【1 7 1 ，并且酶沿着f a d 和芳香残基翻转胸腺嘧啶二聚体进入活性部 位空腔( - - 核苷酸翻转模型) 。 从晶体结构中还可以看出发色团与辅酶蛋白结合的另外一些特征，这些特征 对酶的作用效率有很大影响。在ec o l i 光解酶中，m t h f 和f a d 中心之间的距 离是1 6 8a ，并且两发色团平面几乎是相互垂直的；在互n i d u l a n s 光解酶中，两 个发色团之间距离是1 7 5a ，然而它们的平面之间却不相互垂直。从光天线到光 催化辅基能量转移的速率和效率依赖于两辅基之间的距离和相对方向，虽然短距 离有利于能量转移，但相同方向和取向则有利于瞬态偶极运动1 5 2 1 ，晶体结构说 明了在a n i d u l a n s 光解酶中能量转移更有效( - - 1 0 0 ) ，ec o l i 光解酶中则较低 ( 一7 0 ) 。最后，晶体结构还揭示了在酶的f a d h 光还原期间电子在蛋白质内转 移的势能途径【1 0 1 。 7 第一章绪论 1 3d n a 光解酶的反应机理 光解酶调节的催化反应符合米一曼动力学( m i c h a e l i s m e n t c nk i n e t i c s ) ，它 结合底物s 形成酶一底物复合物e s 后进行催化反应生成酶一产物复合物e p ，最 后产物p 从酶上解离。与经典米一曼过程不同的是：e s j e p 的转变是光依赖性 的【5 3 巧7 1 ，这种独特性质使光解酶可以进行详细的体内稳态动力学实验，并且可 与体外纯化的酶一底物体系得到的反应参数进行对比【1 纠4 , 2 8 , 5 6 ，结果显示体内体 外值很相似【l 肛1 4 1 。整个酶促反应总结如下：酶通过暗反应结合变异d n a 中底物 p y r p y r ，并双螺旋翻转二聚体进入活性部位空腔而形成一个稳定的e s 复合物， 然后叶酸( 或者8 皿f ) 吸收一个近紫外蓝光光子，并转移激发能( 偶极一偶极 相互作用) 给黄素，激发态黄素再转移一个电子给p y r p y r ，二聚体环丁烷环 的c 5 - - c 5 和c 6 - c 6 键反h 0 c k e l 规则的裂解形成两个嘧啶，同时电子回传给 f a d h 又重新生成f a d h - 。这个反应总体上是一个光驱动的循环电子转移反应， 没有净电子得失，所以严格地说，它不是一个氧化还原反应。 1 3 1 酶与底物的结合 光解酶是一个“结构特殊的d n a 结合蛋白”，其特殊性是由变异d n a 结合 部位双螺旋结构骨架和光损伤本身的化学结构所决定的。一般来说结构特殊 d n a 结合蛋白的结合亲合力是序列非依赖性的，但是假如这种结合包括碱基翻 转( 与光解酶相似【1 7 1 ) ，结合亲合力就可能受邻近序列影响。例如在富含g - c 的 d n a 中翻转一个p y r p y r 要比在富含”的d n a 中更难，然而实验并没有显 示邻近序列对ec o i 光解酶与d n a 结合常数的影响【5 8 5 9 1 ，这可能是因为超出 了分析限，也可能是受补偿机理的影响。 ( 1 ) 热力学和动力学 光解酶与单链或双链d n a 中p ) a p y r 结合时有同样的亲合力陬6 1 1 ，与 d n a 中t t 的结合常数是k s = 1 0 r 9m ，而与未损伤d n a 的非专一性结合常数 是1 0 。4m ，这意味着酶与变异d n a 结合的区别因子为k n s k s = 1 0 5 。酶结 合到n t 二核苷酸的平衡常数是c d 1 0 4 m ，这表明有约一半结合能来自酶 2 第一章绪论 - d n a 骨架相互作用 6 2 - - 6 4 ，另一半来自f a d 和活性部位残基与二聚体的相互作