（化学专业论文）apidaecin功能基团和作用靶位点分析及其在乳酸乳球菌中的分泌表达.pdf

浙江大学博士学位论文摘要 摘要 a p i d a e c i n 型抗菌肽指由昆虫细胞诱导表达的一类富含脯氨酸( p r o f i e h ) 的、长度为1 8 2 0 个氨基酸的抗菌肽，是目前己知的最大的p r o r i c h 抗菌肽家族。 a p i d a e c i n 特异地作用于g - 菌，在替代抗生素和抗感染方面显示出良好的应用潜 力。本研究通过c d 谱对a p i d a e c i n 的结构进行了阐析，深入研究了a p i d a e c i n 作 用于g 一菌的作用靶位点及其n 端和c 端基团的功能，并在构建乳酸乳球菌分泌 表达载体的基础上，实现了a p i d a e c i n 在乳酸乳球菌中的诱导、分泌表达。主要 研究内容和结果如下： 1 a p i d a e c i n 功能基团及其作用靶位点的分析 通过固相肽合成方法合成了a p i d a e c i n 及其n 末端和c 末端片段，对其功能 基团及与目标蛋白d n a k 作用的靶位点进行了研究。对a p i d a e c i n 及其n 末端和 c 末端的功能分析表明，a p i d a e c i n 能够迅速进入ec o l i 细胞、显著抑制细胞胞 内的b 一半乳糖苷酶和碱性磷酸酶活性，并能够明显增强d n a k 蛋白的a t p a s e 活 性，而其两个末端结构都不能进入ec o l i 细胞。这表明，a p i d a e c i n 的n 末端和 c 一末端都不含有与进入细胞和与靶蛋白相互作用的特定结构。通过c d 谱分析研 究了a p i d a e c i n 与d n a k 蛋白的d e 螺旋片段和l i d l e s sd n a k 蛋白的相互作用， 结果显示，a p i d a e c i n 能够与l i d l e s sd n a k 蛋白，即d n a k 蛋白的基质结合位点作 用，而不与d n a k 蛋白的d e 螺旋片段作用。以上结果提示，a p i d a e c i n 可能通 过与d n a k 蛋白的基质结合位点结合，并通过与基质竞争该位点而降低d n a k 蛋 白在细胞内的实际浓度，从而抑制ec o l i 的b 半乳糖苷酶和碱性磷酸酶的活性， 最终抑制细胞正常代谢而死亡。基于双相电泳的蛋白表达图谱的初步研究表明， 经a p i d a e c i n 处理的ec o l ik 8 8 的蛋白表达谱与未处理的蛋白存在9 个有意义的 差异蛋白质点，其中4 个蛋白质表达下调，4 个蛋白质表达上调，呈“全或无 改变的蛋白质点1 个。以上结果将为富含p r o 的抗菌肽的作用机理的研究提供重 要的理论依据。 2 a p i d a e c i n 对哺乳动物c a c o - 2 细胞和罗非鱼上皮细胞安全性评价 分离和培养了尼罗罗非鱼( o r e o c h r o m i sn i l o t i c a ) 肠道上皮细胞，并分别研 究了三个浓度的a p i d a e c i n ( 1 0g g m l ，2 0 t g m l 和3 0g g m 1 ) 对哺乳动物c a c o 2 浙江大学博士学位论文 摘要 细胞( 共培养l h ) 和罗非鱼肠道上皮细胞( 分别共培养2 4 h 和4 8 h ) 生长形态、 增殖、存活率、通透性、胞浆游离c a + 和磷脂酶a 2 活性等相关指标的影响。研 究结果表明：1 0 3 0i ，t g m l 浓度范围内的a p i d a e c i n 体外对哺乳动物细胞和鱼的肠 道细胞都没有显著影响( p 0 0 5 ) 。该研究结果将为a p i d a e c i n 在抗菌及替代抗生 素方面的应用提供科学依据。 3 a p i d a e c i n 在乳酸乳球菌中的分泌表达 根据乳酸乳球菌( l a c t o c o c c u sl a c t i s ，三1 a c t i s ) 分泌表达规律，以u s p 4 5 信 号肽作为信号肽序列，成功地构建了乳酸乳球菌分泌型表达载体s p n z 8 0 4 8 。将 抗菌肽a p i d a e c i n 基因克隆到s p n 8 0 4 8 载体中，构建分泌型重组乳酸乳球菌表达 载体s p n z 8 0 4 8 a p ，转化l 1 a c t i s 受体菌n z 9 0 0 0 ，得到重组菌l 1 a c t i s s p n z 8 0 4 8 a p 。在n i s i n 诱导、p i 。a 启动子的调控和u s p 4 5 信号肽的正确引导下， a p i d a e c i n 成功地分泌表达。t r i c i n es d s p a g e 显示表达的a p i d a e c i n 分子量为2 0 k d a 左右，表明u s p 4 5 信号肽序列经正确的翻译后加工而切除。发酵上清液经分 子量截至1 0 0 0 3 0 0 0 超滤膜浓缩、s e p h a c r y l s 1 0 0h r 填料的凝胶柱凝胶过滤及 c 1 8v y d a ec o l u m n 的r p h p l c 纯化获得了具有抑菌活性的表达产物。l 1 a c t i s s p n z 8 0 4 8 a p 】诱导培养液上清及其纯化产物的t r i c i n es d s p a g e 凝胶电泳均 得到了目的大小的条带，纯化蛋白的e s i m s m s 质谱图谱在9 7 9 5 0m z 得到了 一个大的分子离子信号峰 m + 2 h + 】2 + ，即分子量为1 9 5 7 0d a ，与a p i d a e c i n 的分 子量大小一致( 1 9 5 7 3d a ) 。在1 0n g m l 的n i s i n 诱导表达4 h 的前提下，1l 的 a p i d a e c i n 基因工程菌可以表达大约1 0m g 的重组a p i d a e c i n 。纯化产物的抑菌活 性试验显示，重组a p i d a e c i n 具有明显的抑制大肠杆菌k 8 8 的活性。 关键词：a p i d a e c i n ；n 一末端；c - 末端；d n a k ；细胞毒性；分泌表达 浙江大学博上学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t a p i d a e c i n s ( a p i d a e c i n t y p ep e p t i d e s ) r e f e rt o as e r i e so fs m a l l ，p r o l i n e r i c h ( p r o - r i c h ) ，18 - t o2 0 r e s i d u ep e p t i d e sp r o d u c e db yi n s e c t s t h e ya r et h el a r g e s tg r o u p o fp r o r i c ha m pk n o w nt od a t e a p i d a e c i n sa r ea c t i v ea g a i n s tg r a m n e g a t i v eb a c t e r i a a n ds h o wp o t e n t i a lt ob eu s e da sn e wc a n d i d a t e so fp e p t i d ea n t i b i o t i c s t h ep r e s e n t s t u d ye l u c i d a t e d t h es t r u c t u r ei n f o r m a t i o no fa p i d a e c i nt h r o u g hc ds p e c t r u m ，t h e f u n c t i o nt a r g e to fa p i d a e c i no ne c o l ic e l l sa n dt h ef u n c t i o nd o m a i no fi t sn t e r m i n a l a n dc t e r m i n a l a p i d a e c i nw a sa l s os u c c e s s f u l l ye x t r a c e l l u l a rp r o d u c e di nl 1 a c t i s t h em a i nc o n t e n t sa n dr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 a n a l y s i so ft h ef u n c t i o nt a r g e to fa p i d a e c i no ne c o l ic e l la n dt h ef u n c t i o n d o m a i no fi t sn t e r m i n a la n dc - - t e r m i n a lf r a g m e n t s t w oa s p e c t sw e r es t u d i e dt oe l u c i d a t et h ef u n c t i o n a la n ds t r u c t u r a l c h a r a c t e r i z a t i o no fa p i d a e c i na n di t sn - t e r m i n a la n dc - t e r m i n a lf r a g m e n t s ：( 1 ) f u n c t i o n so ft h en - t e r m i n a la n dc - t e r m i n a lf r a g m e n t so fa p i d a e c i nw e r ef i r s t l y s t u d i e db ym e a s u r i n gt h e i ra n t i b a c t e r i a la c t i v i t y , t h e i ra b i l i t yt oe n t e rec o l ic e l l sa n d t h e i re f f e c t so nt h ea c t i v i t i e so f1 3 - g a l a c t o s i d a s ea n da l k a l i n ep h o s p h a t a s e t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tn e i t h e rt h en t e r m i n a ln o rt h ec - - t e r m i n a lo fa p i d a e c i nc o n t a i n s i n t r a c e l l u l a rd e l i v e r yu n i to ra c t i v es e g m e n t ( 2 ) t h ee f f e c to fa p i d a e c i no nt h ea t p a s e a c t i v i t yo fd n a k ，a n dt h ei n t e r a c t i o n so fa p i d a e c i nw i t he c o l il i d l e s sd n a ka n dd n a k d eh e l i xw e r es t u d i e db yc d s p e c t r u m r e s u l t ss h o w e dt h a ta p i d a e c i nc o u l di n t e r a c t w i t ht h ee c o l il i d l e s sd n a kp r o t e i na n ds t i m u l a t ei t sa t p a s ea c t i v i t y ，b u tn o tw i t h e c o l id n a kd eh e l i x t h i si n d i c a t e dt h a tt h ea n t i m i c r o b i a la c t i v i t yo fa p i d a e c i nm a y b es h o w nb ys t i m u l a t i n gt h ea t p a s ea c t i v i t yo fd n a kb yb i n d i n gt oi t sc o n v e n t i o n a l s u b s t r a t e b i n d i n gs i t e ，t od e c r e a s ei t sc e l l u l a rc o n c e n t r a t i o no fd n a kb yc o m p e t i n g w i t hn a t u r a ls u b s t r a t e sa n di n h i b i tt h ee n z y m e s a c t i v i t i e so fe c o l ic e l l s i ti st h ef i r s t s t u d yt os u g g e s tt h a tt h ea p i d a e c i n - b i n d i n gs i t eo fd n a ki st h ec o n v e n t i o n a ls u b s t r a t e b i n g i n gs i t e t h et o t a lp r o t e i n so fc o n t r o la n da p i d a e c i n t r e a t e de c o l ic e l l sw e r e s e p a r a t e dw i t h2 - d e g e li m a g e sw e r ea n a l y z e db yp d q u e s ts o f ta n dr e s u l t ss h o w e d t h a t9d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dp r o t e i ns p o t sw e r ed e t e c t e d ，a n da m o n gt h e m ，4w e r e 浙江大学博f j 学位论文 a b s t r a c t u p r e g u l a t e d ，4w e r ed o w n - r e g u l a t e d ，a n d1u n m a t c h e d 2 i n v e s t i g a t i o no ft h ec y t o t o x i c i t yo fa p i d a e c i no nc a c o 一2c e l l sa n di n t e s t i n a l e p i t h e l i a lc e l l so ft i l a p i a ( o r e o c h r o m i sn i l o t i c u s ) i nv i t r o t h ei n t e s t i n a le p i t h e l i a lc e l l so ft i l a p i a s ，o r e o c h r o m i sn i l o t i c a ，a n dw e r ec u l t u r e d p r i m a r i l ya n du s e da sm o d e l s ，w i t ht h ec a c o 一2c e l l ，t os t u d yt h ee f f e c to fd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o na p i d a e c i n ( t r i a l1 ：10l _ t g m l ，t r i a l2 ：2 0i r t g m l ，t r i a l3 ：3 0p g m 1 ) o nt h e c e l l sv i a b i l i t y , l i v a b i l i t y , p e r m e a b i l i t y , c y t o s o l i cf l e ec a l c i u ma n dm e m b r a n o u sp l a 2 a c t i v i t y r e s u l ts h o w e dt h a ta p i d a e c i nw i t h i nt h ec o n c e n t r a t i o no f3 0i ，t g m ls h o w e dn o s i g n i f i c a n te f f e c to nb o t hc a c o - 2a n de p i t h e l i a lc e l l so ft i l a p i a sc o m p a r i n gw i t ht h e c o n t r 0 1 f u r t h e r m o r e ，t h ee f f e c to fa p i d a e c i no ng r o w t hm o r p h o l o g i c a lv a r i e t yo f c a c o 一2a n di n t e s t i n a le p i t h e l i a lc e l l so ft i l a p i a sw a sa l s oo b s e r v e da n dt h er e s u l td i d n o ts h o wa n ym o r p h o l o g i c a la b n o r m i t y t h i si n d i c a t e dt h a ta p i d a e c i nw i t h i nt h e c o n c e n t r a t i o no f4 0i _ t g m lw a sh a r m l e s st ot h eg r o w t ho fc a c o 一2a n de p i t h e l i a lc e l l s o ft i l a p i a sf o rap e r i o do fd e t e r m i n a t et i m e 3 e x t r a c e l l u l a rp r o d u c t i o no fa p i d a e c i ni nll a c t i s h e t e r o l o g o u sp r o d u c t i o no fa n t i b a c t e r i a lp e p t i d ea p i d a e c i nw a ss t u d i e di nt h e f o o d - g r a d eb a c t e r i u ml a c l o c o c c u sl a c t i s e x p r e s s i o no ft h ea p i d a e c i ng e n ed r i v e nb y t h el a c t o c o c c a ln i s ap r o m o t e ra n dt h eu s p 4 5s i g n a lp e p t i d eg e n er e s u l t e di ne f f i c i e n t e x t r a c e l l u l a rp r o d u c t i o no fa p i d a e c i ni nl 1 a c t i sn z 9 0 0 0 a f t e r4hi n d u c t i o nw i t h1 0 n g m ln i s i n ，t h es e c r e t o r ye x p r e s s i o ny i e l do fr e c o m b i n a n ta p i d a e c i nr e a c h e da b o u t10 p g m lw h i l en oa p i d a e c i nw a sd e t e c t e d i nt h ea n - i n d u c e dc o n t r 0 1 r e c o m b i n a n t a p i d a e c i nw a sp u r i f i e db yg e l f i l t r a t i o no n as e p h a c r y ls 一10 0h rc o l u m na n d s e m i p r e p a r a t i v er p - h p l co nac 18v y d a cc o l u m na n da b o u t10m gp u r ea c t i v e a p i d a e c i n w a so b t a i n e df r o m1lf e r m e n t a t i o nc u l t u r e 15 6 mu r e a t r i c i n e - s d s - p a g ei n d i c a t e dt h a tr e c o m b i n a n ta p i d a e c i np r o t e i nm o l e c u l e rw e i g h ti s a b o u t2 0k d a e s i - m s m so fp u r i f i e da p i d a e c i nd e m o n s t r a t e das i n g l el a r g es i g n a l o ft h em o l e c u l a ri o n m + 2 h + 】2 + a t9 7 9 5 0m z ，m e a n sam o l e c u l a rw e i g h to f19 5 7 0 d aw h i c hi si d e n t i c a lt ot h a to ft h ep u t a t i v ep r o t e i n ( 19 57 3d a ) t h er e c o m b i n a n t a p i d a e c i ns h o w e da n t i m i c r o b i a la c t i v i t ya g a i n s te c o l ik 8 8 t h i si st h ef i r s tr e p o r to n 浙江人学博士学位论文 a b s t t a c t t h ee x t r a c e l l u l a rp r o d u c t i o no fa p i d a e c i ni nl 1 a c i t s e x p r e s s i o na n dd e l i v e r yo f a p i d a e c i ni nt h ef o o d g r a d el 1 a c t i sw o u l df a c i l i t a t et h ew i d e s p r e a da p p l i c a t i o no f a p i d a e c i ni nt h ec o n t r o la n dp r e v e n t i o no fg r a m n e g a t i v eb a c t e r i ai n f e c t i o n k e yw o r d s ：a p i d a e c i n ；n - - t e r m i n a lf r a g m e n t ；c - t e r m i n a lf r a g m e n t ；d n a k ；c y t o t o x i t y ； s e c r e t o r ye x p r e s s i o n v 浙江人学博 = 学位论文图目录 图目录 图1 1 典型抗菌肽的n m r 溶液结构9 图1 2 铜绿假单胞菌p a 0 1 ( 10 8c 如m l - 1 ) 经绵羊c a t h e l i c i d i n 类抗菌肽s m a p 2 9 ( 1 0 烬m l _ 1 ) 处理1 5 h 和3 h 1 0 图1 3 抗菌肽诱导细胞杀伤的桶板模型l5 图1 4 抗菌肽诱导细胞杀伤的地毯模型1 5 图1 5 抗菌肽诱导细胞杀伤的螺旋管模型1 6 图1 6 抗菌肽胞内杀伤微生物作用模式1 8 图1 7a p i d a e c i n 作用机制图示3 0 图2 1 固相肽合成的过程4 6 图2 2 本实验中合成的多肽的h p l c 图谱和e s i m s 检测图谱5 2 图2 3a p i d a e c i n 及其片段进入e c o l i 细胞共聚焦显微镜图5 7 图2 4a p i d a e c i n 对e c o l id n a k 蛋白a t p a s e 活性的影响n 5 8 图2 5a p i d a e c i n 及其片段进a e c o l i 细胞共聚焦显微镜图5 9 图2 6a p i d a e c i n 及其片段的c d 谱图6 l 图2 7a p i d a e c i n 与d n a k 蛋白的qd qe 螺旋和l i d l e s s d n a k 蛋白的c d 谱图6 2 图2 8 大肠杆菌d n a k 蛋白的全序列6 3 图2 9ec o l ik 8 8 总蛋白的s d s - p a g e 单向电泳7 2 图2 1 0a p i d a e c i n 处理和未处理的e c o l ik 8 8 总蛋白的二向电泳图谱”7 3 图2 1 12 d p a g e 图谱分子量和等电点对照7 4 图2 1 2i n t e r s e c t i o n 模式下a p i d a e c i n 处理和未处理e c o l i 的蛋白表达图谱比较分 析”7 6 图2 1 3 差异点蛋白质的比较图谱7 7 图3 1c a c o 2 细胞倒置相差显微镜图( 4 0 0 ) 8 4 图3 2 不同浓度的a p i d a e c i n 对c a c o 2 细胞l d h 活性的影响8 4 图3 3 不同浓度的a p i d a e c i n 对c a c o 2 细胞活力的影响8 5 图3 4 尼罗罗非鱼肠道上皮细胞经不同处理后的倒置相差显微镜图( 4 0 0 ) ”8 9 图3 5a p i d a e c i n 对尼罗罗非鱼上皮细胞胞浆游离c a 2 + ( a ) 的影响9 1 图3 6a p i d a e c i n 对尼罗罗非鱼上皮细胞胞浆磷脂酶a 2 ( b ) 活性的影响9 2 i v 浙江大学博上学位论文 图目录 图4 1 乳酸乳球菌分泌型表达载体及a p i d a e c i n 重组基因工程菌的构建示意图一9 7 图4 2u s p4 5 基因p c r 条带10 5 图4 3s p n z 8 0 4 8 质粒p c r 检测10 5 图4 4s p n z 8 0 4 8 e 全序列p c r 条带1 0 6 图4 5a p i d a e c i n 基因在乳酸乳球菌中表达示意图10 8 图4 6a p i d a e c i n 基因的p c r 扩增产物1 11 图4 7p u c m t a p s 质粒酶切鉴定11 1 图4 8a p i d a e c i n 基因序列及推译得到氨基酸序列”1 1 2 图4 9s p n z 8 0 4 8 a p e 质粒p c r 检测11 2 图4 10 重组a p i d a e c i n 的分离纯化步骤示意图“114 图4 1 1 对e c o l ik 8 8 的抑菌实验1 1 8 图4 1 2 三1 a c t i s 【s p n z 8 0 4 8 - a p 诱导培养液上清t r i c i n e - s d s p a g e 1 1 9 图4 13a p i d a e c i n 纯化产物t r i c i n e s d s p a g e ”1 19 图4 1 4a p i d a e c i n 经r p h p l cc 1 8 柱纯化洗脱曲线1 2 0 图4 1 5 纯化a p i d a e c i n 质谱检测图谱1 2 1 v 浙江大学博t 学位论文 表目录 表目录 表1 1 抗菌肽大致分类及其来源7 表1 2 影响抗菌肽抗菌活性和作用特异性的特征8 表1 3 抗菌肽介导的细胞杀伤和膜裂解的胞内作用模型1 4 表1 4a p i d a e c i n 肽序列比对2 4 表1 515 种a p i d a e c i nh o + 型异构体的抗菌谱比较2 6 表1 616 种a p i d a e c i n 抗菌肽的抗菌谱及其活性比较- 2 7 表2 1 合成的多肽序列4 3 表2 2 主要原料及试剂来源4 3 表2 3a p i d a e c i n 的体外抑菌活性一5 3 表2 4 仪器运行参数7 0 表2 5 差异斑点的定量分析7 7 表3 1a p i d a e c i n 对尼罗罗非鱼上皮细胞增殖的影响( o d 值) 9 0 表3 2a p i d a e c i n 对尼罗罗非鱼上皮细胞存活率的影响( ) 9 0 表3 3a p i d a e c i n 对尼罗罗非鱼上皮细胞通透性的影响( l d h ，u l ) - 9 1 表4 1 实验用菌株9 8 表4 2 实验用菌株- 10 9 表4 3t r i c i n es d s p a g e 电泳凝胶配制1 1 6 表4 4s d s 电泳后凝胶的银染色”1 1 7 v i 浙江人学博士学位论文英文缩写词 英文缩写词 英文缩写英文全称 中文名称 a k p a m p a m p a p a p a p i 9 a p 9 - 1 7 b p b s a c d c d s c l s m c m d d h 2 0 d m f d n a k d n t p e d t a e c o l i e s i - m s f i k - a p l - 9 f 1 k a p 9 17 f l k - a p i d a e c i n f m o c f t i r g + 菌 g 一菌 h n p h p l c i p t g k d a a l k a l i n ep h o s p h a t a s e碱性磷酸酶 a m p i c i l i n 氨苄青霉素 a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e抗菌肽 a m m o n i u mp e r s u l f a t e过硫酸铵 a p i d a e c i nh o + ，序列为( n c ) ：g k p r p q q v p p r p p h p r l a p i d a e c i nh o + n - t e r m i n a lr e g i o n ，序列为( n c ) ：g k p r p q q v p a p i d a e c i nh o + c - t e r m i n a lr e g i o n ，序列为( n c ) ：p p r p p h p r l b a s ep a i r ( s ) 碱基对 b o v i n es e r u ma l b u m i n牛血清蛋白 c i r c u l a rd i c h r o i s m圆二色谱 c o d i n gs e q u e n c e 编码框 c o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p e 共聚焦激光扫描显微镜 c h l o r a m p h e n i c o l 氯霉素 d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r 双蒸水 n n d i m e t h y l f o r m a m i d e n ，n 一二甲基甲酰胺 h e a ts h o c kp r o t e i no f e c o i l 大肠杆菌热应激蛋白 d e o x y r i b o n u c i e o s i d et f i p h o p h a t e 脱氧三磷酸核糖核苷酸 e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 e s c h e r i c h i ac o i l 大肠杆菌 e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o ni o nt r a pm a s ss p e c t r o m e t e r电喷雾离子( 阱) 质谱 f i t c 荧光标记的a p i 9 ，序列州- - c ) ：f i t c k g k p r p q q v p f i t c 荧光标记的a p 9 1 7 ，序列( n - - - c ) ：f i t c - k p p r p p h p l u f i t c 荧光标记的a p i d a e c i n ，序列( n - - - c ) ：f i t c k g k p r p q q v p p r p p h p r l 9 - f l u o r e n y l m e t h o c y c o r b o n y l c h l o r i d e 9 - 芴甲氧羰基 f o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e ds p e c t r o m e t r y傅立叶转换红外线光谱 g m m p o s i t i v eb a c t e r i a 革兰氏阳性菌 g r a m n e g a t i v eb a c t e r i a 革兰氏阴性菌 h u m a nn e u t h o p h i lp e p t i d e s 人嗜中性肽 h i g h - p r e s s u r el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 高效液相色谱 i s o p r o p y l t h i o p d g a l a c t o p y r a n o s i d e 异丙基硫代- p - d 半乳糖苷 k i l od a l t o n千道尔顿 浙江大学博一i j 学位论文 英文缩写词 2 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得堑姿盘堂或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：闰荡稆 签字日期： 们q 苫年峄月矽日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解澎姿盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权逝姿苤鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 。 学位论文作者签名： f 刃嚅彰 导师签名 签字日期：w 。易年中月妒日 签字日期：嘶v 月，细 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 浙江大学博上学位论文 引言 引言 传统抗生素对于控制、预防和治疗各种感染性疾病发挥了重要作用，由于抗 生素的使用，到2 0 世纪8 0 年代，人类几乎可以征服所有的感染类疾病。然而， 随着时间的推移和抗生素的滥用，抗生素不仅严重破坏了人类和动物肠道的微生 态平衡，而且导致耐药菌株愈来愈多。有检测发现，具有代表性的耐药菌株中， 耐药的葡萄球菌已上升到4 0 ；耐药的凝固酶阴性葡萄球菌更是超过7 7 。 w h o 宣布，无论在发达国家或者在发展中国家，抗生素抗性水平正以令人警觉 的速度提高，预计将以与抗生素失效速度相同甚至更快的速度发展，更令人关注 的是出现了可抗多类抗生素的抗性菌株( d a v i e s ，1 9 9 6 ) 。抗生素的滥用和致病菌 株的耐药性问题已经日益严重的威胁到人类和动物的健康，寻找全新类型的抗生 素替代物成为解决这些问题的重要而有效的途径。在此方面，广谱抗菌且抗菌作 用机理独特的抗菌肽具有明显的替代传统抗生素优势，应用前景广阔，已成为国 内外生命科学领域研究的热点之一。 抗菌肽又称抗微生物肽，是一类由基因编码，在核糖体上合成的多肽，是生 物天然免疫防御系统的重要组成部分( b o m a n ，1 9 9 1 ) ，具有分子量小，理化性质 稳定，抗菌谱广，抑菌作用机理独特等特点。抗菌肽的分布极其广泛，在病毒、 细菌到植物、昆虫、软体动物、甲壳动物、两栖动物、鱼类、鸟类和哺乳动物等 生物上均有发现。抗菌肽的作用机制与传统的抗生素不同，具有明显的整体性优 势。抗生素主要通过特异性穿透膜屏障，当通道发生突变形成突变缺陷株可产生 有效的耐药性，而抗菌肽可通过多种渠道杀死细菌。抗菌肽分子常见的一种抑杀 细菌途径是通过在细菌细胞质膜上穿孔而形成离子通道，造成细菌细胞膜结构破 坏，引起胞内水溶性物质大量渗出而导致细菌死亡。因此，不易产生对抗菌肽具 有耐性的菌株。此外，由于微生物的细胞膜和多细胞生物的细胞膜在结构特点上 的不同决定了抗菌肽的作用具有选择性。微生物的细胞膜由脂质双分子层组成， 其带有负电荷的磷脂头暴露在外层，而动植物的脂质双层的外层则没有静电荷的 分布，其大部分的带负电荷的磷脂头均面向细胞质而位于脂质双层的内层。这样， 就使得抗菌肽对正常哺乳动物细胞及昆虫细胞不产生不良影响。由此可见，抗菌 肽的研究在医药、食品防腐、生防等领域具有重要的理论和现实意义。到目前为 止，国内外许多学者相继从人和其它生物中分离纯化了2 0 0 0 多个抗菌肽，这些 浙江大学博士学位论文 抗菌肽的发现无疑给新型绿色抗菌药物的研发提供了新的思路和途径。 在抗菌肽的大家族中，有一类1 9 世纪8 0 年代末才发现的富含p r o 的新型多 肽。这类抗菌肽主要发现于哺乳动物和昆虫中，通常是由1 5 3 9 个氨基酸残基组 成，p r o 含量在2 5 以上，而且肽链中脯氨酸往往与并联或三联形式与碱性残基 排列在一起。它们主要对包括一些人类致病菌和植物致病菌如ec o l i ， e n t e r o b a c t e rc l o a c a e ( 阴沟肠杆菌) ，k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e ( 克雷伯氏菌模式种) ， s a l m o n e l l at y p h i m u r i u m ( 鼠伤寒沙门氏菌) ，s a l m o n e l l at y p h i ( 伤寒沙门氏菌) ， 勋袒l l ad y s e n t e r i a e ( 痢疾志贺氏菌) ，a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ( 土壤杆菌模式 种) 和a c i n e t o b a c t e rc a l c o a c e t i c u s ( 乙酸钙不动杆菌) 等在内的g 一菌具有很强的 抑菌活性。富含p r o