（光学专业论文）菌紫质和高等植物捕光复合物的超快光响应研究.pdf

摘要a b s t r a c t 论文摘要 生物界中存在着许多高效的能量转换蛋白。嗜盐菌的菌紫质b r 和高等植物 捕光复合物l h c i i 就是两个很好的例子，它们能将光能储存起来，转化成化学 能。我i f n 用飞秒泵浦探测获得了b r 和l h c i i 的超快动力学的时间分辨谱， 研究了它们在亚皮秒量级的光响应过程。本论文还首次观察了b r 突变体d 9 6 v 和a r 4 的超快动力学过程，并在较短的波长观察到了l h c i i 色素分子的一个上 能级。主要的结果如下： 1 b r 的原初反应属于亚皮秒时域，其光循环中视黄醛分子的光异构化和中 间体j 态的生成时间在o 5 皮秒之内，j 的寿命则为3 皮秒。通过改变波 长得到一系列的动力学曲线，揭示了b r 的超快过程随波长的变化规律。 在6 2 5r l l t l 附近，可以观察到中间体j 的吸收，因为这是j 的吸收峰值波 长，在动力学曲线上表现为一个向上的漂白峰接着一个负的向下的吸收 带。远离6 2 5n m 的波长，j 的吸收变小，在动力学曲线上，表现为一个 向上的漂白峰，而向下的吸收带变弱或消失。不同的p h 值对b r 的超快 动力学过程有不同的影响。在5 p h 9 的范围，b r 的动力学变化不大； 在p h 9 的范弱，b r 的动力学过程则受到较大的影响。 2 我们首次观察了b r 突变体d 9 6 v 的超快动力学过程。由于9 6 位氨基酸 的差异，导致了突变体光循环中的m 态的寿命非常长，而且希夫碱基周 围的微环境发生改变，使得突变体d 9 6 v 的超快动力学与b r 相比出现 了一些差异：在6 2 5 眦附近未观察到中间体j 态的吸收。 3 我们首次获得了a r 4 的超快动力学曲线。a r 4 与b r 的同源性为5 6 。 它的质子泵的质子摄取和释放的顺序与b r 相反，即：摄取先于释放。 a r 4 的中间体j 的生成时间为0 6 0 7 皮秒。a r 4 中的f 1 4 5 不同于b r 的m 1 4 5 ，可能导致了希夫碱基的兀一电子体系的离域程度发生变化。 4 高等植物捕光复合物l h c i i 的色素间的能量传递发生在亚皮秒时间范 围。由于叶绿素分子之间的紧密结合，在l h c i i 单体中的超快能量传递 主要通过三种途径进行，即：c h lb a 、c h la a 和c h lb b 。我们用不 同的波长激发叶绿素分子，获得了一系列的动力学曲线。6 4 8n n l 波长的 摘要a b s t r a c t 泵浦光主要激发的是c h lb 分子，得到c h lb a 的能量传递的时间为3 6 7 飞秒；6 3 5 眦波长的条件下，观察到了c h lb 3 一a 3 的能量传递时问为 2 8 5 飞秒；波长6 5 7n n 获得的动力学曲线表明c h lb 6 的能量传递时间为 8 2 9 飞秒。6 7 0r l l t l 的波长下，c h la a 的能量传递为2 8 5 皮秒；6 6 4 1 1 1 1 1 激发l h c i i ，得到了2 3 皮秒的能量传递时间常数；6 7 6r i m 条件下，观 察到了c h la 4 的能量传递时间为7 4 5 飞秒。6 8 ln m 的超快动力学中的 2 3 皮秒的成分可以归属于c h la 7 的能量传递时间。另外，还得到了6 9 1 n m 和6 9 8n n l 处l h c i i 的动力学曲线，它们分别含有8 1 0 飞秒和1 7 0 飞 秒的成分。c b _ lb b 的能量传递的速率比c h lb a 的能量传递慢得多。 6 4 8n n l 的波长得到的1 4 3 皮秒的快过程，可能属于c h lb b 的能量传 递过程。 5 我们还获得了6 1 0 6 4 8n m 激发的l h c i i 动力学曲线。这些曲线表明：在 l h c i i 中，叶绿素分子存在着一个上能级。在波长短于6 1 51 3 1 1 时，观察 到了叶绿素分子激发态的吸收。6 1 9n m 是个过渡阶段。大于6 1 9n n 的 波长的动力学只表现出漂白峰。此外，我们从叶绿素分子的各向异性的 计算结果得知：在1 3 皮秒的时间内，l h c l l 分子的各向异性变化不大， 从起始值o 5 附近，降到3 皮秒处的o 4 2 。 关键词；菌紫质，高等植物捕光复合物，超快动力学，飞秒激光，泵浦- 探测技 术 、 摘要a b s t r a c t a b s t r a c t i nt h en a t u r et h e r ea r em a n yk i n d s o f p r o t e i n s ，w h i c h e o n v e r t o p t i c a le n e r g y o f s u n l i g h ti n t oc h e m i c a le n e r g ys t o r e di nt h eo r g a n i cm o l e c u l e s b a c t e r i o r h o d o p s i n ( b r ) a n dl h c i ia r et w oo ft h e s ep r o t e i n s b ri st h eu n i q u ep r o t e i ni nt h ep u r p l em e m b r a n e o fas a l t l o v i n gb a c t e r i u m l h c i ii st h el i g h t h a r v e s t i n ga n t e n n ao f h i g hp l a n t s t h e p r i m a r yp r o c e s s e so fb r a n dl h c i it a k ep l a c ei nt h ep i c o s e c o n do rs u b p i c o s e c o n dt i m er e g i o n u s i n gt h e f e m t o s e c o n dl a s e rs y s t e ma n dp u m p - p r o b et e c h n i q u e ，w es t u d i e dt h e u l t r a f a s t d y n a m i c s o fb ra n d l h c i i f u r t h e r m o r e ，f r o m t h et i m e - r e s o l v e d s p e c t r o s c o p y , w e f i r s to b t a i n e dt h eu l t r a f a s td y n a m i c a lb e h a v i o r so f b rm u t a n td 9 6 v a n da r 4a n dah i g h e re n e r g ys t a t eo fl h c i i c h r o m o p h o r e sw a so b s e r v e da r o u n dt h e w a v e l e n g t ho f 6 1 0m n f o l l o w i n ga r et h em a i nr e s u l t so fo u r e x p e r i m e n t sm e n t i o n e d i nt h et h e s i s ： 1 t h ep r i m a r ye v e n t so fb r sp h o t o c y c l et a k ep l a c ei ns u b p i c o s e c o n d r e g i m e i n c l u d i n gt h ep h o t o i n d u c e di s o m e r i z a t i o no f r e t i n a la n dt h eo c c u r r e n c eo ft h e i n t e r m e d i a t ej n ed y n a m i c so fb r su l t r a f a s t r e s p o n s es u g g e s t st h a tt h e r e t i n a li s o m e r i z a t i o nh a p p e n sw i t h i n0 5p i c o s e c o n da n dt h el i f e t i m eo fji s3 p i c o s e c o n d u n d e rd i f f e r e n tc o n d i t i o n so fv a r y i n gw a v e l e n g t h s ，as e r i e so f d y n a m i c a lc u r v e sw e r eo b t a i n e dt or e v e a lt h er e g u l a r i t yo fb r su l t r a f a s t p r o c e s s e s i ft h e e x c i t a t i o nw a v e l e n g t h sa r ea r o u n d6 2 5n l n ，a tw h i c ht h e a b s o r p t i o np e a ko ft h e i n t e r m e d i a t ejl o c a t e s ，an e g a t i v ea b s o r p t i o nb a n d i m m e d i a t e l yf o l l o w i n gt h eb l e a c h i n gp e a kc a no b v i o u s l yb e s e e ni nt h e d y n a m i c a lc u r v e s i ft h ee x c i t a t i o nw a v e l e n g t h sa r ef a rf r o m6 2 51 l i n t h e n e g a t i v ea b s o r p t i o nb a n dw i l lb es m a l l e ro re v e nd i s a p p e a ri nt h ed y n a m i c a l c n r v e sb e c a u s eo f t h ew e a k e ra b s o r p t i o no f t h ei n t e r m e d i a t ej u n d e rd i f f e r e n t p h v a l u e sb rh a sv a r i o u sd y n a m i c a lb e h a v i o r s i f t h es a m p l es o l u t i o n sp hi s b e t w e e n5a n d9 ，t h eu l t r a _ f a s td y n a m i c so fb r a r es i m i l a r i nc o n t r a s t ，t h e d y n a m i c a lc u l w e sv a r yi f t h ep h i so u to f t h a t r e g i o n 2 w ef i r s to b t a i n e dt h eu l t r a f a s td y n a m i c so fb rm u t a n td 9 6 v , w h i c hh a sa l o n g e r - l i f e t i m em i n t e r m e d i a t er e s u l t i n gf r o mt h ed i s p l a c i n go fa m i n oa c i d - i 摘要a b s t r a c t r a d i c a l a s p 9 6 o fb ri n t ov a t 9 6o ft h em u t a n t a r o u n dt h ee x c i t a t i o n w a v e l e n g t h6 2 5n l t l ，t h es i m i l a ra b s o r p t i o n b a n do fi n t e r m e d i a t ejo c c u r r i n gi n b rw a sn o to b s e r v e di nt h em u t a n td 9 6 v 3 w ef i r s tg o tt h ea r 4 su l t r a f a s td y n a m i c a lb e h a v i o r s t h eu p t a k eo fp r o t o n f r o mt h ep l a s m i cs i d ei na r 4 p r e c e d e st h ep r o t o nr e l e a s ei nt h eo u t s i d eo f t h e m e m b r a n e w h i c ho c c t l r sw i t hc o n t r a r ys e q u e n c ei nb r t h ef o r m a t i o no f a r 4 si n t e r m e d i a t ej i sw i t h i n0 6 - 0 7p i c o s e c o n dp a r t l yb e c a u s eo f t h ef 1 4 5 j na r 4i n s t e a do f t h em 1 4 5i nb r 4 t h e e n e r g yt r a n s f e rb e t w e e n t h ec h l o r o p h y l l so f t h em o n o m e r i cl h c i io c c u r s a tt h er e g i o no fp i c o s e c o n do rs u b p i c o s e c o n di n c l u d i n gt h r e em a i np a t h w a y s f r o mc h lb - a f r o mc 1 1 la _ aa n df r o mc h lb _ b a tt h ee x c i t a t i o n w a v e l e n g t ho f6 4 8n n lt h ed y n a m i c a lb e h a v i o ro ft h em o n o m e r i cl h c i ih a s a nu l t r a f a s tc o m p o n e n to f3 6 7f s ，w h i c hi st h et i m ef o rt h ee n e r g yt r a n s f e r f r o mc h lb a a tt h ee x c i t a t i o nw a v e l e n g t ho f6 3 5n n lt h ec o m p o n e n to f2 8 5 f si nt h ed y n a m i c a lc u r v eb e l o n g st ot h et i m eo ft h ee n e r g yt r a n s f o rf r o mc h l b 3 a 3 a t6 5 7n r nt h ee n e r g yt r a n s f e ro fc h lb 6t a k e sp l a c ei n8 2 9f s t h e e n e r g yt r a n s f e r 丘d mc h la _ a c a nb eo b s e r v e dw i t h i n2 8 5p sa tt h ee x c i t a t i o n w a v e l e n g t ho f6 7 01 1 1 2 1 a n dw i t h i n2 3 p s a t6 6 4n i n t h et i m eo fe n e r g y t r a n s f e ro fc h la 4i s7 4 5f sa t6 7 6s i n t h ec o m p o n e n to f2 3p sa t6 8 1n i t l b e l o n g st ot h et i m eo f c h la 7 se n e r g yt r a n s f e r a tt h ee x c i t a t i o nw a v e l e n g t h s 6 9 1n ma n d6 9 8 眦t h e d y n a m i c a l b e h a v i o r sh a v et h eu l t r a f a s tc o m p o n e n t so f 8 1 0f sa n d1 7 0f s ，r e s p e c t i v e l y t h er a t eo f t h ee n e r g yt r a n s f e rf r o mc h lb - b i sm u c hs l o w e rt h a nt h a tf r o mc h lb _ a a tt h ee x c i t a t i o nw a v e l e n g t ho f6 4 8 n mt h ec o m p o n e n to f1 4 3p so ft h ed y n a m i c a lc u r v ep e r h a p sb e l o n g st ot h e t i m ef o r t h ee n e r g yt r a n s f e rf r o mc h b b 5 t h ed y n a m i c a lc l v e so f t h em o n o m e r i cl h c i ie x c i t a t e da tw a v e l e n g t h sf r o m 6 10t o6 4 8n n ls h o wah i g h e re n e r g ys t a t eo ft h ec h l o r o p h y l l s a b s o r p t i o no f e x c i t e ds t a t ec a nb es e e ni nt h e s ec u r v e sw h e nt h ee x c i t a t i o nw a v e l e n g t hi s b l u e - s h i f t e dt o6 1 5a n d6 1 0n m ，a n di tw i l ld i s a p p e a rw h e nt h ew a v e l e n g t hi s s h i r e dt o6 2 5n n ao rt or e ds i d e f r o mt h ec a l c u l a t i o no f t h e a n i s o t r o p yo f t h e 。 摘要a b s t r a c t l h c l lw eg o tt h er e s u l t st h a tt h ev a l u e so fa n i s o t r o p yd e c r e a s es l o w l yf r o m t h e i n i t i a l0 5 t 0 0 4 2a t3 p s k e y w o r d s ：b a c t e r i o r h o d o p s i n ；l h c i i ；u l t r a f a s td y n a m i c s ；f e m t o s e c o n dl a s e r ； p u m p - p r o b et e c h n i q u e - v - 绪论 绪论 光是地球上一切生命的能量来源。生物在长期的进化过程中，形成了对光能 高效利用的特殊结构。高等植物的捕光复合物l h c i i 和嗜盐菌的紫膜就是很好 的例子。它们都能俘获光子，并通过能量传递，最终将光能转化成化学能，供生 物体的生命活动所需。 紫膜是一种光能转换膜。它是嗜盐菌质膜的一部分，因含有菌紫质( b r ) 而 呈现出紫色。b r 与视紫红质类似，属于视黄醛类蛋白。每个b r 分子由七条跨膜 的a 一螺旋组成，并结合有一分子的视黄醛。视黄醛通过希夫碱基与蛋白的一个 赖氨酸残基相连。因为视黄醛分子能够发生光异构化，所以，当b r 吸收一个光 予后，视黄醛围绕c 1 3 = c 1 4 从全反式变为1 3 顺式，同时，将光能储存起来。接 着，b r 通过一系列的中间体，弛豫回到基态，这就是b r 的光循环。另外，b r 具有质子泵功能：伴随b r 的光循环，质子从细胞内转移到细胞膜外，形成了质 子的跨膜电化学梯度。嗜盐菌利用这种电化学能合成a t p 。b r 光循环的原初反 应是一个飞秒量级的过程。 高等植物的捕光复合物l h c u 中含有叶绿素分子。叶绿素是生物中最常见 的色素分子，能够捕获光能，并进行能量传递和电子传递等。l h c i i 的叶绿素分 子包含叶绿素a 和b ，它们通过一定的排列结构，使色素分子之间能进行有效的 能量传递。这些能量传递的过程通常都发生在亚皮秒的时间范围。 飞秒激光器的出现，为人们提供了一种研究超快过程的犀利武器。泵浦探 测技术可以用来描述分子的激发态性质。我们利用飞秒泵浦探测来研究生物蛋 白分子的超快响应过程。b r 的光循环是嗜盐菌利用太阳光光能的关键所在，质 子泵的功能也在这个循环中得以完成。因此，如果能将b r 的动力学过程研究透 彻，必然使人们对其性质有更为清楚地认识。高等植物捕光复合物l h c i i 的能 量传递也是光合作用利用光能的第一步。通过飞秒泵浦探铡技术获得的时间分 辨光谱，可以更加清楚地了解这些超快的原初过程。 本论文的安排如下：第一部分是对菌紫质的原初反应的研究，首先，在第一 章介绍了b r 的结构和性质；第二章描述了b r 的光循环和质子泵功能；第三章 介绍了实验装置和方法：第四章说明了实验中所用的b r 样品的一些光学特性， 绪论 包括：光吸收、荧光谱和拉曼谱；第五章讨论了我们对b r 的超快过程的研究结 果：第六章简单讨论了b r 突变体和a r 4 的超快动力学。第二部分是我们对高 等植物捕光复合物l h c i i 的动力学研究结果。 第一部分第一章细菌视紫红质的结构和性质简介 第一部分细菌视紫红质的超快过程研究 第一章细菌视紫红质的结构和性质简介 b r ( b a c t e d o r h o d o p s i n ) 是嗜盐菌( h a l o b a c t e r i u mh a l o b i u m ) 紫膜( p u r p l e m e m b r a n e ) 上的唯一的蛋白质( 图1 ) 。该蛋白质与视紫红质类似，故称为细菌视 紫红质( 简称：菌紫质) 。天然的菌紫质利用太阳光能驱使质子从细胞内侧向外 侧进行跨膜转移。由于细胞膜的屏障作用，质子在膜的外侧积累，从而形成电化 学梯度。嗜盐菌便利用这种化学能合成a t p ，供其生理活动所需。 第一节嗜盐茵的生理特性和菌紫质的产生 在长期的实践中，人们发现腌制鱼时，经常有红色的成片的膜斑出现。研究 表明：这就是嗜盐菌。嗜盐菌是一种极端微生物，生活在高盐浓度的环境下。在 咸水湖、盐田中，都能找到它们。嗜盐菌的细胞呈杆状、椭圆形或棍棒形，直径 约0 5 微米，长4 - - 1 0 微米，并且有鞭 毛可以游动。3 9 0 c 下，其增殖时间一 般为7 8 小时。 嗜盐菌属于原核微生物，依靠氨 基酸作为主要的碳源。二羧酸氨基酸 在其总的蛋白质抽提物中占有相当高 的比例。嗜盐菌的细胞壁仅含有 1 0 - 1 2 的碳水化台物和分子量为2 0 万的单一糖蛋白( m e s e h e re ta l ，1 9 7 6 ， 1 9 7 6 ) 。嗜盐菌的细胞膜上含有类胡萝 h 素和其他的非极性脂，约占总脂量 的7 - - 1 0 0 o 。细胞膜上也含有细胞色素 b 和细胞色素c ，以及细胞色素氧化酶 圈1 b r 的分子结构 的呼吸链。嗜盐菌细胞内的盐浓度维持在相当高的水平，可以是等于或高于周围 介质中的盐浓度。其内在的阳离子主要是钾离子。与此相适应的是，嗜盐菌细胞 内的蛋白质对高浓度的盐具有较强的耐受性。 第一部分第一章细菌视紫红质的结构和性质简介 嗜盐菌的膜电位的产生，主要是由于光或者呼吸作用过程中驱使质子从细胞 内向细胞外跨膜转移形成的。细胞膜对离子的低通透性，使得被转移到膜外的质 子在细胞外积累，浓度增加，形成较高的电化学梯度。 嗜盐菌的野生型菌株通常都含有膜被的气泡。这些膜厚度为2 0 埃，仅由蛋 白质组成，而且具有规则的晶格结构。气泡可以调节嗜盐菌在溶液中的深度，以 获得最佳的氧浓度和光照强度。当气泡的体积达到最大时，嗜盐菌便悬浮在溶液 表面。 嗜盐菌的细胞膜呈现紫红色，这是由于含有紫膜的缘故。在低氧浓度的条件 下，嗜盐菌能够大量产生紫膜，将太阳光能转化为化学能，维持其生理活动。在 人工培养过程的后期，在达到一定生长量的菌体浓度后，人们常常降低供氧量， 以获得高产率的紫膜。也就是说，如果将培养条件从高氧、黑暗变成低氧、光照， 则会大大增加这些细菌细胞中紫膜的含量，而细胞数及蛋白质浓度基本保持不 变。此时，嗜盐菌的细胞膜含有两种不同的成分：一种是具有类胡萝h 素的呈现 红色的膜，称为“红膜”：另一种是具有菌紫质的呈现紫色的膜，即“紫膜”。紫 膜与红膜共面，有相同的厚度。显然，紫膜是嗜盐菌的细胞膜中特化的部分，具 有与细胞膜其他部分所不同的结构、功能和特性。通过冰冻刻蚀法，很容易鉴别 紫膜，因为紫膜的破碎面的结构与其周围的红膜的破碎面的结构明显不同。在细 胞质的一侧，紫膜破碎面比红膜的破碎面显得平滑，并显示出菌紫质的有规律的 排列；在细胞膜的外侧，破碎面则完全平滑，只有当用小角阴影法及较高的分辨 率时，才能清晰地分辨出晶格的排列。然而，如果用电镜照片、闪光衍射图等方 法，却能清楚地显示这种晶格的结构。 为了更好地研究紫膜的结构和功能，人们通常将紫膜从嗜盐菌的细胞膜中分 离出来。这种分离出来的紫膜与完整细胞中的紫膜具有相同的形态特点。但是， 它们也有一些区别：紫膜碎片不卷曲。也不形成囊泡，多为圆形或椭圆形的平板 状结构，厚度为5 0 - - 6 0 埃，直径约为0 5 微米。然而，当嗜盐菌细胞含有高浓度 ( 占总表面膜的5 0 或更多) 的紫膜时，从中分离得到的紫膜碎片具有较为复杂 的形状。干燥的紫膜的外表面上，沿着晶胞线常出现裂纹。而且，分离的紫膜碎 片的细胞质一侧的表面常有凹陷。如果用小角阴影法及负染色法制各样品，可以 清晰地辨认膜片上的晶格的结构。膜中蛋白晶格是刚性的，所以，b r 在膜中的 第一部分第一章细菌视紫红质的结构和性质简介 运动受到很大的限制。分离的紫膜含有2 5 的类脂和7 5 的蛋白质( 重量比) 。 通过对紫膜碎片的研究，结果说明紫膜具有脂双层的结构。其中的类脂成分与细 胞膜其它部分中所含的类脂非常类似，但是紫膜不含类胡萝卜索。另外，磷脂酰 硫酸甘油和糖脂硫酸是紫膜所特有的类脂，约占总脂类含量的1 5 。其他的类脂 与红膜中的比例基本一致。紫膜中蛋白质的含量较高，与脂类成分的重量比为 3 ：1 。s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果显示了只有一条蛋白带，这说明紫膜中仅 含有一种蛋白质，就是菌紫质( b r ) 。菌紫质在光照条件下，能够发生构象变化， 经历一系列的中间体完成光循环后，回到基态。在此光循环过程中，伴随有质子 从细胞内侧向细胞外侧转移。因为具有这种驱动质子转移的功能，它被形象地称 为“质子泵”。 第二节菌紫质( b r ) 的结构 菌紫质是一种整合膜蛋白，是嗜盐菌紫膜所含的唯一的蛋白质，分子量为 2 6 ，0 0 0 d a 。菌紫质由七条跨膜的a - 螺旋组成。而且，每个菌紫质分子含有一个 视黄醛( r e t i n a l ) 。视黄醛是生色团，使得紫膜呈现深紫色。视黄醛通过希夫碱与 赖氨酸残基相连。 1 b r 的一级氨基酸序列 大约在3 0 多年前，科学家在嗜盐菌( h a l o b a c t e r i u ms a l i n a r u m ) 中发现了 b r 这种光驱动的质子泵。在1 9 7 9 年，o v c h i n n i k o v 研究小组( o v c h i n n i k o v ，1 9 7 9 ) 和k h o r a n a 小组( k h o r a n a ， 1 9 7 9 ) 首次发表了他们对b r 的 氨基酸序列测定的结果。菌紫质 分子由2 4 8 个氨基酸残基组成， 分子量约为2 6k d a 。人们已经 得到b r 的一级结构，图2 ( b i r g e ， 1 9 8 9 ) 展示了b r 跨膜七次。g t 螺旋是菌紫质的主要结构。这七 条泓螺旋依次被命名为：a 、b 、 c 、d 、e 、f 和g 螺旋。a 螺旋 图2 b r 的氨基酸序列 第一部分第一章细菌视紫红质的结构和性质简介 上的氨基酸残基可以用序号来表示。b r 蛋白质的c 端在细胞质一侧，n 端则伸 展到细胞膜外。在菌紫质中，不含有半胱氨酸，但疏水氨基酸的含量较高 ( s t o e c k e r t i u s ，1 9 7 9 ) 。其中，极性氨基酸占3 8 ，非极性氨基酸占6 2 。螺旋 主要是由一级氨基酸序列中的疏水区段组成的。 通过与s h r 和p h r 的一级结构的比较，b r 与它们之间有2 5 的同源性，跨 膜区段有3 6 的保守氨基酸，而松散肽段的保守氨基酸比例小于1 9 。在b r 分 子中，c 螺旋含有质子受体基团( a s p 8 5 ) 和质子给体( a s p 9 6 ) 。在靠近细胞 外侧，b r 中的a r g - 8 2 、o l u 一1 9 4 、g l u - 2 0 4 和几个结合水分子共同组成了质子 释放复合体。另外，在b r 中有几个高度保守的氨基酸，如：a s p 2 1 2 和a r g 8 2 ， 它们起着稳定质子化的希夫碱基的作用。其他的一些氨基酸( a r g 、1 h 和s e r ) 也是保守的。 2 b r 的二级结构和三级结构 d 用光谱法和低分辨的电子衍射法 就能够清楚地显示紫膜中b r 的二维 晶格排列。这些结果说明b r 蛋白质七 次跨膜，故菌紫质的二级结构主要由小 螺旋组成( 图3 ) 。紫膜悬浮液的紫外 园二色性表明洳螺旋含量高达 7 0 0 0 - 8 0 。h e y n ( h e y n ，1 9 8 8 ) 和a g a r d ( a g a r d ，1 9 8 2 ) 报道了七个跨膜的洳 螺旋在紫膜表面的排列顺序。他们的结 果表明：从细胞质一侧看，七个跨膜的 d - 螺旋( a - g ) 按照顺时针顺序排列。 b r 除了旺螺旋结构外，在各a 螺旋的连接处存在着柔软的松散肽段。 虽然上述方法能够较好地探测出b r 图3 b r 的二级结构 第一部分第一章细菌视紫红质的结构和性质犄介 - 的二维空间结构，但是，缺乏三维信息成为这些方法的广泛应用的限制因素。所 以。人们采用晶体显微镜法，将分辨率从7 埃提高到3 5 埃( h e n d e r s o n , 1 9 9 0 ； c r c i g o r i e i f , 1 9 9 6 ) 。近来，有人利用一种新的结晶方法在脂相中得到三维的高度有 序的微晶( p e b a y - p e y r o u l a , 1 9 9 7 ) 。这种新的晶体生长法有利于获得更高的分辨 率，最近的b r 的结构分辨率是1 5 5 埃( l u e c k e , 1 9 9 9 ) 。从x 射线衍射图的信 ：矗 息中可以分析得到：b r 蛋白质中含有高含量的- 螺旋，这些口螺旋的长度约为 4 0 埃，其长轴几乎垂直于膜表面。图3 ( b i r g e ，1 9 9 9 ) 说明了b r 蛋白质的跨膜 螺旋的排列顺序及各螺旋之间相互的位置关系。 3 8 r 在紫膜上的空间结构 通过电镜照片可以看到：b r 在紫膜碎片上具有有序排列的六角形晶格形状。 这个特点在膜片的x 射线衍射图中更 加明显。b r 分子在紫膜上形成三聚体 ( 图4 ) ，而在b r 三聚体之间以及三 体中的b r 蛋白分子之间充满了脂双 层( s t o e c k e n i u s 。1 9 7 9 ) 。 长期以来，科学家对b r 的空间 结构、b r 的晶格排列和b r 三聚体的 结合方式及三聚体的协同作用进行 了深入的研究。1 9 7 5 年，h e n d e r s o n ( h e n d e r s o n ，1 9 7 5 ) 报道了利用电 子显微镜法对b r 的二维晶体的研究 结果。近年来，由于立体脂相结晶法 的发展，三维b r 结晶( l a n d a u ，1 9 9 6 ) 的获得提供了更详尽的结构信息。通 过立体脂相结晶法还可以得到样品 中b r 分子和脂双层的排列结构。科 学家根据含水的和空气中干燥的样图4 肌在訾膜上的空间排列 品的电镜照片的光衍射圈及x - 射线衍射图计算得出晶胞为6 3 埃 第一部分第一章细菌视紫红质的结构和性质简介 ( s t o e c k e n i u s 。1 9 7 9 ) ，进而，通过对晶格参数、膜密度的分析，已知脂蛋白比和 蛋白分子量，推论每个晶胞单元含有三个b r 蛋白分子和大约1 2 1 4 个脂分子。 更进一步的研究( h e n d e r s o n ，1 9 7 4 ：h a l t i a ，1 9 9 5 ) 表明：这些晶格主要是由于不 同b r 分子的b b 链之间和d d 链之间的相互作用的结果，导致了b r 分子三聚体 的产生，然后，这些b r 三聚体在紫膜上排列出六方晶格的形状。这种六方晶格 的结构对紫膜蛋白分子b r 的稳定性起着非常重要的作用。o h n o 等( o h n o ，1 9 8 1 ) 和t o k a j i ( t o k a j i ，1 9 9 3 ) 研究了b r 三聚体结构对b r 光循环中间体产生的一些影 响，认为三聚体内b r 分子间存在着协同作用。 4 视黄醛的分子结构和异构化 视黄醛是一种生色团。由于它的存在，紫膜呈现深紫色。根据变性后的b r 分子中的视黄醛提取量和蛋白质的分子量可计算得到视黄醛与蛋白质的摩尔比 为1 ：l 。这项研究揭示了：在紫膜中，每个菌紫质( 胩) 结合一个视黄醛( r e t i n a l ) 分子。 视黄醛是c 。的类胡萝p 素物质，与维生素a 的结构很相似。v 是视黄醇， 最大吸收波长在3 3 0n m 左右，而视黄醛的最大吸收波长是3 8 01 2 m 。从视黄醛的 分子结构示意图( 图5 ) 可以看出：每个视黄醛分子含有2 0 个碳原子。整个分 潍ml 撇 子由一个 六元环和 一条长的 碳链组成。 碳i 6 构 成六元环， 在碳5 和6 之间是c = c 双键，环内其他碳原子之间是c - c 单键。长的碳链中c c 和c = c 相问排列。碳1 上连接两个甲基，碳5 、9 、1 3 分别连接一个甲基，碳1 5 能与赖氨酸共价形成希夫碱。视黄醛属于多烯类，具有一种长链形的共轭双键结 构，故围绕单键和双键的转动( 或扭曲) 可以产生顺式与反式的异构体。主要的 异构体的类型包括：全反型、7 一顺型、9 一顺型、1 卜顺型、1 3 - 顺型和9 ，1 l 一二 顺型，l l ，1 3 一二顺型等。b r 中的视黄醛可以发生异构化，主要的异构体是从全 第一部分第一章细菌视紫红质的结构和性质简介 反式( a l l t r a n s ，1 5 - a n t i ) 异构化成1 3 一顺式( 1 3 一c i s ，1 5 - s y n ) ，反之亦然( 图 6 ) 。 视黄醛的异构体含有三个吸收带：一个强吸收带位于3 7 0n m 3 8 0n m ：另外 两个弱的吸收带为2 8 0n m 和2 5 0n m 。在7 7 k 下，全反型视黄醛和顺式异构体的 吸收波长都有1 4n m 的移动，摩尔消光系数则增加1 1 。视黄醛具有三个能量很 接近的低位单线态能级。双光子光谱的结果说明，全反型视黄醛的最低胍态是 1 a g 态。1 a g 态属于共价态，其价键结构具有少量的电荷分离。此外，1 a g 态 有高度相关性的电子构型，电子相互避开而减少了排斥。视黄醛的1 b u ”态是离 子态，其价键结构有高度的电荷分离，电子构型具有较少的相关性，故电子可沿 兀电子体系在不同区域进行堆积。视黄醛的质子化希夫碱可以沿着共轭双键的长 链进行电荷重组，这样可使离子态的1 b u ”更加稳定，进而引发能级次序的变化。 对于共价态的。a g 来说，受到多烯键极性的影响相对较少。视黄醛及其希夫碱 a b 图6 视黄醛分子的异构化 的最大吸收的部位和强度 是由视黄醛的 1 a g 一1 b u * + 的跃迁引起 的。在顺式的视黄醛异构 体中，1 a g 一1 a g ”的跃迁 相对全反式的视黄醛来 说，要强得多。这一点可 用来判断顺式视黄醛的存 在与否。对于瑚态，因为 视黄醛有很高的系间交叉 效率，所以n f 比较靠近 1 b u ”态。视黄醛的希夫碱 相对视黄醛而言觚态稍有蓝移。在质予化的希夫碱中，n 轨道转变为成键轨道， 因此，n 一兀。的跃迁可以蓝移到真空紫外区。 视黄醛的光异构化可以通过单线态也可以通过三重态进行，并且受到溶剂性 质和光波波长的影响。甲醇中的视黄醛的异构化是通过单线态进行的，而碳氢溶 剂中的视黄醛异构化则是通过三重态进行的。视黄醛的质子化的希夫碱没有系问 第一部分第一章细菌视紫红质的结橱和性质简介 交叉，所以它的光化学过程是通过单线态进行的。 5 视黄醛与去色团菌紫质的结合、解离及作用方式 在菌紫质中，视黄醛通过质子化的希夫碱结合到位于g 螺旋的赖氨酸残基 2 1 6 的一氨基基团上。紫膜在2 8 0r i m 附近有典型的蛋白质吸收，另外，在5 7 0 1 3 1 1 1 处有一个宽的吸收峰，在4 0 0n m 左右还有一个小的吸收带。如果破坏视黄醛 与蛋白质的相互作用，可见区的吸收带会消失。强的去垢剂引起b r 蛋白质变性， 使吸收带从5 7 0m 移到3 7 0n m 左右，而这正是前文所提到的去质子化的视黄醛 希夫碱基的最大吸收。天然的b r 蛋白质起着稳定质子化的希夫碱基的作用。在 去除视黄醛的b r ( 即：菌蛋白( b a c t e r i o o p s i n ) ) 溶液中加入稍过量的视黄醛 分子，5 7 0n m 处的吸收峰能在几分钟内恢复，说明视黄醛可以与去色团b r 蛋白 ( 菌蛋白) 在较短的时间内重组而转变回到b r ( o e s t e r h e l te ta l ，1 9 7 4 ) 。只有 1 3 一顺式和全反式视黄醛才能与去色团b r 蛋白有效地进行重组，所得到的不同产 物之间可以互相转化。它们慢慢地达到热平衡，之后就组成了暗适应的b r 。研 究( o e s t e r h e l te ta l ，1 9 7 4 ) 表明：光照条件下，1 3 一顺式的复合体能迅速地转 变成全反式复合体。此外，从天然的紫膜中抽提出来的菌紫质中只有全反式和 1 3 一顺式视黄醛的两种异构体。 一般地，p h 和盐浓度的变化对紫膜的吸收光谱或c d 谱以及晶体结构的影响 很小。这说明，视黄醛与菌紫质蛋白的结合是相当稳定的。在p h 4 以下时，可以 看到可见吸收带的红移和变宽：到p h 2 时，变化达到最大( o e s t e r h e l te t a l ，1 9 7 1 ) 。进步降低p h 至i o mh c i ，生色团缓慢地解体，但对吸收光谱没有 显著的影响( s t o e c k e n i u se l ：a l ，1 9 7 9 ) 。b r 对温和的去垢剂非常不敏感。室温 下，b r 能在1 0 的脱氧胆酸盐溶液中保存数天，而性质不变，仅在吸收光谱、c d 谱和膜片的晶格结构上表现出较小的变化( h w a n ge ta l ，1 9 7 7 ) 。t r i t o n x 一1 0 0 型的非离子去垢剂可以使膜解体，引起可见吸收峰的小的蓝移，但b r 仍然可以 进行光反应循环，只是动力学有所改变且它的稳定性有所下降( r e y n o l d s ，1 9 7 7 ) 。 在中性p h ，强去垢剂( 如：s d s 或c t a b ) 不仅溶解蛋白质，而且破坏生色团的二 第一部分第一章细菌视紫红质的结构和性质简介 级相互作用，导致希夫碱基缓慢水解，使可见吸收的峰值移到3 7 0n m 处。若存 在羟胺，则迅速形成视黄醛肟。在氢硼化钠的存在下，虽然希夫碱基被还原，但 视黄醛仍然与蛋白质稳定地连接着。与羟胺和氢硼化物的反应可以用来判断b r 中视黄醛异构体的存在以及形成希夫碱基的氨基酸残基。大多数的极性有机溶剂 的作用和强去垢剂相似，都可以不可逆地破坏生色团并引起视黄醛的释放。在适 当条件下，有些溶剂( 如：二乙基乙醚、二甲基甲酰胺、二甲亚砜) 可引起b r 的可见吸收峰可逆飘移到4 6 0n m 4 9 0n m ，同时，蛋白质的刚性结构松弛、旋转 运动增加( h e y ne ta l ，1 9 7 7 ) 。 菌蛋白的七条n 螺旋形成了中空的桶状结构，视黄醛被包埋其中( 图7 ) 。 通过1 5 5 埃分辨