（植物病理学专业论文）武夷菌素产生菌CK15细菌人工染色体（BAC）文库构建.pdf

摘 农用抗生素武夷菌素( w u y i e n c i n ) 是一种广谱、高效、低毒的核苷类农用抗生素，它对农作 物的白粉病、番茄叶霉病、番茄灰霉病等真菌病害有良好的防治效果。目前武夷菌素产生菌经过 诱变、原生质体融合等技术的改造后，其效价已经大幅度的提高，但仍不能满足大规模生产的要 求。因此鉴定、分离和克隆武夷菌素产生菌表达产物和调控相关的功能基因，并通过基因改良的 方式进行武夷菌素产生菌分子定向育种，来提高武夷菌素的效价及产量变得非常重要。 分离鉴定抗生素合成相关基因的传统策略有突变与互补基因分离、表达文库免疫筛选分离、 基因组文库筛选及抗性基因连锁标记的分离等，上述几种克隆抗生素合成基因的策略都需要构建 大片段基因组文库，如九噬菌体文库、c o s m i d 文库、f o s m i d 文库、y a c 文库、b a c 文库等。b a c 文库与其他几种文库相比具有容量适中、稳定性好、嵌合率低、容易分离等特点。成功构建b a c 文库是鉴定、分离和克隆武夷菌素合成相关基因的基础。 1 ：本实验测定了武夷菌素产生菌c k - 1 5 菌株的1 6 sr d n a 序列并构建系统发育树，分析后得 出：c k - 1 5 菌株与小白链霉菌( s t r e p t o m y c e s a l b u l u s ) 的1 6 sr d n a 相似性高达9 9 5 ，明确武夷 菌素产生菌c k - 1 5 菌株为小白链霉菌，暂定为小白链霉菌武夷变种( s t r e p t o m y c e s 口舾h 觑sv a t w u y i e n s i s ) 。 2 以武夷菌素产生菌c k - 1 5 菌株为材料，参照z h a n gh b 和m a r g h e r i t as 等的b a c 文库构 建方法，并作了一些改进，建立了一套高效的武夷菌素产生菌b a c 文库构建技术体系。体系包括 高分子量d n a 获得、部分酶切最佳条件的确定、片段大小选择的方法、高效的连接转化体系等。 3 利用所建立的高效b a c 文库构建技术体系，以p c c i b a c 为载体，构建了基因组覆盖率 6 4 5 倍的小白链霉菌武夷变种c k - 1 5b a c 文库，这是国内外首次构建小白链霉菌武夷变种进行 b a c 文库。小白链霉菌武夷变种c k - 1 5 菌株b a c 文库包含4 6 2 个b a c 克隆，随机挑取2 0 个白 色克隆进行n o ti 酶切分析表明文库克降的平均插入大小为1 2 1 k b ，空载率小于1 ，文库覆盖率 为9 9 8 5 。关于b a c 文库阳性克隆的筛选及进一步研究还需要在日后的工作中完成。 c k - 1 5b a c 文库的构建为开展武夷菌素产生菌重要性状基因的图位克隆、物理作图、基因组 测序、功能基因研究等应用提供了重要基因组资源，为使用基因工程手段对武夷菌素产生菌进行 分子定向育种奠定了基础。 关键词：武夷菌素，1 6 sr d n a ，高分子量d n a ，细菌人工染色体文库 要 a b s t r a c t a g r i c u l t u r a la n t i b i o t i c sw u y i e n c i ni s ak i n do fb r o a d - s p e c t r u m ，h i g he f f i c i e n c y ，l o wt o x i c i t y n u c l e o s i d ea g r i c u l t u r a la n t i b i o t i c s ，w h i c hc a nc o n t r o lf u n g u sd i s e a s e se f f e c t i v e l y t h ep r o d u c t i o no f w u y i e n c i n sp r o d u c i n gs t r a i n sh a sb e e ng r e a t l ye n h a n c e dt h r o u g ht h et e c h n i q u eo fm u t a t i o n ，p r o t o p l a s t f u s i o na n d8 0o n h o w e v e r ，i ts t i l lc a nn o tm e e tt h er e q u i r e m e n t so fl a r g es c a l ep r o d u c t i o n t h e r e f o r e ，i t i si m p o r t a n tt oi m p r o v et h ep r o d u c t i o no fw u y i e n c i n sp r o d u c t i n gs t r a i nb yt h em e t h o d so ff u n c t i o n a l g e n e si d e n t i f i c a t i o na n dm o l e c u l a rd i r e c t i v eb r e e d i n g t r a d i t i o n a ls t r a t e g i e st os e p a r a t ea n di d e n t i f yt h es y n t h e s i s r e l a t e dg e n e sa r et h a ts e p a r a t i o no f m u t a n ta n dc o m p l e m e n t a r yg e n e s ，i m m u n o s c r e e n i n go fe x p r e s s i o nl i b r a r i e s ，i d e n t i f i c a t i o nm o l e c u l a r m a r k e r sf i n k e dt or e s i s t a n c eg e n e s ，a l lt h e s en e e dt ob u i l dl a r g ef r a g m e n ti n s e r tl i b r a r i e so fg e n o m ed n a , s u c ha s 九p h a g el i b r a r y ，c o s m i dl i b r a r y , f o s m i dl i b r a r y ，y a c ( y e a s ta r t i f i c i a lc h r o m o s o m e ) l i b r a r y ， b a c ( b a c t e r i a la r t i f i c i a lc h r o m o s o m e ) l i b r a r y t h eb a cl i b r a r yc o m p a r e dw i t ho t h e r sh a ss u c h a d v a n t a g e st h a ti sm o d e r a t ec a p a c i t y ，g o o ds t a b i l i t y ，l o wc h i m e r i cr a t e ，e a s ys e p a r a t i o n i d e n t i f i c a t i o n ， s e p a r a t i o na n dc l o n i n gg e n e sr e l a t e db i o s y n t h e s i so fw u y i e n c i ni sb a s e do nt h es u c c e s s f u lc o n s t r u c t i o n o f a b a c l i b r a r y -、 1 i nt h i ss t u d y , 1 6 sr d n as e q u e n c eo fw u y i e n c i n sp r o d u c i n gs f f a i n sc k - 1 5a n dp h y l o g e n e t i c a n a l y s e sw e r ed e t e r m i n a t e d h o m o l o g ya n a l y s i ss h o w e dt h a tc k - 1 51 6 sr d n as e q u e n c eh a st h ei d e n t i t y o f9 9 5 w i t hs t r e p t o m y c e sa l b u l u s w u y i e n c i n sp r o d u c i n gs t r a i n sc k - 1 5w a si d e n t i f i e da s s t r e p t o m y c e sa l b u l u s ，a n dw a sn a m e da ss t r e p t o m y c e sa l b u l u sv a t w u y i e n s i s ( at e m p o r a r yn a m e ) 2 as e to fe f f i c i e n tw u y i e n c i n sp r o d u c t i n gs t r a i nb a c l i b r a r yw e r ec o n s t r u c t e d ，w h i c hi n c l u d e d s e p a r a t i n gh i g hm o l e c u l a rw e i g h td n a ，d e t e r m i n i n gt h eb e s td i g e s t i o nc o n d i t i o n s ，c h o o s i n gt h er e g i o n s i z e 3 as t r e p t o m y c e sb a cl i b r a r yw a sc o n s t r u c t e di nac o p y - c o n t r o l l a b l ev e c t o rp c c i b a cw i t h g e n o m i cd n a i s o l a t e df r o ms t r e p t o m y c e sa l b u l u sv a r w u y i e n s i s t h i sl i b r a r yc o n s i s t so fa b o u t4 6 2 c l o n e s n o tir e s t r i c t i o na n a l y s i so f 2 0w h i t ec l o n e sp i c k e dr a n d o m l yi n d i c a t e dt h ea v e r a g ei n s e r ts i z eo f b a cl i b r a r yi s1 2 1 k ba n dt h ef r e q u e n c yo fc l o n e sw i t h o u ti n s e r t si sl e s st h a n1 t h e o r e t i c a l l y , t h e p r o b a b i l i t yt of i n da n yu n i q u es e q u e n c ei nl i b r a r ys c r e e n i n gi s9 9 8 5 t h eb a cl i b r a r yp r o v i d e sa ni m p o r t a n tg e n o m i cr e s o u r c e sf o r m a p - b a s e dc l o n i n g ，p h y s i c a l m a p p i n g ，g e n o m es e q u e n c i n g ，f u n c t i o n a lg e n e sr e s e a r c h t h eb a cl i b r a r yi s af o u n d a t i o nf o rm o l e c u l a r d i r e c t i v eb r e e d i n go fw u y i e n c i n sp r o d u c i n gs t r a i n s k e yw o r d ：w u y i e n c i n ，1 6 sr d n a , h i 曲m o l e c u l a rw e i g h td n a ，b a cl i b r a r y i l 英文缩略表 v i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 己石萄 i 时间瓣v 。v占其 | 关于论文使用授权的声明 日 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科 学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不 同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 论文作者签名：吻移橱 1 一互v 导师签名： 帆郦年歹月罗日 时间：抛召年d 月 7 日 中国农业科学院硕士学位论文 第一章绪论 第一章绪论 1 1 农用抗生素发展概况 农用抗生素是指微生物产生的次级代谢产物，可用于防治农业上有害生物或调节作物的生长 发育的一类生物制剂。目前按农用抗生素的用途分类，可以分为畜用抗生素和植用抗生素两大类； 按作用功能分类，可以分为防病抗生素、杀虫抗生素和除草抗生素( 朱昌雄，2 0 0 4 ) 。 早期美国、英国、日本等先后把链霉素、土霉素、灰黄霉素等医用抗生素用来防治植物病害， 同时也筛选到了一批如放线酮( a c t i d i o n e ) ，抗霉素a ( a c t i m y e i na ) 以及一些多烯类抗生素 ( d e k k e r ，1 9 7 1 ) 。1 9 5 8 年日本s e t s u o 等人研制成功了杀稻瘟菌素( b l a s t i c i d i ns ) ，并于1 9 6 1 年 大面积应用于稻瘟病的防治，基本上取代了使用有机汞制剂来防治稻瘟病。杀稻瘟菌素s 的发现和 工业化，使农用抗生素的开发研究进入了新时期( 蒋细良，1 9 9 4 ) 。此后不久人们又研制出春日 霉素( k a s u g a m y c f i l ) 、多氧霉素( p o l y o x i n ) 、有效霉素( v a l i d a m y c i n ) 等高效、低毒、无公害 的农用抗生素( 这些抗生素绝大部分来自放线菌，其次是真菌和细菌) ( 李妲，2 0 0 3 ；沈寅初， 1 9 9 8 ) ，并且把农用抗生素的开发研究扩展到筛选微生物中杀虫、除草、抗病毒和调节植物生长 等生理活性物质的研究。 我国农用抗生素的研究始于2 0 世纪5 0 年代，之后相继开发出农抗1 0 1 、井冈霉素、多抗霉素、 农抗1 2 0 、内疗素、灭瘟素、春日霉素、庆丰霉素等农用抗生素( 曾广然，1 9 8 9 ；唐卓，2 0 0 1 ) 。 进入2 0 世纪9 0 年代后，农用抗生素的开发研究又进入一个新的发展高潮，中生菌素、宁南霉素、 武夷菌素等杀菌抗生素以及浏阳霉素、华光霉素和阿维菌素等杀虫抗生素先后开发成功( 谢德龄， 1 9 9 3 ) ，特别是阿维菌素的迅速推广应用，年产阿维菌素制剂量近万吨，并大量出口，开创了我 国农用抗生素的新时代( 庄锡亮，1 9 9 4 ；吴文君，2 0 0 4 ) 。 2 0 0 6 年数据显示我国登记注册的农业抗生素有2 4 个品种，其中防病农用抗生素1 5 种，杀虫农 用抗生素5 种，除草农用抗生素1 中，植物生长调节农业抗生素3 种。年产制剂超过8 万吨，年产值 超过2 3 亿元，约占农药总产值的8 左右，占生物农药总产值的9 0 左右( 朱昌雄，2 0 0 6 ) 。 随着社会的发展，人类对环境、生态认识的逐步提高，可持续发展观的深入人心，人们对农 药的认识也越来越深刻，不但认识到人类需要农药、而且需要低残留、不易产生抗性的产品。由 于农用抗生素不可比拟的优越性，已越来越受到人们的青睐。 1 1 1 农用抗生素的特点 农用抗生素作为生物农药，具有使用剂量低，环境相容性好，对人畜安全无毒，不污染环境， 无残留，能保持农产品的优良品质；生产原料和有效成分属于天然产物，能保证可持续发展；能 通过现代生物技术对发酵工艺和菌种进行改进，不断改进农用抗生素的性能，提高其品质；多种 因素和成分发挥作用，害虫和病原菌难以产生抗药性。同时生产原料以农副产品为主，资源广， 1 中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论 适于大规模的工业生产，在剂型j j n i _ k 也明显优于其它生物农药。 1 1 2 农用抗生素的品种 近2 0 年来，国内外发现了许多可以通过拮抗作用抑制植物病原菌生长的细菌和放线菌，它们 都能产生抗生素，可制备成微生物杀菌剂。据农业部农药检定所发布的2 0 0 3 年农药登记公告 显示：截至2 0 0 2 年我国已登记注册农用抗生素类品种有2 1 个，其中正式登记注册的品种有多氧菌 素( p o l y o x i n s ) 、有效霉素( v a l i d a m y c i n ) 、春雷霉素( k a s u g a m y c i n ) 、杀稻瘟菌素( b l a s t i c i d i n s ) 、农抗1 2 0 ( a g r i - a n t i b i o t i c l 2 0 ) 、农用链霉素( a g r i s t r e p t o m y c i n ) 和公主岭霉素 ( g o n g z h u l i n g r n y c i n ) 等7 个品种，临时登记注册的有阿维菌素( a v e r m e c t i n ) 、杀螨霉素 ( p o l y n a c t i n ) 、尼可霉素( n i k k o m y c i n ) 、多杀菌素( s p i n o s a d ) 、甲氨基阿维菌素 ( e m a m e c t i n b e n z o a t e ) 、有效霉素a ( v a l i d a m y c i na ) 、中生菌素( z h o n g s h e n g m y c i n ) 、武夷菌 素( w u y i e n c i n ) 、宁南霉素( n i n n a n m y c i n ) 、四霉素( t e t r a m y c i n ) 、多氧菌素a ( p o l y o x i n sa ) 、 金核霉素( j i n g h e m y c i n ) 、土霉素( t e r r a m y c i n ) 、双丙氨磷( b i a l a p h o s ) 等1 4 个品种。 有效霉素即井冈霉素，可以用于防治小麦纹枯病、水稻纹枯病和蔬菜根腐病等。有效霉素可 抑制病原菌中肌醇的生物合成，对纹枯病菌的海藻糖酶活性有强烈的抑制作用( 海藻糖是纹枯病 菌的主要储存糖；海藻糖酶能分解海藻糖为葡萄糖，使其能在菌丝体内运输) 。有效霉素能有效 地阻止纹枯病菌从菌丝基部向顶都输送养分，从而抑制病菌生长和发育( y a m a g u c h i ，1 9 9 0 ) ，现 已成为防治纹枯病的首选用药品种。 农抗1 2 0 又叫抗霉菌素1 2 0 ，它对多种真菌病害，如白粉病、炭疽病、枯萎病、纹枯病等有很 好的防效，增产显著。农抗1 2 0 能显著提高西瓜幼苗体内的过氧化物酶活性，而过氧化物酶活性的 高低与西瓜抗枯萎病能力成正相关，说明农抗1 2 0 是通过提高植株自身的免疫抗病能力而起到防病 治病作用的( 蒋细良，1 9 9 4 ) 。农抗1 2 0 自1 9 8 4 年工厂化生产以来，已在全国推广应用。 中生菌素可抑制病原菌菌体蛋白质的合成，并能使丝状真菌畸形，抑制孢子萌发并杀死孢子。 该药具有广谱、高效、低毒、无污染等特点，对多种细菌及真菌病害具有较好的防治效果。 尼可霉素属于核苷肽类抗生素，对真菌、昆虫和螨虫均有抑制作用，而对哺乳动物、蜜蜂和 植物无毒或者毒性极低并且在自然界中易降解，是一种较理想的农用抗生素。田间试验证明尼可 霉素对很多植物病害，如小麦自粉病、黄瓜菌核病、番茄叶霉病、烟草红斑病和苹果轮斑病等都 有很好的防治作用。尼可霉素与几丁质合成酶底物u d p n 乙酰葡萄糖胺结构类似，是该酶的强竞 争性抑制剂，导致敏感细胞几丁质不能合成而起到杀菌作用( h e c t o r ，1 9 9 2 ) 。 杀稻瘟菌素是一种核苷类抗生素主要用来防治水稻稻瘟病，对稻瘟病菌的孢子萌发，菌丝生 长，孢子形成具有强烈的抑制作用，研究表明杀稻瘟菌素能抑制肽基转移酶，从而抑制菌体蛋白 质的合成( b o w y e r ，1 9 8 1 ) 。 武夷菌素是由中国农业科学院植物保护研究所研究发现的一种具有自主知识的新型核苷类农 用抗生素。武夷菌素是一种广谱、高效、低毒的核苷类农用抗生素，它对白粉病、番茄叶霉病、 番茄灰霉病、黄瓜黑星病、大豆灰斑病、叶裸病、棉花立枯病、芦笋茎枯病、柑橘疮痂病等真菌 性病害有良好的防治效果( 黄仲生，1 9 8 5 ；杨洪文，2 0 0 2 ；马汇泉，2 0 0 2 ；孙延忠，2 0 0 3 ) ，同 时对作物生长还有一定的促进作用( 冉隆殉，2 0 0 5 ) 。武夷菌素为水溶性物质，其主要活性组分 2 中围农业科学院硕上学位论文第一章绪论 武夷菌素a 为一种结构全新的、具有胞苷骨架的核昔类抗生素，具有我国自主知识产权。毒性试 验表明，武夷菌素急性毒性属相对无毒，无明显蓄积毒性，无致畸、致突变效应，安全可靠。通 过同位素标记进行的作用机理研究表明，武夷菌素能干扰病原真菌蛋白质的合成，造成丝原生质 渗漏，致使菌丝畸形生长( 孙延忠，2 0 0 4 ) ，从而达到防治真菌病害的效果。 1 1 3 农用抗生素武夷菌素存在的问题 1 产业化水平低、使用成本高：目前市场上的农用抗生素产品，除有效霉素、阿维菌素的生 产企业具有一定规模以外，其他均为小企业，武夷菌素的生产企业也不例外。到目前为止只有山 东潍坊万胜生物农药公司一家企业生产武夷菌素，企业生产设备和条件差，资金和技术力量不足， 市场份额小，难于进一步发展。由于武夷菌素是通过微生物发酵生产制造出来的，产品质量、产 量受菌株生产能力及各种发酵条件的影响，而通过发酵条件优化、菌种诱变等方法对武夷菌素的 生产条件和菌株生产能力进行了优化，使得武夷菌素的效价有了一定程度的提高，但其生产成本 与化学农药相比没有优势，特别是与目前的复配农药相比处于明显劣势。 2 起效慢、田间效果不稳定：目前武夷菌素商品化的有水剂和粉剂两种产品，由于武夷菌素 是通过于扰病原真菌蛋白质的合成，造成丝原生质渗漏，致使菌丝畸形生长，从而达到防治真菌 病害的效果，与病原真菌接触后必须渗透到病原真菌内部后才能发挥效果，没有化学农药见效快。 武夷菌素在自然条件下容易分解，其田问药效维持时间比化学农药短，造成使用次数增加，当农 民未按其应用技术要求用药时，就易造成其田间效果不稳定；另外同一产品大量生产时，产品质 量控制水平不一致，造成制剂产品的理化指标和稳定性也存在问题，如含水偏高、颗粒粒度大、 悬浮率低、稳定性差等。 1 1 4 武夷菌素的研究方向 1 加强武夷菌素产生菌的选育与改良方面的基础研究工作：生产成本过高是限制武夷菌素大 规模生产以及在农药市场上竞争力差的主要因素之一。选育效价高、稳定性好的优良菌株是降低 生产成本，增强武夷菌素在市场上竞争力的最基础性工作。菌种选育的方法主要包括自然选育、 诱变育种、原生质融合和分子育种等，要加强在这方面的研究工作。 2 加强武夷菌素作用机理的研究：近年来，武夷菌素作用机制的研究虽然取得了不少进展， 但与医用抗生素的作用机理研究相比，无论是在方法上，还是在“研究模型”的建立方面，都存 在很大的差距。武夷菌素，针对不同的防治对象，其作用方式、使用方式和环境条件差异造成防 效不一致，而防治范围较窄往往是武夷菌素缺乏竞争力的主要原因之一。因此深入研究武夷菌素 的作用机理，不仅有助于制定武夷菌素筛选模型，还可以为武夷菌素的分子改造、耐药性的克服 提供理论指导，并根据其对防治对象的作用方式，增大武夷菌素的防治范围。 3 加强武夷菌素新剂型、复配等方法的研究：生产成本高、防效不稳定是制约武夷菌素产业 化和推广应用的主要因素，武夷菌素与化学农药混用或复配及武夷菌素纳米化是改善这一境况的 有效途径。纳米化的武夷菌素可以迅速进入病原菌内部，极大地提高了药效，并依托纳米物质的 表面效应( 粒度越小，比表面就越大) ，充分降低用药量，从而在使用经济性上得到突破。 3 中圈农、监科学院硕士学位论文第一章绪论 皇舅黧燃皇曼曼曼蔓曼笪i i i i i , , i i ii i , iiii|h i i 曼曼曼曼嬲蹩 4 加强武夷菌素结构改造的研究；武夷菌素由于稳定性、选择性、毒性、经济性等因素与化 学农药相比没有优势，但是武夷麓素具有低毒、高效、广谱，戈其是与环境裰容性良好，可戬利 用武夷菌素作为前体，改造武夷菌素结构，使其防治效果持效期延长、抑菌范围拓宽、抑菌效果 增强。 1 2 微生物的分类鉴定方法 1 2 1 微生物鉴定的依据 获得纯化的微生物分离菌株盾，首先判定是原核微生物还是真核微生物，这实际上在分离过 程中所使用的方法和选择性培养慕已经决定了分离菌株的大类的归属，从平板菌落的特征和液体 培养的性状都霹加以翔定。然后，懿是原孩微生物，便可根据魔示的经典分类鉴定指标( 令体、 形态特征、形态特征、莆养要求、生理生化特征、酶、生态学特性、血清学反应、噬菌体的敏感 性等) 进行黢定，如条件允许，可做碳源利用的b i o l o g g n 分析和1 6 sr d l a 序列分析。多项 结果结合起来确定分离德株的属稻种。 1 2 2 微生物鉴定的技术与方法 根据目前微生物分类学中使用的技术和方法，可把它们分成四个不同的水平：细胞形态和行 必水平，细臆组分水平，蛋盘质求平，基医组水平：在微生物分类学发震昭翠麓，主要的分类鉴 定指标是以在细胞形态和习性为主，可称为经典的分类鉴定法。其他三种实验技术主要是2 0 世纪 6 0 年代以后采用的，称为化学分类翻遗传学分类法，这些方法髯加上数值分类鉴定法，可稔为现 代的分类鉴定方法。 1 2 。3 遗传学分类法 分子遗传学分类法是以微生物的遗传型( 基因型) 特征为依据，判断微生物闻的亲缘关系， 排列出一个个的分类群。目前较常使用的方法有：d n a q b g + ct 0 0 1 分析，d n a - d n a 杂交， d n a - r r n a 杂交，1 6 sr d n a 寡核膂酸的序列分析。 1 2 41 6 sr d n a 序列分析 由于现代分子生物学技术的迅速发展，琵在形成一套与传统的分类鉴定方法完全不同的分类 鉴定技术与方法，从基因水平上分析各微生物种之间的亲缘关系，即系统发育地位。众所周知， 原核生物细胞中的1 6 sr d n a 的碱蒸序列都是十分保守的，不受微生物所处环境条件的变化、营养 物质的丰缺的影响而有所变化，都研以看作为生物进化的时间标尺，记录着生物进化的真实痕迹。 因此，分析原核生物细胞中的1 6 sr d n a 的碱基序列，比较所分析的微生物与其他微生物种之间1 6 s 4 中国农业科学院硕七学位论文第一章绪论 f d n a 序列的同源性，可以真实地揭示它们亲缘关系的距离和系统发育地位。在现实研究中，除了 选择1 6 sr d n a 作序列分析进行系统发育比较外，还可利用间隔序列、巢些发育较为古老而序列又 较稳定的特吴性酶的基因律序列分析，进行系统发育分析。如在环境徽生物研究孛，对予谷髋甘 肽转移酶的基因序列分析所获得的系统发育鉴定结果与用其他方法所获褥的结果具有十分吻合的 一致性。随着研究技术和理论的日趋成熟，现在有人提出了分子系统学( m o l e c u l a rs y s t e m a t i c s ) 这一瑾论概念。根据分离菌株酶1 6 sr d n a 穿刭与相关微生物耱之闻的霹源性，将分离获褥的菌株 放置于系统发育树的确当分支位置，以显示其在系统发育中的地位和与其他种间的亲缘关系。 1 3 链霉菌基因组研究进展 链霉菌( s t r e p t o m y c e t e s ) 是一种生活在土壤中的羿养革兰氏阳性菌属于放线 菌露( a c l i 鑫。糙y c e l a | e s ) ，链霉菌属( s t r e p t o m y c e s ) ( g a r r i t y ，2 0 0 3 ) ，链霉壤 属的特征是高g + cm 0 1 含鬟，大的线性染色体( 8 m b ) 。自从1 9 4 3 年w a k s m a n 和h e n r i c i 建立链 霉蒴属以来，其重要的应用价值越来越得到人们的重视，人们不断从中筛选出新 的抗生素、酶李枣裁裁、免疫镶节蠢| l 等等。嚣前已发现懿1 圭9 0 0 种抗生素中超过5 0 是由链霉菌产生的( k i e s e r ，2 0 0 0 ) ，其中许多抗生素在医药、农业及畜牧业中都 得到应用。除了制药相关的化合物外，链霉菌产生大量胞外水解酶使得它们在土 壤环境巾竞争营养处于优势。这些酶毽括淀粉酶、足丁厦酶、纤维素酶、巢胶酶、 木聚糖酶和蛋白酶，其中有一部分具有相当的商业潜力( i r i n a ，2 0 0 7 ) 。 天蓝色链霉菌( s t r e p t o m y c e sc o e l i c o l o r ) 是到目前为止研究链霉菌遗传最好 的模式菌株( h o p w o o d ，1 9 9 9 ) 。关于链霉菌遗传分化、抗生素和产生酶豹硒究可 以追溯到2 0 世纪5 0 年代初期。2 0 0 1 年7 月在英国剑桥s a n g e r 中心完成了天蓝色链霉 菌( 爱c o e l i c o l o r ) 的全基因组测序( b e n t l e y ，2 0 0 2 ) 。测序所用的菌株是m 1 4 5 ，其缺少质粒，内 天蓝色链霉菌野生菌株a 3 ( 2 ) 派生丽来的( w w w g a n g e r 。a c u k p r o j e c t s s - e o e l i c o l o r ) 。天蓝色链 霉荫( s c o e l i c o l o r ) 基因组全序列的发表进一步扩展了链霉菌的遗传信息并且得到 大量关于链霉蓠转录组学、蛋白质组学赫信息( h u a n gg ，2 0 0 1 _ ；h e s k e t h ，2 0 0 2 ；b u c c a ，2 0 0 3 ； n o v o t n a ；2 0 0 3 ) 。目前已经完成测序的链霉菌还有s t r e p t o m y c e sa m b o f a c i e n s ，s t r e p t o m y c e s a v e r m i t i l i s ，s t r e p t o m y c e sd i v e r s a ，s t r e p t o m y c e sn o u r s e i ，s t r e p t o m y c e s p e u c e t i u s 和s t r e p t o m y c e ss c a b i e s 等( o m u r a ，2 0 0 3 ：h t t p ：w w w 。g e n o m e s o n l i n e o r g s e a r c h c g i ) 。随着近2 0 年来d n a 克隆系统 的发展，链霉菌基因核苷酸序列数据稳步增多，早期研究确定了链霉菌高g + c m o l 含艇的密码予( b i b b ，1 9 8 0 ；s u a r e z ，1 9 8 0 ；t h o m p s o n ，1 9 8 0 ) 。利用链霉 蓥密码子高g + cm 0 1 会量这一特薤可以菲常容易懿利用f r a m e 程痔确定链霉蒲 基因组序列中的o r f s ( w r i g h t ，1 9 9 2 ) ；关予基因组的信息大量增长，这些信息描 述了链霉菌在不同时期的分子调节机制等等，特别是通过数学模型整合这魑已知 的数据将可以提取基因组数据库中更多鲍信怠。警蓠已经应瘸基因组刻度模型来研 究链霉菌代谢相关基因( t h o m p s o n ，1 9 8 0 ；i d e k e r ，2 0 0 1 ；s t e l l i n g ，2 0 0 2 ：c o v e r t ，2 0 0 4 ) 。 对比非病原链霉菌的基因组序列将可以得到关于病原链霉菌的重要信息，基因组 5 中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论 水平的比较可以用来研究基因组结构、系统发育、进化和基因调控等等。 在链霉菌基因组序列测定时使用的许多方法。测定c o e l i c o l o r 序列用构建c o s m i d 文库的方法，得到3 2 5 个重叠的克隆，其中3 0 5 个是c o s m i d 克隆，1 个是包含染色体 末端反向重复序列的质粒克隆，另外1 9 个来源于b a c 克隆。有序的c o s m i d 文库和b a c s 在m t u b e r c u l o s i s 全序列测定中同样起着重要作用( b r o s c h ，1 9 9 8 ) 。由于在每个细胞中 只有1 2 个复制，b a c s 可以避免c o s m i d 中潜在的克隆高复制数，如不稳定插入、d n a 片段间重组和致死基因过量表达等。另外，在阿维链霉菌s a v e r m i t i l i s 基因组序列测 定中采用了全基因组鸟枪法结合c o s m i d 末端序列的方式，精确测定c o s m i d 克隆d n a 重复区域 ( o m u r a ，2 0 0 1 ) 。 链霉菌的基因组是目前已知最大的原核生物基因组。在天蓝色链霉菌( & c o e l i c o l o r ) 全长 8 6 6 7 5 0 7 b p 基因组中确定有7 8 2 5 个基因，其中只有5 5 个基因被预测是假基因( b e n t l e y ，2 0 0 2 ) ，而 在另一种链霉菌& a v e r m i t i l i 超过8 7 0 0 0 0 0 b p 的基因组中约有7 6 0 0 个基因。链霉菌基因组大小约为原 核生物mt u b e r c u l o s i s 和ec o l d 的两倍，链霉菌基因组中的开放阅读框( o r f ) 比真核生物酵母 ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 基因组中的0 r f 还要多( o m u r a ，2 0 0 1 ；r e e d ，2 0 0 3 f o r s t e r ，2 0 0 3 b o r o d i n a ，2 0 0 5 ) ( 见表1 ) 。 表1 基因组特征比较 t a b l e1c o m p a r i s o no ft h eg e n o m ec h a r a c t e r i s t i c s 目前普遍认为，链霉菌线状染色体是线状质粒和原始环状染色体重组的结果( v o l f f ，2 0 0 0 ) ， 链霉菌染色体富含次生代谢和调控链霉菌中某一特定次生代谢途径相关的基因，通常以基因簇 ( c l u s t e r ) 的形式存在线状染色体上，链霉菌基因组富含次生代谢物合成基因簇。如c o e 矗c o l o r 基因组中有2 3 个参与形成次生代谢产物的基因蔟，约占基因组总量的5 ( c h a l l i s ，2 0 0 3 ) ， a v e r m i t i l i s 中则有3 0 个次生代谢基因簇，占全基因组的6 6 ( i k e d a ，2 0 0 3 ) ，分析链霉菌基因组数据 显示，其所编码的次生代谢途径远比我们目前已知的要多。过去2 0 年取得的宝贵资源，结合新兴 的基因数据，可以用来分析涉及链霉菌形态分化、次生代谢等方面的功能基因。 链霉菌基因组同样富含编码调控蛋白的基因，如c o e l i c o l o r i 编码9 6 5 种参与遗传调节的蛋 白，占整个基因组的1 2 3 。在c o e l i c o l o r 中这种超级编码能力由膨化蛋白家族组成，涉及调节、 转运和降解胞外营养物质的蛋白。链霉菌这种基因组构成特点与其生存在高度竞争的土壤环境相 适宜，土壤中存在各种胁迫压力( 化学、物理和生物的) ，而链霉菌是静止生物，面对胁迫相对被 动( c h a l l i s ，2 0 0 3 ) 。因此，链霉菌除产生抗生素抑杀“异己”外，其基因组富含编码调控、转录 蛋白的基因有利于其感应各种环境信号和生理信息并作出反应，行使各种复杂功能，从而在具有 6 中国农业科学院硕上学位论文第一章绪论 高度竞争的土壤环境得以良好的生存( 吴雪昌，2 0 0 5 ) 。 链霉菌的基因组序列还为研究人员了解链霉菌的生活方式提供了新的线索。不同寻常的是， 天蓝色链霉菌许多基因编码的是有助于运输材料进出细胞的蛋白质，这使得天蓝色链霉菌成为可 以应付多种土壤条件和食物来源的“多面手”。也许最令人惊异的当属发现了一组正常条件下编码 用于形成气囊( g a sv e s i c l e ) 蛋白的基因，气囊通常被水生细菌用作产生浮力。d a v i dh o p w o o d 认 为，编码气囊蛋白基因的发现是“最最奇妙的事情”，他推测：气囊有助于链霉菌的孢子生存于富 氧的湿地土壤表面。经过特别设计的链霉菌株系可以使研究人员将链霉菌以及其它细菌生产的各 种基础抗生素结合起来，制成新型的混合抗生素。 & c o e l i c o l o r 是一种具有典型的遗传特性和遗传可操控性的链霉菌，它很大程度的推动了遗传 信息与生物功能之间综合的关联性，与& c o e l i c o l o r 同一种属的病原菌膨t u b e r c u l o s i s 和肱l e p r a e 的 基因组全序列测定也已经完成了( c o l e ，1 9 9 8 ；c o l e ，2 0 0 1 ) ，比较这些致病菌和非致病菌基因序 列的差异，可以( 分离特殊致病基因序列) 提供重要的关于发病机理的本质信息。 1 4 抗生素生物合成基因簇分离克隆策略 分离鉴定抗生素合成相关基因的传统策略包括：突变与互补基因分离、表达文库免疫检测分 离、基因组文库筛选及抗性基因连锁基因分离等。突变与互补基因分离主要适用于遗传操作方法 成熟的微生物；表达文库免疫检测分离必须首先分离纯化合成酶，并制备抗体筛选d n a 表达文库， 用该方法克隆得到的抗生素合成基因簇有g r a m i c i d i ns 合成基因簇( k r a u s e ，1 9 8 5 ；k r a u s e ，1 9 8 8 ； k r a t z s c h m a r ，1 9 8 9 ) ，b a c i t r a c i na 合成基因簇( p o d l e s e k ，1 9 8 7 ；p o d l e s e k ，2 0 0 0 ；n e u m u l l e r ， 2 0 0 1 ) 等；抗体筛选表达文库结合基因探针筛选基因组文库克隆了t y r o c i d i n e 合成基因簇( k r a u s e ， 1 9 8 5 ；m a r a h i e l ，1 9 8 7 ；m o o t z ，1 9 9 7 ) 等；基因组文库筛选需要合成酶基因座探针可通过合 成酶末端序列测定人工合成，也可以用保守核心序列做探针筛选基因组文库，利用该方法已经得 到- j l i c h e n y s i n 、m y c o s u b t i l i n 和d a p t o m y c i n 的合成基因簇( k o n z ，1 9 9 9 ；d u i t m a n ，1 9 9 9 ；v i v i a nm ， 2 0 0 5 ) ；插入序列及其侧翼序列d n a 分子克隆也是一种有效的分离鉴定抗生素合成基因簇的方法， 利用该方法克隆得到的合成基因簇有很多种，如：s u r f a c t i n 合成基因簇( n a k a n o ，1 9 9 1 ；c o s m i n a ， 1 9 9 3 ；f a b r e t ，1 9 9 5 ) ，f e n g y c i n 合成基因簇( c h e ncl ，1 9 9 5 ；踟gh ，1 9 9 8 ；l i ntp ，1 9 9 9 ) ， l t u r i n 合成基因簇( t s u g e ，2 0 0 1 ) 等；抗性基因连锁基因分离即首先分离产生菌相应抗生素抗性基 因，再进一步鉴定抗性基因的侧翼d n a 序列，适用于抗性和合成相关基因紧密连锁的微生物如 s t r e p t o m y c e s ( d i s t l e r ，1 9 8 7 ；p i s s o w o t z k i ，1 9 9 1 ；m a n s o u r i ，1 9 9 1 ；d i s t l e r ，1 9 9 2 ：a h l e r t ，1 9 9 7 ) 。 上述几种克隆抗生素合成基因的策略都需要构建大片段基因组文库。大片段插入文库有入噬 菌体文库、c o s m i d 文库、f o s m i d 文库、酵母人工