（分析化学专业论文）酶生物传感器及酶联荧光免疫技术的研究.pdf

硕士学位论文 摘要 生物传感器在临床诊断、食品工业、环境监测及军事等领域具有广阔的应用 前景，因而引起了科研人员的广泛研究。但传感器的敏感膜的制各即生物分子的 固定化技术仍然是研制性能优良的传感器的关键。寻找新材料、新方法制各选择 性好，灵敏度高，响应快速的生物传感器一直是研究的热点。为此，本文开展了 以下四方面的工作： 1 研制了基于超薄二氧化钛膜固定辣根过氧化物酶的过氧化氢传感器。在b 一 巯基乙醇活化的金电极上通过异丙醇氧钛水解形成均匀的超薄二氧化钛膜，吸附 固定h r p ，以对苯二酚为电子媒介，对过氧化氢进行测定。用计时电流法对工作 电极的工作电位，对苯二酚的浓度等实验条件进行了优化。实验表明：此传感器 对过氧化氢表现出良好的电催化活性。在最佳实验条件下，线性范围为1 o 1 0 。 t o o l l 7 6 1 0 4 t o o l l 一，检测限为7 1 1 0 “t o o l l 。 2 通过气相沉积方法在玻碳电极表面形成二氧化钛溶胶凝胶，与n a t i o n 结 合，将电子媒介二茂铁和h r p 、g o d 同时固定到电极表面制成双酶葡萄糖生物 传感器。由于工作电位低，电活性物质如抗坏血酸、尿酸对测定无干扰。用该传 感器检测葡萄糖，其线性范围为5 0 x 】0 5t o o ll 一一1 5 1 0 。m o l 】- l ，检测下限】0 1 0 。5 m o l l 。 3 制各了电化学聚合阿魏酸膜修饰的金电极，研究了一种利用此修饰电极检 测神经递质多巴胺的新方法。结果表明：此修饰电极对多巴胺具有显著的催化作 用，在多巴胺浓度1 ，0 1 0 一1 0 1 0 。m o tl 。范围内与峰电流呈良好线性关系。 此修饰电极能有效抑制电活性物质抗坏血酸的干扰。 4 研究了采用阿魏酸作为h r p 底物的酶联荧光免疫传感体系，用于转铁蛋白 的测定。实验结果表明：用阿魏酸作为底物，克服了传统t m b 作为底物对过氧 化氢不够稳定、背景信号大的缺点。详细讨论了酶标物浓度，p h ，培育时间等实 验条件的影响。在最佳条件下，底物溶液的荧光强度与转铁蛋白浓度的对数在3 9 3 17 7 0 n g m l 内呈良好线性关系，线性相关系数为o 9 9 5 5 。此法初步用于血清样 品中转饺蛋白的测定，结果可满足临床分析的要求。 关键词：酶生物传感器：二氧化钛溶胶一凝胶；阿魏酸；酶联荧光免疫体系 酶生物传感器及酶联荧光免疫技术的研究 a b s t r a c t b i o s e n s o r sa r eo fp r a c t i c a l s i g n i f i c a n c e i n c l i n i c a l d i a g n o s i s ，f o o di n d u s t r y ， e n v i r o n m e n tm o n i t o r i n ga n dm i l i t a r ya f f a i r s ，s oe x t e n s i v er e s e a r c hh a sb e e nd o n e b y s c i e n t i s t si nt h i s f i e l d h o w e v e r ，t h ep r e p a r a t i o no ft h es e n s i t i v ef i l m i e t h e i m m o b i l i z a t i o no fb i o m o l e c u l e si st h ek e yt e c h n i q u e w i t ht h i si nm i n d ，f o u ra s p e c t s o ft h ew o r ki nt h e p r e s e n tt h e s i sh a v eb e e nc a r r i e do u t ： 1 ap r o c e d u r ef o rf a b r i c a t i n ga ne n z y m ee l e c t r o d eh a sb e e nd e s c r i b e db a s e do n t h ee f f e c t i v ei m m o b i l i z a t i o no fh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) t oa nu l t r a t h i nt i t a n i a l a y e rm o d i f i e ds e l f - a s s e m b l e dg o l de l e c t r o d e t h es t r o n ga f f i n i t yo ft h et i t a n i al a y e r f o rp o s i t i v e l yc h a r g e dh r p e n z y m eh a sb e e nu t i l i z e dt or e a l i z et h ei m m o b i l i z a t i o no f h r p e n z y m e t h er e s u l t i n ge l e c t r o d ee x h i b i t se x c e l l e n t e l e c t r o c a t a l y t i c a la c t i v i t yt o h y d r o g e np e r o x i d e i nt h e p r e s e n c eo fh y d r o q u i n o n ea s am e d i a t o r t h ea n a l y t i c a l c o n d i t i o n s ，s u c ha st h ea p p l i e dp o t e n t i a lo ft h ew o r k i n ge l e c t r o d e ，t h ec o n c e n t r a t i o n o fh y d r o q u i n o n ew e r es t u d i e di nd e t a i l b yu s i n ga m p e r o m e t r i em e t h o d u n d e rt h e o p t i m i z e de x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s ，t h el i n e a rr e s p o n s et oh y d r o g e np e r o x i d er a n g e d f r o m1 0 1 0 。6t o o l1 1t o7 6 1 0 。4m o l1 一a n dad e t e c t i o nl i m i to f7 1 1 0 7m o l1 1 w e r eo b t a i n e d 2 b i e n z y m es e n s o rh a sb e e np r e p a r e df o rg l u c o s ea s s a yb a s e do nc o m b i n i n g n a t i o nw i t ht i t a n i a s o l g e lp r e p a r e db yv a p o rd e p o s i t i o nm e t h o do ng l a s sc a r b o n e l e c t r o d e f e r r o c e n ea c t e da sa ne l e c t r o nm e d i a t o ra n dg o d ，h r pw e r ei m m o b i l i z e d s i m u l t a n e o u s l yi nt h er e s u l t i n gn a t i o n t i t a n i as o l g e lm o d i f i e de l e c t r o d e b e c a u s eo f l o ww o r k i n gp o t e n t i a l ，e l e c t r o a c t i v e s p e c i e ss u c ha sa s c o r b i ca c i da n du r i c a c i dd o n o tc a u s ea n yi n t e r f e r e n c e u n d e rt h # o p t i m i z e de x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s ，t h el i n e a r r e s p o n s et og l u c o s er a n g e df r o m5 0 x1 0 5m o l1 t o1 5 1 0 。3m o l1 1 a n dad e t e c t i o n 】i m i to f1 0 1 0 。m o l1 w e r eo b t a i n e d 3 p o l y ( f e r u l i ca c i d ) f i l m m o d i f i e d g o l d e l e c t r o d ew a s p r e p a r e db y e l e c t r o p o l y m e r i z a t i o n ，t h e e l e c t r o c a t a i y t i c r e a c t i o n i n v o l v i n gd o p a m i n e a tt h e f o r m e de l e c t r o d ew a si n v e s t i g a t e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ee l e c t r o d es h o w s e x c e l l e n te l e c t r o c a t a l y t i ce f f e c to nd o p a m i n e ，a n ds h o w sag o o dl i n e a rr e l a t i o n s h i p b e t w e e nt h e p e a k c u r r e n ta n dt h ec o n c e n t r a t i o no fd o p a m i n er a n g e df r o m1 0 。 l0 一一1 0 l0 。m o l1 m o r e o v e r t h e r e s u l t i n g e l e c t r o d ec a n s u p p r e s s t h e e l e c t r o a c t i v es u b s t a n c e ( a s c o r b i ca c i d ) t oac e r t a i ne x t e n t 硕士学位论文 4 af l u o r o i m m u n o s e n s i n gs y s t e mw i t ht h eu s eo ff e r u l i ca c i da st h es u b s t r a t e f o rt h ed e t e r m i n a t i o no ft r a n s f e r r i ni ns e r u ms a m p l e sh a sb e e n d e v e l o p e d t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tf e r u l i ca c i da st h es u b s t r a t ep o s s e s s e sab e t t e rs t a b i l i t yt o w a r d sh ，o ，a s c o m p a r e dt o t m b t h ea n a l y t i c a l c o n d i t i o n s ，s u c ha sp h ，t h ea m o u n to fl a b e l e d t r a n s f e r r i n ，i n c u b a t i o nt i m ea n d t e m p e r a t u r e w e r es t u d i e di nd e t a i l ，u n d e rt h e o p t i m i z e de x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s ，t h el i n e a rd e t e c t i o nr a n g e df r o m3 9 3t o 17 7 0 n g m l w a so b t a i n e d t h i s a p p r o a c h h a sb e e n a p p l i e d t oc l i n i c a l s a m p l e s w i t h s a t i s f a c t o r yr e s u l t s k e y w o r d s ： e n z y m eb i o s e n s o r ；t i t a n i as o l - g e l ；f e r u l i ca c i d ；e n z y m e l i n k e d f l u o r o i m m u n o a s s a ys y s t e m ； i l l - 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名：曾戾、 臼期：叫。埤r 月诺日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇 编本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：曹居j 、 , t r p 签名： 日期：硼 _ 耷 图1 4 夹心法示意图 3 竞争法 此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。以测定抗原为例， 将特异性抗体吸附于固相载体；加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者 竞争与固相抗体结合：经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含 量呈负相关。操作步骤：用已知特异性抗体包被固相载体：加待测抗原和一 定量的酶标抗原，培育，使二者与固相抗体竞争结合：洗涤，除去未结合的组分； 加底物反应，如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固 相上结合的酶标抗原量减少，从而实现定量的目的。 1 4 本文构想 蕊 i n c u b a t i o n 图1 5 竞争法示意图 结合现有文献报道及在本实验室原有研究的基础上，拟进行新的固定方法研 究，对以往固定方法进行改良或提高，着重从以下几个方面开展工作： ( 1 ) 运用表面溶胶一凝胶技术，在活化金电极表面形成一层均匀的具有良好 生物相容性的二氧化钛薄膜用来固定辣根过氧化物酶，以对苯二酚为电子媒介， 对过氧化氢进行测定。 ( 2 ) 与n a t i o n 结合，通过气相沉积方法在玻碳电极表面形成二氧化钛溶胶 凝胶，将电子媒介二茂铁和h r p 、g o d 同时固定到电极表面制备工作电位低，抗 干扰能力强的双酶葡萄糖生物传感器。 ( 3 ) 电化学聚合膜因其制备简单，膜的厚度可以由扫描圈数控制，拟制备+ 种可检测多巴胺含量的聚阿魏酸膜修饰电极，同时抑制电活性物质抗坏血酸的干 扰。 ( 4 ) 选用天然产物阿魏酸为h r p 底物，制各敏感层可再生的免疫复合物， 用于酶联荧光免疫体系，克服传统t m b 作为底物对过氧化氢不够稳定、背景信 号大的缺点。以转铁蛋白为模式免疫试剂建立一种新的酶联免疫方法。 霾 娄 霾 酶生物传感器及酶联荧光免疫技术的研究 第2 章超薄氧化钛膜固定酶的过氧化氢传感器研究 2 。1 前言 在传感器的制备过程中酶的固定是很重要的因素。目前常用的方法有共价法 和非共价法【6 弘“j 。近几年来，二氧化钛溶胶凝胶引起了分析化学家的广泛关注， 因为二氧化钛溶胶一凝胶有如下优点：( 1 ) 和不导电的氧化铝和氧化硅溶胶一凝胶 相比，二氧化钛是一种半导体材料，可以使电子受体还原，也可和生物分子之间 进行电子传递。( 2 ) 二氧化钛可与酶表面的氨基、羧基形成配合物。( 3 ) 二氧化 钛具有很好的生物相容性，作为添加剂已广泛应用于牙膏、化妆品及涂料的生产 中。二氧化钛溶胶凝胶与碳构成的复合电极成功用于n a d h 的测定，大大降低 了过电位 67 i 。y u 等人通过气相沉积方法形成多孔二氧化钛溶胶凝胶用于固定辣 根过氧化物酶构建的过氧化氢生物传感器很好的保持了酶的生物活性1 6 8 j 。在多孔 二氧化钛溶胶凝胶表面用聚吡咯膜包埋酶的葡萄糖生物传感器也有报道。二 氧化钛溶胶凝胶与树枝化合物结合构建的酪氨酸酶传感器也具有响应快，灵敏度 高，稳定性好等优点1 7 0 1 。 过氧化氢( h 2 0 2 ) 在纺织物的漂白、造纸业、食品处理及矿物石油化工等领 域中有重要作用，因此过氧化氢的测定具有实际意义。常用的方法有滴定法，光 谱测定法，化学发光法，高效液相色谱法和电化学方法7 “。其中，电化学方 法结合酶催化反应而制备的酶传感器被认为是一种很有潜力的测定过氧化氢的方 法 7 5 - 7 6 1 。本文试图通过表面溶胶凝胶过程在组装有巯基乙醇的金电极上制备均 匀的二：氧化钛薄膜来固定辣根过氧化物酶实现对过氧化氢的测定。用对苯：二酚作 为电子媒介，详细研究了工作电极的工作电位及底物溶液的浓度等实验条件对响 应电流的影响，结果表明此传感器具有响应快，灵敏度高等优点。 2 2 实验部分 2 2 1 试剂和仪器 辣根过氧化物酶( h r p ，e c 1 1 1 1 7 ，r z 3 0 ，a 2 5 0um g _ ) ，b 一巯基乙 醇购自于上海生物试剂公司，异丙醇氧钛( t i ( i p r o ) 4 ，9 8 ) 购自于a c r o s 。3 0 过氧化氢为上海桃浦化 厂产品，其它所有试剂均为分析纯，溶液用三次蒸馏水 配制。 支持电解质为含有0 1m o ll ok c i 的o 0 3 3t o o ll 。的磷酸盐缓冲溶液( p b s k h 2 p 0 4 + n a 2 h p 0 4 ) 。 1 n 硕士学位论文 循环伏安和计时电流实验都是用传统的三电极体系：修饰金电极为工作电极， 饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极，在p o t e n t i o s t a t ，g a l v a n o s t a t ( m o d e l 2 8 3 ，e g & gp r i n c e t o na p p l i e dr e s e a r c h ，p r i n c e t o n ，n j ，u s a ) 上进行的，所连接的 电脑采用4 3 0 版的m o d e l2 7 0 研究软件。进行计时安培电化学测定时，电解池 中溶液应采用磁力搅拌器不断搅拌。所有的实验均在室温下进行。 2 2 2h 2 0 2 传感器的制备 l 一簇 图2 1h 2 0 2 传感器制备过程的示意图 图2 1 是h 2 0 2 传感器制备过程的示意图。首先将金电极浸泡在p i r a n h a 溶液 ( 3 0 h 2 0 2 ：浓h 2 s 0 4 = l ：3 ) 中3 0 分钟，蒸馏水浴中超声清洗5 分钟，n 2 流干燥 后，浸入l0m m o li 1 的b 一巯基乙醇( 乙醇) 中活化1 2 小时，再用乙醇沈涤，n 2 吹干。然后将组装有b 一巯基乙醇的电极浸入t i ( i - p r o ) 4 溶液中3 分钟，再在水 中保持3 分钟后用n2 吹干。最后将得到的电极置于h r p 酶溶液( 5m g m l ，p h = 7 ) 中吸附3 0 分钟后，用水洗涤3 次。每一步骤后在含有0 ，lm o ll “k c i 的0 1 m o ll k 3 f e ( c n ) 6 溶液中进行循环伏安扫描。电极于p b s ( p h7 0 ) 中4 。c 下 保存。 2 3 结果与讨论 2 3 1h r p 酶电极制备过程的表征 图22 是会电极经过如上各步骤处理后在含有0 1m o ll 1k c i 的0 ，lm o ll “ k f e ( c n ) 。溶液中的循环伏安图。可以看到，当二氧化钛膜修饰到自组装电极 上后，氧化电流和还原电流同时降低，这可能是由于二氧化钛本身是一种半导体 材料当修饰到电极上后，在一定程度上抑制了伏安响应。但通过二氧化钛膜， 蛋白质就可以吸附到电极的表面【7 7 1 ，电流强度的进一步降低证明了h r p 酶已成 功固定到了电极的表面。而且实验表明此制备过程具有很好的可重复性。 k k咖黜汛 萋缸 监 爝 一 ! 篁k x剐黼刚溉 纩籍弛缸 掣 佩 咂姐嗯 嘶呱嘶慨嘶呱 纩惩k舢 卜 一 酶生物传感器及酶联荧光免疫技术的研究 图2 2 修饰金电极在含有0 1m o ll “k c i 的0 1m o l1 一k 3 f e ( c n ) 6 溶液中的循环伏安图 ( a ) ：p - 巯基乙醇修饰金电极：( b ) ：二氧化钛膜修饰自组装金电极；( c ) h r p 酶电极 2 3 2h 2 0 2 传感器的电化学特性 图2 3 是h r p 酶电极在含有1 0m m o l1 “对苯二：酚的0 0 3 3m o ll “p b s ( p h = 70 ) 中的循环伏安图( a ) ，( b ) 加入1 0m m o l1 h 2 0 2 。从图中可以看到加入1 0 m m o tl 。h 2 0 2 后，还原电流升高，氧化电流降低，表明在电极上发生了对苯二酚 的电催化还原反应，也表明二氧化钛膜很好地保持了h r p 的生物催化活r 眭。 图23h r p 酶电极在含有1 0m m o l1 。1 对苯二酚溶液的o 0 3 3m o l1 1p b s ( p h 70 ) 中的循 环伏安圄【a ) 未加入h 2 0 2 ( b ) 加入1 0m m o 1 h2 0 2 扫描速度：5 0m v s 1 2 毛_、毫】u h，芒ujj，o 硕士学位论文 曩_ 嘲霉暑鼻= 置= ! = 是毒鼍皂暑矗e 皇e 曩墨毫皇篁i _ - 岫_ e = 皇! ! 一衄 酶催化反应过程的机理如下 7 8 】： h r p ( f e ”) + h 2 0 2 一化合物( i ) + h 2 0 化合物( i ) + q h 2 一化合物( i i ) + q 化合物( i i ) + q h 2 一h r p ( f e 3 + ) + q + h 2 0 q + 2 e q h 2 化合物i ( 氧化态+ 5 ) 和i i ( 氧化态十4 ) 代表反应中的中间产物，q h 2 ，q 分别代表对苯二酚和它的氧化产物对苯醌。化合物i 被还原为化合物i i 之后，化 合物i i 通过氧化还原介质q h 2 而形成h r p ( f e ”) 的原始形式。对苯醌则在电极 上得到2 个电子而被还原为对苯二酚。 图2 4h r p 酶电极在舍有10m m o li “对苯二酚和0 2m m o l1 一h 2 0 2 溶液的0 0 3 3m o li 。p b s ( p h7 0 ) 中在不同扫描速度下的循环伏安图由内至外扫描速度依次为3 0 ，4 0 ，5 0 ，8 0 ，12 0 ， 15 0 ，2 0 0 m v s ；内为峰电流对v 17 2 图 图2 4 是酶电极在含有0 2m m o l