（生物化学与分子生物学专业论文）regγ的sumo化修饰及其功能研究.pdf

一一 e a s tc h i n an o r m a l u n i v e r s i t y s u m om o d i f i c a t i o no f r e g ? a n d i t s f u n c t i o n s d e p a r t m e n t ： m a j o r ： s c h o o lo fl i f es c i e n c e s u p e r v i s o r ： g r a d u a t e ： p r o f x i a o t a ol i y a nw h a p r i l2 0 1 1 3m m i 的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过 的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表 示谢意。 师指 作者签名：日期：2 0 1 1 年0 4 月0 8 日 华东师范大学学位论文著作权使用声明 本人同意华东师范大学根据相关规定保留和使用此学位论文，并向主管部门和相关机构 如国家图书馆、中信所和“知网”送交学位论文的印刷版和电子版；允许学位论文进入 华东师范大学图书馆及数据库被查阅、借阅；同意学校将学位论文加入全国博士、硕士 学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和摘要汇编出版，采用影印、缩 印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于( 请勾选) ( ) 1 经华东师范大学相关部门审查核定的“内部 或“涉密 学位论文掌， 于年月日解密，解密后适用上述授权。 ( 歹2 不保密，适用上述授权。 聊签名脾 6 。 j “涉密”学位论文应是已经华东师范大学学位评定委员会办公室或保密委员会审定过的 学位论文( 需附获批的华东师范大学研究生申请学位论文“涉密”审批表方为有效) ，未 经上述部门审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认为公开学位论文，均 适用上述授权) 。 嘉 毒胪 名 敞 m 人 本 华东师范大学 2 0 1 1 届研究生硕士学位论文 昱蘧硕士学位论文答辩委员会成员名单 姓名职称单位备注 翁杰敏教授华东师范大学主席 干平 教授华东师范大学 li 王传贵教授华东师范大学 届研究生硕士学位论文 。在过去几十年里， 尽管在肿瘤研究中取得令人鼓舞的进展，肿瘤的预防和治疗却尚未完善。最近几年来，研究发现蛋 白酶体抑制剂是一种有效而令人鼓舞的抗癌治疗手段。蛋白酶体是一种催化蛋白水解的复合体。而 i 也g 丫是一种l l s 蛋白酶体激活因子，它的许多生物学功能目前还不清楚。实验证明，r e 研蛋白酶 体能降解在乳腺癌中经常发生过表达的蛋白s r c 3 ，这提示i 也g 在肿瘤进展中具有调节作用。而 且有实验证实p 2 1 为r e c n , 蛋白酶体的另一个靶目标，揭示了i 垣g 吁可能在肿瘤形成各个阶段均 起着重要作用。因此，进一步认识r e c k 蛋白酶体将有助于发现新的肿瘤治疗方法。蛋白质翻译后 修饰是细胞内蛋白质发挥生物学功能的重要调节机制之一。s u l o 分子是一种泛素样分子，也参与 蛋白质的翻译后修饰。与泛素化不同的是，s u m o 化修饰并不介导靶蛋白的蛋白酶体降解，而是可 逆性修饰靶蛋白。现已有多项研究表明，s u m o 化修饰可以改变蛋白质的稳定性，并影响蛋白质的 定位、功能以及蛋白质之间的相互作用。 我们研究发现r b 研的s u m o 化修饰在体内和体外均能发生。于是我们用多种专业软件对r e ( 吖 氨基酸序列进行分析，并预测了多个潜在的s u m o 化修饰位点。s u m o 化修饰连接酶p l a s l 与r e c 坤 有着相互作用，而且能够促进其s u m o 化修饰。我们还发现r e c 叶的s u m o 化修饰发生在多个位 点，包括k 6 ，k 1 4 以及k 1 2 。通过对突变体的分析，我们发现这些s u m o 化修饰位点同时影响着 细胞内l 也c 吖的s u m o 修饰。s u m o 化修饰介导了r e c i 吖的亚细胞定位，并增加了这种蛋白酶体激 活因子的稳定性。因为s u m o 化修饰使得r e 研与p 2 1w 曩眦j p l 之间的相互作用减弱，所以s u m o 化 修饰缺陷型r e g 叶突变体表现出降解p 2 1 能力的下降。总体来说，我们发现了之前从未被报道的一 种调节蛋白酶体激活因子l u i c 叶活性的机制。这种调节机制可能使r 脚能够更为广泛的在蛋白质 降解过程中起到作用。 ：关键词：蛋白酶体，r e c e ，s u m o ，修饰，p i a s l 。 i i i 究生硕士学位论文 m o r b i d i t i e si nt h ew o r l da r ei n c r e a s i n g i nt h ep a s td e c a d e s ，c a n c e rr e s e a r c hh a sm a d e e n c o u r a g i n gp r o g r e s s ； b u tp r e v e n t i o na n dt r e a t m e n to fc a n c e r sh a v en o tb e e np e r f e c t e d r e c e n ty e a r s ，p r o t e a s o m ei n h i b i t o r sh a v e b e e ns h o w nt ob ea ne x c i t i n ga n de f f e c t i v et r e a t m e n tf o rc a n c 君l 5 p r o t e a s o m ei sac o m p l e xw h i c hc a n c a t a l y z ep r o t e o l y s i s r e o yi sall sp r o t e a s o m ea c t i v a t o r t h eb i o l o g i c a lr o l e so fr e o ya r ey e tt ob e e x p l o r e d w ep r e v i o u s l yd e m o n s t r a t e dt h a tr e 研p r o t e a s o m ec o u l dd e g r a d es r c - 3w h i c hi sa l lo n c o g e n e f r e q u e n t l ya m p l i f i e da n do v e r e x p r e s s e di nb r e a s tc a n c e r s i t ss u g g e s t e dt h a tr e o y 铆lr e g u l a t et h ep r o c e s s o ft u m o rd e v e l o p m e n t m o r e o v e r , w ea l s of o u n dp 21i sa n o t h e rt a r g e tp r o t e i no fr e c 吖p r o t e a s o m e ，w h i c h r e v e a l e di 淝g 丫a l s oh a dar o l ei nt h er e g u l a t i o no f t h ec e l lc y c l et h r o u g hi t sa b i l i t yt oi n f l u e n c et h el e v e lo f ac e l l - c y c l er e g u l a t o r ( s ) t h u sf u r t h e rs t u d i e so nr e c r y p r o t e a s o m em a yl e a dt on o v e lt h e r a p e u t i c sf o r c a n c e r p o s t t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o n sa r em o d i f i c a t i o n st h a tc e l l su s e dt oc o n t r o lt h ef u n c t i o no f p r o t e i n s s u m om o d i f i c a t i o ni so n ek i n do fp o s t t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o n s u m oi sas m a l lp o l y - p e p t i d ew h i c hi s s t r u c t u r a l l yr e l a t e dt ou b i q u i t i n u n l i k et h es i t u a t i o nw i t hu b i q u i t n a t i o n , s u m om o d i f i c a t i o nd o e sn o t a p p e a rt ot a r g e tp r o t e i n sf o rp r o t e a s o m e - m e d i a t e dd e g r a d a t i o na n di ti sar e v e r s i b l ep r o c e s s an u m b e ro f s t u d i e ss h o wt h a ts u m om o d i f i c a t i o nc a na l t e rt h es t a b i l i t yo f t h et a r g e tp r o t e i na n dw i l la l s oa f f e c tp r o t e i n s u b e e l l u l a rd i s t r i b u t i o n , p r o t e i nf u n c t i o n , p r o t e i n - p r o t e i ni n t e r a c t i o n i no u r 咖d yw ef o u n dt h a tr e 研c a nb es u m o y l a t e d nv i t r oa n d nv v o s ow ea n a l y z e dt h ea m i n o a c i ds e q u e n c eo fr e g 丫u s i n gd i f f e r e n tp r o f e s s i o n a ls o f t w a r ea n dp r e d i c t e ds e v e r a ls i t e sa sp o t e n t i a l s u m o y l a t i o ns i t e s t h es u m o - e 3p r o t e i ni n h i b i t o ro fa c t i v a t e ds t a to a i a s ) lp h y s i c a l l ya s s o c i a t e sw i t h 肛研a n dp r o m o t e ss u m o y l a t i o no fr e c f f s u m om o d i f i c a t i o no fr e c 吖w a sf o u n dt oo c c u ra tm u l t i p l e s i t e s ，i n c l u d i n gk 6 ，k 1 4 ，a n dk 1 2 m u t a t i o na n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h e s es u m os i t e ss i m u l t a n e o u s l y c o n t r i b u t e dt ot h es u m o y l a t i o ns t a t u so fr e 研i nc e l l s s u m om o d i f i c a t i o no fr s o rw a sr e v e a l e dt o m e d i a t es u b c e l l u l a rd i s t r i b u t i o no fp e c na n da l s oi n c r e a s e ds t a b i l i t yo ft h i s p r o t e a s o m ea c t i v a t o r s u m o y l a t i o n - d e f i c i e n tr e g rd i s p l a y e da t t e n u a t e da b i l i t yt od e g r a d ep 2l 咖忙i p ld u et or e d u c e da f f i n i t yo f t h er e c , rs u m o y l a t i o n - d e f e c t i v em u t a n tf o rp 21 t a k e nt o g e t h e r , w er e p o r tap r e v i o u s l yu n r e c o g n i z e d m e c h a n i s mr e g u l a t i n gt h ea c t i v i t yo ft h ep r o t e a s o m ea c t i v a t o rr e 研t h i sr e g u l a t o r ym e c h a n i s mm a y e n a b l er e o yt of u n c t i o na sam o r ep o t e n tf a c t o ri np r o t e i nd e g r a d a t i o nw i t hab r o a d e rs u b s t r a t es p e c t r u m k e y w o r d ：p r o t e a s o m e ，r e 研，s u m o ，m o d i f i c a t i o n , p i a s l i v 究生硕士学位论文 1 1 蛋白酶体降解系统。1 1 2l 也( 叶的结构及其生化特性2 1 3r e c r r 的生物学功能4 1 4i 也c 吖与癌症的关系5 第二节s u m o 化修饰及其功能的概述6 2 1s u m o 分子的发现及其结构7 2 2s u m o 化修饰过程及其酶。8 2 3s u m o 化修饰的生物学功能。1l 第三节本研究的理论依据与意义。1 2 第二章材料与方法1 3 第一节实验材料1 3 1 1 细胞1 3 1 2 细胞培养用试剂l3 1 3 主要试剂1 3 1 4 主要仪器。1 4 第二节实验方法1 5 2 1r e c r r 蛋白质序列的生物信息学分析。1 5 2 2 实验所需各类质粒的获得( 参考质粒抽提试剂盒说明书) 1 5 2 3 实验所需表达载体的构建1 5 2 4g s tp u l l d o w n 实验21 2 5 细胞培养与转染2 2 2 6 免疫荧光染色实验2 3 2 7 免疫印迹实验( w e s t e r nb l o t ) 2 5 2 8 免疫共沉淀实验( c o - w ) 2 6 第三章结果与分析2 7 第一节r e c r r 与p i a s1 的相互作用2 7 1 1 酵母双杂交实验发现r e c 吖与p i a s l 相互作用2 7 1 2 体外r e ( 计与p i a s l 的相互作用2 7 华东师范大学2 0 1 1 届研究生硕士学位论文 1 3 细胞内r e c e 与p i a s l 的相互作用2 7 第二节p i a s l 能够促进体内r e c 吖的s u m o 化修饰2 9 2 1r e c , t 的体外s u m o 化修饰2 9 2 2r e gy 在细胞内的s u m o 化修饰。2 9 2 3p i a s1 能够增强r e c , t 的s u m o 化修饰3l 第三节s u m o 化修饰对r e c , t 的亚细胞定位的影响3 2 第四节r e g _ 蛋白质序列的生物信息学分析。3 4 4 1r e g t 保守结构域的分析3 4 4 2i 汪g y 的s u m o 化修饰位点的预测。3 5 4 3r e g t 氨基酸序列在进化上的保守性分析。3 6 4 4 生物信息学分析结果的分析3 6 第五节r e ( 吖的s u m o 化修饰发生在多个位点3 7 第六节s u m o 化修饰对p e g t 蛋白质稳定性的影响3 9 第七节s u m o 化修饰对r e g t 降解蛋白功能的影响3 9 第四章讨论与展望4 1 附勇匙i 4 3 附录i i 4 7 参考文献。4 8 致 射。5 8 届研究生硕士学位论文 已经成为当今人 类社会的三大疾病之一。世界卫生组织发表的数据表明，2 0 0 8 年全球因癌症死亡人数达 到7 6 0 万，占所有死亡人数的1 3 ，到2 0 3 0 年癌症死亡人数可能超过1 1 0 0 万。而在我 们中国，癌症的发病率一直早上升趋势。过去的3 0 年，中国癌症死亡率上升了8 0 ， 已经成为中国城市和农村居民的第一死因。目前我国每年癌症的发病人数约为2 6 0 万， 因癌症死亡人数则约为1 8 0 万。正因为癌症对人类健康的影响日趋显著，癌症研究已经 成为了生物学研究的热点。在过去的几十年时问里，尽管在肿瘤研究中人们己经取得了 令人鼓舞的进展，但是肿瘤的预防和治疗却不甚完善。最近几年来，蛋白酶体( p r o t e a s o m e ) 抑制剂成为一种有效而令人鼓舞的抗癌治疗的方向。 第一节蛋白酶体激活因子r e g y 的概述 r e ( 吖，又称为p a 2 8 丫、l1 s y 或者是p s m e 3 ，最初是在系统性红斑狼疮病人的血清 中作为自身抗体的细胞核内靶蛋白被发现的，最早的时候被鉴定为k i 抗原【l 】。虽然k i 抗原和自身免疫综合症的联系很早就被阐明，但是在此之后k i 抗原被证实和r e g o 9 一样是蛋白酶体激活因子r e g 家族中的一员 2 ，3 】。r e g 是唯一能够非泛素非a t p 依赖 激活2 0 s 核心蛋白酶活性的蛋白酶体激活凶子家族 2 ，3 】。r e g a 和r e g b 已经被证明。町 以作为免疫蛋白酶体参与m h c i 类配体的抗原呈递【4 6 】。但是r e ( 计的生物学功能并 没有被人们充分认知。研究发现，r e g t 敲除小鼠的体型明显偏小，而且r e g t 敲除的 小鼠胚胎成纤维细胞在细胞周期过程巾被阻抑在从g 期进入s 期的阶段，这就表明 r e g 叶可能与细胞周期调控和细胞增殖有关【7 ，8 】。最近，有关r e ( 计的功能得到进一步 的研究，这些研究结果都表明r e g n 在细胞和人类疾病中所起的重要作用和角色。下面 将从几个方面对r e g t 进行简单概述。 1 1 蛋白酶体降解系统 人体组织细胞中存在着多种蚩白质降解途径。在蛋白质降解的过程中，相邻氨基酸 之间起到连接作用的肽键被水解，氨基酸单体被释放成游离状态，同时存在于肽键中的 生物能量也得到了释放。按照来源，可以将人体中的蛋白质分为外源性蛋白和内源性蚩 白。外源性蛋白在消化系统中被降解成为无免疫原性的氨基酸，然后被人体吸收，并用 来合成体内所需要的蛋白质。内源性蛋白质又可以分为细胞内蛋白和细胞外蛋白。细胞 外蛋白，例如免疫球蛋白、白蛋白等，可以通过胞饮作用和受体介导的吞噬作用进入细 华东师范大学2 0 l l 届研究生硕士学位论文 胞，然后直接被溶酶体降解。而细胞内蛋白则是通过蛋白酶体降解系统进行降解的。蛋 白酶体降解系统主要可以分为两类：泛素依赖性蛋白质降解途径和非泛素依赖性蛋白质 降解途径。由此可见细胞内蛋白质降解的核心就是蛋白酶体。 蛋白酶体( p r o t e a s o m e ) 是一种高度保守的多价催化蛋白酶复合物。其普遍存在于 真核生物和古细菌中的，也存在于部分原核生物中。在真核生物中，蛋白酶体广泛存在 于细胞质和细胞核内，主要作用是降解细胞不需要的或者是受到损伤的蛋白质。从结构 上看，蛋白酶体是一个桶状的复合物，包括一个核心结构和结合其卜的帽状结构。蛋白 酶体最普遍的形式是2 6 s 蛋白酶体，其分子量约为2 0 0 0 k d a ，包含一个2 0 s 核心颗粒和 两个1 9 s 调节颗粒。核心颗粒由四个环堆积而成，其中每一个环由七个亚基组成。中间 的两个环各由七个b 亚基组成，且分别具有谷氨酸肽水解酶( p g p h ) ，类胰蛋白酶和类 胰凝乳蛋白酶活性 5 ，9 】。环状结构使得核心颗粒中空，中间形成的空腔使靶蛋白能够被 围在其中降解。在外部的两个环各含有七个a 亚基，起到了“门 的作用，是靶蛋白进 入“空腔”中的必经之路。而这个“门”是由结合在它们上面的调节颗粒控制的，这些 调节颗粒我们也称为蛋白酶体激活因子。最为人们所熟知的调节颗粒就是泛素一一蛋白 酶体降解途径中的1 9 s 颗粒。真核生物中1 9 s 颗粒可以被分成两个部分：一个由1 0 个 蛋白质组成的可以与2 0 s 核心颗粒上的0 【环直接结合的基底，和一个由9 个蛋白质组成 的结合多泛素链的盖子。其中，1 0 个基底蛋白质中有6 个具备a t p 酶活性。1 9 s 和 2 0 s 颗粒的结合需要a t p 先结合到1 9 s 颗粒上的a t p 结合位点。a t p 的水解对于 蛋白酶体降解一个连接着泛素的折叠蛋白质是必不可少的。因此，泛素一一蛋白酶 体降解途径需要a t p 的参与才能够降解蛋白质。另外，除了1 9 s 调节颗粒以外，还存 在其他的蛋白酶体激活因子，例如：r e g - 邮( 又称p a 2 8 a 1 3 或者l l sa 1 3 ) ，r e 研，p a 2 0 0 ， p 1 3 1 等等。r e 研在“非泛素依赖性降解蛋白途径”中起着重要的作用 1 0 - 1 3 】( 在后文 中将详细介绍) 。同样，一些不对称的蛋白酶体复合物也由2 0 s 核蛋白酶体和其两端的 不同激活因子所构成。而且，在一些蛋白酶体同种型中发现，蛋白酶体激活因子被p c 5 3 0 蛋白复合物或多亚基蛋白c o p 9 复合体所替代 1 4 】。 1 2r e c , q , 的结构及其生化特性 前文中提到r e ( 吖属于r e g 家族。我们通常也将r e g 家族称为p a 2 8 家族或者是 l l s 蛋白酶体激活因子家族( 简称1 1 s 家族) 。在这一家族中，r e g a 和l 砸g b 在氨基酸 序列上有近5 0 的同源性，但是与r e g a 和r e g p 氨基酸序列相比，r e 研与它们只 2 2 0 11 届研究生硕士学位论文 有2 5 的同源性【1 5 】。i 岫的二级结构与i 也( 剐p 相似，具有四个3 3 4 5 氨基酸长度 的a 螺旋构成。其中，第二个螺旋和第三个螺旋之间的连接序列被称为“活性环” 1 5 】。 如果“活性环中的一个位点发生突变( n 1 5 1 y ) ，就会使r e 研失去活性。虽然发生 点突变的r e g r 仍然能够与核心蛋白酶紧密结合，但是却不能将其激活。这充分地说明 “活性环”在r e g v 激活蛋白酶体过程中的重要性 1 0 ，1 1 ，1 6 。另外，r e g a 和r e g d 可以激活并促进蛋白酶体三种酶活性，分别是降解疏水性、酸性以及碱性肽段；但是 一r e 研只能够促进碱性氨基酸的降解，并选择性的激活2 0 s 核心蛋白酶的类胰蛋白酶活 性，同时抑制2 0 s 核心蛋白酶的谷氨酸肽水解酶( p g p h ) 和类胰凝乳蛋白酶活性【1 7 ，1 8 】。 从盘基网柄菌分离得到的r e g 家族蛋白与k e c q 有着3 4 的相似性，但与r e g a 和 i 汪g p 相似性不高【1 9 】。同时，盘基网柄菌中的k e g 家族蛋白虽然具有激活2 0 s 蛋白酶 体的类胰凝乳蛋白酶和类胰蛋白酶活性的能力，但是其激活后者的活性远远高于前者， 这也进一步体现了r e g r 蛋白酶体激活能力的特异性 1 9 1 。 目前为止，人们并不清楚在k e g 家族蛋白的结构中是哪个区域造成了它们的差异 性。r e g 家族蛋白的n 末端、c 末端的序列和“活性环”侧翼氨基酸序列存在着多样 性。嵌合体研究表明，n 末端区域和位于“活性环”侧翼序列与r e g 多聚体的形成有 关，然而c 末端区域则影响着七聚体的稳定形成及其与蛋白酶体的结合【2 0 】。至今，我 们还没有发现这些不同的区域与k e g 选择性催化活性相关。但是，r e 研突变体 ( k 1 8 8 肋) 的催化活性却发生了改变。这种突变体不再只拥有单一的催化活性，而是 具有催化三种蛋白酶活性的能力【18 】。不过，k 18 8 e d 突变会使得r e c r t 七聚体稳定性 有所降低【1 8 】。更有意思的是，纯化后并通过硫酸铵沉淀后得到的重组r e ( 叶具有激活 三种蛋白酶体活性的能力【2 l 】。而这些重组r e g v 所形成的七聚体也表现出稳定性减弱 的现象。上述实验结果均告诉我们，r e c q 七聚体的稳定性和r e c , r 催化活性范围有着 负相关的联系。k e g v 不具有激活类胰凝乳酶和谷氨酸肽水解酶( p g p h ) 活性的能力，这 可能是在呦改变蛋白酶体构型时抑制了这些活性位点。这种选择性激活蛋白酶体催 化活性的特性是否具有某种特别的生理学意义至今还是未知的。 之前，人们认为r e 研只能够降解短肽【2 】。在最近的报道中，细胞内一些完整的蛋 白质同样也可以作为i 也研的靶蚩t 兰t 1 0 - 1 2 ，2 2 。但是，完整的蛋白是如何被去折叠化， 又是如何利用非a t p 依赖的方式进入到2 0 s 蛋白酶体中的，这些机理目前还是不清楚。 研究已经证明了2 0 s 蛋白酶体具有内切蛋白酶解活性【2 3 】。因此，r e 研被推测是以非 3 华东师范大学2 0 1 1 届研究生硕士学位论文 a t p 依赖的方式促进蛋白酶体水解那些无结构亦或是自然无折叠的蛋白【2 4 】。另外， r e c r t 和其底物的物理结合可能是以布朗棘轮形式防止那些已经进入2 0 s 蛋白酶体中的 分子从中退出，从而使其得到充分的降解【2 5 ，2 6 。 1 3r e c _ 订的生物学功能 一 早在上世纪8 0 年代末，人们对r e g y 的研究就提示了i 汪g 叶与细胞生长调控之间 存在着的潜在联系 2 7 】：但是在r e g v 基因敲除小鼠建立和r e g r 靶蛋白发现之后，人 们才开始对r e 研的生物学功能有所了解。两个不同的实验室建立了敲除r e g 7 基因的 小鼠模型，并报道了r e g r 基因的敲除会导致小鼠体型偏小并使得特定细胞的有丝分裂 受阻。这些研究结果都说明i 汪研在调控细胞生长和增殖方面的作用【7 ，2 8 。而且，r e 研 基因敲除的小鼠胚胎成纤维( m e f ) 细胞也表现出细胞周期中g i 期到s 期过程的受阻。 在r e g r 基因敲除果蝇细胞中也能够观察到类似现象，这表明r e c r t 的细胞周期调节作 用具有一定的保守性 2 9 】。另外，r e 研还参与了细胞程序性凋亡的调节。研究发现r e 研 基因敲除的m e f 细胞的细胞凋亡程度大大高于正常的m e f 细胞【7 】。而且，能够与r e 研 相互作用的因子中就存在着能够诱导或是调控细胞凋亡的凶子，包括了c a s p a s e 7 ， m e k k 3 ，f l a s h ，d a x x ，r a n b p m 和p i a s 3 0 - 3 2 。 随着近年来人们发现了越来越多的r e g q , 靶蛋白，r e c r 在细胞增殖以及凋亡调控 过程中的作用也愈发显得重要了。我们在早先就已经发现r e 研以非a t p 非泛素依赖的 方式促进2 0 s 蛋白酶体对甾体类受体共激活因子3 ( s r c 3 a i b l ) 和细胞周期依赖性激 酶抑制因子p 2 l 的降解 1 0 1 2 。而丙型肝炎病毒蛋白( h c v ) 的降解更是受nj 泛素途 径和依赖于r e 研的非泛素途径两种不同蛋白降解途径的精确调控 1 3 1 。s r c 3 被认为 是一种原癌基因，经常在乳腺癌中过表达并影响着细胞的生长 3 3 】。p 2 1 是一种能够将 细胞周期阻断在g 1 期到s 期的重要调控因子【3 4 】。r e 研对这两种在肿瘤发牛发展中起 着截然不同功能的蛋白的降解，体现了r e g v 功能的复杂性。 另外，人们又新近发现了r e g t 不依赖蛋白酶体的生物学功能。例如；r e 研能使 m d m 2 与p 5 3 的相互作用得到加强，从而促进m d m 2 介导p 5 3 蛋白的降解 16 】。当在某 些人类肿瘤细胞( 如肺癌细胞a 5 4 9 ) 中抑制r e g 叶的表达，就会阻碍m d m 2 所介导的 p 5 3 的降解，并使p 5 3 蛋白的活性被增强而促进细胞凋亡的发生【1 6 】。肿瘤抑制蛋白p 5 3 是一种重要的转录因子，在细胞周期受阻和凋亡中能够激活几个重要的靶基因，包括 b a x ，p 2 ，和g a d d 4 5 1 3 5 。在细胞周期过程中，如果使p 5 3 的蛋白水平降低，那么细胞 4 华东师范大学2 0 1 1 届研究生硕士学位论文 就可以通过g 1 s 检验点。b a l d i n 等在2 0 0 8 年提出在细胞有丝分裂过程中，r e 研在调 节核内斑体上起着重要作用【3 6 】。同年，z a n n i n i 等也提出l 迮研能够在细胞有丝分裂时 稳定染色体 3 7 】。而且，人们还发现r e g v 还能通过与早幼粒细胞白血病( p m l ) 蛋白 和关卡蛋白激酶c h k 2 的相互作用，影响到p m l 核小体的数目【3 8 。c h k 2 能够在细胞 周期进程中起到调节作用。另外，n a k a h a t a 等人发现r e g v 能与凝血烷a 2 受体c 末端 结合，从而调控g 蛋白偶联受体的活性 3 9 1 。 综上所述，越来越多的研究结果表明i 汪研对细胞周期调控具有重要作用。尽管如 此，r e c , v 在细胞凋亡前期和抗凋亡过程中的作用机理目前还不清楚。因此，需要我们 研究和发现更多相关靶蛋白。 1 4r e 研与癌症的关系 正如前文中提到的，癌症对人类牛活的影响日趋显著。因此，人们对r e 研在肿瘤 发生发展中的研究最为关注。事实上，人们已经发现在直肠癌【4 0 】、甲状腺癌【4 l 】和乳 腺癌以及淋巴结r 中 4 2 q ur e g v 呈现了过表达现象，并认为其可以作为一种癌症标签 4 0 ， 4 2 。免疫组织化学染色的结果表明，r e c o , 在直肠恶性肿瘤和侵袭性肿瘤中表达量偏高， 这些都暗示了在肿瘤发生发展中各个阶段中r e 研起着重要的作用 4 0 ，4 2 。r e g v 在 哺乳动物细胞中发现的第一个靶蛋白是甾体类受体共激活凶子3 ( s r c 3 ) 0 0 】。s r c 3 属 于转录共激活因子s r c 家族。该家族蛋白不仅仅与核受体相关，例如雌激素受体、黄 体脂酮受体和甲状腺激素受体；同时也和转录因子相关，例如激动蛋白1 、核因子k b 、 转录激活凶子和e 2 f i 【4 3 】。利用这些相互作用，s r c 3 的高表达可以影响到细胞增殖， 细胞存活以及细胞迁移等信号通路。由于s r c 3 的过表达一般存在于激素敏感的癌症 ( 乳腺癌、前列腺癌和子宫颈癌) 或是非激素依赖的癌症( 胰腺癌和胃癌) ，而且r e o r 能够选择性地降解s r c - 3 ，所以r e g r 和癌症有着紧密联系 3 3 ，4 4 4 7 】。另外。r e g 丫也 可以降解丙型肝炎病毒( h c v ) 核心蛋白 4 8 】和脑下垂体肿瘤转化因子1 ( p t t g l ) 【4 6 】 等其它的原癌基因蛋白。这些都说明r e 研能够影响肿瘤的发生发展。 人们新近发现了一个非常重要的r e 研调控的蛋白，那就是p 5 3 蛋1 刍 1 6 1 。众所周 知，肿瘤抑制因子p 5 3 在细胞的d n a 收到损伤后，发生应激反应，刺激细胞发生程序 性凋亡，并阻抑细胞周期的进行，从而显著地抑制了肿瘤的发生【3 5 】。r e g r 不仅能够 与p 5 3 结合，而且可以与m d m 2 发生作用，并能促进两者结合，从而加强p 5 3 通过泛素 蛋白酶体降解途径被水解 1 6 1 。r e 研的缺失会导致几种肿瘤细胞系中的p 5 3 蛋白 华东师范大学 2 0 11 届研究生硕士学位论文 水平的上升。r e g y 的敲除可以阻断m d m 2 介导的p 5 3 蛋白降解途径，而使细胞内p 2 l 的蛋白水平上升，从而使得细胞周期受阻，诱导细胞发生凋亡【1 6 】。同样的，细胞周期 抑制因子p 2 1 也是r e g r 的靶蛋白之一【l l ，1 2 。p 2 1 在调控细胞周期和细胞凋亡中有着 重要的作用，因为它是细胞周期依赖性激酶的广谱特异性抑制因子，并可以作为细胞调 亡的调控因子 3 4 】。在无论是体外实验还是体内实验，r e g v - 蛋白酶体都是以非泛素依 赖的途径对p 2 1 蛋白进行降解的。t i a n 等人发现r e g r 可以通过对p 2 1 蛋白的降解使得 细胞增殖能力提高，并抑制了细胞凋亡，从而促进m d a m b 2 3 1 细胞的癌化 4 9 】。 除了p 2 1 以外，r e 研还可以促进另外两种细胞周期依赖性激酶抑制因子p 1 6 和p 1 4 ( 小鼠中称p 1 9 ) 的降解0 2 。p 1 6 和p 1 4 都是肿瘤抑制因子，而人类肿瘤细胞经常缺失 编码这两个因子的基因序列i n k 4 a a 矿【5 0 】。p 1 6 或p 1 9 单个基因的缺失亦或是两者同时 缺失的小鼠表现出自发诱导肿瘤形成的能力和对致癌物质敏感性【5 0 】。 综上所述，r e g t 既可以参与原癌蛋白的降解，如s r c 3 、h c v 核心蛋白和p t t g l ， 也参与了肿瘤抑制因子的降解，如p 5 3 、p 2 1 、p 1 6 和p 1 9 。因此，i 迮研可以扮演原癌 蛋白和肿瘤抑制因子两种角色，所以r e g t 蛋白酶体的病理学意义是复杂的。r e c f y 在 癌症发生发展中截然相片的两种作用似乎是决定于不同的因素，如细胞特异性等。蚩白 酶体抑制剂b o r t e z o m i b 成功地治疗多种骨髓瘤就是最好的例子 5 l 】。虽然r e c p 在受到 不同靶蛋白影响时表现出大量的正面功能和负面功能，但是这都表明了r e 研在调节细 胞生长和凋亡卜具有动态且显著的作用。毋庸置疑，更进一步地建立和研究r e g t 高表 达的转基因小鼠模型将能够证明r e 研在肿瘤发生发展中的作用。 第二节s u m o 化修饰及其功能的概述 翻译后修饰是细胞对蚩白质功能调节的手段，可以影响蛋白质的活性、亚细胞定位、 稳定性以及蛋白质蛋白质相互作用。可逆的蛋白质修饰使得靶蛋白能够参与多种生 物功能通路。蛋白质修饰使得蛋白功能能够快速响应细胞本身或环境的变化，但却不改 变蛋白质合成和降解的速度。类泛素化修饰物( u b l s ) 通过类似于泛素化修饰的酶促反 应结合至靶蛋白【5 2 ，5 3 。一些u b l s ( 例如r u b l n e d d 8 ) 的序列与泛素高度相似，然而 有部分却不是如此，例如s u m o 。s u m o 因为参与到真核细胞的多种重要过程而最为人 们所关注。尽管s u m o 与泛素在结构和酶促反应过程有着相似之处，但是它们的功能 截然不同。但是，也存在l r b a 和p c n a 这样能够在两种修饰中二者选其一的底物。下 面将对s u m o 化修饰进行简单的概述。 6 2 0 11 届研究生硕士学位论文 类泛素蛋白s u m o 1 是在研究哺乳动物细胞的核质运输时作为r a n g a p l 的共价修 饰发现的。细胞质中的r a n g a p i 发生s u m o 修饰，随后与承担着入核运输作用的核孔 蛋白( n p c ) 结合， 这一过程需要核质转运因子r a n 激活g t p a s e 的活性 8 ，5 4 5 8 】。 r a n g a p l 的s u m o 化修饰使其与r a n 结合蛋白r a n b p 2 在n p c 的胞质段发生结合。后 来的报道称r a n b p 2 自身发生s u m o 化修饰，并已经被证实为s u m o 连接酶 5 8 ，5 9 】。 另外还有其它一些独立的研究发现了s u m o 化修饰，这也就是s u m o 被称为“g m p ”、 “p i cl ”、“s e n t r i n ”、“s m t 3 以及“u b l l ”的原因 8 ，6 0 6 3 。 在酵母和无脊椎动物中，s u m o 是由单一的基因编码的。尽管在酿酒酵母中编码 s u m o 的s m t 3 基因是必需的【6 4 】，但是同源基因p m t 3 在裂殖酵母中却不是必需的【6 5 】。 但是p m t 3 突变体表现出生长缓慢，并具有裂殖酵母s u m o 化系统条件突变相关的多 种表型。 在哺乳动物中，人们检测到四种s u m o 亚型：s u m o - l 、s u m o - 2 、s u m o - 3 和 s u m o - 4 。s u m o 2 和s u m o 3 在序列上非常相似，因此有些时候将其缩写成s u m o ，2 3 。 四种亚型的不同功能也刚刚开始表现。s u m o 1 是与酵母中s u m o s m t 3 相似性最高 的，约有4 7 的氨基酸残基相同，也是通常情况下与底物的结合最为显著的。s u m o 2 3 与酵母s m t 3 只有4 5 的氨基酸残基相同，其在胁迫条件下( 例如高温) 优先发生对底 物的修饰 6 6 1 。然而，拓扑异构酶i l 和c a a t 增强子结合蚩白p ( c e b p h ) 在正常生理 条件下就是由s u m o - 2 3 特异性修饰的 6 7 ，6 8 。最近发现的第四种亚型s u m o - 4 是由 位于人类t a b 2 基因内含子的序列所编码的【6 9 】。s u m o - 4 在肾脏细胞中表达最高。人 们已经从模式植物拟南芥中提取出八种s u m o 亚型。和哺乳动物细胞相似，在拟南芥 受到热胁迫时，特定的s u m o 亚型与底物发生作用【7 0 】。 人类的s u m o 1 结构已经通过核磁共振成像检测解析，并与泛素的晶体结构进行了 比较【7 1 】。最近，出芽酵母的s u m o ( s m t 3 ) 结构通过与u l p l 的共结晶被