（急诊医学专业论文）p选择素基因多态性与脓毒症遗传易感性及严重程度关联性研究.pdfVIP

p ，i 。“ - ； f ： 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 ，学位论文懈琵中嗍加年细日 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大 学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权 郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、 使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍 然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。 刀、t 学位论文作者：怨申日期：砷，一年6 月日 中文摘要 摘要 背景和目的：脓毒症是感染和或创伤引起的全身炎症反应综合征( s y s t e m i c i n f l a m m a t o r yr e a c t i o ns y n d r o m e ，s i r s ) ，是诱发脓毒症休克和多器官功能障碍综 合征( m o d s ) 的重要原因。临床流行病学资料统计显示，严重创伤、休克、 外科大手术后等患者并发脓毒症是临床危重患者的重要死亡原因。虽然感染菌 株毒力、数量等外部因素是引起脓毒症的根源，而机体的性别、年龄和遗传易 感基因等内部因素对脓毒症的发生、发展和转归也起到了极为重要的作用。探 讨基因背景与脓毒症的关系可以更加科学地认识脓毒症的发病机制，且为脓毒 症的早期诊断、预后判定及治疗带来新的机遇。鉴于p 一选择素在介导炎症过程 中自细胞的起始黏附和血栓的形成中起重要作用，故将p 一选择素基因定为本实 验的候选基因。 方法：对p 一选择素基因多态性位点的位置、重要性、连锁不平衡状态和次 要等位频率等进行综合分析后，确定p 选择素基因上的候选多态性位点。在河 南人群中选取无亲缘关系的2 5 5 例脓毒症患者和2 6 0 例对照个体，利用 g e n o m e l a bs n p s t r e a m 分型平台对候选多态性位点进行分型，应用非条件 l o g i s t i c 回归模型进行关联性分析，在两种遗传模式中对脓毒症遗传易感性和严 一重程度进行统计分析，计算比值比和9 5 可信区间，同时在遗传易感性分析中 校正性别、年龄、烟酒史和慢性病史对统计结果的影响，在严重程度分析中还 校正了a p a c h ei i 的影响。 结果：在多态性位点与脓毒症遗传易感性的分析中，r s 3 9 1 7 6 4 7c t 位点的 两个等位在病例和对照组中的频率分布有显著性差异( p = 0 0 1 3 ) ，t 等位频率在对 照组中明显增高，是脓毒症保护性因素，显性遗传模式中，c 佴们联合基因型 相对于参考基因型c c 可降低导致脓毒症的发生率，发病风险是c c 基因型的 o 6 2 倍， p = 0 0 1 6 ，o r ( 9 5 c i ) ：0 6 2 ( 0 4 2 0 9 2 ) 。r s 3 7 5 3 3 0 6a g 位点的两个等位 在病例和对照组中的频率分布有显著性差异( p = o 0 0 3 ) ，g 等位频率在对照组中 明显增高，是脓毒症保护性因素，显性遗传模式中，a g g g 联合基因型相对 于参考基因型a 可降低导致脓毒症的发生率，发病风险是a 基因型的0 5 3 倍，f p = 0 0 0 8 6 ，o r ( 9 5 c i ) ：0 5 3 ( o 3 3 0 8 6 ) 】。r s 2 2 4 4 5 2 9c t 位点的两个等位在 中文摘要 病例和对照组中的频率分布有显著性差异( p = o 0 0 7 ) ，c 等位频率在对照组中明 显增高，是脓毒症保护性因素，显性遗传模式中，t c c c 联合基因型相对于 参考基因型t t 可降低导致脓毒症的发生率，发病风险是t 厂r 基因型的o 6 l 倍， p = o 0 1 ，o r ( 9 5 c i ) ：0 61 ( o 4 2 0 8 9 ) 】。在单体型分析中发现单体型t - a c a t - c 具有保护作用可防止脓毒症的发生，其p 值= o 0 2 7 和o r ( 9 5 c d 值为o 2 2 ( o 0 6 0 8 4 ) 。在多态性位点和脓毒症严重程度的分析中6 个s n p 均与严重程度 无明显关联。 结论：p 一选择素中m 3 9 1 7 6 4 7 、r s 2 2 4 4 5 2 9 、r s 3 7 5 3 3 0 6 等3 个多念性位点 与脓毒症遗传易感性关联，r s 3 9 1 7 6 4 7 位点的t 等位可降低脓毒症的发病风险， c t 和t 厂r 基因型可减少导致脓毒症的发生，r s 2 2 4 4 5 2 9 位点的g 等位可降低 脓毒症的发病风险，a g 和g g 基因型可减少导致脓毒症的发生，r s 3 7 5 3 3 0 6 位点的c 等位可降低脓毒症的发病风险，t c 和c c 基因型可减少导致脓毒症 的发生。 在单体型分析中p 一选择素单体型t - a c a t - c 为脓毒症的保护性因素，可 降低脓毒症的发病风险。 关键词：p 选择素脓毒症单核苷酸多态性显性遗传 u 英文摘要 a b s t r a c t b a c k g r o u n da n d0 b i e c t i v e ：s e p s i si ss i r st h a ti sc a u s e db yi n f e c t i o na n d o r t r a u m a , i sa l li m p o r t a n tr e a s o nt h a ti n d u c es e p s i ss h o c ka n dm o d s e v i db yc l i n i c a l e p i d e m i o l o g i c a ld a t as t a t i s t i c s ，t h ei m p o r t a n tr e a s o nt h a ti n d u c ep a t i e n tw h os u f f e r s f r o ms e v e r et r a u m a , s h o c ko rs u r g e r yt od e a t hi s c o m p l i c a t i n gs e p s i s a l t h o u g h b a c t e r i as t r a i nv i r u l e n c ea n da m o u n ti st h ek e yt oi n d u c es e p s i s ，i n t r i n s i cf a c t o r i n c l u d es e x ，a g e ，h e r e d i t yp r e d i s p o s i n gg e n e sa n ds oo ni sv e r yi m p o r t a n tt op y e m i c d e v e l o p m e n ta n dc o n s e q u e n c e i tc o u l db et oc o m p r e h e n dp a t h o g e n e s i sa b o u ts e p s i s m o r es c i e n t i f i c a l l y , t ob r i n gn e wc h a n c ee l e m e n tf o re a r l yd i a g n o s i s ，j u d g m e n t p r o g n o s i sa n dc u r et os e p s i sb yi n v e s t i g a t i o nt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ng e n ea n d s e p s i s s e l pw a ss e l e c t e da sm ye x p e r i m e n to b j e c t ，b e c a u s ei t sai m p o r t a n tr o l e a b o u tw b ci n i t i a t i o na d h e s i o ni ni n f l a m m a t i o na n dt h r o m b u sf o r m a t i o n m e t h o d s ：c a n d i d a t es n pi ns e l pw e r ec o n f i r m e di n c o n s i d e r i n ga l l f o u r f a c t o r s ，i n c l u d i n g l o c a t i o ni n g e n e ，a s s o c i a t i o nw i t ho t h e rd i s e a s e s ，l i n k a g e d i s e q u i l i b r i u ms t a t u sa n dm i n o ra l l e l ef r e q u e n c y t h ee x p e r i m e n to b j e c tc o n s i s t e do f 2 5 5p a t i e n t sw i 廿1s e p s i sa n d2 6 0v o l u n t e e r sa sc o n t r o lw h oa l l f r o mh e n a n c o m m u n i t y g e n o m e l a bs n p s t r e a m g e n o t y p i n gp l a t f o r m w e r ee m p l o y e dt o g e n o t y p e u n c o n d i t i o n a ll o g i s t i cr e g r e s s i o na n a l y s i sw a sp e r f o r m e dt oa n a l y z et h e a s s o c i a t i o no fp o l y m o r p h i s m sw i t hr i s ka n d s e v e r i t yo fs e p s i si nf i v eg e n e t i cm o d e l s pv a l u e s ，o d d sr a t i o s ( o r s ) ，a n d9 5 c o n f i d e n c ei n t e r v a l s ( c i s ) w e r ec a l c u l a t e d w ea d j u s t e df o u rc o n f o u n d i n gf a c t o r s ，i n c l u d i n ga g e ，s e x ，s m o k i n g - d r i n k i n gh i s t o r y a n dc h r o n i cd i s e a s e sh i s t o r ys t a t u sf o r a n a l y s i so fs u s c e p t i b i l i t yt os e p s i s i n a n a l y z i n gt h es e v e r i t yo fs e p s i s ，a n o t h e rc o n f o u n d i n gf a c t o r - a p a c h ei is c o r i n gw a s a l s oc o n s i d e r e d r e s u l t s ：i nt h et e s t so fa s s o c i a t i o nb e t w e e ns n p sa n dr i s ko fs e p s i s ，t h e r ei s s i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nf r e q u e n c i e so fa l l e l eca n dto fr s 3 9 17 6 4 7 ( p = 0 0 13 ) f r e q u e n c i e so fa l l e l et i sh i g h e ri nc o n t r o lg r o u pt h a nc a s e ta l l e l ec a nd i m i n i s ht h e 1 i i 英文摘要 p r o b a b i l i t yo fr i s ko fs e p s i s i nt h ed o m i n a n tm o d e l 、c n - 弋l 弋c o m b i n a t i o ng e n o t y p e i sa s s o c i a t e dw i t hd i m i n i s h e ds u s c e p t i b i l i t yt os e p s i s ( p = 0 016 ) w i t ho r ( 9 5 c i ) b e i n g0 6 2 ( 0 4 2 0 9 2 ) f r e q u e n c i e so fa l l e l eg o fr s 3 7 5 3 3 0 6i sh i g h e ri nc o n t r o l g r o u pt h a nc a s e ( p = 0 0 0 3 ) i nt h ed o m i n a n tm o d e l ，a g g gc o m b i n a t i o ng e n o t y p e i sa s s o c i a t e dw i t hd i m i n i s h e ds u s c e p t i b i l i t yt os e p s i s ( p = o 0 0 8 6 ) w i t ho r ( 9 5 c i ) b e i n go 5 3 ( 0 3 3 0 8 6 ) f r e q u e n c i e so fa l l e l ec o fr s 2 2 4 4 5 2 9i sh i g h e ri nc o n t r o l g r o u pt h a nc a s e ( p = o 0 0 7 ) i nt h ed o m i n a n tm o d e l ，t c c cc o m b i n a t i o ng e n o t y p e i sa s s o c i a t e dw i t hd i m i n i s h e ds u s c e p t i b i l i t yt os e p s i s ( p = 0 01 ) w i t ho r ( 9 5 c i ) b e i n g 0 61 ( 0 4 2 0 8 9 ) t - a c a t - ch a p l o t y p eo fs e l pi sa s s o c i a t e dw i t h d i m i n i s h e d s u s c e p t i b i l i t y t o s e p s i s ( p = o 0 2 7 ) w i t ho r ( 9 5 c i ) b e i n g 0 2 2 ( 0 0 6 0 8 4 ) s i n g l es n pa n a l y z i n gs h o wa l l6s n p so fs e l pi s n ta s s o c i a t e d w i t hs e v e r i t yo f s e p s i si nt w og e n e t i cm o d e l s c o n c l u s i o n ：3s n p so fs e l pa l ea s s o c i a t e dw i t hs u s c e p t i b i l i t yt os e p s i si n d o m i n a n tm o d e l ，i n c l u d i n gr s 3 9 1 7 6 4 7 、r s 2 2 4 4 5 2 9 、r s 3 7 5 3 3 0 6 ta l l e l eo f r s 3 9 1 7 6 4 7 c a nd i m i n i s ht h ep r o b a b i l i t yo fr i s ko fs e p s i s i nt h ed o m i n a n tm o d e l 。c r n c o m b i n a t i o ng e n o t y p ei sa s s o c i a t e dw i t hd i m i n i s h e ds u s c e p t i b i l i t yt os e p s i s ga l l e l e o fr s 2 2 4 4 5 2 9c a nd i m i n i s ht h ep r o b a b i l i t yo fr i s ko fs e p s i s i nt h ed o m i n a n tm o d e l ， a g g gc o m b i n a t i o ng e n o t y p ei sa s s o c i a t e dw i t hd i m “s h e ds u s c e p t i b i l i t yt o s e p s i s ca l l e l eo fr s 3 7 5 3 3 0 6c a nd i m i m s ht h ep r o b a b i l i t yo fr i s ko fs e p s i s i nt h e d o m i n a n tm o d e l t c - c cc o m b i n a t i o ng e n o t y p ei sa s s o c i a t e dw i t hd i m i n i s h e d s u s c e p t i b i l i t yt os e p s i s t - a - c - a t - ch a p l o t y p eo fs e l pi sa s s o c i a t e dw i md i m i n i s h e ds u s c e p t i b i l i t yt o s e p s i s k e y w o r d s ：p - s e l e c t i n ，s e p s i s ，m o n o n u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ，d o m i n a n t h e r e x t i t y i v 目录 目录 摘要i 英文缩略词注释v i i 论文正文1 前言1 日u 吾。1 1材料与方法5 1 1 确定入选人群5 1 2 主要试剂、耗材和仪器7 1 3 实验方法1 0 2 结果一1 5 2 1 哈温平衡检验1 8 2 2 遗传易感性分析1 9 2 3 脓毒症严重程度关联性分析2 3 3 讨论2 9 4 结论。3 3 参考文献3 5 综! 述3 9 参考文献4 7 致谢51 个人简历5 3 在学期间发表的学术论文5 3 v 缩略词注释 英文缩略词注释 v i l 刖鬲 论文正文 p 一选择素基因多态性与脓毒症遗传易感性 及严重程度关联性研究 硕士研究生 导师 庞伟 刘保池 郑州大学第一附属医院急诊科 河南郑州4 5 0 0 5 2 _ 一o 一 刖舌 脓毒症是感染和或创伤引起的全身炎症反应综合征( s y s t e m i c i n f l a m m a t o r yr e a c t i o ns y n d r o m e ，s i r s ) ，是诱发脓毒症休克和多器官功能障碍综 合征( m o d s ) 的重要原因。临床流行病学资料统计显示，严重创伤、休克、 外科大手术后等患者并发脓毒症是临床危重患者的重要死亡原因，死亡率超过 1 5 t 1 1 ，此外烧伤、爆震伤、挤压伤、疼痛等也是常见的脓毒症病因，既可造成 局部组织损伤，也可以导致全身应激性反应。内毒素的侵袭，内毒素有一系列 对人体有害的生物学作用，如损伤人体免疫功能，促进弥散性血管内凝血和严 重的血流动力学改变，影响正常新陈代谢，以及增加血管和肠粘膜的通透性等。 其他如饥饿、肠梗阻、免疫功能低下等也是脓毒症的常见病因之一。随着社会 的发展，生活水平的提高，象糖尿病、高龄、器官移植、介入等有创性检查和 治疗、滥用抗生素、肿瘤放化疗、人工假体植入术、结核病、激素和免疫抑制 剂的应用等脓毒症的易患因素也与日俱增。每年大约全球有1 8 0 0 万人罹患脓毒 症，仅美国每年就约有7 5 万脓毒症患者，而且发病率还在以8 7 吲年的速度递 增瞳1 。按比例推算我国每年的脓毒症患者可达3 0 0 万。在美国严重脓毒症的死 亡率仅次于心脏病，高达2 0 5 0 ，是i c u 病人中最常见的死因之一口1 。按每例 刖舀 患者花费2 21 0 0 美元计，那么每年用于该病的支出将近1 6 7 亿美元。所有数据 表明，重度脓毒血症是一个严重的公共卫生问题。脓毒症由感染菌、环境因素和 机体本身的遗传因素三者协同交互作用，但脓毒症患者的预后却千差万别，各 个脓毒症患者除了在感染菌株毒力、环境因素起的作用方面不同外，机体的性 别、年龄和遗传易感基因等遗传因素对脓毒症的发生、发展和转归也起到了极 为重要的作用。因此，探讨基因背景与脓毒症的关系可以更加科学地认识脓毒 症的发病机制，且为脓毒症的早期诊断和预后判定及治疗带来新的机遇。 脓毒症早期主要表现为促炎性反应，大范围激活炎症细胞和凝血系统，来 阻止病原体的扩散。如果炎症受到控制那么就是一般的局部感染。当炎症因子 的促炎作用大于抗炎因子的作用时机体就会表现为过度的炎性反应，出现全身 性的临床表现，引起s i r s 和血管内皮细胞的损伤，如果没有得到及时的干预 措施，就会进一步发展为m o d s 。在严重脓毒症中，血管内皮细胞释放大量组 织因子( 组织因子是在多种组织细胞内表达的一种跨膜蛋白口1 ) ，凝血机制的启 动主要是由外源性凝血途径介导喵1 。但是在受致炎因子( 如l p s 、t n f - o c 及i l 1 ) 刺激之前的内皮细胞表达组织因子量非常少，当致炎因子刺激后内皮细胞活 化，组织因子的表达量明显增加呻孔口k 哺1 。炎症反应并不只是单向的激活凝血系 统，被激活的凝血系统反过来也可以进一步促进炎症反应的放大，这种现象称 之为交叉对话归k 1 0 o 内皮细胞是凝血系统和炎症系统之间的桥梁，内皮细胞的 主要功能有调节血管的收缩舒张、参与新生血管的形成、维持血流通畅及营养 物质交换。在一般的物理化学病原体刺激后，内皮细胞激活释放炎性介质，趋 化炎症细胞，形成防御屏障，内皮细胞的过度激活是引起凝血系统过度反应和 由感染引起全身炎症反应综合症的重要载体，可以造成内皮细胞结构的改变 ( 核空泡化、胞质肿胀、破裂) ，炎症细胞黏附的增加，血管舒缩功能的减退， 凝血系统的紊乱，甚至内皮细胞凋亡。可见内皮细胞的功能在急性全身炎症反 应综合征( s i r s ) ，多器官功能障碍综合征( m o d s ) 的发生发展中起着重要作 用，它表达的多种炎症因子和凝血相关蛋白及相关受体就理所当然的成为研究 的重点。 脓毒症时，炎症反应可以激活凝血系统，甚至可以导致d i c ，而失控的凝 血系统可以造成微循环障碍，反过来又加重炎症反应对组织器官的损伤，这就 是炎症反应与凝血系统之间存在的交叉对话。参与脓毒症的因子如i l 1 、t n f a 、 i c a m 1 、m a p k 、j a k s t a t 和n f k b 、i l 8 、补体成分3 ( c o m p l e m e n tc o m p o n e n t 2 前言 3 ，c 3 ) 和单核细胞趋化因子等有很多，其中p 选择素在介导炎症过程中自细胞 的起始黏附和血栓的形成中均起重要作用，j 下是因为p 选择素在炎症反应和凝 血系统中的双重角色，预示着它与脓毒症之问可能存在着某些必然的联系，而 大量的临床研究和动物实验也证实了p 选择素与炎症或脓毒症之间存在关联， 而既往对于p 选择素基因多态性研究的主要是在心脑血管疾病方面，这些主要 是基于p 一选择素基因多态性在凝血机制相关性方面的研究，目前国内外对p 选择素基因多态性在脓毒症方面却缺乏研究，所以将p 选择素选为本研究的目 标基因，在某些方面可能会有所突破。 p 一选择素( c d 6 2 ) 就是黏附因子中非常重要的一个，它的编码基因定位于 人类染色体l q 2 1 2 4 ，含有1 7 个外显子和1 6 个内含子，由7 8 9 个氨基酸构成， 由n 端的凝集素样区、e g f 区、2 - 9 个补体调节蛋白样同源重复序列区、一个 跨膜区和胞浆短尾区构成，分子量约为1 4 0 k d ，p 一选择素是一种富含半胱氨 酸和高度糖化的整合蛋白。p 一选择素存在于血小板的o c 颗粒和内皮细胞的棒状 小体( w e i b e l p a l a d e 小体) ，在凝血酶、组胺、补体c 5 b 9 等刺激下，o 【颗粒和 棒状小体会迅速与细胞膜融合，表达在细胞膜上n 。当p 一选择素表达于巨核细 胞、活化血小板和活化的内皮细胞表面时，通过识别其相应配体( p s l g 一1 、。 s l e w i s x 等) 介导活化的中性粒细胞在活化的内皮细胞上滚动。选择素可以在 血流状态下介导白细胞与血管内皮细胞的起始粘附，在此过程中白细胞与血管 内皮细胞粘附，又从内皮上脱落，粘附、脱落相互交替进行，称为白细胞滚动。 据研究证实参与和t 细胞、中性粒细胞黏附的主要是p 一选择素。通过整合素与 其配体i c a m 1 、i c a m 2 及v c a m 1 等结合而使白细胞与血管内皮细胞黏附、 固定，然后炎症细胞在p 2 整合素和i c a m 1 、p e c a m 1 的相互作用下变形、 穿过出内皮细胞之间的间隙，在e c m 和趋化因子的指引下阿米巴样游走到炎症 部位。m a c 等n 2 1 观察了创伤致脓毒症休克、严重脓毒症以及失血性休克的患者， 发现3 组的血浆sp 一选择素水平均较正常人显著升高，其与脓毒症严重程度也 呈明显相关。p 一选择素除了介导血管内皮细胞、白细胞之间的相互作用，还介 导血管内皮细胞与血小板之间、血小板与血小板之间的黏附、聚集，内皮细胞 通过细胞表面表达的细胞间黏附分子一1 、血管问黏附分子一l 、p 一选择素等来促 进炎症细胞的滚动黏附及迁移，和募集血小板黏附到内皮细胞表面。o g u r a 等 n 3 1 实验中发现，严重脓毒症患者的微血管内，血小板与单核细胞可以组成的微 粒，其与血清s p 选择素水平呈正相关，当使用p 一选择素单抗之后，微粒形成 3 刚吾 明显被抑制，从实验方面说明p 一选择素参与了血小板与白细胞之间相互黏附、 甚至形成微血栓的过程。 基因多态性rg e n ep o l y m o r p h i s m ) 是人类个体对疾病易感性、疾病表型和 对药物治疗反应差异性的重要因素。基因多态性有多种表现形式，其中最重 要和最常见的是s n p ( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ，单核苷酸多态性) 。s n p 是指基因组水平上由于单个核苷酸的突变导致的d n a 序列多态性，其中最少 一种在群体中的频率不小于1 。其突变包括单个碱基的转换、颠换、插入和 缺失等形式。研究发现基因组中的s n p 并不是随机组合的，有许多处于连锁不 平衡的状态，形成l d 岛，岛内所有的s n p 是以整体的方式遗传给下一代，这 提示我们可以选取一些有代表性的s n p 替代岛内其它全部的s n p 进行研究， 既减少了支出，又提高了效率。至于候选位点的选择主要考虑以下四点：( 1 ) 位于候选基因编码区、基因调控区，3 端无编码区的位点；( 2 ) 经h a p l o v i e w 软件计算得到的标签s n p 位点；( 3 ) 次要等位频率0 1 的位点。以上3 点选取 p 选择素的具有代表性的6 个s n p 位点，采用病例对照分析研究p 选择素的基 因多态性与脓毒症遗传易感性和多样性临床转归自j 的关系。 4 材料与方法 1 材料与方法 1 1 确定入选人群 本研究中病例组标本及临床资料均来自于2 0 0 6 年7 月至2 0 0 8 年3 月间在 郑州大学第一附属医院急诊科住院治疗的脓毒症患者，共2 5 5 人，其中男1 6 8 例、女8 7 例，平均年龄4 5 6 - 士1 7 7 岁。对照组来源于同期健康志愿者，共2 6 0 人，其中男1 7 1 人、女8 9 人，平均年龄4 5 3 + 1 5 9 岁。籍贯均为河南省。病例 组严格按照2 0 0 1 年美国危重病医学会美国胸科医师学会( s c c m a c c p ) $ 1 j 定的 脓毒症诊断标准入选。诊断标准如下：体温 3 8 c 或 9 0 次分； 呼吸频率 2 0 次分；或动脉血二氧化碳分压 p a c 0 2 1 2 x 1 0 9 l 或 0 1 0 。 具备以上2 项或2 项以上的体征，且可以证实有微生物存在或有高度可疑感染 灶，即可诊断为脓毒症。脓毒症进一步发展恶化可分为严重脓毒症( s e v e r e s e p s i s ) ，脓毒症休克( s e p t i cs h o c k ) ，多器官功能障碍综合征( m o d s ) ，甚至死 亡。严重脓毒症就是在脓毒症基础上出现器官功能的障碍、微循环的低灌注及 低血压。脓毒症休克是指严重脓毒症发展到给予足量液体复苏仍不能改善低血 压状态，应用血管活性药物除外，可伴有意识状态的改变。多器官功能衰竭是 指机体在受到急性创伤后同时或序贯出现两个或两个以上的器官或系统功能 障碍或衰竭。死亡是指脓毒症所致的不可复的心跳呼吸停止。入选标准为完全 符合以上诊断标准且临床资料完整者。排除标准为：1 年龄小于1 4 岁，大于 8 5 岁。2 非感染原因所致的脓毒症。3 慢性病终末期、器官移植、肿瘤、长期 应用免疫抑制剂、特殊感染( 如h i v ) 及怀孕者。最终入选病例组有2 5 5 人，按 脓毒症严重程度分级，其中一般脓毒症1 2 9 例，严重脓毒症6 5 例，脓毒症休 克2 1 例，m o d s 2 1 例，死亡1 9 例。收集入选者的一般资料：病因、发病时间、 就诊时间、烟酒史、慢性病史、家族史，t 、p 、r 、b p 、w b c 、r b c 、p l a t 、 c r ( 病情最重时的指标) ，感染部位、细菌培养取材部位、培养结果、主要治疗 措施等。对照组源于郑州大学第一附属医院体检中心的健康体检者( 有体检报 告) 。在随机前提下与病例组在性别年龄上进行匹配，最终入选2 6 0 人，并记录 5 材料与方法 一般情况、烟酒史及慢性病史。所以标本均为外周静脉血5 m l ，存放e d t a 抗 凝管中，晃匀后放于- 2 0 c 冰箱冻存。病例组和对照组的一般资料见表l 。 表格1 病例组和对照组的一般资料 2 6 0 例 p 5 9 1 o o a 0 8 3 。 o 0 0 1 4 0 1 ，因为如果次要等位频率太低的话，在本研究的5 1 5 例中可能会检 测不出频率低的基因型，或数量太小，在统计时偏倚太大。 1 3 2 实验过程 1 3 2 1 外周血基因组d n a 的提取 盐析法提取人白细胞基因组d n a ： 1 取e d t a n a 2 抗凝全血5 m l ，置于5 0 m l 离心管中； 2 加入5 8 倍体积( 约4 0 m 1 ) 冷蒸馏水，反复颠倒混匀，冰中静置5 m i n ，4 。c 3 8 0 0 9 ，离心2 0m i n ； 3 缓慢倒出上清液，在沉淀中加入5m lt e s ( 体积同上) ，轻柔混匀沉淀； 4 加入1 0m g m l 蛋白酶k5 0 山( 至终浓度为2 0 0p g m 1 ) ，混匀后加入1 0 s d s 2 5 0 山，混匀，3 7 过夜，消化； 5 加入等体积的酚氯仿( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，混匀，剧烈震荡2 0 s ： 6 3 8 0 0 9 离心2 0 m i n ，将上清液移至另一个5 0 m l 有盖离心管中； 材料与方法 7 加入2 5 倍体积- 2 0 。c 预冷无水乙醇，反复颠倒混匀至出现絮状d n a 沉淀， 挑出d n a 至1 5 m l 的e p 管中； 8 7 0 冷乙醇洗涤d n a 两遍，1 2 0 0 0 9 离心l m i n ，弃上清液； 9 于超净台中晾两个小时，挥发干乙醇即可，注意不要过于干燥； l o 加入2 0 0 p l t e 溶解d n a ( 约3 4 天) ； 1 1 测o d 值定量稀释至l o n g p l ，在9 6 孔p c r 板中制成d n a p a n e l ，放于一2 0 冰箱保存备用。 1 3 2 2 引物设计 应用在线引物设计软件a u t o p r i m e r ( h t t p ：w w w a u t o p r i m e r c o m ) 对每个s n p 位点两条用于扩增含目的s n p 位点d n a 片段的引物，和一条用于单碱基延伸 反应的引物。各s n p 位点的引物设计详情见表5 。 表格5s n p s t r e a m 分型引物 材料与方法 p c r u ：p c r 扩增使用的上游引物；p c r l ：p c r 扩增使用的下游引物；s n p u ：单碱基延 伸时，位于s n p 位点上游的延伸引物，延伸方向与基因编码链一致；s n p l ：单碱基延伸 时，位于s n p 位点下游的延伸引物，延伸方向与基冈非编码链一致。 1 3 2 3 引物的配制 引物是在h t t p ：w w w a u t o p r i m e r c o m 上进行1 2 重设计的，并由北京奥科生物 技术有限责任公司合成，且经变形聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。 1 3 2 3 1 配制p c r 引物池( 共1 2 2 个) ：先将合成好的引物稀释到2 4 0 l am ， 从2 4 管稀释好的p c r 引物中各取5ul 加入到新的离心管中，p c r 引物池中 共有1 2 0 l al 试剂，并且其终浓度为l o um 。 1 3 2 3 2 配制延伸引物池( 共1 2 个) ：将合成好的引物稀释到1 2 0 l am ，从 1 2 管稀释好的延伸引物中各取l oul 加入到一个新的离心管中，延伸引物池中 共有1 2 0 l al 试剂，并且其终浓度为1 0 um 1 3 2 41 2 重p c r 反应和纯化 制备1 2 重p c r 反应混合物( p c rm i x ) ，见表6 表格6s n ps t r e a m1 2 重p c r 反应混合液 试剂 体积( 山) a m p l i t a qg o l dd n ap o l y m e r a s e ( 5ulal)45 1 0 p c r b u f f e r i i 2 2 5 m g c l 2 ( 2 5m mstock)450 d n t p ( 2 5m meach)675 p r i m e r p o o l ( 1 0 肚me a c h ) 1 1 2 5 d d h 2 0 5 5 1 2 5 t o t a l1 3 5 0 材料与方法 向3 8 4 孔板每孔内加入配好的p c rm i x 3 1 tl ，再向对应的孔内加入2ul 稀释好的基因组d n a 。1 0 0 0 r p m 离心后，在p c r 仪上运行以下程序：先9 5 。c 变性1 5 m i n ，然后再以“9 4 3 0 s ，5 5 3 0 s ，7 2 l m i n ”为一循环，运行4 5 个循环。将p c r 板1 0 0 0 r p m 离一1 1 , ，每孔加入c l e a n u p 混合液3ul ( 组成见表 7 ) 。注意加样时避免交叉污染。重新用封板膜封上p c r 板，1 0 0 0 r p m 离心。 离心后将p c r 板放入p c r 仪，运行3 73 0 m i n ，9 61 0 m i n ，进而纯化p c r 产物。 p c r 板如暂时不用，可在一2 0 条件下存放数天。 表格7c l e a n u p 混合液的配制 试剂体积( “1 ) e x o i ( 2 0 u 山) 4 5 1 0 s a p b u f f e r 1 3 5 s a p ( 1uit1)448 d d h 2 0 6 6 7 t o t a l 1 3 5 0 1 3 2 5 引物延伸 p c r 板先解冻再1 0 0 0 r p m 离一1 1 , ，再添加引物延伸反应混合物( 见表8 ) ， 每孔7ul 。重新封上封板膜，再次1 0 0 0 r p m 离一1 1 , 。返回p c r 仪，9 6 。c 预热3 m i n ， 以“9 42 0 s ，4 0l l s ”为一循环，运行4 6 个循环。 表格8s n pw a r e 引物延伸反应混合液 试剂体积( 止) d n ap o l y m e r a s e 9 4 2 0xe x t e n s i o nm i x 9 0 e x t e n s i o np r i m e rm i x1 3 5 d d h 2 013 3 6 5 e x t e n s i o nd i l u t i o nb u f f e r 16 9 2 5 t o t a l 3 1 5 0 1 3 2 6 杂交 空的杂交板用杂交板清洗液i ( 见表9 ) 清洗，每孔每次1 0 | jl 。把s n p w a r e 杂交板反过来放在无尘纸上，放入离一1 1 , 机离- 1 1 , ，每次l m i n ，速度1 0 0 1 2 0 r c f ， 重复3 次。向p c r 板中添加s n p s t r e a m 分型杂交混合液( 见表9 ) ，每孔8ul ， 反复吹打后到离心机慢速离一1 1 , 混匀，取出1 5ul 混合液加入到对应s n p w a r e 材料与方法 杂交板的孔内，再将s n p w a r e 杂交板放入密闭的容器中，一起放入温箱中4 2 孵育2 h 左右。在杂交板的每个孔中加入1 0 1 a l 杂交板清洗液i i ( 见表9 ) ， 反过来放在无尘纸上，1 0 0 1 2 0 r c f 离心l m i n ，重复3 次。再用无尘纸蘸少许 无水甲醇轻轻擦净杂交板背面玻片，用扫描仪读取数据，e x c e l 表登记分型结果 后进行统计学分析。 表格9 杂交用溶液的配制 堕型签墼! 丛生!萱签塑：! 坚生! s n p s 竺黑。1 5 二型杂交 2 0 w a s hb u 妇衙12 5 0 0 5 0 0 0 0 板清洗液i d d h 2 04 7 5 0 0 一 s n p 竺竺乏掣杂交 “w 如hb u 脓 2 7 8 1 5 0 0 0 0 板清洗液i id d h 2 04 9 2 1 9 研旧s 缸? 2 型杂交 h y 晰d i z a 。ns o l u t i 伽 3 4 0 2 3 6 0 0 混合液h y b r i d i z a t i o n a d d i t i v el9 8 。 8 每块3 8 4 孔板用量 1 3 3 统计分析 首先对病例组和对照组的基因型频率进行检