（分析化学专业论文）扫描电化学显微镜测定dna.pdf

山东大学硕士学位论文 摘要 扫描电化学显微术( s e c m ) 作为一种电化学方法，已经用于d n a 片断斑点 的表征。目前已经报道的关于s e c m 测定d n a 的文章仅有四篇。在这些工作中， 利用直接杂交法将目标d n a 片段固定在载玻片上，分别通过银增强、鸟嘌呤氧化 和具有电化学活性的杂交指示剂来表征目标d n a 片段。我们首次将d n a 夹心杂 交法和s e c m 相结合，利用酶的高效催化作用，进行了d n a 的定量分析，并对实 际样品进行了测定。 全文分为三部分：第一部分是用固相直接杂交法，通过s e c m 的收集模式测 定d n a 。首先利用生物素与链霉亲和索的结合反应，把生物素化的d n a 探针固 定在链霉亲和素覆盖的聚苯乙烯板上，然后加入生物素化的目标d n a ，利用核酸 分子杂交使目标d n a 与探针发生杂交。杂交反应结束后，加入链霉亲和素一辣根 过氧化物酶( h r p ) 结合物，将h r p 连接到被测d n a 上。利用扫描电化学显微 镜的收集模式，通过检测h r p 催化氢醌( h 2 q ) 和h 2 0 2 反应产生的i ，4 - 苯醌( b q ) 来间接检测目标d n a 。工作中，我们确定了检测d n a 的实验条件：缓冲液为 0 2m o l l 磷酸缓冲溶液( p h7 0 ) ，底物h 2 q 和h 2 0 2 的浓度均为4 5 5 1 0 1m o l l ， 探头电位为一0 3v ，探头距基底的距离为1 4 舯。在这些实验条件f ，列。剧定在聚 苯乙烯板上的个d n a 点进行了扫描，得到了它的s e c m 图像。 第二部分用固相夹心杂交法，通过s e c m 的收集模式对p u c l 9 质粒d n a 的 个片段进行了检测。固相夹心杂交法中利用两个不互相重叠的d n a 片段分别作 为捕捉探针和检测探针来共同检测目标d n a 。实验中酋先将生物素化的捕捉探针 固定在链霉亲和素覆盖的聚苯乙烯板上。然后加入目标d n a 与检测探针，使三者 进行杂交反应。杂交反应结束后，加入链霉亲和素一h r p 结合物，将h r p 连接在 检测探钊上。利用s e c m 的收集模式，通过检测h r p 催化h 2 q 和h 2 0 2 反应产生 的b q 来间接检测目标d n a 。按照常规的固相杂交法，空白值为4 0 3n a 。我们 找出了空白产生n 0 原因：( 1 ) 在滴加到链霉亲和素覆盖的聚苯乙烯板上之前 捕捉探针之f 刚发生了杂交反应；( 2 ) 链霉亲和素一h r p 结合物在聚苯乙烯板上 的吸附。在重新优化了实验条件以后，空白值降低到了0 ，3 3n a 。在s e c m 测定 叫，除探头”h 离艇底的距离为1 0p m 外，其它条件同第一部分。根据所确定的实 验方法，得到s e c m 图的峰电流与目标d n a 浓度在9 2 0n m o l l - - 7 3 2n m o l l 范 山东太学硕士学位论文 围内呈线性关系。 第三部分用固相夹心杂交法，通过s e c m 对p u c l 9 质粒d n a 进行了检测。 在这部分工作中，我们沿用了第二部分的试验条件。对两个不同浓度的p u c l 9 质 粒d n a 样品进行了检测，通过第二部分的峰电流一目标d n a 浓度的工作曲线， 得到的检测结果与样品的实际含量基本一致。 关键词：扫描电化学显微镜，核酸分子杂交，脱氧核糖核酸，固相夹心杂交 4 些查查兰堡主堂垡堕苎 a b s t r a c t t h i st h e s i sc o n s i s t so ft h r e ep a n s c h a p t e ro n ed e s c r i b e st h ed e t e c t i o no fd n a f r a g m e n tv i ad i r e c th y b r i d i z a t i o n ，u s i n gs c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y ( s e c m ) i nt i f f s s t u d y , t h e b i o t i n l a b e l e d c a p t u r ep r o b e w a sf i r s ti m m o b i l i z e do nt h e s t r e p t a v i d i n c o a t e dp o l y s t y r e n ep l a t e t h ei m m o b i l i z e d c a p t u r ep r o b e c o u l db e h y b r i d i z e d w i l ht h eb i o t i n l a b e l e d t a r g e td n a ， w h i c hw a sl i n k e dt o s t r e p t a v i d i n h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) c o n j u g a t e h r pc o u l dc a t a l y z et h er e a c t i o n b e t w e e nh y d r o q u i n o n e ( h e q ) m a d h 2 0 2a n dg e n e r a t ep - b e n z o q u i n o n e ( b q ) ，w h i c hc a n b ed e t e c t e db ys e c m d m i n go l i rs t u d y ，p r o p e re x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sw e r es e l e c t e d f o rt h ed e t e c t i o no f d n a u n d e rt h es e l e c t e dc o n d i t i o n s ，a l li m m o b i l i z e dd n a s p o tw a s s c a n n e da n dt h es e c m i m a g ew a so b t a i n e d i nc h a p t e rt w o am e t h o di n v o l v e das a n d w i c h h y b r i d i z a t i o nw a sd e v e l o p e df o r s e c md e t e c t i o no fa s i n g l e s t r a n d e dd n af r a g m e n tf r o mt h ep u c l 9p l a s m i d i nt h i s m e t h o d ，t h e b i o t i n l a b e l e d c a p t u r ep r o b e w a sf i r s t i m m o b i l i z e do nt h e s t r e p t a v i d i n c o a t e dp o l y s t y r e n ep l a t e t h et a r g e td n a w a sh y b r i d i z e dt ot h ec a p t u r e p r o b e ab i o t i n - l a b e l e dd e t e c t i n gp r o b ew a ss u b s e q u e n t l yh y b r i d i z e dt ot h et a r g e td n a a s t r e p t a v i d i n h r pc o n j u g a t ew a st h e nl i n k e d t ot h eh v b r i dv i at h eb i o t i no ft h e d e t e c t i n gp r o b b q ，t h ep r o d u c to ft h er e a c t i o nb e t w e e nh 2 qa n dh 2 0 2w a sf i n a l l y d e t e c t e du n d e rt h ec o l l e c t i v em o d eo fs e c m t h es a n d w i c h ，h y b r i dm e t h o dn o r m a l l y r e s u l t e di nab l a n kp e a ko f4 0 3n a f u r t h e rs t u d i e sh a sr e v e a l e dt h a tt h i si sd u et ot h e u n s p e c i f i ch y b r i d i z a t i o n b e t w e e nt h e c a p t u r ep r o b e s b e f o r ei m m o b i l i z e do nt h e s t r e p t a v i d i n c o a t e dp o l y s t y r e n ep l a t e ，w h i c h c a u s e dt h e u n s p e c i f i ca d s o r p t i o n o f s t r e p t a v i d i n h r pc o n j u g a t et ot h ep o l y s t y r e n ep l a t e a f t e ro p t i m i z e dt h ee x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s t h eb l a n kw a s f i n a l l yl o w e r e d t o0 3 3n a t h es a m ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s m e n t i o n e di n c h a p t e r o n ew e r e a p p l i e d i nt h e s e e x p e r i m e n t s ，e x c e p t i n g t h a tt h e s e p a r a t i o nb e t w e e n t h et i pm a dt i r es u b s t r a t ew a s1 0p m t h ei n e a rr e l a t i o nb e t w e e nt h e p e a kc u r r e n td e t e c t e db ys e c m a n dt h ec o n c e n t r a t i o no ft h et a r g e td n a r a n g e df r o m 9 2n m o l i ，t o7 32n m o l i ， c h a p t e rt h r e ed e s c r i b e sd e t e c t i o no f t h ep u c l 9p l a s m i dd n ab ys e c m u s i n g t h e e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n sm e n t i o n e di n c h a p t e r t w o ，t w o s a m p l e s w i t hd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so fp u ci9p l a s m i dd n aw e r eu s e dt ov e r i f yt h em e t h o dm e n t i o n e di n c h a p t e rt w o t h ed e t e r m i n e dv a l u e sf i t t e dw i t ht h es a m p l ec o n c e n t r a t i o n s k e yw o r d s ：s e c m ，h y b r i d i z a t i o n ，d n a ， 原创性声明 。水人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 r i ：t q l k 个八或集体已经发表或撰写过的科研成粟。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人 刊锄j 。 沦义作者签名： 至盗趁 e l 期：麴生垒! 自堡 关于学位论文使用授权的声明 乍人完全：解i j 1 东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 甜或川一家加奠、j 或机构送交论文的复印件和电子版，允 ：论文被查测 僻恻：水k 授权i l j 东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 诣i 进仃附褒，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学f 训仑文。 ( 保密沦史f e q ? ! 密后应遵守此规定) 沧逻怍者签名：至垒真导师签名：金丞盎目期：型! 生! 丝 山东大学硕士学位论文 a a a f m b b p b q b s a c d d d n a 止 e 。 e c o l i e d l t a ， g g o x h r p h q l s 1 1 j t 一 l l 界面 o p a p b s p c r r r n a s d s s e c m s g t c s p m s t m t 符号与缩写 探头半径 腺嘌呤 原子力显微镜 探头绝缘层的半径和电极半径之和 碱基对 1 ，4 - 苯醌 牛血清自蛋白 胞嘧啶 探头与基底的距离 扩散系数 脱氧核糖核酸 探头电位 标准电位 大肠杆菌 乙二胺四乙酸二钠 法拉第常数 鸟嘌呤 葡萄糖氧化酶 辣根过氧化物酶 对苯二酚，氢醌 基底的电流 探头上的电流 探头上的稳态扩散电流 液，液界面 氧化还原反应的电子转移数 氧化态 帕斯卡 生理盐水 聚合酶链式反应 还原态 核糖核酸 十二烷基磺酸钠 扫描电化学显微镜 基底产生探头收集模式 扫描探针显微镜技术 扫描隧道显微镜 胸腺嘌呤 坐查查鲎堡主兰丝笙壅 探头产生基底收集模式 三羟甲基氨基甲烷 聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酯 酶的活性单位 超微电极 t g s c 1 、r i s 1 、e e n 2 0 u u m e 山东大学碗士学位论文 刖罱 l 扫拙i u 化学显微镜及其特点 8 0 年代术，a j b a r d 小组l1 】在超微电极( u l t r a m i c r o e l e c t r o d e ，u m e ) 和 扫描隧道显微镜( s t m ) 【2 】的基础上提出和发展了一种新型扫拙探针显微镜 技术( s p m ) 一扫描电化学显微术( s c a n n i n g e l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y , s e c m ) ， 它是一种分辨率介于普通光学显微镜与扫描隧道显微镜之间的电化学现场检测 技术。它把一支能够进行三维移动的超微电极作为探头插入电解质溶液中，在 离固相基底表面非常近的位置进行扫描，来研究基底的形貌和固液界面的电化 学性质。由于其具有化学灵敏性，不但可以用来研究探头与基底上的异相反应动 力学及探头和基底之间溶液层中的均相反应动力学，分辩电极表面微区的电化学 不均匀性，给出导体和绝缘体表面的形貌，而且还可以对材料进行微米级加工及 研究许多重要生物过程等，从而弥补了s t m 或原子力显微镜( a f m ) 不能直接提 供电化学信息的不足。 2 实验装置及s e c m 探头 常规的s e c m 实验装置如图1 所示，主要由电化学部分( 电解池、探头、基 底、参比电极、辅助电极和双恒电位仪) ，用来精确控制、操作探头位置的压电 驱动器以及用来控制操作、获取和分析数据的计算机( 包括接口) 三部分组成。 把探头固定在出三维马达控制的爬行器上，通过控制爬行器，可以使探头在基 底上方沿x 、y 、z 轴方向精确移动。基底固定在电解池的底部，爬行器及固定 电解池的载物台都放置于一个稳固的平台上。通过双恒电位仪可控制探头和基 底的电位。计算机通过位置控制器来控制x y z 三维爬行器在基底上方移动。 s e c m 探头就是电化学研究中常用的u m e 和离子选择性微电极。s e c m 实 验中所得到的信息主要与所用的探头大小和类型有关。在s e c m 早期的研究中， 大多采用各种金属和碳纤维圆盘电极作为探头，这种探头至今仍是最常用的 s e c m 伏安式( 或称之为安培式) 探头，这就限制了s e c m 仅可应用到有电活 性样品的研究中。为了检测c i 一、n h 4 + 、a c 一( 乙酰胆碱) 及碱金属和碱土金属 离子等非电活性物质，人们又制作了固体或以微米管为基础的电位式的离子选 择性微电极来作探头。与伏安式探头相比，电位式探头选择性较好，但其图像 分辨率较低，也不能给出距离基底距离的信息。c l - 选择性微电极已作为探头检 山东大学硕士学位论立 a 图1s e c m 仪器装置示意图 a ，装置方框示意图；b ，爬行器示意图。 b 测在电化学转换导电高分子时的c l 一流量 3 】和金属腐蚀时的c l 一浓度分布图 【4 | o 应用对h + 有选择性的微p h 探头已测量了钢和铝【4 】腐蚀时的表面p h 值 以及还原水、酶催化水解尿素和用酵母对葡萄糖新陈代谢的区域p h 分布图i5 i 。 l i u 等【6 】采用锑电极测定了单个哺乳动物细胞的氧化还原活性( 伏安n 向应) 和酸碱活性( 电位响应) 形貌图。化学修饰电极和生物传感器由于选择性好， 测定物质广，特别是能测定发生慢氧化还原反应的物质，因而一直都为分析化 学家广泛重视。s e c m 如采用二者做探头，可以大大扩展其应用领域。b a r d 小 组在这方面做了探索性的研究【7 】他们制备了种碳纤维表面固定有辣根过氧 化物酶的过氧化氢生物传感器。用这种电极测定了固定在基底上的葡萄糖氧化 酶催化葡萄糖生成的h 2 0 2 的浓度分布和正在分解h 2 0 2 的p t 电极表面上方的 h 2 0 2 的浓度分布。s e c m 实验中的金属探头也可被一个充满与外界不相溶溶液 的微米管所代替。利用此方法制作的伏安型探头，可以获得s e c m 的图像【8 】o 这种形状规则的亚微米级玻璃管比金属探头更易制作。另外，发生在l l 界面 上的离子转移也可以用作s e c m 信号的来源【9 ，1 0 】。s h a o 和m i r k i n 1 1 】还制 成了半径可达4n m 的纳米管，并把它用作s e c m 的探头。 3 工作模式 s e c m 是以电化学原理为基础的，具有以下两个优点：( 1 ) 能够用于反应机 理的研究和探测界面现象；( 2 ) 分辨率高，在微米级和纳米级范围内，传质速 一 生堡查兰堡主兰些堡苎 度快，可以在稳态条件下研究快速反应过程。s e c m 可以以多种模式进行实验 如反馈模式、产生收集模式、穿透模式、离子转移反馈模式、平衡扰动模式、 电位测定。在此仅简单介绍一下反馈模式和产生，收集模式。 3 1 反馈模式 反馈模式是s e c m 实验中最常用的，也是可用于定量分析的一种工作 模式( 见图2 ) 。在反馈模式中，u m e 做为三或四电极体系中的工作电极，相当 于其它扫描探针显微镜中的探头。最常用的探头是外部包着绝缘玻璃的微米圆 盘电极有时根据实验需要还选用圆锥形、球形及凹形电极作为s e c m 的探头。 探头的电位是相对于参比电极的电位，电荷在探头和对电极之间流动。所要研 究的样品通常称之为基底，基底也可以作为第二个工作电极。在这种情况下， 用一个双恒电位仪来控制探头和基底电极的电位。所有电极都浸泡在含有氧化 还原介质的电解质溶液中。 以还原型介质( r ) 为例，当探头上所加的电位足够j e 时，r 在探头上发生 氧化反应( 见反应式( 1 ) ) 。 r n e oo( 1 ) 此时电极反应速度是受r 扩散到探头上的速度控制的( 见图1 3 a ) 。当探头离 基底很远时，探头上的稳态扩散电流f t 。符合公式( 2 ) 。 i t 。= 4 n f d r c r a ( 2 ) 式中 是电子转移数，f 是法拉第常数，d r 是r 的扩散系数，c r 是r 的浓度， a 是探头的半径。 公式( 2 ) 不仅适用于微圆盘探头，还适用于其它形状的小探头。当探头向 导体基底逼近至探头与基底的距离( d ) 大约为几个a 时，在探头上所产生的被 氧化的物质( o ) 就可以扩散到基底上并能在基底上重新还原成r 。这种使探头 上的电流( f t ) 增加的过程被称为正反馈，即f t f t 。( 见图2 3 b ) 。d 越小，f t 越大。当基底反应是个快反应时，如果d o ，则f t m 。反之，当基底是绝缘 体时，探头产生的物质( o ) 则不能在其表面上发生反应。绝缘体在此仅起到一 个阻碍r 从本体溶液扩散到探头上的作用，此时i t 随d 的减少而降低，即f r 金圆盘工作电极、铂辅助电极和a g a g c l 参比电 极( 1m o l l k c i ) 组成，该三电极体系用于伏安法及s e c m 检测。 1 2 2 材料与试剂 苯醌( b q ，化学纯。北京芳草药学化工研制公司，北京) ，氢醌( h 2 q ，分 析纯，中国医药( 集团) 上海化学试剂公司，上海) ，h 2 0 2 ( 含量3 0 ，分析纯， 江苏徐州试剂二厂，徐州) ，生物索化d n a 探针( 分子量为1 3 5 9 5 ，属于免疫 球蛋白重链可变区，碱基顺序为：5 一b i o t i n c c g a g a g t c c g a c a a g t a a a c g t c t a t g t c g c a c a a g a a c 。g e n e d e t e c t ， a u c k l a n d ，新西兰) ，生物素化目标d n a ( 分子量为1 3 2 9 2 ，碱基顺序为：5 一 b i o t i n g g c t c t c a g g c t g t t c a t t t g c a g a t a c a g c g t g t t c t t g ， g e n e d e t e c t ，a u c k l a n d ，新西兰) ，链霉亲和素一h r p 结合物( h r p 活性为2 0 7 u m g ，链霉亲和索活性为7u m g ，p i e r c e ，r 0 r k f o r d ，i l l i n o i s ，美国) ，链霉亲 和素覆盖的聚苯乙烯板( 3 8 4 孔，无色，平底，底宽2 8m m ，孔深1 1m m ，s i g m a ， s a i n tl o u i s ，m i s s o u r i ，美国) ，牛血清白蛋白( b s a ，上海市浦江应用生物化学 研究所，西德进口分装) ，n a i l 2 p 0 4 2 h 2 0 ( 分析纯，西安化学试剂厂，西安) ， n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ( 分析纯，汕头市化学试剂厂，汕头) ，n a c l ( 分析纯，天津 塘沽化学试剂厂，天津) ，柠檬酸钠( 分析纯，天津市广成化学试剂有限公司， 天津) ，乙二胺四乙酸二钠( e d t a ，分析纯，上海化学试剂一厂，上海) ，十二 烷基磺酸钠( s d s ，分析纯，白鹤化工厂，上海) ，三羟甲基氨基甲烷( t r i s ， 纯度 9 9 8 ，a m e r s c o 分装，s o l o n ，o h i o ，美国) ，h c l ( 分析纯，含量3 6 一3 8 ，淄博化学试剂一厂，淄博) ，聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酯( t w e e n - 2 0 ， s i g m a ，s a i n tl o u i s ，m i s s o u r i ，美国) 。链霉亲和素一h r p 结合物的溶解液( 0 1 5 m o l l n a c l ，0 0 lm o l l n a 3 p 0 4 ，p h6 8 ) ：称取o 4 3 8g n a c i ，0 1 9 0g n a 3 p 0 4 ，溶 于4 0 m l 水中，用1m o l l h c i 调p h 至6 8 ，定容至5 0 m l 。高压灭菌后，用于溶 解分装链霉亲和素一h i 冲结合物。 生物素化d n a 的溶解液( o 0 1 0m o l l t r i s ，0 0 0 1m o l l e d t a ，p h7 8 8 ) ：称 取0 0 6 0 6g t r i s ，0 0 1 8 6g e d t a ，溶于4 0 m l 水中，用1 m o l l h c i 调p h 至7 8 8 ， 定容至5 0m l 。高压灭菌后，用于溶解分装生物素化d n a 。 链霉亲和素一h r p 结合物的溶解分装：移取1m l 灭过菌的链霉亲和素一h r p 结合物溶解液于装有1 0m g 链霉亲和素一h i 强结合物粉末的试剂瓶中，振荡2 l7 山东大学硕士学位论文 r a i n 。充分溶解后。平均分装到2 0 个离心管中，每管分装5 0 此，于一2 0 。c 保存。 分装操作在超净工作台中进行，溶液中h r p 的浓度为2 0 7u m l 。 生物素化d n a 的溶解分装：把分别装有7 0 g 生物素化d n a 探针和1 0g g 生物素化目标d n a 的离心管1 0 0 0r p m 离心1m i n ，使生物素化d n a 粉末聚集在 离心管的底部。小心打开盖子，向装有生物素化d n a 探针的离心管中加入5 0 0g l 生物素化d n a 溶解液，向装有生物素化目标d n a 的离心管中加入18 0 此生物素 化d n a 溶解液，盖上盖子，水化2 m i n ，振荡1 m i n ，混匀，1 0 0 0r p m 离，t l , 3 0 s 。 然后把5 0 0g l 生物索化d n a 探针溶液平均分装到5 0 个离心管中，每管分装1 0 儿。 把1 8 0 此生物素化目标d n a 溶液平均分装到1 8 个离心管中，每管分装1 0 旺， 于2 0 。c 保存。分装操作在超净工作台中进行，生物素化d n a 探针溶液的浓度为 1 0 5 x 1 0 一m o l l 。生物素化目标d n a 的浓度为4 1 8 x 1 0 6m o l l 。 生理盐水( p b s ，0 1 5m o l l n a c i ，7 6 x 1 0 一m o l l n a 2 h p 0 4 ，2 4 1 0 。m o l l n a i l 2 p 0 4 ) ：称取1 7 0g n a c i ，o 5 1 6g n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ，o 0 8 7g n a l t 2 p 0 4 2 1 - 1 2 0 溶 于水中，然后定容至2 0 0 m l 容量瓶中。现用现配。 o 2 0m o l l 磷酸缓冲溶液( p h7 0 ) ：称取4 3 6 9gn a 2 h p 0 4 + 1 2 h 2 0 ，1 2 1 7g n a i l 2 p 0 4 2 t i 2 0 溶于水中，然后定容至1 0 0m l 容量瓶中。现用现配。 1 0 s s c ( 1 5 m o l l n a c i ，0 1 5 m o l l 柠檬酸钠，p h7 0 ) ：称取8 7 6 6g n a c i ， 4 4 1 2g 柠檬酸钠溶于8 0 m l 水中，用1m o l l h c l 调p h 至7 0 ，定容于1 0 0 m l 容量瓶中，高压灭菌后室温保存。 洗膜缓冲液储液( 0 5m o l lt r i s ，2m o l ln a c i ，3 t w e e n - 2 0 ，p h7 4 ) ：称 取3 0 2g t r i s ，5 8 4 4g n a c l ，移取1 5 m l t w e e n 一2 0 于5 0 m l 烧杯中，调p h 至7 4 ， 定容至5 0m l 容量瓶中，4 。c 存放。洗膜缓冲液由洗膜缓冲液储液稀释1 0 倍而得。 2 5 s d s ：称取2 5gs d s ，溶于水中，然后定容至1 0 0m l 容量瓶中，室温 存放。 2 x s s c ( 含o 2 os d s ) ：移取2 0m l1 0 s s c ，8m l 2 5 s d s 于1 0 0m l 容量 瓶中，加水定容，室温存放。 2 s s c ( 含o 3 t w e e n 2 0 ) ：移取2 0m l 1 0 s s c ，0 _ 3m l t w e e n - 2 0 于1 0 0m l 容量瓶中，加水定容，室温存放。 洗膜缓冲液( 含3 b s a ) ：称取o 3gb s a 溶于1 0m l 烧杯中，再移取1 m l 洗膜缓冲液储液，定容至1 0m l 。室温存放。 o 1 0 0m o l lh 2 q ：称取0 1 1 0gh 2 q ，加水，超声溶解，定容至1 0 0m l 容量瓶 中，避光保存。 o 1 0 0 m o l l h 2 0 2 ：移取0 1 0 6 m l h 2 0 2 于1 0 m l 容量瓶中，加水定容，4 。c 保 l b 些壅盔堂堡主兰垡堡塞 存。 o 0 5 0 m o l l b q ：称取o 0 5 4 1g b q 溶于水中，定容于1 0 m l 容量瓶中，避光 保存。 生物素化d n a 探针溶液( 5 2 5 x 1 0 6m o l l 生物素化d n a 探针，0 0 7 5m o l l n a c i ，3 8 1 0 一m o l l n a 2 h p 0 4 ，1 2 1 0 。3 m o l l n a h 2 p 0 4 ) ：移取2 t l l p b s ，2g l 1 0 5 1 0 4 m o l l 生物素化d n a 探针溶液于离心管中，混匀。现用现配。 生物素化目标d n a 溶液( 2 0 9 1 0 击m o l l 生物素化目标d n a ，0 1 5m o l l n a c i ，0 0 1 5m o l l 柠檬酸钠) ：移取31 t l 2 s s c ( 含0 2 s d s ) ，3 “l 4 1 8 1 0 4 m o l l 生物素化目标d n a 溶液于离心管中，混匀。现用现配。 链霉亲和素一h r p 结合物溶液( h r p 的浓度为6 9u m l ，0 2 b s a ，o 3 3m o l l 7 i r i s ，1 3 3m o l l n a c i ，2 t w e e n 2 0 ) ：移取4 此洗膜缓冲液( 含3 b s a ) ，2 1 t l 2 0 7u l 链霉亲和素一h r p 结合物溶液于离心管中，混匀。现用现配。 1 2 3 实验方法 1 2 3 1 高压灭菌 生物素化d n a 和链霉亲和索一h r p 结合物等生物产品，保存或使用不当就会 变质或失活，同时也要防止外源性的污染，因此在试验过程中，需进行必要的灭 菌操作，以将微生物的污染程度降至最小。首先需要对溶解分装生物产品所需的 离，t l , 管及一次性吸头用电热压力蒸汽消毒器进行高压灭菌。灭菌的基本操作步骤 如下：1 打开锅盖，向锅内加入适量水，使水面与桶底的三角支架持平，并把内桶 放在三角支架上；2 将所要灭菌的离心管及一次性吸头包在塑料袋内，连同需要 灭菌的溶液一齐放入内桶，并保持一定距离，以免影响蒸汽流通和灭菌效果；3 加 盖，旋紧螺旋，打开放气阀，接通电源加热，冒蒸汽约1 0m i n 后关闭放气阀；4 待压力升至0 1 4m p a 时，切断电源，当压力降至0 1 0m p a 时再打开电源，将压力 保持在该范围内约2 0m i n ，切断电源停止加热；5 压力降至0m p a 时，打开锅 盖，取出灭菌物品，置于超净工作台中至室温。用蒸汽消毒器高压灭菌的同叫， 把移液器( o 5 一l o 此可调、5 0 此、1 0 0 1 l l ，e p p e n d o r f ，h a m b u r g ，德国) 放入超 净工作台中，打开紫外灯进行消毒。由于购买的生物素化d n a 及链霉亲和素一h r p 结合物是粉末状的，所以在使用之前需要将其溶解，为了避免重复取样带来的污 染，溶解后还需对其进行分装。 1 2 3 2 工作电极的处理 金电极( 1 4p m 直径) 在使用前用0 0 5 l a m 的a 1 2 0 3 抛光，尖端绝缘玻璃层 1 9 山东大学硕士学位论文 直径约为5 0g m ( r g 5 ，其中r g = b a ，b 为探头绝缘层的半径和电极半径之 和，为探头的半径) 。然后依次分别在无水乙醇、1m o l l n a o h 、1m o l l h n 0 3 、 亚沸蒸馏水中超声将电极清洗干净，晾干备用。 1 2 3 3 微量加样器的制备 把内径为1 5l - t m 的毛细管( 3 7 5i n n 外径，河北省永年瑞丰色普器件有限公 司，河北) 的一端用石蜡固定在注射器的针头中。插入注射器并用二次水打通， 使其内部充满水。然后把毛细管的另一端竖直插入4 0 的氢氟酸中。为防止氢 氟酸扩散到毛细管内部腐蚀内腔，每隔几分钟给注射器加压，令毛细管的内腔 始终充满水。6 0m i n 后将毛细管从氢氟酸中取出，在显微镜下观察毛细管端 呈细锥形，内腔没有扩大( 见图1 - 3 a ) 。把刻蚀好的毛细管用环氧树脂固定在 2 5 乩的微量进样器( 上海安亭微量进样器厂，上海) 的针头巾，固化2 4 小时 ( 见图1 3 b ) 。 a b i 上堂l _ 一 il 聚丙烯酰胺玻璃管 内腔 不锈钢芯进样器 针头毛细管 图1 - 3a h f 刻蚀后毛细管的端部示意图；b 微量加样器示意图 1 2 3 4d n a 杂交 因为购买的链霉亲和素覆盖的聚苯乙烯板是3 8 4 孔固定在一起的，而每次实 验只需要一个小孑l ，所以使用前先用锯条锯下一个孔，并把小孔的凹个侧面也锯 掉。将链霉亲和素覆盖的聚苯乙烯板用5 0 2 胶固定在灭菌塑料培养皿( 5 0m m 直 径，b b i ，t o m t o ，加拿大) 的底部，用p b s 冲洗，晾干。在聚苯乙烯板的中央滴 上一滴直径为1 0 0 “m ，浓度为5 2 5 1 0 。6m o l l 生物素化d n a 探针溶液，盖上培 上t 坐查查堂堡主堂垡笙壅 养皿盖，然后把培养皿放入湿盒，于恒温箱中2 5 ( 2 温育2 小时。2 小时后，用5 0 儿 p b s ( 含o 1 t w e e n 一2 0 ) 洗板四次，在聚苯乙烯板上滴加3i t l2 0 9 x 1 0 6m o l l 生物 素化靶d n a 溶液，盖上培养皿盖，放入湿盒，于恒温箱中4 2 温育3 小时进行杂 交。杂交反应结束后，用5 0u l 2 s s c ( 含o 3 t w e e n 一2 0 ) 洗板四次，每次振荡 3r a i n 。在聚苯乙烯板上滴加3 此洗膜缓冲液( 含3 b s a ) ，振荡t 5m i n ，用吸 水纸吸干。然后在聚苯乙烯板上滴加3 此6 9 u m l 的链霉亲和素一h r p 结合物溶 液，于2 5 c 温育3 0m i n 。最后用洗膜缓冲液和0 2m o l l 磷酸缓冲液( p h7 0 ) 分 别洗板四次，进行s e c m 检测。 1 2 3 5 伏安法 在灭菌塑料培养皿( 5 0 m m 直径) 中加入4 7 5 m l 0 2 m o l l 磷酸缓冲溶液( p h 7 0 ) ，将三电极体系的各电极接至电化学分析仪上，记录空白溶液的循环伏安曲线。 再向缓冲溶液中加入2 5 0p l o 1 0 0 m o l l h 2 q 溶液和5 0 0p l5 0 0 1 0 也m o l l b q 溶 液，记录伏安曲线。 1 2 3 6s e c m 探头渐进曲线和s e c m 图像 为了进行s e c m 图像扫描，需要首先把探头逼近到距离基底足够近的高度， 以便自2 够检测到产物b q 的还原电流信号。在培养皿中加入4 m l 0 2m o l l 磷酸缓 冲溶液( p h7 o ) 和4 0i t l 0 1 0 0m o l lh 2 q ，将探头的电位恒定于+ 0 8v ，设定 1 4i t m 金圆盘探头沿z 轴向基底逼近，当电流降至极限电流的8 0 时停止逼近， 记录此过程的探头渐进曲线( 见图1 4 a 中的曲线) 。为了确定此时探头与基底的 距离，将换算后的校正探头电流一距离曲线( 图1 4 b 中的实线) 与理论曲线( 图 1 4 b 中菱形组成的曲线) 进行比较，可以得出探头与基底的距离约为探头的直径。 此时对于1 4 l a m 金圆盘探头，它与基底的距离约为1 4 t t m 。加入4 0 i t l o 1 0 0 m o l l h 2 0 2 ，将溶液搅拌均匀。这时将探头的电位改为一o 3v 以便测定与d n a 相连的 h r p 催化h 2 q 与h 2 0 2 反应产生的b q 。为了找到d n a 点的位簧，将探头沿x 、 y 轴扫描，找到d n a 点处的电流比基线电流有显著增加，确定扫描范围。具体方 法如下t 示于图1 5 ) ：当探头沿x 轴( 即直线1 ) 扫描时，探头测得的电流会有 明显升高。在探头扫描曲线中为一个正峰，说明此处有d n a 点。这是由于与d n a 札l 连的1 1 刚，催化反应产生大量的b q 所致。在扫过整个d n a 点后，让探头回扫 ( 即沿直线2 扫描) 并停留在电流最高点的位置。然后将探头沿y 轴的直线3 扫 描。扫过d n a 点后再沿y 轴回扫过整个d n a 点( 直线4 ) ，直线4 的扫描轨迹就 为d n a 点信号变化最大的扫描轨迹。然后把探头沿直线5 移动到扫描起点，搅拌 山东大学硕士学位论文 溶液，将溶液中的物质混匀，待其稳定3r a i n 后，再进行s e c m 扫描。所有实验 是在室温2 5 士2 。c t 完成的。实验结果用o r i g i n6 0 软件处理。 图1 - 4 探头逼近玻璃基底的探头渐进曲线录f 校正探头电流一距离曲线 a ，探头渐进曲线；b ，实线为校正探头电流一距离曲线，菱形为理论曲线。0 2 m o l l 磷酸缓 冲溶液( p h7 o ) ，3 0 0 x 1 0 3 m o l l h 2 q ：探头电位，o 8 v ；步进速度，5g m s 。 ，r、 欲 占a 斑i 4 扫描起始点 图l 。5 确定d n a 点扫描范围的方法 1 ，4 为实线：2 ，3 为虚线。 y x 1 3 结果与讨论 1 3 1 金探头半径的测定 图i - 6 是金电极在1 0 0 x 1 0 。2m o l lk 3 f e ( c n ) 6 j i 0 5 0 0m o l lk c i 溶液中的 2 ， 8 6 4 2 o l 0 0 0 0 2 o 9 8 7 6 一己v 、 赫b 己 o 000加 如帅，引 a 如0 r 些查查! ! ! 生堂些堡兰 循环伏安【i i 线，从图l 一6 可以看出，k 3 f e ( c n ) 6 在金电极上有良好的伏安响应。根 据圆盘微电极的稳态电流公式( 1 - 3 ) 可以求出金探头的半径【3 6 】。 f t 。= 4 n f d c o n( 】一3 ) 式巾，i t 。是稳态极限电流( a ) ，n 为体系中氧化还原电对发生氧化还原反应时 电子转移数，d 为体系中氧化还原物质的扩散系数( c m 2 s ) ，口为探头的半径( m ) ， f 为法拉第常数，c 。为体系中氧化还原物质的浓度( m o l l ) 。 实验测得的f t 。= 1 94 - o 1 x 1 0 一a ，而k 3 f e ( c n ) 6 在a u 电极上发生还原反应 的”= l ，k 3 f e ( c n ) 6 在0 5 0 0m o l lk c i 溶液中的d = 7 2 x 1 0 击c m 2 s1 3 7 l = 1 0 0 1 0 。m o l l ，由此可以计算出探头的半径：6 8l a m 。 1 3 2 h 2 q 和b q 在金电极上的循环伏安响应 s e c m 是通过测定与d n a 相连的h r p 催化h 2 q 和h 2 0 2 反应产生的b q 的浓度 变化来检测d n a 的，因此应首先确定金电极测定b q 的检测条件。图1 6 是1 4g m 金圆盘电极上0 2m o l l 磷酸缓冲溶液( p h7 o ) ( 曲线1 ) 和含4 5 5 x 1 0 。m o l l h 2 q 2 0 1 5 苕1 0 5 o 050 40 30 20 10 0 e ( v ) v s a g a g c i 图1 - 6 k 3 f e