（动物学专业论文）动物microrna相关核心蛋白的生物信息学分析.pdf

摘 要 i 摘 要 非编码 rna 是指不编码蛋白质的一类功能性 rna 分子。其中 micrornas 是一类小的、 大约 22 个核苷酸长的非编码 rnas(non-coding rnas)，这类小分子 rna 在真核生物中参与 许多重要的生物学过程，包括细胞生长、分化、增殖和凋亡等，也具有重要的时序调控功能， 对胁迫的应答反应以及病毒防御功能等。在 1993 年，首先在秀丽隐杆线虫中发现了第一个 microrna，2001 年 micrornas 被正式命名。到现在，在动物、植物和病毒等许多生物中都 发现了 micrornas，截止到 2009 年 3 月根据来自桑格(sanger)研究中心的著名的 micrornas 数据库 mirbase 中的数据，已经在 103 个物种中发现了 9169 个成熟的 micrornas。可见 micrornas 的研究已经成为当前科学研究中一个新的领域和热点。 在动物 micrornas 的发生过程中需要许多蛋白或蛋白复合体的参与， 其中研究较多的是 drosha，dicer，argonaute 和 exportin 5 这四个蛋白家族。为了系统地研究这四个蛋白家族， 我们充分利用生物信息学的手段，在 11 个真核生物的基因组中，包括线虫，果蝇，斑马鱼， 鸡， 鸭嘴兽， 牛， 马， 狗， 大鼠， 小鼠和人类， 系统地分析了 drosha， dicer， argonaute 和 exportin 5 基因家族中的一些重要特征。 本论文研究内容主要包括每个蛋白家族成员的数量，结构域的组成，选择性剪接现象， 核定位信号，这些蛋白是否能与小 rna 作用，编码这些蛋白的基因表达模式，这些蛋白之 间及与其它蛋白的相互作用等。 研究结果简要概括如下： 1. 确定了每个蛋白家族在 11 个真核生物中的成员数量，并鉴别了一些新的成员。 2. 构建了 drosha， dicer， argonaute 和 exportin 5 蛋白家族在不同物种间的系统发生树。 3. 详细地阐明了 drosha，dicer，argonaute 和 exportin 5 基因编码的蛋白质的结构域，并 发现同一基因家族的大部分蛋白质具有相同或相似的结构域。 4. 发现了 drosha，dicer 和 argonaute 基因在所研究物种中的选择性剪切转录本。 5. 鉴定了 argonaute 蛋白家族中的核定位信号序列。 6. 初步预测了 11 个物种中所有基因家族包含的 microrna 的靶标序列。 7. 探索了 drosha，dicer 和 argonaute 基因在人类 34 个不同组织中的表达模式。 8. 构建了人类的 drosha，dicer，argonaute 和 exportin 5 蛋白之间相互作用的网络。 通过以上研究和发现， 提供了动物中的 micrornas 发生过程中这四个核心蛋白的系统信 息，为后续这些蛋白的功能研究指明了道路和方向。 关键词：microrna； drosha； dicer； argonaute； exportin 5 abstract iii bioinformatic analysis of microrna related key proteins in animal genomes abstract non-coding rna (ncrna) genes produce functional rna molecules rather than encoding proteins. non-coding rnas are emerging as central players in gene expression regulation. micrornas are 22 nt long small non-coding rnas that play important regulatory roles in eukaryotes. micrornas involve in the regulation of many important biological processes, such as cell proliferation and differentiation, developmental timing and organ formation, signal transduction and the development of some diseases, especially certain cancers, and also growth control, stress response and antiviral defense. the founding member of micrornas, lin-4, was first identified in c. elegans in 1993. and micrornas were given systematic naming standard in 2001. many micrornas from aminals, plants and viruses have been identified to this day. till march 2009, the mirbase sequence database from the famous sanger institute contained 9539 entried representing hairpin precursor micrornas, expressing 9169 mature microrna products in 103 species.the research on micrornas has been a new field and hot spot of biological research. the biogenesis process of micrornas in animals requires the participation of many proteins, of which, the well studied ones are dicer, drosha, argonaute and exportin 5. to systematically study these four protein families, we screened 11 animal genomes, including c.elegans, drosophila, zebrafish, chicken, platypus, cow, horse, dog, mouse, rat and human, to study genes encoding above mentioned proteins and their important properties. the main researches contained numbers of each protein family, their domain components, alternative splicing phenomenon, nuclear localization signal, the interaction between these genes and micrornas, the expression and regulation pattern and interactions between these proteins and other ones. the results of this research included the following aspects. 1) identified some new members for each protein family. 2) constructed the phylogenetic trees of drosha, dicer, argonaute and exportin 5 protein families among different species. 3) clarified domains of these proteins and the domain analysis results revealed that most proteins within the same family share identical or similar domains. 4) alternatively spliced transcript variants were found for some proteins. 5) identified the nuclear localization signal sequences in argonaute protein families. 6) predicted the target sequences of micrornas in the four protein families among 11 species. 东北农业大学理学硕士学位论文 iv 7) examined the expression patterns of these proteins in different human tissues and identified other proteins that could potentially interact with these proteins. these findings provided systematic information on the four key proteins in animal microrna biogenesis pathway, will shed light on further functional studies of these proteins. keywords：microrna; drosha; dicer; argonaute; exportin 5 candidate: liu xiuying major: zoology supervisor: prof. bai xiujuan and prof. wang xiujie 学位论文独创声明和版权使用授权书 v 独 创 声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 (注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空)或其他教育机构的学位或证书 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、 使用学位论文的规定， 学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密 后适用本授权书) 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 导 师 签 名： 日期： 年 月 日 引 言 1 1 引言 1.1 非编码 rna(non-coding rna)介绍 1.1.1 非编码 rna 及其研究进展 非编码 rna 是指不具有编码蛋白质功能的一类 rna 分子。转录非编码 rna 的 dna 序列叫 rna 基因或非编码 rna 基因。在 1961 年 jacob 和 monod 提出 rna 通过与基因的 操纵子区域配对结合，能够抑制基因的表达 (jacob and monod, 1961)。rna 的功能已经潜在 地涉及到许多重要的细胞学过程， 比如前体 mrna (pre-mrna) 的剪切以及蛋白质的合成等。 rna 干扰现象的发现， 揭开了小非编码 rna 通过转录后修饰的机制。rna 干扰在基因表达 等许多生物学过程中起重要的作用。 常见的非编码 rna 主要包括功能非常重要的转运 rna (transfer rna, trna)，核糖体 rna (ribosomal rna, rrna)，以及 snrnas，snornas，micrornas，sirnas，pirnas 以及 long ncrnas 等，trna 与 rrna 是我们熟悉的非编码 rna，它们主要在基因表达的翻译过 程中起作用；而 snrna 主要在 mrna 剪切过程中起作用，snorna 主要涉及 rrna 的修饰 等。 最近的转录组学及生物信息学研究表明， 在人类基因组中有上千个非编码 rna 的存在， 并且大都是有功能的非编码 rna (birney, et al., 2007; cheng, et al., 2005; washietl, et al., 2007)。 脊椎动物基因组序列的研究表明， 在进化上保留下来的非编码基因远远超过编码基因。 自从发现非编码基因以来，它们的种类、数量以及所发挥的功能越来越受到人们的关注。例 如人类基因组中编码蛋白质的基因数目不足 3 万个，约占整个基因组序列的 2%，而占整个 基因组序列 98%的非蛋白编码区实际上编码了大量的非编码 rna，除了 rrna，trna， snrna，snorna 等非编码 rna 外，近年来发现的 microrna，sirna，pirna 等调控型的 小分子非编码 rna，在基因的转录和翻译，细胞分化和个体发育，遗传和表观遗传等生命活 动中发挥重要作用。 近期，来自冷泉港实验室的科学家利用芯片技术找出两种非编码 rna，men和 men 的新功能， 这两种非编码 rna 对细胞核内 rna-蛋白复合体的结构和形态的维持具有关键 的作用 (sunwoo, et al., 2009)。最近有研究组又发现了一类新型的“大型干涉性非编码 rna” (large intervening non-coding rnas，简称，lincrnas)，这些大型非编码 rna 可能具有涉及 从胚胎干细胞多能性到细胞增殖在内的许多功能。特定 lincrnas 是由包括 p53、nfkb 和 sox2 等在内的，在基因表达调控过程中起关键作用的转录因子，而且这些 lincrnas 大多数 在不同哺乳动物中都保留了下来。lincrnas 对生命健康以及疾病都有重要的影响，特别是 对癌症产生，免疫学和干细胞生物学特性的维持等都有重要的作用 (brodersen and voinnet, 2009)。 总之，非编码 rna 特别是 microrna，sirna 等是现代生命科学研究的热点，近年来国 内外在非编码 rna 方面取得了举世瞩目的成就。其研究领域从非编码 rna 的发现与鉴定， 到非编码 rna 的结构与功能，系统发生，信号转导以及在基因表达调控中的作用等等，掀 东北农业大学理学硕士学位论文 2 起了非编码 rna 研究的热潮。 1.1.2 非编码 rna 的识别与鉴定 对于非编码 rna 的筛选，主要是通过生物信息学的手段在模式生物，如线虫和果蝇等 全基因组内预测，然后通过生物学的实验进行验证。目前基于生物信息学的手段发现的非编 码 rna， 真核生物中平均有上千个， 原核生物基因组中平均有上百个非编码 rna (hershberg, et al., 2003; washietl, et al., 2005a; washietl, et al., 2005b; zhang, et al., 2004b)。最近利用生物信 息学的方法在蓝细菌中也发现了非编码 rna (voss, et al., 2009)。这些非编码 rna 的功能包 括参与 dna 的复制，染色质的重塑，转录调控，rna 编辑，mrna 的稳定性和翻译以及蛋 白质的翻译和稳定性调控等 (ambros, 2001; bartel, 2004; hannon, et al., 2006; tuschl, 2003; volpe, et al., 2002)。最近几年新的生物信息学和实验手段已经在模式生物中鉴定出了更多的 非编码 rna，所有的这些发现都表明非编码 rna 的数量和种类远比我们期望的要多。 对于非编码 rna 的生物信息学预测，以前主要是基于序列的相似性等特征，而现在更 多是基于非编码 rna 能够反应功能信息的二级结构特征来预测。例如有一研究组开发出一 识别非编码 rna 的算法 grapple， 主要是基于反映非编码 rna 功能的二级结构模型以及基 于图形属性的非编码 rna 在 rfam(rna families)数据库中的分类 (childs, et al., 2009) 来预 测非编码 rna。最近有研究组通过非编码 rna 结构元件的热力学稳定性结合比较基因组学 的方法在酵母基因组中预测非编码 rna (kavanaugh and dietrich, 2009)。 总之， 对非编码 rna 的预测方法更加先进，其结果也相对更加准确。 对于实验验证， 主要有 northern 杂交或利用芯片系统来检测整个基因组以获得新的转录 物，分离鉴定 cdna 克隆用于富集非编码 rna，cdna 末端快速扩增法(race)，和高通量 测序等方法。 1.1.3 非编码 rna 的功能研究 非编码 rna 的功能主要体现在以下几个方面： 一是影响染色质的结构进而影响转录。例如哺乳动物的 xist(x inactive specific transcript) 基因编码的非编码 rna，可以使两条 x 染色体随机失活一条，从而使雌雄性 x 染色体的转 录水平保持一致。 二是非编码 rna 在 rna 转录后的加工修饰中起重要作用。例如线虫中的 micrornas， lin-4 和 let-7，主要通过与靶标 mrna 的 3非翻译区配对结合，从而抑制翻译。 三是非编码 rna 在翻译后水平对基因的调控，主要包括 mrna 的稳定性及蛋白质翻译 的调控。研究较多的是 micrornas 和 sirnas，其功能多与发育的时序调控有关，例如 micrornas 对衰老和死亡的调控作用 (boehm and slack, 2005)。 1.2 microrna 介绍及研究进展 micrornas (mirnas) 是一类小的内源性非编码 rna，长度大约为 22 个核苷酸，主要 通过序列互补配对的方式对靶 mrna 的表达进行调控。micrornas 在真核生物中参与许多 重要的生物学过程，包括细胞生长、分化、增殖和凋亡等，也具有重要的时序调控功能，对 引 言 3 胁迫的应答反应以及病毒防御功能等 (bartel, 2009; cordes and srivastava, 2009; voinnet, 2009)。 由于 microrna 仅有 22 个核苷酸左右， 而且往往在特殊的组织中表达， 所以很长一段时 间研究者都没有发现这类小 rna，因而曾有人将 microrna 称为生命体里的“暗物质” 。直 到 1993 年，人们首先在秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans)中发现了 micrornas 的最初的 成员 lin-4 (lee, et al., 1993)。但是由于当时实验手段的限制，研究者在之后的 7 年时间内没 有再找到任何新的 microrna。直到 2000 年，另一个 microrna 基因 let-7 才在秀丽隐杆线 虫中被发现 (reinhart, et al., 2000; slack, et al., 2000)，而且研究人员发现 let-7 的序列在从线 虫到人类在内的几乎所有的动物中都高度保守 (pasquinelli, et al., 2000)，这表明这种小 rna 参与的调控机制在动物中是广泛存在的， 而且这两个 micrornas 的功能缺失突变体都表现出 强烈的发育时序调控缺陷 (boehm and slack, 2005; reinhart, et al., 2000; wightman, et al., 1993)。在 2001 年，来自德国和美国的三个实验室同时在科学(science)杂志上报道了近 百个分别在线虫和人类的细胞中找到的这类小 rna，这时 micrornas 才被正式命名 (lagos-quintana, et al., 2001; lau, et al., 2001; lee and ambros, 2001; ruvkun, 2001)。他们的研 究工作被认为是 microrna 研究的重大突破，主要体现在以下三个方面：一是建立了一套 microrna 克隆的试验方案， 并且第一次大规模地在多个物种中发现了新的 microrna； 二是 建立了一套规范的 microrna 命名体系，并为研究者所接受；三是提出了 microrna 的几个 重要的生物学特征，主要包括 microrna 在基因组上的位置和序列特征，microrna 前体的 发夹结构，microrna 表达的时序性和组织特异性，以及 microrna 在不同物种之间的保守 性等。自从那时起，人们通过克隆测序，生物信息学预测等方法在很多真核生物包括植物， 动物中都发现了大量的micrornas。 如2002年在拟南芥中发现了microrna的存在 (reinhart, et al., 2002)，此后在玉米和水稻中也发现了 microrna。2004 年，tuschl 的研究小组通过对 疱疹病毒的研究，首次在病毒基因组中发现了 microrna (pfeffer, et al., 2004)，最近又在一些 病毒基因组中发现了 microrna (cullen, 2009)。 国内对 microrna 的研究也是日新月异。中科院遗传发育所的王秀杰实验室和北京生命 科学研究所的戚益军实验室合作，在基因与发育(genes ruby, et al., 2007)，但是这一过程在micrornas的成熟过程中是至关重 要的。切割之后，pre-micrornas在ran-gtp依赖的exportin 5蛋白的转运下，从细胞核转运 到细胞质 (bohnsack, et al., 2004; lund, et al., 2004; yi, et al., 2003)。 在细胞质中， pre-micrornas被另一个rnase iii型酶dicer识别， dicer蛋白主要依靠其paz 结构域，识别被drosha蛋白切割形成的在3端的两个核苷酸长度的悬垂碱基，然后从发夹结 构的区域切成长度约22个核苷酸的成熟的micrornas (grishok, et al., 2001; hutvagner, et al., 2001; ketting, et al., 2001; liu, et al., 2008)。然后成熟的micrornas的一条链进入microrna介 导的沉默复合体 (microrna-induced silencing complexes，risc)，复合体中的argonaute蛋白 (ago) 作为一个关键的组分指导micrornas与靶mrnas相互作用 (liu, et al., 2008; schwarz, et al., 2003)。 1.4 microrna 与靶标 mrna 的作用机制研究进展 micrornas 的主要功能是通过与 mrnas 靶序列之间的互补配对，对靶 mrnas 进行翻 译抑制或将其降解。micrornas 结合到靶 mrnas 上，抑制 mrna 的翻译或对靶 mrna 进 行降解 (bartel, 2009)。抑制翻译还是降解 mrna 的作用主要取决于 microrna 和它的靶 mrna 之间的匹配程度，匹配程度高的靶 mrna 将被降解 (valencia-sanchez, et al., 2006)。 不完全匹配的靶 mrna 将被有效地抑制翻译。 正是由于这种不完全匹配抑制翻译的机制， 可 以使一个 microrna 有多个靶 mrnas，相反几个 micrornas 也可以同时结合一个靶 mrna (ying and lin, 2006)。 因此， 这种复杂的基因表达调节网络可以通过一个 microrna 来经济地 调节多个基因的表达，也可以通过几个 micrornas 来共同调节某一基因的表达。 在动物中 micrornas 与靶 mrnas 的结合配对，通常存在一些不完全配对的情况，也就 引 言 5 是所说的错配 (gaps/mismatches)， 一般允许三个碱基之内的错配， 这通常发生在 mrna 的 3 非翻译区域 (untranslated region, utr) (doench and sharp, 2004)， 因此靶 mrnas 的翻译受到 了抑制。动物中 microrna 与靶 mrna 的匹配有多种模式，而且在同一靶 mrna 上的作用 位点也从一个到几个不等。一般情况下，microrna 的 5端 28bp 的“种子区”(seed region) 与靶 mrna 完全匹配，并在抑制翻译过程中起到关键的作用，其余部分的匹配模式对靶 mrna 的翻译效率也有一定的影响。microrna 与靶 mrna 结合后，通过 risc 复合体把 mrna 运输到细胞质处理小体 (p-bodies)，在这里对 mrna 进行回收和降解 (liu, et al., 2005)。 目前普遍认为人类中有1/3以上的基因被microrna调控 (lewis, et al., 2005; xie, et al., 2005)。 相反，植物的 micrornas 倾向于结合到靶 mrnas 的编码区域，从而对靶 mrnas 进行 降解 (chuck, et al., 2009)。少数情况下 micrornas 也会结合到靶 mrnas 的 5非翻译区，从 而激活转录 (henke, et al., 2008)。 (hammond, 2005) 图 1-1 micrornas 的生物发生过程。microrna 基因在 rna 聚合酶 ii 的作用下转录， 生成前体转录本 pri-microrna。然后在细胞核中被 drosha 切割生成 pre-microrna，在 exportin 5的作用下转运出细胞核。 在细胞质中被dicer切去茎环结构， 成为成熟的microrna， 然后在解旋酶的作用下被解链为 microrna:microrna*，后者在胞质中被降解。单链的 microrna 进入 risc 复合体，在 risc 中的 argonaute 蛋白家族的指导下 microrna 与靶 mrna 互补配对，从而实现对靶 mrna 的切割或抑制。 东北农业大学理学硕士学位论文 6 fig.1-1 biogenesis pathway of micrornas. microrna genes are transcribed by rna polymerase ii. the primary transcript is referred as “pri-microrna”. drosha processing occurs in the nucleus. the resulting precursor, “pre-microrna”, is exported to the cytoplasm for dicer processing. in a coordinated manner, the mature microrna is transferred to risc and unwound by a helicase. mrna targets that duplex in the slicer scissile site are cleaved and degraded, if the microrna is loaded into an argonaute risc. mismatched targets are translationally suppressed. 1.5 microrna 的功能研究进展 早期发现的 micrornas，如 lin-4 和 let-7 在线虫胚胎发育的不同时期和细胞分化的过程 中起到很重要的作用。 一旦这些 micrornas 的基因突变， 就会影响幼虫特定细胞的分化 (lee, et al., 1993; reinhart, et al., 2000)。在果蝇的发育过程中，也发现了 microrna 能通过调控某 些基因的表达，影响果蝇平衡杆向翅的同源异形转化 (ronshaugen, et al., 2005)。另外， microrna 还能调控许多细胞信号转导途径，例如 mir-14 能调控蜕皮激素受体的表达，从而 影响蜕皮激素信号的表达 (varghese and cohen, 2007)。总之，microrna 在胚胎的发育和细 胞分化，以及信号转导途径中起着重要的作用。 近年来，microrna 在癌症中的作用已成为研究的热点，而且已经通过基因芯片技术鉴 定了 microrna 在多种癌症中的表达模式 (calin, et al., 2004)。 尽管大多数已知的动物 microrna 特异的靶标 mrna 还没有被证明， 但是越来越多的证 据表明，microrna 在许多重要的生物过程中发挥着重要的作用，比如细胞的增殖和分化， 发育和器官的形成，激素信号转导 (vaucheret, 2006) 以及一些疾病，特别是肿瘤、癌症以及 神经性疾病等 (leung and sharp, 2007; sun and tsao, 2008; wang, et al., 2008)。 在哺乳动物中， 有研究者预测 microrna 能够控制大约 30%的编码蛋白质的基因的活性，而且现在已有证据 表明 microrna 几乎参与调控了所研究的每一个细胞过程 (filipowicz, et al., 2008)。 近期对 microrna 的调控研究发现，microrna 对哺乳动物免疫系统具有重要的调控作 用。 研究者发现用遗传手段敲除某一 microrna 或是使某一 microrna 基因的功能减弱(与免 疫功能相关的 microrna)，对免疫系统的发育会造成重大的影响， 导致机体发生疾病。 例如， 可能引发自体免疫疾病甚至是癌症。单个的 microrna 就能调节上百个靶基因来影响蛋白表 达，从而对生物体的正常生理功能造成影响，比如某些关键蛋白表达量的降低，可能会导致 细胞功能异常，甚至产生疾病 (xiao and rajewsky, 2009)。 在植物中，microrna 在植物的形态建成、花器官发育和营养代谢等方面都有很重要的 作用。受 microrna 调控的靶标基因很多，包括各种转录因子、各种酶类，如泛素结合酶、 f-box 蛋白等。例如在赤霉素的信号途径中，achard 等发现短日照条件下，受赤霉素调控的 microrna159 (mir159) 对 gamyb 相关蛋白 mnra 进行切割，当过表达 mir159 时，开花 时间延迟、花粉囊发育异常等 (achard, et al., 2004)。另外植物 microrna 对外界逆境胁迫的 应答具有重要的调节作用。例如，mir399 能通过调控其靶基因泛素结合酶 e2 的表达，进而 影响体内磷的吸收和转运相关的蛋白质的稳定性，从而调节体内的磷的平衡，使植物免受高 磷和低磷环境的胁迫 (chiou, et al., 2006; fujii, et al., 2005)。 近年来在病毒学研究中，也发现microrna在病毒中发挥着重要的作用 (pfeffer and 引 言 7 voinnet, 2006)。2004年研究者首次在epstein-barr病毒(epstein-barr virus，ebv)中鉴定了5个 microrna (pfeffer, et al., 2004)。 近期又有研究者发现ebv中的microrna-155在调控ebv调节 的基因表达途径中具有重要的作用 (yin, et al., 2008)。最近在艾滋病毒(hiv)研究中，也发现 microrna在艾滋病毒的感染、传播中起着重要的作用 (chable-bessia, et al., 2009; ouellet, et al., 2009)。 最近中科院遗传发育所王秀杰实验室和得克萨斯州anthony griffiths实验室合作在 猕猴疱疹病毒中也发现了microrna (besecker, et al., 2009)。总之，microrna在动物、植物以 及及病毒中都行使着重要的生物学功能。 1.6 microrna 产生与功能行使中核心蛋白的结构和功能研究 在 microrna 生物发生过程以及功能行使的过程中，需要许多蛋白或者蛋白复合体的参 与。 在这些蛋白家族中， 研究较多的是 drosha， dicer， argonaute 和 exportin 5 蛋白家族 (kim, et al., 2009)。 1.6.1 rnase iii 型蛋白家族 根据 rnase iii 型蛋白的结构域组分，可以将其分成三类 (如图 1-2)：第一类蛋白主要存 在于细菌和酵母中。这类蛋白包括一个 rnase iii 结构域 (riiid) 和一个双链 rna 结合结构 域 (dsrbd)。第二类蛋白包含两个 rnase iii 结构域 (riiida 和 riiidb) 和一个双链 rna 结 合结构域， 两个 rnase iii 结构域通常作为同源二聚体形成一个单独的处理中心而行使其功能 (zhang, et al., 2004a)。 这类蛋白及其同源蛋白主要在动物中被发现， 其分子量在 130160kda， 拥有较长的 n 端，而且 n 端富含脯氨酸，丝氨酸和精氨酸。drosha 属于第二类蛋白。第三 类蛋白包含 dicer 的同源物，在酵母、植物和动物中都是非常保守的。这类蛋白除了包含两 个 rnase iii 结构域和一个双链 rna 结合结构域外，在长的 n 末端还有一个 rna 解旋酶 (helicase) 结构域，也有 duf283 和 paz (piwi/argonaute/zwille) 结构域。 (han, et al., 2004) 图 1-2 rnase iii 型蛋白分类示意图。根据结构域的不同将 rnase iii 型蛋白分为三类， 分别为第一类(class i)，第二类(class ii)和第三类(class iii)。 fig.1-2 the rnase iii proteins figure. rnase iii proteins are grouped into three classes based on their domain orgnization, class i, classii and classiii. 尽管 drosha 和 dicer 都是 rnase iii 型酶，但是它们分别属于不同的类。drosha 是第二 类 rnase iii 型酶，而 dicer 属于第三类 rnase iii 型酶 (macrae and doudna, 2007)。大部分 drosha和dicer蛋白中包含两个rnase iii结构域。 另外， dicer也有一个paz结构域和helicase 东北农业大学理学硕士学位论文 8 结构域 (collins and cheng, 2005)。大部分真核生物的基因组中仅仅有一个 dicer 基因，在有 多个 dicer 基因的物种中， 不同的 dicer 基因的产物往往有不同的功能 (lee, et al., 2004; xie, et al., 2004)。 从原核生物 aquifex aeolicus 的 rnase iii 编码蛋白质的晶体结构 (gan, et al., 2006) (如图 1-3 所示)，可以看出两个 rnase iii 作为同源二聚体，其结构域相互接触，并且形成一浅的裂 缝把结构域的两个活性位点分开。在每一个相互接触的反应中心，一些保守的氨基酸残基都 与一个单独的 mg2+相联， 一旦底物与其结合，酶就会改变其构象重新形成相互接触的二聚体 而发挥其功能。 (gan, et al., 2006; jinek and doudna, 2009) 图 1-3 rnase iii 家族晶体结构图。 左边的图表示细菌 thermotoga maritima 分开的两个同 源二聚体的单体。右图表示当底物结合时，在活性位点处 mg2+的催化下构象改变，同源二聚 体重新形成。mg2+用紫色标示，切割位点用箭头表示。 fig.1-3 the crystal structure of rnase iii family enzymes. the crystal structure of rnase iii from the bacterium thermotoga maritima in the rna free state is shown (left). magnesium ions, which are present at the active sites, are shown as purple spheres. cleavage sites are indicated by arrows. from these structures, it is clear that the dsrna-binding domains (dsrbds; blue) undergo a marked rotation on substrate binding. 1.6.1.1 drosha 的结构及功能 drosha 有两个 rnase iii 结构域和一个双链 rna 结合结构域。这两个 rnase iii 结构域 来自分子内二聚体以及茎部的 3和 5链的切割 (han, et al., 2004)。由于 drosha 的双链 rna 结合结构域对于 drosha 的结合是不充分的，drosha 必须借助于另外一个蛋白去替代 rna 的 识别功能。dgcr8(digeorge syndrome critical region gene 8) (也称 pasha)是与 drosha 相互作 用的辅助因子，它与 drosha 相互作用形成一个称为“微处理器”的功能复合体 (denli, et al., 2004; gregory, et al., 2004; han, et al., 2004; landthaler, et al., 2004)。dgcr8 含有两个双链 rna 结合结构域，能够识别特征性的 pri-microrna，主要是识别合适长度的茎环部位的双 链 rna 片段 (han, et al., 2006)。dgcr8 锚定在单链 rna 与双链 rna 结合处，指导 drosha 在结合处切去大约 11bp 的片段(han, et al., 2006)，而且 dgcr8 通过与 drosha 相互作用，能 够稳定 drosha 蛋白 (han, et al., 2009)。 引 言 9 尽管 dgcr8 与 drosha 形成的微处理器，内部的作用机制仍有很多未知的问题。但是有 研究者通过比较基因组学的方法预测，在 dgcr8 的 mrna 中有很多保守的发夹结构，而这 种结构恰好与 pi-microrna 的结构相似，因此这就说明发夹结构可能与 dgcr8 的自主调控 机制有关 (pedersen, et al., 2006)。 如果微处理器的活性发生异常，microrna 的功能就会发生异常。例如在小鼠的胚胎干 细胞中敲除 dgcr8 基因，则不能产生增殖和分化的 microrna (wang, et al., 2007)。在许多人 类的癌症中 microrna 的表达将受到抑制 (lu, et al., 2005b)，这都说明 dgcr8 基因对 microrna 的发生过程的控制是至关重要的。在最近的研究中 dgcr8 能够通过 drosha-dgcr8 复合体对 dgcr8 的 mrna 其进行切割，并使其变得不稳定；也能够通过 drosha 与 dgcr8 蛋白的相互作用， 使 drosha 蛋白变得稳定， drosha 蛋白也有助于控制其它 mrna 的稳定性 (han, et al., 2009)。这种在 drosha 和 dgcr8 之间的自动的和相互的调控， 可能有助于保持 microrna 生物合成过程中的平衡状态。drosha 和 dgcr8 相互调控的模型 见图 1-4。 (han, et al., 2009) 图 1-4 drosha 和 dgcr8 蛋白之间相互调控的模型。当 drosha-dgcr8 复合体在细胞中 增多时， 此微处理器就会切割 dgcr8 的 mrna 的发夹结构， dgcr8 的 mrna 变得不稳定， 最终使 dgcr8 减少。相反由于蛋白的不稳定也会使 drosha 蛋白含量较少，从而降低微处理 器的活性。 fig.1-4 model of t