（病原生物学专业论文）益生菌安全性和免疫调节作用的前瞻性研究.pdf

上海交通大学医学院2 0 0 9 届博士学位论文 中文摘要 益生菌的安全性和免疫调节作用的前瞻性研究 摘要 益生菌是指一类活的，摄入足够量能够对宿主产生有益作用的微生 物。它们大多来源于人或动物肠道的正常菌群，涉及乳杆菌、双歧杆菌、 肠球菌、乳球菌、明串珠菌等多个菌属，通过补充人体消化道内的有益 微生物，改善消化道菌群平衡而对人体产生有益作用。目前益生菌已经 广泛地应用于食品发酵、医疗保健等领域中。 由于益生菌的应用范围具有一定的特殊性，因此其潜在的安全问题 也是不容忽视的重要方面。对于益生菌的安全性评价目前主要集中于四 个方面：1 潜在的感染能力和对细胞的可能负面作用；2 有害的代谢产物； 3 机体免疫系统的过激反应：超敏反应；4 有害基因菌间水平转移。 本论文的第一章包含两个内容，首先从表型和基因型两个方面分析 了国内市场商品中所含益生菌对常用抗生素的耐药性现状，由此作为益 生菌相关产品安全性评价的指标，并为益生菌食品药品相关法规的制定 提供一定的依据。从市场上的食品和药品中分离到共4 1 株商品化乳酸 菌，通过生化反应和分子生物学方法的鉴定，将4 1 株乳酸菌鉴定至种的 水平。先采用纸片法药敏试验初步筛选菌株对1 6 种常用抗生素的耐药表 型。而后通过e t e s t 法检测耐药菌株的m i c 。抽提耐药菌株的基因组 d n a ，用p c r 法筛查了共5 7 个相应的耐药基因。在检测的4 1 株菌中： 所有菌株都对氯霉素、四环素、氨苄西林、阿莫西林克拉维酸、头孢噻 吩和亚胺培南敏感。8 株菌对万古霉素耐药( 1 9 5 ) 。1 7 株菌对环丙 上海交通大学医学院2 0 0 9 届博士学位论文 中文摘要 沙星耐药( 4 1 5 ) 。2 2 株菌对庆大霉素耐药( 5 3 7 ) 。1 株菌对红霉素 耐药( 2 4 ) 。l 株菌对头孢噻肟耐药( 2 4 ) 。5 株菌对利福平耐药( 1 2 2 ) 。2 0 株菌对阿米卡星耐药( 4 8 8 ) 。2 株菌对链霉素耐药( 4 9 ) 。 5 株菌对杆菌肽耐药( 1 2 2 ) 。2 8 株菌对甲基苄氨嘧啶磺胺甲基异嗯 唑耐药( 6 8 3 ) 。p c r 法筛查出2 株植物乳杆菌携带v a n x 基因，l 株 肠球菌携带m s r c 基因，以及l 株链球菌和l 株乳球菌携带d f r a 基因。 结果提示，国内市场上食品药品用益生菌对一些常用的包括抗革兰阳性 菌的抗生素存在着耐药现象，并有一部分菌株携带耐药基因，而耐药基 因潜在的可转移能力会对食品安全构成潜在的危害。 其次，在论文第一章的内容中还对益生菌的氨基脱羧酶活性进行了 检测。具有氨基脱羧酶活性的益生菌能够利用食物中的氨基酸产生生物 胺。人体吸收过量的生物胺后会引起不良的生理反应。从这点出发，对 上海市场上食品和药品中分离出的2 0 株乳杆菌，1 3 株链球菌，3 株乳球 菌和3 株肠球菌的产生物胺能力进行分析检测，以揭示其潜在的安全性 问题。检测的生物胺共包括6 种：分别为酪胺、精胺、尸胺、组胺、腐 胺和色胺。利用添加了前体氨基酸的氨基酸脱羧酶筛选培养基对各菌株 的产胺能力进行初筛，通过筛查培养基中指示剂的颜色变化判定产胺能 力。结果显示在检测的3 9 株菌中，9 株菌具有产酪胺的能力，7 株菌具 有产精胺的能力，1 株菌具有产组胺的能力，1 株菌具有产腐胺的能力。 尤其是精胺和酪胺的产量较高。虽然生物胺的危害水平取决于个体解毒 的能力，但在筛选食品药品用菌株时应运用规范的方法来检测其产生物 胺的能力，以保障相应食品药品的安全问题。 本论文的第二章，从细胞水平研究了益生菌b i f i d o b a c t e r i u ml a c t i s 上海交通大学医学院2 0 0 9 届博士学位论文中文摘要 h n o l 9 与人类小肠上皮细胞i n t - 4 0 7 之间的相互作用，尤其对益生菌对 细胞的免疫调节机制进行了初步研究。首先对b i f i d o b a c t e r i u ml a c t i s h n o l 9 黏附于i n t - 4 0 7 的能力进行了评价，并进一步从形态学角度观察 了b i f i d o b a c t e r i u ml a c t i sh n 0 1 9 对i n t - 4 0 7 的影响，其次从核酸和蛋白水 平检测了益生菌刺激细胞产生细胞因子的能力，并对i n t - 4 0 7 细胞表面 的t o l l 样受体在h n 0 1 9 的作用下的表达变化进行了检测分析。结果发现， b i f i d o b a c t e r i u ml a c t i sh n 0 1 9 能够有效黏附于i n t - 4 0 7 细胞，还能够被 i n t - 4 0 7 细胞所内化，并能够明显减少肠道病原菌s a l m o n e l l at y p h i m u r i u m a t c c1 4 0 2 8 对i n t - 4 0 7 细胞的黏附。以s a l m o n e l l at y p h i m u r i u ma t c c 1 4 0 2 8 预处理细胞后，细胞的炎症相关因子i l 1 p 、i l 8 、t n f q 均被诱 导上调为8 7 3 、4 7 9 7 和9 3 倍，而b i f i d o b a c t e r i u ml a c t 缸h n 0 1 9 能明显 降低这些炎症相关细胞因子的表达至2 6 、0 8 9 和0 3 7 倍，并保持在相 对较低的表达水平。以b i f i d o b a c t e r i u ml a c t i sh n 0 1 9 预处理的实验组，炎 症因子的基因表达与对照无明显差异，再加入s a l m o n e l l at y p h i m u r i u m a t c c1 4 0 2 8 刺激后，i l 1 p 和i l 一8 的表达虽也能够被上调，但与 s a l m o n e l 肠t y p h i m u r i u ma t c c1 4 0 2 8 单独刺激相比，表达量分别下降1 3 3 和5 0 1 倍。在b i f i d o b a c t e r i u ml a c t i sh n 0 1 9 单独对肠道上皮细胞作用时， 能够降低i l 8 的表达，基本不影响影响i l 1 1 3 、t n f a 的分泌。结果还 发现，i n t - 4 0 7 细胞在蛋白水平不表达t l r 2 受体，b i f i d o b a c t e r i u ml a c t i s h n 0 1 9 能够上调t l r 4 的表达。以上结果提示，b i f i d o b a c t e r i u ml a c t i s h n 0 1 9 能够有效抑制病原菌s a l m o n e l l at y p h i m u r i u ma t c c1 4 0 2 8 的定 植，并可能通过对炎症因子的调控下调病原菌引起的炎症反应，而在 b i f i d o b a c t e r i u ml a c t i sh n 0 1 9 单独作用时则不刺激肠道上皮细胞的细胞 上海交通大学医学院2 0 0 9 届博士学位论文中文摘要 炎症因子的产生，这为益生菌b i f i d o b a c t e r i u ml a c t i sh n 0 19 株在维持肠道 稳态的功能方面提供了理论基础。此外，本研究还发现，b i f i d o b a c t e r i u m l a c t i s 心0 1 9 能够通过上调t l r 4 的表达增加i n t - 4 0 7 细胞对革兰阴性菌 的敏感性，并且肠道中t l r 2 不是起主要作用的免疫受体。 通过以上两部分的研究，能够部分揭示国内商品化产品中益生菌的 安全性现状，以此作为乳酸菌相关产品安全性评价的指标，为企业的生 产和相关部门法律法规的制订提供依据，使我们的食品安全得到更好的 保障，并能促进本土菌株更早地走向国际市场。同时，对益生菌的免疫 调节益生功能进行了机制的探讨，填补了国内外相关研究的空白，有利 于进一步推动功能性食品的发展。 关键词：益生菌，耐药基因，生物胺，免疫调节 上海交通大学医学院2 0 0 9 届博士学位论文英文摘要 p r o s p e c t i v es t u d i e so ns a f e t ya n d i m m u n o m o d u l a t o r yp r o p e r t i e so fp r o b i o t i c s u s e di ni 认r k e t i n gf o o d a n dd r u g s a b s t r a c t p r o b i o t i c sa r eag r o u po fl i v em i c r o o r g a n i s m sa d m i n i s t e r e di na d e q u a t e a m o u n t sw h i c hc o n f e rab e n e f i c i a lh e a l t he f f e c to nt h eh o s t m o s tp r o b i o t i c s a reo m n i p r e s e n tm e m b e r so ft h ei n t e s t i n a lf l o r a ，b e l o n g i n gt ot h eg e n u s l a c t o b a c i l l u s ，b i f i d o b a c t e r i u m ，e n t e r o c o c c u s ，p e d i o c o c c u sa n ds oo n p r o b i o t i co r g a n i s m sa r ec l o s e l ya s s o c i a t e dw i t ht h eh o s t sh e a l t ht h r o u g h r e e s t a b l i s ht h eh e a l t h yb a l a n c eo fc o m m e n s a lf l o r ai nh o s ti n t e s t i n a lt r a c t a f t e rs u p p l e m e n t a t i o n m a n ys p e c i e sa r ei n v o l v e di nt h ep r o d u c t i o na n d c o n s u m p t i o no ff e r m e n t e df o o d s ，d r u ga n df u n c t i o n a lf o o d s d u et ot h es p e c i a la p p l i c a t i o n so fp r o b i o t i c s ，m o r ec o n c e r n sh a v eb e e n r a i s e do nt h es a f e t yp r o b l e m s a tp r e s e n t ，t h e r ea r ef o u ra s p e c t so fs a f e t y c o n c e r n so np r o b i o t i c s ：p a t h o g e n i c i t ya n di n f e c t i v i t y ；d e l e t e r i o u sm e t a b o l i c a c t i v i t i e s ；e x c e s s i v ei m m u n er e s p o n s ea n dp o t e n t i a lg e n et r a n s f e r i nt h ef i r s t p a r t o ft h i sr e s e a r c h ，w ee v a l u a t e dt h ea n t i m i c r o b i a l r e s i s t a n c es t a t u so ft h ep r o b i o t i cs t r a i n sa p p e a r e di nc h i n am a r k e t sb yb o t h p h e n o t y p i c a n dg e n o t y p i cm e t h o d s w ei s o l a t e d f o r t y - o n e i s o l a t e so f p r o b i o t i cs t r a i n su s e di nm i c r o b i a lf o o da n dd r u ga d d i t i v e si nc h i n a b a c t e r i a i d e n t i f i c a t i o nw a sa c c o m p l i s h e db yb i o c h e m i c a la n dm o l e c u l a rb i o l o g i c a l m e t h o d s a n t i m i c r o b i a ls u s c e p t i b i l i t yo f16a n t i b i o t i c sw a ss c r e e n e db yd i s c d i f f u s i o na n de t e s tm e t h o d sa f t e rs p e c i e s 1 e v e li d e n t i f i c a t i o n r e s i s t a n t v 塑璺塑堕苎望塑塑竺星塑圭兰垡望茎 茎奎塑墨 - 一7 e ，) r - k s t r a i n sw e r es e l o c t e da n de x a m i n e df o rt h e p r e s e n c eo f 5 7r e s i s t a n c eg e n e sb y p c r w ef o u n dt h a tr e s i s t a n c ew a sd i s t r i b u t e da m o n g d i f f e r e n ts p e c i e s a l l i s o l a t e sw e r e s u s c e p t i b l et o c h l o r a m p h e n i c o l ，t e t r a c y c l i n e ，a m p i c i l l i n ， a m o x i c i l l i n c l a v u l a n i ca c i d ，c e p h a l o t h i n ，a n di m i p e n e m i na d d i t i o n i s o l a t e s r e s i s t a n tt o v a n c o m y c i n ， r i f a m p i c i n ， s t r e p t o m y c i n ，b a c i t r a c i n ，a n d e r y t h r o m y c i nw e r ed e t e c t e d ， a l t h o u g hi n c i d e n c e so fr e s i s t a n c et ot h e s e a n t i b i o t i c sw e r er e l a t i v e l yl o w i nc o n t r a s t ，m o s ts t r a i n sw e r l er 粥i s t 羽1 t t o c i p r o f l o x a c i n ，a m i k a c i n ，t r i m e t h o p r i m s u l p h a m e t h o x a z o l e ，a n dg e n t a m y c i n t h eg e n e s 刀柳ev a n x , a n d 矽幼w e r ed e t e c t e di ns t r a i n so f 局口纪阳c c 淞 f a e c i u m ，l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ，s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s ，a n d l a c t o c o c c u sl a c t i s t h er e s u l t sm a y c o n t r i b u t et oc o n s t r u c tn e wc r i t e r i o n g u l d e l l n e sa n dr e g u l a t i o n s ，a n ds t a n d a r d i z e dm e t h o d sf o rp r e m a r k e tb i o s a f e t y t e s t i n ga n dp o s tm a r k e ts u r v e i l l a n c es h o u l d b ee s t a b l i s h e d i na d d i t i o n ，w ee v a l u a t e dt h eb i o g e n i ca m i n e p r o d u c t i o na b i l i t i e so f 3 9 i s o l a t e ds t r a i n s ，i n c l u d i n g2 0s t r a i n so f l a c t o b a c i l l i ，13s t r a i n s s 衍e p t o c o c d 。 3s t r a i n so fl a c t o c o c c u sa n d3s t r a i n so f e n t e r o c o c c i t h ep r o d u c t i o no ft h e b i o g e n i ca m i n e st y r a m i n e ，h i s t a m i n e ，p u t r e s c i n e ，c a d a v e r i n e ，s p e r m i n ea n d t r y p t a m i n ew a ss c r e e n e db yak i n do fd e c a r b o x y l a s es y n t h e t i cp l a t ew h i c h a d d e dw i t hp r e c u r s o ra m i n oa c i d s ，c o l o ro ft h ep l a t e sw i l lc h a n g ei fa m i n e e x i s t e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t13s t r a i n s s h o w e ds t r o n ga b i l i t i e st o p r o d u c et h eb i o g e n i ca m i n e s ，e s p e c i a l l yt h et y r a m i n ea n dt h es p e r m i n e t h e 13s t r a i n s i n c l u d i n g6s t r a i n so fs t r e p t o c o c c i ，3s t r a i n so fe n t e 倚c o c c l 3 s t r a i n so fl a c t o c o c c ia n d1s t r a i no f l a c t o b a c i l l u s a l t h o u g ht h er e s u l t sf o r b i o g e n i ca m i n ep r o d u c t i o ni n l a b o r a t o r ym e d i ad o e sn o ti m p l ys i m i l a r b e h a v i o ri naf o o dp r o d u c t ，t h ep o t e n t i a lb i o g e n i ca m i n e f o r m i n ga b i l i t yo fa s t r a i ns h o u l db et e s t e di nf o o da d d i t i v e ss e l e c t i o ni no r d e r t ok e e po u rf o o d v i 上海交通大学医学院2 0 0 9 届博士学位论文 英文摘要 s a f e i nt h es e c o n dp a r to ft h i sr e s e a r c h ，w es t u d i e dt h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e n p r o b i o t i cs t r a i nb i f i d o b a c t e r i u ml a c t 妇h n 0 19a n dh u m a ns m a l li n t e s t i n a l e p i t h e l i u mc e l l si n t - 4 0 7 ，e s p e c i a l l yt h ei m m u n o m o d u l a t o r ye f f e c t si n d u c e d b yb i f i d o b a c t e r i u ml a c t i sh n o 19 a d h e s i o na s s a y so fb i f i d o b a c t e r i u m a c f i s h n 019a n ds a l m o n e l l at y p h i m u r i u ma t c c14 0 2 8t oi n t - 4 0 7c e l l sw e r c c a r d e do u tb yd e t e c t i n gt h ec o p i e so f s p e c i e s - s p e c i f i cg e n e sw i t hr e a l t i m e p c r m o r p h o l o g i c a lr e s e a r c hw a sf u r t h e rd o n eb yt r a n s m i s s i o ne l e c t r o n m i c r o s c o p y i l 一19 、i l - 8 、t n f a 、t g f 一9 1a n dt l r 2 、t l r 4g e n ee x p r e s s i o n w e r ea s s e s s e du s i n gr e a l t i m ep c r e l i s aw a su s e dt od e t e c ti l - 8a n d t g f - 9 1 p r o t e i ns e c r e t i o n f l o wc y t o m e t r yw e r ea p p l i e df o rd e t e c t i n g p r o t e i n l e v e le x p r e s s i o no ft l r 2a n dt l r 4 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e b i f i d o b a c t e r i u m l a c t i sh n o19c o u l dd e c r e a s et h ea d h e r e dn u m b e ro f s a l m o n e l l at y p h i m u r i u ma t c c14 0 2 8a n db ei n t e r n a l i z e di n t ot h ei n t - 4 0 7 c e l l s b i f i d o b a c t e r i u ml a c t i sh n 0 19c o u l dr e v e r s et h em r n ae x p r e s s i o n l e v e lo fs a l m o n e l l at y p h i m u r i u ma t c c14 0 2 8i n d u c e di l - 19 ，i l - 8a n d n 师一ap r o d u c e db yi n t - 4 0 7c e l l sf r o m8 7 3 ，4 7 9 7 ，9 3f o l d st o2 6 ，0 8 9 ， o 3 7f o l d sc o m p a r e dw i t ht h eu n t r e a t e dg r o u p i l - ipa n dt n f 一( i tm r n a e x p r e s s i o n l e v e lw a sn o tc h a n g e da tb a s e l i n ea f t e r p r e t r e a t e d w i t h b i f i d o b a c t e r i u ml a c t i sh n 0 19w h i l ea d d e dw i t hs a l m o n e l l at y p h i m u r i u m a t c c14 0 2 8c o u l di n c r e a s et h em r n ae x p r e s s i o no fp r o - i n f l a m m a t o r y c y t o k i n e s ，b u tt h ee x t e n tw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a ns t i m u l a t i o nw i t l l s a l m o n e l l at y p h i m u r i u ma t c c14 0 2 8a l o n e i l 一8s e c r e t i o nw a sr e d u c e d w h i l ei l - 19a n dt n f 0 【m r n ae x p r e s s i o nl e v e lw a sn o tc h a n g e da tb a s e l i n e a f t e rt r e a t e dw i t hb i f i d o b a c t e r i u ml a c t i sh n 019a l o n e t l r 2w a sf o u n dd o n o te x p r e s si nt h ei n t - 4 0 7c e l l s ，h o w e v e r , t h ee x p r e s s i o no ft l r 4w a s 上海交通大学医学院2 0 0 9 届博士学位论文英文摘要 p r o m o t e db yb i f i d o b a c t e r i u ml a c t i sh n o l9 硼1 er e s u l t sa b o v ei n d i c a t e dt h a t i n t - 4 0 7 d i s p l a yi m m u n o l o g i c a l q u i e s c e n c e w h e n e x p o s e d t o b i f i d o b a c t e r i u ml a c t i sh n 0 19 b i f i d o b a c t e r i u ml a c t i sh n 019c a l lb o t h m o d u l a t ee p i t h e l i a lr e s p o n s e st ol i m i ti n f l a m m a t o r ys i g n a l sa n dm a r k e d l y i n d u c e dt u me x p r e s s i o n ，i n d i c a t i n gt h a ti n t - 4 0 7c e l l sh a v ei n c r e a s e d s u s c e p t i b i l i t yt og r a m - n e g a t i v eb a c t e r i av i at l r 4 i nc o n c l u s i o n ，o u rr e s u l t sr e v e a l e dt h e s a f e t yp r o b l e mo fp r o b i o t i c s t r a i n se x i s t e di nc h i n am a r k e t a ne v a l u a t i o no ft h es a f e t yo fl a c t i ca c i d b a c t e r i af o rh u m a nc o n s u m p t i o nm u s tb eg u i d e db ye s t a b l i s h e dc r i t e r i a , g u i d e l i n e sa n dr e g u l a t i o n s o u rs t u d i e sa l s oi n d i c a t e dt h a tb i f i d o b a c t e r i u m l a c t i sh n 019c o u l dm o d u l a t et h ei m m u n es y s t e mt o w a r d sa n t i - i n f l a m m a t o r y a c t i o na n di n h i b i te n t e r o p a t h o g e na d h e s i o n ，t h er e s u l t sh e l p i n gt oe x p l a i ni t s b e n i f i c a le f f e c ta n df u r t h e ra p p l i c a t i o n s k e yw o r d s ：p r o b i o t i c s ，a n t i b i o t i cr e s i s t a n c e g e n e ，b i o g e n i ca m i n e ， i m m u n o m o d u l a t o r y 上海交通大学医学院2 0 0 9 届博士学位论文 符号说明 b p d d h z o d n t p d n a e l i s a e t e c f b s i b d l b l p s t c m l n m 【l 璐 p b m c p b s p c r r n a 符号说明 b a s ep a i r d o u b l e - d i s t i l l e dw a t e r d e o x y n u e l e o s i d et r i p h o s p h a t e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y e n t e r o t o x i g e n i ce c o l i f e t a lb o v i n es e r u m i n f l a m m a t o r yb o w e ld i s e a s e l u r i a - b e r t a mb r o t h u p o p o l y s a c c h a r i d e m i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n s m e s e n t e r i cl y m p hn o d e s d e m a nr o g o s as h a r p e p e r i p h e r a lb l o o dm o n o u c l e a rc e l l s p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r i b o n u c l e i ca c i d 碱基 双蒸水 脱氧三磷酸核苷酸 脱氧核糖核酸 酶联免疫吸附试验 肠产毒性大肠埃希菌 胎牛血清 炎症性肠病 l b 培养基 脂多糖 最小抑菌浓度 肠系膜淋巴结 m r s 培养基 外周血单核细胞 磷酸盐缓冲液 聚合酶链反应 核糖核酸 上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意 识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 、- 守l 畅 1 日期：幽罗年5 月i 专日 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在- 年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密吖 ( 请在以上方框内打“”) 学位论文作者签名：毒1 畅 师嘲一 日期：加7 年s 月f 日日期：州年j 月房日 论文创新点 1 本课题对我国市场上分离得到的商用乳酸菌菌株进行了表型和基因型两方面的 耐药性研究，共发现了3 1 株菌对一些常用的包括抗革兰阳性菌的抗生素存在耐 药现象，其中2 8 株菌呈现多重耐药，并有5 株菌检测出携带耐药基因：2 株植 物乳杆菌携带v a n x 基因，l 株肠球菌携带m s r c 基因，以及l 株嗜热链球菌和l 株乳酸乳球菌携带a f r a 基因。耐药基因潜在的可转移能力会对食品安全构成潜 在的危害。本研究为益生菌相关食品药品法规的完善提供了依据。 2 本课题首次对我国市场上的商用菌株进行了产生物胺能力的初步检测，在检测的 3 9 株菌中，9 株菌具有产酪胺的能力，7 株菌具有产精胺的能力，1 株菌具有产 组胺的能力，1 株菌具有产腐胺的能力，尤其是精胺和酪胺的产量较高。在筛选 食品药品用菌株时应运用规范的方法来检测其产生物胺的能力，以保障食品药品 的安全。 3 本课题首次从细胞水平对商业化菌株b i f i d o b a c t e r i u ml a c t i sh n 0 1 9 与人类小肠上 皮细胞i n t - 4 0 7 之间的相互作用，尤其是该菌株的免疫调节作用进行了初探。发 现b i f i d o b a c t e r i u ml a c t i sh n 0 1 9 与肠道上皮细胞作用后，能够明显下调由 s a l m o n e l l at y p h i m u r i u ma t c c1 4 0 2 8 引起的m - l l b 、i l - 8 和t n f - a 的表达升高， 并推测可能通过这种方式减缓由于病原菌刺激引起的炎症反应，为其在炎症性肠 病中的应用提供理论依据。而在b i f i d o b a c t e r i u ml a c t i sh n 0 1 9 单独作用于i n t - 4 0 7 细胞时，对细胞i l 1 p 、t n f c t 的表达基本无影响，这为益生菌b i f i d o b a c t e r i u m l a c t i sh n 0 1 9 株在维持肠道稳态的功能方面提供了理论基础。此外，本研究还发 现，b i f i d o b a c t e r i u ml a c t i sh n 0 1 9 能够上调t l r 4 的表达，从而增加i n t - 4 0 7 细 胞对革兰阴性菌的敏感性。t l r 2 在i n t - 4 0 7 细胞中检测不到表达，由此推测肠 道中t l r 2 不是起主要作用的免疫受体。 上海交通大学医学院2 0 0 9 届博士学位论文第一章益生菌安全性的前瞻性研究 第一章 益生菌安全性的前瞻性研究 近年来，食品安全问题已成为世界范围内关注的焦点。作为功能性食品中最常 应用的益生菌，其应用具有一定的特殊性，通过直接摄入人体而发挥益生作用。为 了揭示其应用对宿主是否安全成为本研究的目的所在。传统的毒理学实验等安全性 评价方法具有一定的局限性。因此，需要针对目前益生菌安全性存在的问题建立一 套包含基因组学，代谢组学，蛋白质组学等研究内容的评估方法，对益生菌的安全 性进行系统全面的评估。 第一节益生菌安全性的现状与对策 益生菌( p r o b i o t i c s ) 是指一类活的，摄入足够量能够对人体产生有益作用的微 生物，又称为微生态制剂生态制品或活菌制剂。益生菌主要来源于人和动物肠道的 正常菌群，涉及乳杆菌、双歧杆菌、肠球菌、乳球菌、明串珠菌等多个菌属，通过 补充人体消化道内的有益微生物，改善消化道菌群平衡而对人体产生有益作用。早 在四千年前，人类就开始利用益生菌，其中乳酸菌是益生菌中的最主要最重要的代 表。上世纪初，俄国微生物学家梅切尼可夫提出了“酸奶长寿 理论，使得益生菌 的生理功能逐渐被人们所认识。目前，活性益生菌、死菌及其代谢产物等益生菌相 关制品已经广泛应用于食品和药品等诸多领域中。越来越多的体外实验和临床研究 认为，益生菌在体内能够发挥促进营养物质的吸收、减缓乳糖不耐症、改善肠道功 能、降低血清胆固醇水平和血脂水平、抗高血压、调节特异性免疫和非特异性免疫 以及抗肿瘤作用等。 随着对这一特殊微生物群体的认识不断增加，国际上对益生菌制剂的研究也不 断地发展，目前国内对于益生菌的研究主要集中于两个方面：一个方面是关注益生 上海交通大学医学院2 0 0 9 届博士学位论文第一章益生茵安全性的前瞻性研究 菌的功能性研究，即益生菌具有的益生作用及其机制的研究；另一方面则关注的是 益生菌尤其是乳杆菌作为基因工程载体的潜能，将益生菌作为较为安全的基因导入 载体，把各种有益或有治疗作用的基因导入机体。虽然近年来关于益生菌各方面研 究的文章越来越多，但是对于益生菌的安全性的研究文章所占比例并不高。体现出 入们对益生菌的安全性认识仍然不足。虽然益生菌已经有较长的应用历史并认为是 相对安全的，但由于益生菌作为微生态制剂应用的领域具有一定的特殊性，通过被 机体直接摄入而发挥作用，因此其潜在的安全问题是不容忽视的。现有部分益生菌 的安全情况见表l 。 表1 益生菌的分类及其安全情况 菌种 感染潜力 乳杆菌属( l a c t o b a c i l l u s )主要为非致病菌，有些是条件致病菌 乳球菌属( l a c t o c o c c u s ) 主要为非致病菌 明串珠菌属( l e u c o n o s t o c )主要为非致病菌，有些与感染案例有关 链球菌属( s t r e p t o c o c c u s ) 口t l 牌l e r m o 蓊p l l t l u 纛s 僦蒸嘉毽羹磬铆埘 j ：伺些困种长弓i 越移l 芸 黪梨 肠球菌属( e n t e r o c o c c u s ) 一些菌种是条件致病菌，具有溶血活性和抗生素耐药性 双歧杆菌属( b i f i d o b a c t e r i u m )主要为非致病菌，一些菌种与人类感染有关 酵母菌属( s a c c h a r o m y c e s )主要为非致病菌，一些菌种与人类感染有关 国际上对于益生菌安全性主要关注以下几个方面： 1 感染能力。虽然大多的益生菌在长期的使用过程中被认为是“相对安全 的， 然而“细菌会产生感染 的观念也是部分人无法接受益生菌制品的重要原因。大多 数我们目前正在应用和将要应用的菌株都会经过动物实验来检测其感染能力，然而， 世界范围内仍有多起可能与乳杆菌、双歧杆菌以及其它乳酸菌摄入相关的心内膜炎 和败血症等局部或者全身性感感染的报道【l 训。1 9 9 9 年，两例与鼠李糖乳杆菌( 三 r h a m n o s u s ) 有关的感染病例分别被报道。一位7 4 岁老年妇女患有非胰岛素依赖性糖 尿病，还有右肺肺炎和右侧脓胸，并由此引发右侧肝脓肿。肝脓肿的抽提物中分离 出了鼠李糖乳杆菌，这位妇女被报道在发现症状前的4 个月内每天服用0 5l 含有三 r h a m n o s u sg g 的酸奶制品。从病灶中分离出的菌株经过检测认为与l g g 株无法区分 嘲；另有一位6 7 岁的老年男子患有先天性的轻微的二尖瓣关闭不全。发病前做过龋齿 上海交通大学医学院2 0 0 9 届博士学