（植物学专业论文）烤烟、咖啡的梅拉德反应及其产物抗氧化活性研究.pdf

摘要：近年来随着公众对食品安全性的逐步重视和大量实验表明，化学合成抗氧 化剂对人体有极大的毒副作用，因此筛选鉴定天然药食资源中安全有效的抗氧化 活性物质已日益引起国内外学者的关注。通过查阅文献可知，梅拉德反应的研究 大多显示出与人体健康密切相关的特点，因此本项目通过研究梅拉德反应及其产 物类黑精的抗氧化活性，用以替换化学合成抗氧化剂。 云南省为烟草( n i c o t i a n at a b a c u ml ) 、咖啡( c o f f e aa r a b i c al ) 种植大省， 烟草、咖啡产量高，质量好，资源十分丰富。本课题拟以云南特产烟草和咖啡为 基本原料，分别与糖类利用梅拉德反应生成类黑精，研究其抗氧化活性，并与常 用抗氧化剂v c 进行对比，得到以下结论： 1 制备烟草类黑精的最佳条件为： 葡萄糖和烟草的质量比，1 ：3 ；水分含量，6 0 ；p i - ! 值，9 5 ； 反应温度，1 0 0 ；反应时间，8 h 2 最佳制备条件下所得烤烟类黑精的产率及活性为： 产率，2 6 ；还原能力( a 瑚) ，2 1 0 0 ： 抗氧化值( m g g ) ，1 1 3 2 ： 自由基清除率( ) ，4 4 9 0 3 制备咖啡类黑精的最佳条件为： 葡萄糖和咖啡的质量比，1 ：3 ；水分含量，4 0 9 6 ； p h 值，4 5 ；反应温度，2 5 0 ；反应时间，3 - 5 5 h 4 最佳制备条件下所得咖啡类黑精的产率及活性为： 产率，2 8 ；还原能力( a ，) ，3 0 0 0 ： 抗氧化值( r a g g ) ，1 2 1 7 ： 自由基清除率( ) ，7 2 2 0 其中：p h 值、反应温度和反应时间是对半合成梅拉德反应有关键的影响因素， 对于烟草而言p h 呈中性至弱碱性，咖啡p h 呈中等酸性，其产物的抗氧化活性更 佳。 本文选取了类黑精分离的三种常用分离方法：大孔吸附树脂分离方法、低温 透析分离方法和低温超滤分离方法，研究了烤烟、咖啡半合成梅拉德反应产物中 类黑精活性成分的分离手段。研究结果表明： 1 大孔吸附树脂分离方法，可作为类黑精粗分方法； 2 低温超滤分离方法是类黑精分离纯化的最佳方法； 3 经低温超滤分离后的类黑精在大分子量部分( i o k d a ) 活性更强，其活性 l 分别为： 制备烤烟类黑精，产率，3 5 ：还原能力( a ，) ，2 7 1 0 ； 抗氧化值( m g g ) ，1 3 3 2 ： 自由基清除率( ) ，7 9 9 0 制备咖啡类黑精，产率，4 5 ：还原能力( a ，) ，3 2 3 0 ； 抗氧化值( m g g ) ，1 5 2 6 ： 自由基清除率( ) ，8 9 1 2 关键词：咖啡，烟草，梅拉德反应，类黑精类物质，抗氧化活性 i i a b s t r a c t ：i nr e c e n ty e a r st oe d i b l es e c u r et o o ks e r i o u s l yg r a d u a l l ya l o n gw i t h t h ep u b l i c i na d d i t i o n ，t h em a s s i v ee x p e r i m e n t si n d i c a t e dt h a tt h ec h e m i c a ls y n t h e s i s o x i d a t i o ni n h i b i t o rh a st h ee n o r m o u sp o i s o n o u ss i d ee f f e c tt o t h eh u m a nb o d y t h e r e f o r e ，i nt h es c r e e n i n ga p p r a i s a lc r u d ed r u ga n df o o dr e s o u r c e st h es a f ee f f e c t i v e o x i d a t i o nr e s i s t a n c ea c t i v em a t e r i a lh a sa r o u s e dt h ed o m e s t i ca n df o r e i g ns c h o l a r s i n t e r e s td a yb yd a y m a yk n o wt h r o u g ht h el i t e r a t u r e ，m a i l l a r dr e s p o n d e dt h er e s e a r c h d e m o n s t r a t e st h eg o o df o rh u m a nh e a l t h t h e r e f o r et h i s p r o j e c tt h r o u g hs t u d i e s m a i l l a r dr e s p o n d 、t h em a i l l a r dr e s p o n d p r o d u c t sa n dt h ea n t i o x i d a t i v ea b i l i t i e so f m e l a n o i d i n s w i t hs e e k sf o rt h en a t u r a lo x i d a t i o ni n h i b i t o rt a k et h ep l a c eo ft h e p h e n o l so x i d a t i o ni n h i b i t o r y u n n a np r o v i n c eh a st h er i c hr e s o u r c e so ft o b a c c o ( n i c o t i a n at a b a c u ml ) a n d c o f f e e ( c o f f e aa r a b i c al ) ，t h et o b a c c oa n dt h ec o f f e eh a v eh i g ho u t p u t a n di tq u a l i t y a r eg o o d ，t h er e s o u r c e sa r ev e r yr i c h t h i sp r o j e c t p l a n st a k et h ey u n n a n st o b a c c oa n dc o f f e ea st h em a t e r i a l r e s p o n d st h ep r o d u c t i o nm e l a n o i d i n ss e p a r a t e l yw i t ht h ec a r b o h y d r a t eu s i n gm a i l l a r d r e s p o n d s t u d i e si t so x i d a t i o nr e s i s t a n c ea c t i v e n e s s ，a n dc a r r i e so nt h ec o n t r a s tw i t h c o m m o n l yu s e do x i d a t i o ni n h i b i t o rv c o b t a i n st h ef o l l o w i n gc o n c l u s i o n ： 1 t h ep r e p a r a t i o nt o b a c c om e l a n o i d i n s o p t i m u mc o n d i t i o ni s ： g l u c o s ea n dt o b a c c o sm a s s r a t i o ，1 ：3 ； m o i s t u r ec o n t e n t ，6 0 ； p h ，9 5 ； r e a c t i o nt e m p e r a t u r e ，10 0 ( 2 ； r e a c t i o nt i m e ，8 h 2 u n d e rt h eb e s t p r e p a r a t i o nc o n d i t i o nt h eo b t a i n e df l u e c u r e dt o b a c c o m e l a n o i d i m p r o d u c t i o nr a t ea n da c t i v e n e s sa l e ： p r o d u c t i o nr a t e ，2 6 ； r e d u c i n ga b i l i t y ( a 7 0 0 ) ，2 10 0 ； o x i d a t i o nr e s i s t a n c ev a l u e ( m e g ) ，11 3 2 ； f r e er a d i c a lp e r c e n t a g ec l e a r a n c e ( ) ，4 4 9 0 3 t h ep r e p a r a t i o nc o f f e em e l a n o i d i n s o p t i m u mc o n d i t i o ni s ： g l u c o s ea n dc o f f e e sm a s sr a t i o 1 ：3 m o i s t u r ec o n t e n t ，4 0 ： i p h ，4 5 ； r e a c t i o nt e m p e r a t u r e ，2 5 0 c ； r e a c t i o nt i m e ，3 - 5 5 h 。 4 u n d e rt h eb e s tp r e p a r a t i o nc o n d i t i o nt h eo b t a i n e dt h ec o f f e em e l a n o i d i n s p r o d u c t i o nr a t ea n d a c t i v e n e s sa l e ： p r o d u c t i o nr a t e ，2 8 ； r e d u c i n ga b i l i t y ( a t 0 0 ) ，3 。0 0 0 ； o x i d a t i o nr e s i s t a n c ev a l u e ( m g 曲，12 17 ； f r e er a d i c a lp e r c e n t a g ec l e a r a n c e 麟) ，7 2 。2 0 a n dt h ep hv a l u e ，t h er e a c t i o nt e m p e r a t u r ea n dt h er e a c t i o nt i m ea r ef i f t y - f i 埘 s y n t h e s i z et h em a i l l a r dr e a c t i o nt h a th a st h ek e yi n f l u e n c i n gf a c t o 毛p hs p e a k i n go f t h et o b a c c ot oa s s u m et h en e u t r a l i t yt ot h ew e a kb a s i c i t y , c o f f e ep ha s s u m e st h e m e d i u ma c i d i t y , i t sp r o d u c t so x i d a t i o nr e s i s t a n c ea c t i v e n e s si sb e t t e r t h i sa r t i c l eh a ss e l e c t e dt h r e ec o m m o n l ys e p a r a t i o nm e t h o dt os e p a r a t e dt h e m e l a n o i d i n s 。髓em a c r o p o r o u sr e s i ns e p a r a t i o nm e t h o d ，t h el o wt e m p e r a t u r ed i a l y s i s s e p a r a t i o nm e t h o da n dt h el o wt e m p e r a t u r eu l t r af i l t e rt h es e p a r a t i o nm e t h o d s t u d i e d t h ef l u e * c u r e dt o b a c c o ，t h ec o f f e ep a r t l yt os y n t h e s i z ei nt h em a i l l a r dr e s u l t a n tt h e m e l a n o i d i n sa c t i v ec o n s t i t u e n ts e p a r a t i o nm e t h o d 1 。n l em a c r o p o r o u sr e s i ns e p a r a t i o nm e t h o d , m a yt a k et h em e l a n o i d i n st h ef i r s t s e p a r a t i o n ； 2 硼1 el o wt e m p e r a t u r eu l t r af i l t e r st h es e p a r a t i o nm e t h o di sb e s tm e t h o dt o s e p a r a t et h em e l a n o i d i n s ； 3 u l t r af i l t e r st h es e p a r a t i o na f t e rt h el o wt e m p e r a t u r et h em e l a n o i d i n s ( io k d a ) a c t i v e n e s sa r es t r o n g e ri nt h eg r e a tm o l e c u l a rw e i g h tp a r t ，i t sa c t i v e n e s sr e s p e c t i v e l y i s ： p r e p a r a t i o nf l u e c u r e dt o b a c c om e l a n o i d i n s ： p r o d u c t i o nr a t e ，3 5 ； r e d u c i n ga b i l i t y ( a 7 妨，2 710 ； o x i d a t i o nr e s i s t a n c ev a l u e ( m g g ) ，13 3 2 ； f r e er a d i c a lp e r c e n t a g ec l e a r a n c e ( ) ，7 9 9 0 p r e p a r a t i o nc o f f e em e l a n o i d i n s ： p r o d u c t i o nr a t e ，4 5 ； i v r e d u c i n ga b i l i t y ( a 7 0 0 ) ，3 2 3 0 ； o x i d a t i o nr e s i s t a n c ev a l u e ( m g g ) ，15 2 6 ； f r e er a d i c a lp e r c e n t a g ec l e a r a n c e ( ) ，8 9 12 k e yw o r d ：t o b a c c o ，c o f f e e ， m a i l l a r dr e a c t i o n ，m e l a n o i d i n s ，o x i d a t i o n r e s i s t a n c ea c t i v e n e s s v 声明尸明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南林学院或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中做了明确的说明并表示了谢意。 签名：霉娶 日期：竺翌垦：兰 关于论文使用授权的说明 本人同意西南林学院有权保留论文的复印件，可以采用影印、缩印或其他复 制手段保存论文；提交论文一年后，允许论文被查阅和借阅，学校可以公布论文 的全部或部分内容。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名：i 翌。 导师签名：堑立塾日期：竺星：】 t 1 前言 1 前言 1 1 梅拉德反应 1 1 1 梅拉德反应机理 梅拉德反应( m a i l l a r dr e a c t i o n ) 由法国化学家l c m a i l l a r d ( 1 8 7 8 1 9 3 6 ) 于1 9 1 2 年提出【h2 1 ，1 9 5 3 年由h o d g e 等正式命名的非酶促褐变反应( n o n e n z i m i c b r o w n i n g ) 之一，又叫羰氨反应1 3 ( a m i n o c a r b o n y lr e a c t i o n ) 。其是指具有氨基的氨基酸、蛋 白质与糖类的羰基在加热条件下所引起的着色反应【4 1 。( 多为发生在食品加工和 贮存过程中) 。 梅拉德反应机理十分复杂，其反应历程、产物组成及其性质等受多种因素影 响，氮基化合物和还原糖的种类、性质、以及它们间的反应比例，反应时的p h 值、温度、反应时间、水分活度、缓冲液浓度对反应的速率以及最终产物的组成 有着重要的影响p j 。 当梅拉德反应温度提高或加热时间增加时，表现为色度增加，碳氮比、不饱 和度、化学芳香性也随之增加。在单糖中，五碳糖( 如核糖) 比六碳糖( 如葡萄糖) 更容易反应；单糖比双糖( 如乳糖) 较容易反应；在所有的氨基酸中，赖氨酸参与 梅拉德反应，可获得更深的色泽。而半胱氨酸反应，获得最浅的色泽f 6 】。总之， 富含赖氨酸蛋白质的食品，如奶蛋白易于产生褐变反应。糖类对氨基酸化合物的 比例变化也会影响色素的发生量。 h o d g e 在1 9 5 3 年提出的梅拉德反应的3 条可能的反应途径，梅拉德反应的 路线见图1 ，反应的过程一般可以总结如下【1 7 1 。 ( 1 ) 初级反应阶段：还原糖的羰基与氨基之间进行加成，加成物迅速失去1 分子水转变为希夫碱( s h i f tb a s e ) ，再经环化形成相应的n 取代的醛基胺，经 a m a d o r i 重排转成有反应活性的1 氨基1 脱氧2 酮糖。 ( 2 ) 高级反应阶段：在氨基酮糖和氨基醛糖等重要的不挥发性香味前驱物形成 之后，梅拉德反应变得更为复杂，经历还原酮路线、还原型葡糖醛酮和糠醛路线、 斯特勒克降解三条反应路线，产生还原酮、糠醛( h m f ) 和不饱和羰基化合物等， 这些不同的化合物依次反应，开始形成无氮及含氮褐色可溶性化合物。 1 烤烟、咖啡的梅拉德反应及其产物抗氧化活性研究 ( 3 ) 最终反应阶段：高级梅拉德反应阶段形成的众多活性中间体，如葡萄糖酮 醛、3 脱氧o s u l o s e ( 3 d g ) 、3 , 4 - 二脱氧o s u l o s e ( 3 ，4 二d g ) 、h m f 、还原酮类、 不饱和醛亚胺等等，又可继续与氨基酸反应，最终都生成类黑精色素一褐色含氮 色素，此过程包括醇醛缩合、醛氨聚合、环化合反应等。最终反应阶段的反应途 径尚未清楚，生成的色素称为黑色素( 类黑精类物质) ，无特定的结构，是分子量 相当高的含氮、含氧化合物，有着各种各样的构成单位。但是，褐色色素不是由 单一构成单位重复构成，而是由不同构成单位构成的非常复杂的结构。 1 9 8 0 年代，几本书【9 】详细论述了梅拉德反应在化学、营养学、食品的色香 味、食品加工、体内过程、毒理学等方面的研究进展。1 9 9 0 年l e d l 等【lo j 综述了 梅拉德反应的一些小分子中间体或产物，列出了与食品香味、色泽相关的一些杂 环产物。1 9 9 6 年f r i e d m a n t l l 】列出了一些梅拉德反应的蛋白质交联产物、对身体 健康有害的杂环胺类化合物以及可能的减慢或阻止梅拉德反应的方法。 图1 1 梅拉德反应路线图 f i g u r e1 - 1t h ep a t ho fm a i l l a r dr e a c t i o n 2 i 前言 1 1 2 梅拉德反应产物类型 梅拉德反应的广泛性及复杂性，决定了梅拉德反应产物( m r p s ) 种类繁多， h o d g e 等曾将m r p s 致香成分分为四个类别：第一类是含氮杂环化合物，如吡嗪、 吡啶、吡咯等；第二类是环状烯醇结构化合物如麦芽酚等；第三类是多羰基化合 物如丙酮醛等；第四类是单羰基化合物，如斯特勒克降解产生的s t r e c k e r 醛类【i2 1 。 除挥发性致香成分外，还包括具有抗氧化活性的类黑精中的褐变色素及其他成 分。研究表明随反应时间的延长，抗氧化能力明显增加，而经脱色处理的m r p s 抗氧化能力则显著下降，说明了类黑精中的色素物质的抗氧化作用。梅拉德反应 产物的抗氧化活性是由f r a n z k e 和1 w a i n s k y 于1 9 5 4 年首次发现，他们对加入甘 氨酸一葡萄糖反应产物的人造奶油的氧化稳定性进行了相关报道。至上世纪八十 年代关于梅拉德反应产物的抗氧化性的研究逐渐增型1 3 j 。研究表明，梅拉德反应 产物中含有类黑精、还原酮及一系列含n 、s 的杂环化合物具有一定的抗氧化性 能，其中某些物质的抗氧化强度可以与食品中常用的抗氧化剂相媲美。 梅拉德反应产物中致香挥发性成分中噻吩、吡咯等物质，由于有比较特殊的 化学结构，具有一定的抗氧化性。这类物质较强的抗氧化性表现在：具有芳香特 性的五元和六元杂环化合物中六个7 【电子非定域分布于环上，使碳原子上兀电子 云密度提高而有助于自由基的加剧1 4 j 。 梅拉德反应产物中非挥发性成分抗氧化机理比较复杂，人们还没有完全了解 其作用原理，但目前有报道指出该类物质的抗氧化原理主要表现在两个方面【i5 】： a 具有螯合金属离子的特性；b 具有很强消除活性氧的能力。h a y a s e 认为梅拉德 反应产物的抗氧化性能可能是由梅拉德反应终产物类黑精具有很强的消除活性 氧的能力。y o s h i m u r a 发现m r p s 具有螯合金属离子的能力。e i c h n e r 也认为梅拉 德反应产物的中间体( 还原酮化合物) 通过供氢原子而终止自由基的链，并发现梅 拉德反应产物具有络合金属离子和还原过氧化物的特性。 1 2 国内外对类黑精类物质活性的研究状况 类黑精是一类聚合度不等的高分子混合体，多以短肽或蛋白复合物( 即蛋白 3 烤烟、咖啡的梅拉德反应及其产物抗氧化活性研究 黑素m e l a n o p r o t e i n ) 的形式存在，亲水性极强，具有类似膳食纤维的功能，可降 低人体餐后血糖，抑制胰蛋白酶和a c e 活性，阻断致癌物亚硝胺合成，抗杂环 胺诱变，结合封闭金属离子，具有很强的抗氧化活性和自由基清除能力【1 6 】。 到目前为止，关于类黑精类物质的结构还不是很清楚。起始原料、反应条件 的不同影响类黑精类物质组成7 1 , h a y a s e 等对类黑精类物质捕获自由基进行了 研究，他们认为类黑精类物质中应该还有还原酮、烯胺或吡咯类的结构。h o m m a 等研究了类黑精类物质及氧化还原后的性质差异，发现氧化还原后类黑精类物质 的颜色强度都降低，而氧化或还原后的分子量都增加了，可以认为氧化或还原是 生色团断裂，但是又有新的聚合发生【1 8 】 关于类黑精类物质的结构，目前主要有3 种观点：( 1 ) h e y n s ，后来是t r e s s l 等提出类黑精类聚合物主要是由重复单元的吡咯或呋喃组成，通过缩聚反应最终 形成梅拉德反应【1 9 1 ；( 2 ) h o f m a n n 发现低分子量的生色团通过赖氨酸的e - n h 2 或 精氨酸和蛋白质交联而形成高分子量的有颜色物质，他认为类黑素根据分子量可 以被分为两部分，一类是低分子量的有色物质，分子量低于1 0 0 0 ；另一类是分 子量达到1 0 0 0 0 0 的大分子。( 3 ) c a n u n e r e r 等认为主要是由梅拉德反应第一阶段 的糖降解产物通过a l d o l 缩合聚合而成，氨基酸可能是后连上的【2 0 1 。 近年来，国外对类黑精物质抗氧化作用和抗菌作用进行了较多的研究。据日 本与台湾媒体报道，类黑精系非消化性高分子化合物而存在于消化器官中，发挥 食物纤维素类似生理机能即可以促进血清胆固醇降低，又可以使肠道内乳酸菌素 增值。可与糖类在肠内的移动速率减慢并阻碍粘膜消化素的作用，以致可抑制血 糖值升高1 2 2 1 。 阚建全等【2 3 j 在研究相对分子量大于1 0 0 0 m r 的非透析类黑精的性能中发现， 与甘氨酸葡萄糖体系的非透析类黑精相比，豆豉类黑精具有很强的消除羟基自 由基的能力。随着浓度增加，豆豉非透析类黑精对自由基的消除能力也增强，但 浓度效应不如抗坏血酸明显。此外，研究显示，0 5 和1 0 添加量的豆豉类黑 精对干燥猪油的抗氧化效果比较明显，1 o 的添加量与0 2 的b h t 作用相当。 目前，除了对食品品质影响的研究仍在进行外，有关梅拉德反应的研究大多 显示出与人类健康密切相关的特点。因此研究梅拉德反应产物的抗氧化性能，用 以代替酚类食用抗氧化剂，正逐渐引起人们的关注，并对某些氨基酸与葡萄糖合 成的梅拉德反应产物的抗氧化活性进行了初步探讨。l i n g n e r t 等人的研究发现在 弱碱性( p h = 7 9 ) 条件下组氨酸与木糖的m r p s 表现出较高抗氧化活性洲； b e c k e 、朱敏等人先后报道在弱酸性( p h = 5 7 ) 条件下，精氨酸与木糖的抗氧化活 4 1 前言 性最佳。万素英等报道在弱酸性( p h = 5 7 ) 条件下，木糖一赖氨酸m r p s 的抗氧化 活性较木糖甘氨酸m r p s 的高1 2 5 1 。 然而，由于梅拉德反应产物的组成和性质因反应条件及反应时间而有较大的 差异，梅拉德反应产物的合成等还有待于进一步深入研究。 1 3 云南省的烟草、咖啡优势及其类黑精的研究意义 烟草( n i c o t i a n at a b a c u ml ) ，茄科烟草属，一年生或多年生植物，共有6 0 余 种1 2 6 】，可制卷烟和烟丝。烟叶中成分含量非常复杂，其中碳水化合物约占5 0 ， 蛋白质含量同样也颇为丰富( 如白肋烟中蛋白质含量高达2 0 4 8 ) 。其中各种必需 氨基酸含量均高于世界粮农组织( f a o ) 制定的蛋白制品中必需氨基酸含量标准 【2 7 1 ，表明烟叶蛋白质具有较高的营养价值和药用价值。 云南烟草，又称云烟或云叶，以其品质优良，烟叶油润丰满，组织细腻，颜 色金黄，光泽好，弹性强，烟碱含量适中( 国际上要求含碱量为2 ，以3 为最 好，云南烤烟含碱量2 1 4 ) 。云南的气候和土质适宜烤烟生长，1 9 4 1 年初推广 种植以来，现已有玉溪、曲靖、楚雄、昭通、大理、红河、昆明等地、州、市的 七十多个县种植。主要以栽培世界优良品种、少吐型“红花大金元”和“斯佩特 g 一2 8 为当家品种。云南省烤烟产量，仅次于河南省，居全国第二位，是云南 省的一大经济优势。 下以2 0 0 7 年为例分析云南省的烟草优势：2 0 0 7 年云南全省实际收购烤烟 1 5 0 5 万担，比2 0 0 2 年实际收购量增加2 4 3 万担，年平均增长5 4 ，实际收购香 料烟2 2 5 4 万担，白肋烟6 万担，高于全国平均增长水平。2 0 0 7 年与2 0 0 2 年相 比，烟叶亩产量由1 2 1 8 公斤提高到1 4 0 3 公斤，增长1 5 2 ；均价由1 0 2 8 元 公斤提高到1 1 8 9 元公斤，增长1 5 7 。云南省的香料烟已发展成为全国最大产 区。 但是随着全球禁烟的呼声越来越高，烟草作为卷烟方面的用途必将会大大减 弱，研究烟草在开发食品、药物资源等诸多方面的潜在功能亦成为当今全球一大 热点。因此可以利用烟草中的氨基酸、蛋白质或糖类进行梅拉德反应从而制备烟 草类黑精。 咖啡( 小粒种为c o f f e aa r a b i c al ，中粒种为c o f f e ac a n e p h o r a ，大粒种为 5 烤烟、咖啡的梅拉德反应及其产物抗氧化活性研究 c o f f e al i b e r i c a ) ，茜草科( r u b i a c e a e ) ，咖啡属( c o f f e a ) 。 咖啡原产非洲北部和中部的热带地区，栽培历史已有2 0 0 0 多年，其椭圆形 浆果，成熟时呈红色、紫红色，可提取咖啡碱，在医药上用作麻醉剂兴奋剂、利 尿剂、强心剂，咖啡果肉可酿酒、制醋、作饲料、肥料、燃料等。 咖啡为世界三大饮料作物之一，主要消费地区为欧、美两洲，近几年国际上 以咖啡为主要消费饮料的国家( 如意大利、西班牙等) 的学者纷纷将对咖啡抗氧化 能力的研究集中到咖啡生产、使用过程中产生的咖啡类黑精上。 世界咖啡主产区是拉丁美洲、非洲和亚洲，据统计全世界有7 6 个国家栽培 咖啡。我国咖啡最早是于1 8 8 4 年引种于台湾的，1 9 0 8 年华侨自马来西亚带回大 粒种、中粒种种在海南岛，目前，主要栽培区分布在云南、广西、广东和海南。 云南省为咖啡种植大省，其1 9 5 2 年热经所马锡晋等从德宏引进潞江坝试种 “文革期间咖啡产业遭受破坏，1 9 8 0 年恢复生产，2 0 0 5 年，全省面积3 2 万亩， 产量2 2 万吨，产值2 4 亿元，栽培上以小粒种为主，已确认的栽培品种有7 0 多 个，种质资源达数百个，国内有品种资源2 0 0 多个，其中单云南热带植物研究 所就拥有1 0 0 多个。 由以上资料分析可以得知：云南省为烟草、咖啡种植大省，烟草、咖啡样品 产量高，质量好，容易获得，且满足通过梅拉德反应制备类黑精的反应物条件。 1 4 本课题研究的目的、重要性及意义 近年来随着公众对化学合成抗氧化剂食用安全性的质疑和大量实验对其人 体毒副作用的揭示，筛选鉴定天然药食资源中安全有效的抗氧化活性物质己日益 引起了国内外学者的极大关注【28 2 9 1 。国际上于1 9 9 9 年3 月成立了题为：“食品 类黑精与健康”的9 1 9 活动( c o s ta c t i o n9 1 9 ) ，这个由j e n n i f e r a m e s 教授( 英 国里丁大学) 负责，有1 6 个欧洲国家的科学家参与的大型科研活动，专门就类黑 精的结构特性、风味结合特性、色泽与热力学特性、食品基质中的抗氧化特性、 人体生理学及健康特性等五大领域进行协作研究【3 0 1 。 由此可见，类黑精对人体健康的重要性，它可望成为人类解开许多与人类健 康密切相关的谜团的一把钥匙。但目前，人类对梅拉德反应的具体过程和机理还 不清楚，对类黑精的具体组成、分子结构、性质及其发挥抗氧化的功能机理知之 6 1 前言 甚少，还需要做大量的深入研究。 总之，梅拉德反应产物中的类黑精类物质具有明显的抗氧化功能，这一点已 为大量的研究成果所证实。目前，此类研究的焦点主要集中在如何定量、定性的 确定类黑精物质的组成、分子结构及其抗氧化的机制等方面。 研究表明烟叶蛋白质具有较高的营养价值和药用价值，利用烟草中的氨基 酸、蛋白质或糖类进行梅拉德反应制备烟草类黑精。可开发烟草食用、药用方面 的潜在功能；咖啡是人们喜爱的饮料，其类黑精的抗氧化作用有利于人体健康， 以烟草、咖啡为原料制备类黑精，研究其抗氧化活性的报道极少，云南具有烟草、 咖啡的资源优势，本项目对烟草类黑精、咖啡类黑精的制备条件、抗氧化活性进 行研究，可为应用天然抗氧化剂提供理论依据，在食品工业中具有重要意义。 7 烤烟、咖啡的梅拉德反应及其产物抗氧化活性研究 2 烟草类黑精的抗氧化活性研究 2 1 烤烟类黑精的制备 2 1 1 仪器试剂与材料 烤烟叶( 云南大理产，复烤) ：云南瑞升烟草科技有限公司提供： 无水乙醇、丙酮、葡萄糖、盐酸、氢氧化钾等均为市售国产分析纯； 油浴设备、5 8 0 4 r 低温高速离心机；旋转蒸发仪( r e 一5 2 ，上海安亭电子仪器 厂) ；恒温水浴锅( d z k w 一4 ，上海科析试验仪器厂) ；真空干燥箱( z d f - - 6 0 3 0 a ，上 海一恒科学仪器有限公司) ；精密p h 计( p h s 一3 c ，上海雷磁仪器厂) 等。 2 1 2 烤烟类黑精的提取原理 梅拉德反应是在一定的温度、水分条件下，蛋白质或氨基酸的氨基与糖类的 羰基所发生的复杂反应。 烟草的成分十分复杂，其中的碳水化合物约占5 0 ，而且其蛋白质含量颇为 丰富( 如白肋烟中蛋白质含量高达2 0 4 8 ) ，各种必需氨基酸含量均高于世界粮 农组织( f a o ) 制定的蛋白制品中必需氨基酸含量标准。因此可以利用烟草中的氨 基酸、蛋白质或糖类进行梅拉德反应从而制备烟草类黑精。 烤烟是将生长成熟的烟叶置于设有热气管道的烤房中，给以适当的温湿度条 件，使烟叶内在成分进行生物化学变化，最终使烟叶变黄后干燥，是制作烤烟型 卷烟的主要原料口。其生产过程同样也满足了梅拉德反应的所有条件，所以在烤 烟中理论上应该存在一定量的类黑精组分，可以对其进行提取作为制备条件的对 比参照物。 8 2 烟草类黑精的抗氧化活性研究 2 1 3 烤烟类黑精的提取方法 烤烟叶一磨碎一煮沸( 3 - 1 0 m i n ) 重复2 一- 3 次一过滤一滤液离心( 室温， 3 0 0 0 r m i n ，3 0 m i n ) 一上清液，盐析( 静置过夜) 一过滤一滤液离心( 6 0 ) ，其大小对产物的检测结果影响并不明显。 2 3 2 3p i - i 值对制备类黑精的影晌 梅拉德反应是氨基和羰基在一定温度条件下所发生的反应，但作为一个复杂 的多步多参与物的反应而言，p h 值是一个很重要的影响因素。实验通过控制反 应初始p h 值，检测其对反应的影响。 1 4 2 烟草类黑精的抗氧化活性研究 根据文献【3 9 4 0 ，4 1 ，4 2 1 ，p h 值是影响梅拉德反应的一个重要因素，一般该反应 随p h 值的升高而加剧，而通过实验也表明，在起始p h = 9 5 的条件下得到的制 备烤烟类黑精表现出的抗氧化活性最大，强于起始p h i 1 2 5 c ) 时，其又会随温度的升高而降低。原因可以 推测为，温度过高造成原料的胶化、碳化，从而减少了参与反应的反应物的量， 最后导致产物的减少。 2 3 2 5 反应时间对制备类黑精的影响 梅拉德反应是氨基和羰基在一定温度条件下所发生的反应，但其反应并不剧 烈，很难通过外在特征判别反应程度。而作为一个多步多产物的反应，不同的反 应程度必然会产生不同的反应产物，带来不同的活性。实验通过统一其他因素， 间隔取样，从而检测反应时间对反应产物的影响 表2 5 反应时间对制备类黑精的影响 t a b l e2 - 5r e a c t i o nt i m e st op r e p a r et h em e l a n o i d i n st h ei n f l u e n c e 一定的反应时间是梅拉德反应产物拥有较高产率和较好抗氧化活性的必要 条件。但是无限的延长反应时间并不能提高产率和产物活性，原因推测为在产物 最高点( 8 至1 0 5 小时) 反应物已消耗尽，再延长反应时间也没有更多的反应物 参与反应而导致反应停止。 2 3 3 制备烤烟类黑精的最佳条件 1 6 2 烟草类黑精的抗氧化活性研究 制备烟草类黑精的最佳条件为： 葡萄糖和烟草的质量比，1 ：3 ； 水分含量，6 0 ； p h 值，9 5 ； 反应温度，1 0 0 ； 反应时间，8 h 表2 - 6 烟草类黑精与v c 抗氧化活性比较 t a b l e2 - 6t m sa n dv co x i d a t i o nr e s i s t a n c ea c t i v e n e s sc o m p a r e s 表2 - 6 的结果表明：烟草类黑精均具有一定的抗氧化能力，虽然最佳条件下 的制备烤烟类黑精的抗氧化能力弱于v c ，但较之烤烟类黑精其各种抗氧化能力 具有很大程度的提高。而且烤烟类黑精的热稳定性均强于v c ，其长时间暴露在 空气中也不会造成其抗氧化能力的下降，稳定性高，所以制备烤烟类黑精初提物 仍具有继续研究开发的广大前景。 2 4 烤烟及制备烤烟类黑精的分离方法研究 2 4 1 仪器试剂与材料 使用2 1 制得的各种烟类黑精( 烤烟类黑精、制备烟草类黑精) 作为实验材料 层析柱( 3 8 7 0 c m m ) ，大孔吸附树脂( s 8 极性大孔吸附树脂) ，透析袋( 1 k d a 、 1 7 烤烟、咖啡的梅拉德反应及其产物抗氧化活性研究 3 5 k d a10 k d a ) ，超滤仪等； 无水乙醇、盐酸、氢氧化钠等均为国产分析纯； 双蒸去离子水等 2 4 2 分离方法 2 4 2 1 分离方法原理 1 ) 大孔吸附树脂分离法 大孔吸附树脂是一种具有大孔结构的有机高分子共聚体，是一类人工合成的 有机高聚物吸附剂。因其具多孔性结构而具筛选性，又通过表面吸附，表面电性 或形成氢键而具吸附性。一般为球形颗粒状，粒度多为2 0 6 0 目。大孔树脂有非 极性( h p d 一1 0 0 ，h p d 3 0 0 ，d 1 0 1 ，x 一5 ，h 1 0 3 ) ，中等极性( a b 一8 ，d a 2 0 1 ， h p d 4 0 0 ) ，极性( n k a 一9 ，s 8 ，h p d 5 0 0 ) 之分。大孔吸附树脂理化性质稳定，一 般不溶于酸碱及有机溶媒，在水和有机溶剂中可以吸收溶剂而膨胀m 】。 大孔吸附树脂的吸附原理是根据类似物吸附类似物的原则，一般非极性树脂 宜于从极性溶剂中吸附非极性有机物质，相反强极性树脂宜于从非极性溶剂中吸 附极性溶质，而中等极性吸附树脂，不但能从非水介质中吸附极性物质，也能从 极性溶液中吸附非极性物质。 由于类黑精属于大极性的复合成分，所以选用极性( s 8 ) 的大孔吸附树脂。 2 ) 低温透析分离法【4 5 】 透析为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一，在生物大分子的 制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用 到透析的技术。 透析通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析 袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐 和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保留 在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋( 膜) 外的溶液称为“渗出液 或“透析液”。 透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速 1 8 2 烟草类黑精的抗氧化活性研究 度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正 比于膜的面积和温度，通常是4 c 透析，升高温度可加快透析速度。 透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜， 目前常用的是美国u n i o nc a r b i d e ( 联合碳化物公司) 和美国光谱医学公司生产的 各种尺寸的透析管，截留分子量m w c o ( 即留在透析袋内的生物大分子的最小分 子量，缩写为m w c o ) 通常为l 万左右。 3 ) 超滤分离法【4 6 ，4 7 ，4 8 , 4 9 , 5 0 】 超滤( u l t r a f i l t r a t i o n ) 技术是一种膜滤法，也有错流过滤( c r o s sf i l t r a t i o n ) 之称。 它能从周围含有微粒的介质中分离出1 0 1 0 0 a 的微粒( 通常是指液体内的溶 质) 。其基本原理是在常温下以一定压力和流量，利用不对称微孔结构和半透膜 介质，依靠膜两侧的压力差作为推动力，以错流方式进行过滤，使溶剂及小分子 物质通过，大分子物质和微粒子如蛋白质、水溶性高聚物、细菌等被滤膜阻留， 从而达到分离、分级、纯化、浓缩目的的一种新型膜分离技术。 与传统分离方法相比，超滤技术具有以下特点： 第一，超滤过程是在常温下进行，条件温和无成分破坏，因而特别适宜对热 敏感的物质，如药物、廓、果汁等的分离、分级、浓缩与富集。 第二，超滤过程不发生相变化，无需加热，能耗低，无需添加化学试剂，无 污染，是一种节能环保的分离技术。 第三，超滤技术分离效率高，对稀溶液中的微量成分的回收、低浓度溶液的 浓缩均非常有效。 第四，超滤过程仅采用压力作为膜分离的动力，因此分离装置简单、流程短、 操作简便、易于控制和维护。 2 4 2 2 分离方法 1 ) 大孔吸附树脂树脂的分离方法【5 l 】 普通商品大孔吸附树脂常含有一定量未聚合的单体、致孔剂、分散剂及交联 剂等，既影响其吸附性能，又具有毒性，造成药品的不安全性，使用前必须经过 预处理以除去树脂中的有机残留物。 第一，预处理的方法：大孔吸附树, i 旨( 2 0 , - - , 6 0