（生物化学与分子生物学专业论文）大鼠zfp580基因的克隆与原核表达.pdf

英文缩写a b b r e v i a t i o na sd n ac d n am r n al d le c o l ik da m pk a np c rr t p c ro i 疆m c si p t gs d sp a g el bp m s fd e p c0 d英文缩写f u l le n g l i s hn a m ea t h e r o s c l e r o s i s 。d e o x y n u c l e i c a c i dc o m p l e m e n t a r yd n am e s s e n g e rr i b o n u c l e i ca c i dl o w d e n s i t yl i p o p r o t e i ne s c h e r i c h i ac o l ik i l od a l t o na m p i c i l l i nk a n a m y c i ns u l f a t ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nr e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p c ro p e n - r e a d i n gf r a m em u l t i p l ec l o n i n gs i t ei s o p r o p y l t h i o p d - g a l a c t o s i d es o d i u md o d e c y l s u l f o n a t ep o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h r e s i sl u r i a b e l - t a n im e d i u mp h e n y l m e d t h y l s u f o n y lf l u o r i d ed i e t h y lp y r o c a r b o n a t eo p t i c a ld e n s i t yc h i n e s e动脉粥样硬化脱氧核糖核酸互补d n a信使核糖核酸低密度脂蛋白大肠杆菌千道尔顿氨苄青霉素卡那霉素聚合酶链反应逆转录聚合酶链反应开放阅读框架多克隆位点异丙基硫代p d 半乳糖苷十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳l b 培养基苯甲基硫酰氟焦碳酸二乙酯光密度8英文缩写ux g a ld t te bd wm rn c b it r i sg s tp b sa m vb pk bd s m ou n i t单位5 - b r o m o 4 c h l o r o 3 i n d o l y 5 溴一4 - 氯一3 吲哚一d - d g a l a c t o s i d e3 - d 半乳糖苷d i t h i o t h r e i t o l二硫苏糖醇e t h y l e n eb r o m i d e溴化乙锭d e m o m z e dw a t e r去离子水m o l e c u l a r分子量n a t i o n a lc e n t e rf o r美国国立生物b i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n技术信息中心t r i s h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷g l u t a t h i o n - s t r a n s f e r a s e谷胱苷肽巯基转移酶p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e磷酸盐缓冲生理盐水a v i a nr e v e r s et r a n s c r i p t a s e禽源性反转录酶b a s ep a i r碱基对k i l o b a s e千碱基d i m e t h y is u l f o x i d e二甲基亚砜9河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师( 或指导小组) 的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，碱警枣姊臌臻鬣誓：晦河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名杀谢导师签每：多砻焉。籀年方月& 夕日中文摘要大鼠z f p 5 8 0 基因的克隆与原核表达摘要目的：克隆和分析z f p 5 8 0 基因c d n a 开读框架全编码区( 编码1 7 2 个氨基酸) 、n 端编码区( 编码1 8 8 位氨基酸) 、c 端c 2 h 2 型锌指主构域编码区( 编码8 9 17 2 位氨基酸) 。构建z f p 5 8 0 基因原核表达载体并鉴定，诱导表达g s t z f p 5 8 0 融合蛋白。方法：l 从正常大鼠小脑组织中提取总r n a 。2 根据g e n b a n k 公布的大鼠z f p 5 8 0 基因c d n a 开读框架序列设计引物，用r t p c r 的方法扩增z f p 5 8 0 基因c d n a 开读框架以及z f p 5 8 0 基因的n 端编码区和c 端编码区。3 用t - a 克隆方法将目的基因克隆至p m d l 8 t e a s y 载体中，挑取琼脂板上的白色菌落，接种于5 m l 含有a m p 的l b 液体培养基中，3 7 摇菌培养过夜。用碱裂解法小剂量制备重组质粒。采用且搬i 和勋p i 双酶切法、p c r 法及测序法鉴定重组质粒。构建成功的阳性重组质粒记作p m d l8 t z f p 5 8 0 。同法成功克隆z f p 5 8 0 基因n 端编码区和c 端编码区，阳性重组质粒记作p m d18 一t n 、p m d18 - t - c 。4 用b g i i i 和x h o i 对克隆载体p m d l 8 t z f p 5 8 0 和原核表达载体p e t 4 2 a ( + ) 分别进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳酶切产物，纯化回收带有粘端的z f p 5 8 0 基因和p e t 4 2 a ( + ) 载体。将z f p 5 8 0 基因和i p e t 一4 2 a ( + ) 表达载体用t 4 d n a 连接酶连接过夜。连接产物转化d h 5 感受态细胞，加l b 液体培养基，3 7培养6 0 m i n 。将菌液均匀涂布于含k a n 的l b 琼脂平板上，中文摘要于3 7 。c 培养箱中培养1 2 。1 6 h 。挑取琼脂板上的单菌落，接种于5 m l 含有k a n 的i 。b 液体培养基中，3 7 摇菌培养过夜。用碱裂解法小剂量制备质粒进行鉴定。阳性重组质粒记作p e t 4 2 a z f p 5 8 0 。同法成功构建z f p 5 8 0 基因的c 端编码区，阳性重组质粒记作p e t 4 2 a - c 。阳性重组质粒用双酶切的方法鉴定并双向测序，确认有无读码框错误。5 阳性重组载体p e t 4 2 a z f p 5 8 0 转化e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) ，i p t g 诱导表达，优化表达条件，确定最佳表达参数，s d s p a g e 分析鉴定g s t - z f p 5 8 0 蛋白的表达。6 生物信息学分析z f p 5 8 0 基因结构和功能。结果：l 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳呈现清晰的2 8 s 矛il8 s两条带，并且2 8 s 宽度以及亮度是1 8 s 的2 倍，5 s 量较少。证实所提取总r n a 完整性高。测o d 2 6 0 o d 2 8 0 比值1 9 左右，证明总r n a 纯度高，无蛋白质和酶等抑制物残留。2r t p c r 扩增后，在5 1 9 b p 附近出现了一条特异性条带，此d n a 条带与大鼠z f p 5 8 0 基因c d n a 开读框架全编码区的大小相符合。测序证明已获得z f p 5 8 0 基因开读框架，其序列与g e n b a n k 中预测序列完全一致。同法获得2 6 4 b p 和2 5 2 b p 大鼠z f p 5 8 0 基因的n 端编码区和c 端编码区。序列比对结果证实与g e n b a n k 中预测的一致。3t a 克隆构建获得的阳性克隆载体p m d l 8 t n 、p m d l 8 一t c 、p m d l 8 t z f p 5 8 0 ，用b g li i 矛i x h oi 双酶切和p c r 法鉴定。结果表明，上述三个克隆载体己成功构建。4 原核表达载体p e t 4 2 a z f p 5 8 0 、p e t 。4 2 a c 经鉴定证实构建成功。测序证实p e t 4 2 a z f p 5 8 0 载体无读码框的错误，转化入表达菌株e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) ，i p t g 诱导，s d s p a g e 鉴中文摘要定分析g s t z f p 5 8 0 融合蛋白表达情况。5 小剂量多次进行蛋白表达实验，未能诱导表达目的蛋白。深入探讨了未能表达目的蛋白的原因。6 大鼠z f p 5 8 0 基因c d n a 全长l10 0 b p ，完整开读框架为5 1 9 b p ，编码一个含有1 7 2 个氨基酸的蛋白质，所编码的蛋白与锌指蛋白相似有2 个功能结构域：n 端的富含脯氨酸结构域和c 端的3 个c 2 h 2 型锌指结构。结论：1 大鼠z f p 5 8 0 基因c d n a 开读框架全编码区、大鼠z f p 5 8 0 基因的n 端编码区和c 端编码区与g e n b a n k 中预测序列完全一致。2 成功构建克隆载体p m d l 8 t n 、p m d l 8 t c 、p m d l 8 t z f p 5 8 0 和原核表达载体p e t 4 2 a z f p 5 8 0 、p e t 4 2 a c 。3 原核表达载体p e t 一4 2 a z f p 5 8 0 读码框正确无误，i p t g 诱导表达，经s d s p a g e 分析表达情况。小剂量多次进行蛋白表达实验，未能诱导表达目的蛋白。4 详细分析大鼠z f p 5 8 0 基因结构和功能，大鼠z f p 5 8 0 基因开读框架编码一个含有1 7 2 个氨基酸的蛋白质，所编码的蛋白与锌指蛋白相似有2 个功能结构域。关键词：z f p 5 8 0 ；基因克隆；原核表达；动脉粥样硬化；c 2 h 2 型锌指结构英文摘要c l o n i n ga n dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o no fz i n cf i n g e rp r o t e i n( z f p 5 8 0 ) g e n ei s o l a t e df r o mr a tc e r e b e l l u ma b s t r a c to b j e c t i v e ：t oc l o n et h ef u l l - l e n g t ho p e nr e a d i n gf l a m ec d n as e q u e n c eo fz i n cf i n g e rp r o t e i n ( z f p 58 0 ，e n c o d i n g17 2a m i n oa c i d s ) g e n ef r o mr a tc e r e b e l l u m t oc l o n ea n da n a l y z et h ee d n as e q u e n c eo fa m i n ot e r m i n a le n c o d i n gr e g i o n( e n c o d i n g1 - 8 8a m i n oa c i d s ) a n dc a r b o x y lt e r m i n a le n c o d i n gr e g i o n ( e n c o d i n g8 9 17 2a m i n oa c i d s ) o fz f p 58 0g e n e t oc o n s t r u c tp r o k a r y o t i cf u s i o ne x p r e s s i o nv e c t o r sa n di n d u c e st h ee x p r e s s i o no ff u s i o np r o t e i ng s t - z f p 58 0 m e t h o d s ：1t o t a lr n aw a se x t r a c t e df r o mr a tc e r e b e l l u mw i t ht r i z o ls o l u t i o n 2t h es p e c i f i cp r i m e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h ee d n ae n c o d i n gs e q u e n c eo fz f p 58 0f u l l l e n g t ho p e nr e a d i n gf r a m ep u b l i s h e db yg e n b a n k t h ee d n ae n c o d i n gs e q u e n c e so fz f p 58 0f u l l l e n g t ho p e nr e a d i n gf r a m e ，a m i n ot e r m i n a le n c o d i n gr e g i o na n dc a r b o x y lt e r m i n a le n c o d i n gr e g i o nw e r eo b t a i n e db yr t - p c r s e q u e n c ea n a l y s i so ft h e s ef r a g m e n t sa n di t sd e d u c e da m i n oa c i d sw e r ea c c o m p l i s h e do n l i n ea tt h en a t i o n a lc e n t e rf o rbi o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o ns e r v e r sa n de d i t e du s i n gt h ep r i m e r 5 ，c l u s t a l xa n dd n a m a np r o g r a m s 3t h e s ec d n af r a g m e n t so fz f p 58 0g e n ew e r ec l o n e di n t op m d18 一t e a s yv e c t o ra c c o r d i n gt ot h ei n s t r u c t i o n so ft h et a4英文摘要c l o n ek i ta n ds e q u e n c e d p l a s m i d sw e r ee x t r a c t e da c c o r d i n gt ot h ei n s t r u c t i o n so fp l a s m i de x t r a c t i o nk i ta n dd i g e s t e dr e s p e c t i v e l yb yr e s t r i c t i o ne n z y m ex h oia n db g li it os e l e c tp o s i t i v er e c o m b i n a n t s t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d sw e r en a m e da sp m d18 一t z f p 58 0 ，p m d18 一t ca n d p m d18 一t nr e s p e c t i v e l y t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d sw e r es e n tt ot a k a r ac o m p a n yt ob es e q u e n c e db yu s i n gt h ed i d e o x yc h a i n t e r m i n a t i o nm e t h o d 4t h ep m d l8 一t - z f p 5 8 0r e c o m b i n a n tv e c t o ra n dp e t 一4 2 a ( + )f u s i o ne x p r e s s i o nv e c t o rw a sd i g e s t e db yt h eb g li ia n dx h oir e s p e c t i v e l y t h ed i g e s t e dp r o d u c t sw e r ep u r if i e d ，r e c o v e r da n dt h e nl i n k e db yt 4 d n al i g a s ea t16 0 cf o rlh t h er e c o m b i n a n t sw e r et h e nt r a n s f o r m e di n t oe c o l id h 5 ac o m p e t e n tc e l l s s e v e r a lc l o n e sw e r er a n d o m l ys e l e c t e d ，t h e ni n o c u l a t e d i n5 m ll bl i q u i dc u l t u r em e d i u m ( c o n t a i n i n gk a n ，lo i j g m 1 )r e s p e c t i v e l y ，a n dc u l t u r e d37 0 ca t2 2 0r p mo v e r n i g h t p l a s m i d sw e r ee x t r a c t e da c c o r d i n gt ot h e i n s t r u c t i o n so fp l a s m i de x t r a c t i o nk i ta n dd i g e s t e dr e s p e c t i v e l yb yr e s t r i c t i o ne n z y m eb g li ia n dx h oit os e l e c tp o s i t i v er e c o m b i n a n t s t h ec d n ae n c o d i n gs e q u e n c eo fz f p 580f u l l l e n g t ho p e nr e a d i n gf l a m ew a ss u b - - c l o n e di n t op r o k a r y o t i ce x p r e s s i n gp l a s m i dp e t - 4 2 a( + ) ，g e n e r a t i n gp e t - 4 2 a - z f p 58 0 p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp e t - - 4 2 a - z f p 58 0w a ss e q u e n c e db yu s i n gt h ed i d e o x yc h a i n t e r m i n a t i o nm e t h o da n dc o n f i r m e db yr e a d i n gb o t hs t r a n d s 5p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nr e c o m b i n a n tp l a s m i d sw e r e5英文摘要t r a n s f o r m e di n t oe c o l ib l 21 ( d e 3 ) t oe x p r e s st h ep r o t e i n s a f t e rt h er e c o m b i n a n tb a c t e r i u mw a si n d u c e dw i t hi p t g ，t h ee x p r e s s e dr e c o m b i n a n tp r o t e i nw a sa n a l y z e dw i t hs d s p a g e r e s u l t s ：1t h et o t a lr n ap r o d u c tw a se x a m i n e db yt h ee l e c t r o p h o r e s i so fa g a r o s eg e lc o n t a i n i n gf o r m a l d e h y d e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew e r et w oc l e a rb a n d so f18 sa n d2 8 s t h er a t i oa 2 6 0 a 2 8 0a n da 2 6 0 a 2 3 0o fr n as a m p l ew a sa l la b o u t1 9 ，w h i c hd e m o n s t r a t e dt h a tr n aq u a n t i t ya n dp u r i t yw e r ew e l l i tc a nb eu s e di nt h ef o l l o w i n gr t p c r 2t h ee d n ao p e nr e a d i n gf r a m es e q u e n c eo fz f p 58 0 ，a m i n ot e r m i n a le n c o d i n gr e g i o na n dc a r b o x y lt e r m i n a le n c o d i n gr e g i o nw e r eo b t a i n e db yr t p c rs u c c e s s f u l l y d n as e q u e n c i n gr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ez f p 5 8 0o p e nr e a d i n gf r a m es e q u e n c e ，t h es e q u e n c e so f z f p 58 0a m i n ot e r m i n a le n c o d i n gr e g i o na n dz f p 58 0c a r b o x y lt e r m i n a le n c o d i n gr e g i o nw e r ee x a c t l yc o n s i s t e n tw i t ht h es e q u e n c er e p o r t e di ng e n b a n k 3t h er e s u l t so fd o u b l ee n z y m ed i g e s t i o nw i t hb g ti ia n dx h ois h o w e dt h er e c o m b i n a n tp l a s m i d sc o n s t r u c t i o no fp m d18 一t -z f p 5 8 0 ，p m d l 8 一t - ca n dp m d l 8 一t - no fz f p 5 8 0g e n ei ss u c e e s s f u l 4t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d so fp e t 4 2 a - - z f p 58 0a n dp e t - 4 2 a -cw e r ec o n f i r m e db yr e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s ed i g e s t i o na n dd n as e q u e n c i n gr e s p e c t i v e l y t h er e s u l ti n d i c a t e st h a tt h er e c o m b i n a n tp l a s m i do fp e t 4 2 a z f p 58 0c o n t a i n st h ec o r r e c to p e nr e a d i n gf r a m e 5t h ee x p r e s s i o no ft h eg s t z f p 58 0f u s i o np r o t e i ni nec o l i6英文摘要b l 21 ( d e 3 ) w a sa n a l y z e db ys d s p a g e n oe x p e c t e dp r o t e i nb a n dw a so b s e r v e dw i t hi n d u c t i o no fi p t g6t h es e q u e n c eo ft h ew h o l el e n g t hc d n ao fz f p 58 0g e n ei s110 0 b p i tc o n t a i n sa no p e nr e a d i n gf l a m e ( 519 b p ) ，e n c o d i n gap r o t e i nc o n s i s t e do f17 2a m i n oa c i d s t h er e s u l to fa m i n oa c i d ss e q u e n c ea n a l y s i so fz i n cf i n g e rp r o t e i no n l i n ed e m o n s t r a t e dt h a tt h ee n c o d i n gp r o t e i no fz f p 58 0h a st w od o m a i n s t h ea m i n ot e r m i n a lr e g i o nb e t w e e na m i n oa c i d s5a n d8 8i sa l s or e m a r k a b l er i c hi np r o l i n er e s i d u e s t h ec a r b o x y lt e r m i n a lr e g i o nb e t w e e na m i n oa c i d s9 4 17 2i n c l u d e st h r e eh i g hc o n s e r v e dc 2 h 2z i n cf i n g e rm o t i f s c o n c l u s i o n ：1t h ec d n ao p e nr e a d i n gf r a m es e q u e n c eo fz f p 58 0 ，a m i n ot e r m i n a le n c o d i n gr e g i o na n dc a r b o x y lt e r m i n a le n c o d i n gr e g i o nw e r es u c c e s s f u l l yc l o n e d t h o s ec d n as e q u e n c e sa r ei d e n t i c a lt ot h ep r e d i c t e dz f p 58 0g e n eo fg e n b a n k 2t h ec l o n ev e c t o r so fp m d18 - t n 、p m d18 t c 、p m d18 一t z f p 58 0a n dp e t 4 2 a - - z f p 58 0f u s i o ne x p r e s s i o nv e c t o rw e r ec o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y 3n oe x p e c t e dp r o t e i nb a n dw a so b s e r v e dw i t hi n d u c t i o no fi p t g 4t h eo p e nr e a d i n gf l a m eo fz f p 58 0g e n ee n c o d e sa17 2a m i n oa c i dp r o t e i nc o n t a i n i n gt w od o m a i n s k e yw o r d s ：z f p 5 8 0 ；g e n ec l o n i n g ；p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ；a t h e r o s c l e r o s i s ；c 2 i - 1 2z i n cf i n g e r研究论文大鼠z f p 5 8 0 基因的克隆与原核表达 _ l - j - 一刖吾动脉粥样硬化( a t h e r o s e l e r o s i s ，a s ) 以富含脂肪的斑块在大动脉壁聚积为特征，是心脑血管疾病的主要病理基础，a s常伴有高血压、高胆固醇血症或糖尿病等。a s 导致的疾病是发达国家第一位的死亡原因【l 】。近年来，随着我国经济的快速发展和人口的老龄化，心脑血管疾病的发病率与死亡率也显著增加。关于a s 的发病机制至今尚未完全阐明，主要有以下几种说法：( 1 ) 认为a s 是一种慢性炎症和自身免疫性疾病，炎症和免疫是致a s 发病的中心环节【2 3 】，a s 过程中炎症因子始终存在，随着炎症因子量的升高加重其病理发展【4 】。( 2 ) 有研究资料表明，a s 的发生和发展与脂质代谢紊乱关系密切。如：新近发现的一种载脂蛋白m ( a p o m ) 主要与h d l 代谢相关，能降低a s 的发病率【5 1 。( 3 ) a s 是一种与a s 有关的基因表达异常引起的疾病，近年来研究表明，a s 斑块内细胞基因异常表达【6 】。本课题主要研究低密度脂蛋白( l o w d e n s i t yl i p o p r o t e i n ，l d l ) 降调节新基因z n f 5 8 0 的大鼠同源基因z f p 5 8 0 ，为阐明l d l 致a s 的发病机制提供实验依据。自19 7 6 年成功进行e d n a 的分子克隆至今【7 】，e d n a 文库已有2 0 多年的历史，它己经成为分子生物学研究的一个极为重要且有效的方法。在体外将细胞的m r n a 由反转录酶酶促合成单链d n a ，称为互牢b d n a ( e d n a ) ，再以其为模板，由大肠杆菌d n a 聚合酶i 合成第二链，此双链d n a 和载体d n a研究论文重组，并转化到宿主菌细胞中或包装成噬菌体颗粒得到一系列克隆群体，每个克隆只含种m r n a 的信息，足够数目克隆的总和则包含细胞的全部m r n a 信息，这样的克隆群体叫c d n a 文库 8 1 ，c d n a 便于克隆和大量扩增，可以从e d n a 库中筛选到所需的目的基因。生物信息学是近年来发展起来的一门由分子生物学和计算机信息处理技术相结合的交叉学科。它的基本出发点是利用数据库和软件技术对大量积累的生物大分子序列数据和实验新测定的序列进行结构比较和统计学分析，推导出序列同源性，揭示出生物大分子的分子结构、功能和进化关系【9 】o本实验的前期工作：以致a s 因素l d l 诱导人脐静脉内皮细胞系e c v 3 0 4 ，采用差异显示逆转录p c r 技术进行分析，以差异表达的新e s t s 为探针，筛选人主动脉c d n a 文库，得到一个全长为1 7 2 6 b p 的新基因c d n a 全长( g e n b a n k 注册号：a f l8 4 9 3 9 ) 0 0 ，该基因由人类基因命名委员会定名为z n f 5 8 0 。该基因是一个与l d l 降调节有关的新基因。z n f 5 8 0基因定位于人1 9 号染色体1 9 q 1 3 4 2 。z n f 5 8 0 基因c d n a 第7 4 8 1 2 6 6 位碱基序列构成一个完整的开放阅读框架，编码1 7 2个氨基酸的蛋白质。经分子生物学网站进行蛋白质的功能基序分析：其氨基端5 8 8 位氨基酸序列为脯氨酸富含域，羧基端9 4 1 7 2 位氨基酸序列中含有三个串联重复的c 2 h 2 型锌指蛋白结构域，三个锌指符合c 2 h 2 型锌指蛋白基序c x 2 c x 3 f x 5 l x 2 h x 3 h ( 其中x 代表保守性差的氨基酸) 。前期研究工作表明：l d l 诱导内皮细胞使z n f 5 8 0 基因表达明显下调。将z n f 5 8 0 编码区克隆到真核表达载体p e g f p c 1 上，研究论文转染人胚肾上皮细胞系h e k 2 9 3 、胃癌细胞系m g c 8 0 3 进行瞬时表达，融合有绿色荧光蛋白e g f p 的目的蛋白定位于细胞核。z n f 5 8 0 基因编码一种与a s 爿f h 关的具有调控作用的c 2 h 2型锌指核蛋白转录因子i l l - 1 3 。由于在人体内的研究受到诸多限制，而大鼠具有易操作、成本低等优点，为了进一步阐明z n f 5 8 0 基因在a s 发生、发展中的作用，有必要克隆其鼠源性同源基因z f p 5 8 0 ，原核表达其蛋白，制备多克隆抗体，利用免疫组织化学技术检测z f p 5 8 0 在正常鼠与a s 模型鼠主动脉内皮细胞、平滑肌细胞中的差异表达情况。在动物整体水平探讨z f p 5 8 0 表达与血浆l d l 水平及a s 发生的关系，为阐明a s 发病机理及a s 的防治提供新的科学依据。本实验从正常大鼠小脑组织中提取总r n a ，进行反转录反应合成e d n a 第一链，通用r t p c r 的方法获得目的基因片段。经过酶切、纯化、连接后，转化到大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 )表达菌株中，对阳性克隆进行鉴定，测序结果说明成功构建了z f p 5 8 0 基因的表达载体p e t 4 2 a ( + ) z f p 5 8 0 。表达载体经诱导表达后产生目的蛋白质，有利于进一步制备多克隆抗体，为深入研究z f p 5 8 0 基因与a s 的相关性奠定了基础。研究论文材料与方法1 实验材料1 1 实验动物健康成年s d 雄性大鼠，购白军事医学科学院动物室。动物清洁度3 级，动物生产许可证号s c x k l1 0 0 0 0 0 0 9 0 。1 2 实验用菌株菌株基因型用途e c o l id h 5 af 冷8 0 dl a c z a m l 5用于质粒的扩增与转化r e c a ie n d a1g y r a 9 6e c o l i j m l 0 9r e c a ls u p e 4 4e n d a l用于质粒的扩增与转化h s d r l 7g r y a 9 6e c o l i b l 2 1 ( d e 3 ) h s d sg a l ( c l t s 8 5 7i n d i用于含t 7 1 a c 启动子的载s a m 7n i n 5i a c u v 5 t 7 )体表达外源蛋白的宿主菌1 3 工具酶和分子量标准所用限制性内切酶砌d i 和b g l i i 购自t o y o b o 生物工程公司( 鼎国代理) ；高保真e x t a q 酶、d n t p 、溶菌酶、t 4d n a连接酶及其相对应的缓冲液、1 0 0 b p d n al a d d e r 、d l 2 0 0 0m a k e r 购自大连宝生物公司；低分子量蛋白m a r k e r 购自p h a r m a c i a 公司；r e s i n 、r n a s e a 购自s i g m a 公司。以上酶类皆为2 0 冰箱保存。1 4 质粒载体p e t 4 2 a ( + ) v e c t o r ( n o v a g e n ) ：( 图谱如下) 用于原核表达。p m d l 8 tv e c t o r ( t a k a r a ) ：( 图谱如下) 用于p c r 产物的克隆及测序。研究论文p e t 一4 2 a ( 十) 载体限制性酶切位点和多克隆位点图谱如下：。谳矗篙蒜谲撩器慧端茹茹黻。嚣。漉若。0 熬，。m m “m d w m u r t “”w “1 。c c “t t t ”“”“”馏搿怒j 剑凹酗l 一j 丝塑刍l 一j 龇馓2 兰爵 等：嚣k 嚣i 粼；篇龄：黑笨：盟绻蹬：搿：粼 嚣c c c 器：鼢：黧黑笛盖譬跬篮：王盆姒鼬耋翼些呈篓坠mm “。鬈k “仃“t 代黼誓“毹w 仃r r w c e 肛c m 懈“坫c “榭i r c l & g , g r 腻o * t 礴t 筠盯。函讯t 代嘲t 研孙“- “州n r l “l 憎哺山“幽h 咖“孙血畦岬蠕m 鼍黑譬鼍，j 吲耽群w4 r 舭i ：神 _ 嚼扁自i一 “墓函匣轴l量- 。州“暑字t 时e 曼酗刍l 一搿誓：勰踹翟j 等棼娶微嬲：“l h “；t l 譬臻嚣誓；：怒嚣甓浅蹈销微嬲：黜搿t 王篙徽i 粼；燃错竺徽擞臻：嚣”舢鬈z 燃搿臻黜器怒搿器篙：恶：篙：黝：紫：觜： 嚣嚣：鬈：搿暑：嚣焉嚣掰：搿f c 搿：蹴嚣：裂：萎鞲揣! 曼冀：嬲燃嬲臌嬲端器黢嬲翳嬲麒黑霉筘墅麓糍；蔓熊嬲；黧釜篓娑箱劂竺，! 篓竺p e l - 4 2 a + jc l o n i n 9 j e x p r e s s i o nr e 9 i o n s1 4研究论文p m d i8 - t 载体限制性酶切位点和多克隆位点图谱如下：p m d l 8 - t & p m d l 9 - tv e c t o r 的结构! 生一声骂器鬻地睁掣霉擘譬盘叫冀陋螺挈甥删x 认l o m r te 珊o 聃a o m 靠雠， t a t “n w o a 爿t c 粕瓣1 0 r f j t 慑；陬 肭1c i x , 1 耵 r m i f o g ，o r 翻拍“o n ，o v 啪t ，o 蝌。一“翟鼍嚣：怒燃荔鬻，f 撕一鲫洲vc f “： r 二m ( ：c ：c r ；睁j 0 c ( 站蹦“狮m p l # n e 4 m | ”lp m d l 9 - tv e c t o r+ ：；涩翟嚣，搿线搿：m q 删直嗽f 瑚8 嘲l 啊，咖f i 懈r 哺瓠站x 认l ； 1t 1 口 m c c n - 蜥t a i r皇l “m m , f t t s # t ! ip j i ! i lm vm i , o - m t 4 1 ，熟! 伽i “i 1嬲! 曼! w l9 。i擞凸c m l m c 从 t f c 臻掰峨( 1 c 越；f t 噶艇o t 瑚h c z i 盈石荔才盏碱蠡苫赢石磊烈藩箍讼j 夏蕊矗i c 喊猢矗；霜卤焉苫矗 ol 鹪( 幽射螂，黼埘。枞c l 嘲 m 。c i 曲l嘞嘲蜥鳓v协o f ；坼t c c o t t l f o 。m c 。i峨女1 1 蛳t 瑚h 蛐n 州_ ” * 盯口t c 4 h c a lr8 t 。l 。a 口 螂o l # a1 4船的硪4 t 萍c b 嘴喇鞲埘1 5 试剂盒名称r t p c r 试剂盒d n a 纯化回收试剂盒p m d l8 tv e c t o rk i t1 6 试剂来源大连宝生物工程公司鼎国生物公司美国o m e g ab i o t e k 公司大连宝生物工程公司大连宝生物工程公司用途获得目的基因d n a 纯化和回收p c r 产物克隆焦碳酸二乙酯( d e p c ) 、四甲基乙二胺( t e m e d ) 购白s i g m a 公司；r n a 提取液t r i z o l 购g i b c o 公司；5 溴4 氯3 吲哚b d 一半乳糖苷( x g a l ) 、异丙基硫化b d 半乳糖苷( i p t g ) 、氨苄青霉素( a m p ) 和卡那霉素( k a n ) 购自t a k a r a 公研究论文司；二硫苏糖醇( d t t ) 购自美国b o e h r i n g e r 公司；酵母提取物、胰化蛋白胨、琼脂糖、氯化钠、三羟甲基氨基甲烷( t r i s )等购自北京奥博星生物技术有限责任公司；丙烯酰胺、n 、n 亚甲基双丙烯酰胺、二甲基甲酰胺、溴酚蓝购自p r o m e g a公司；十二烷基磺酸钠、醋酸钠、氢氧化钠购自广州化学试剂厂；过硫酸胺、甘油、1 3 疏基乙醇、氯仿、异丙醇、无水乙醇等其它各种试剂均为国产或进口分析纯。1 7 电泳相关溶液( 1 ) 5 0 x t a e 缓冲液：准确称取2 4 2 9 t r i s 溶于适量去离子水中，加入5 7 1 m l 乙酸，l o o m l0 5 m 的e d t a ( p h 8 o ) ，用乙酸调节p h 值至7 2 定容至1 0 0 0 m l 。( 2 ) 2 0 x t b e 缓冲液：t r i s1 2 1 1 9 ，硼酸6 1 7 9 ，e d t a7 4 4 9 ，加去离子水定容至1 0 0 0 m l 。( 3 ) d n a 上样缓冲液：0 2 5 溴酚蓝，0 2 5 - 甲苯青，3 0 甘油水溶液( w v