（水生生物学专业论文）草鱼和银鲫肠道产消化酶细菌的研究.pdf

华中农业大学2 0 0 8 属硕士学位论文 摘要 本试验以草鱼( c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l u s ) 和银鲫( c a r a s s i u sa u r a t u sg i b e l i o ) 为试验对象，研究了草鱼和银鲫肠道内可分泌胞外消化酶的细菌，并将筛自草鱼肠 道的高产酶活芽孢杆菌以不同浓度添加到草鱼饲料中，研究芽孢杆菌对草鱼肠道菌 群及肠道和肝胰脏消化酶活性的影响。 在研究草鱼和银鲫肠道内可分泌胞外消化酶细菌的试验中，检测了分别从草鱼 和银鲫肠道中分离的1 8 0 株细菌的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶的产酶能力。 结果显示，两种鱼肠道内可分泌胞外消化酶的细菌包括气单胞菌( a e r o m o n a s ) 、弧 菌( v i b r i o ) 、芽孢杆菌( b a c i l l u s ) 、假单胞菌( p s e u d o m o n a s ) 四个种属的细菌， 气单胞菌在其中占优势，4 5 7 1 的气单胞菌可分泌胞外消化酶。草鱼可分泌上述四 种胞外消化酶的菌株共有3 3 株，占肠道菌总数的3 6 6 7 ；银鲫4 3 株，占银鲫肠道 菌总数的4 7 7 8 。产酶菌的分布上，草鱼中肠内产消化酶细菌数量显著多于前肠和 后肠( p 鲫 鲢 鳊，而后肠壁细菌含量与食物没有明显的关系；后肠内容物和后肠壁中的 双歧杆菌数为：乌鳢 鲫 鲢 鳊。表明后肠内容物中的细菌总数、后肠内容物和 后肠壁中的双歧杆菌数都与食性相关。大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 、肠球菌和乳酸 菌( l a c t o b a c i l l u s ) 在后肠的分布没有规律，说明它们与食物相关性不强。 1 2 鱼类消化道细菌的作用 与人类及其它陆生动物相似，鱼类消化道内有着种类繁多的微生物群，它们在 消化道内维持着动态平衡。正常微生物群对鱼类具有屏障、免疫、营养、辅助消化 等方面的作用，这些作用是在长期的历史演化进程中形成的，起着互利共生的作用。 1 2 1 屏障 鱼类消化道内细菌的屏障作用主要是指正常菌群像一道屏障，抑制病原菌的生 长，提高宿主的抗病能力，保护宿主的健康。s a i n s b u r y 指出，1 0 个肠炎沙门氏杆菌 ( s a l m o n e l l a ) 就可杀死一只肠道内无菌群的小鼠，但要有1 0 0 万个肠炎沙门氏杆菌 才能杀死一只肠道内有常规菌群的小鼠，这说明了正常肠道菌群的屏障作用。b e r g h ( 1 9 9 5 ) 指出，鱼类的体表和消化道粘膜内定居着共生性细菌，形成细菌丛，并且 部分细菌与肠道粘膜上皮细胞紧密结合形成生物膜，这种对宿主细胞占位性的保护 作用有效地抑制了外来菌群的入侵，成为防止病原菌定居和增殖的屏障。l e m o s ( 1 9 8 5 ) 在潮间带的海藻上发现了有抗菌活性的细菌，之后产生抗菌活性的菌株也 从鱼类肠道中分离出来。w e s t e r d a h l ( 1 9 9 1 ) 认为肠道内有抗菌活性的菌可能会抑制 病原菌在肠道内的增殖。 s u g i t a 等( 1 9 9 6 ) 从7 种淡水鱼类肠道内分离出3 0 4 种肠道细菌，研究了它们 对1 8 种病原菌的体外抗菌能力，结果有3 2 表现出对病原菌的抗菌活性，肠道优 势菌中有部分细菌表现出不同程度的抗菌效果，抗菌活力随鱼的种类、采样时间、 部位而有差别，并且它们分泌的抗菌物质对肠道菌群的组成也有影响。o l s s o n ( 1 9 9 8 ) 给大菱鲆口服鳗弧菌，发现肠道细菌肉杆菌可抑制鳗弧菌生长。 1 2 2 免疫 鱼体肠道内存在数量庞大、结构复杂的正常菌群，而肠壁内存在为数众多、功 能强大的淋巴细胞，以肠粘膜为界，两者相互作用，相互制约，处于动态平衡状态。 正常肠道细菌及其代谢产物包含了大量的免疫刺激物质，如抗原、毒素等，而肠道 免疫屏障能对来自粘膜表面的各种抗原作出正确反应，即对无害抗原如食物及正常 茵群的抗原表现为免疫耐受( i m m u n et o l e r a t i o n ) 以保证食物的吸收和微生态的稳定， 不会因对无害抗原起反应而耗竭免疫资源；同时对病原体则产生免疫清除与免疫排 斥( i m m u n ee l i m i n a t i o na n di m m u n ee x c l u s i o n )。这种准确识别并产生两种截然不 2 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 同、方向相反的免疫反应，提示肠道免疫存在精确的调控机制。这种机制是在细菌 与机体免疫系统的长期相互作用、相互适应、长期进化过程中形成的。 有研究显示，与正常动物相比，无菌动物免疫系统发育不良，免疫细胞的结构 发生改变，包括集合淋巴结的发育不良、肠系膜淋巴结缺乏生发中心和浆细胞、巨 噬细胞趋化性降低、细胞内杀死致病菌的能力下降( w o s t m a n n ，1 9 9 6 ) 。李莉( 2 0 0 3 ) 报道，随着肠道内气单胞菌百分含量的下降，肠杆菌( e n t e r o b a c t e r i a c e a e ) 百分含 量的上升，草鱼白细胞的吞噬百分比和吞噬指数明显上升，这说明草鱼肠道优势菌 群气单胞菌、肠杆菌的变化可能影响到白细胞吞噬活性。另外，据r i n g n e ( 1 9 9 8 ) 和 d e l n e s t e ( 1 9 9 8 ) ，乳酸菌是鱼肠道内的正常菌群，在鱼体肠道内定植可抵抗g 致病 菌，增强抗感染能力，增加肠粘腊的免疫调节活性，促进生长。 1 2 3 营养 消化道菌群的维生素合成作用经常被认为是菌群所具有的主要积极作用之一。 消化道内的双歧杆菌能合成维生素b l 、维生素b 2 、维生素b 6 、维生素b 1 2 、烟酸和叶 酸等多种维生素，并能抑制内毒素血症( 王宁，李志远，2 0 0 4 ) 。尾崎久雄( 1 9 8 5 ) 介绍鱼类肠内能合成维生素b l 、尼克酸、泛酸、生物素及b 1 2 等。这些营养物质来 自于消化道微生物的分泌。k a s h i w a d a 等( 1 9 7 0 ) 以鲤为实验动物，用赖氏乳杆菌 ( l a c t o b a c i l l u sl e i c h m a n n i i ) 作为饲料添加剂进行投喂实验，测定鲤消化道内的维生 素b 1 2 ，结果表明，当投喂不含b 1 2 的饵料时，在肠内仍然可以观察到大量的b 1 2 ，显 然，这些b 1 2 是由鲤肠内的细菌合成的。s u g i t a 等( 1 9 9 0 ) 研究了淡水鱼类日本鳗鲡、 鲤、金鱼、罗非鱼和斑点叉尾鲴肠道菌群中产生维生素b 1 2 的菌株，发现鲤、金鱼、 罗非鱼肠道内寄生着大量的厌氧拟杆菌，这些鱼类无需补充外源维生素b 1 2 ，而日本 鳗鲡和斑点叉尾鲴肠道内未发现拟杆菌，需要食物补充维生素b 1 2 才能满足机体所 需，这说明厌氧拟杆菌与鱼类肠道维生素b 1 2 的分泌有关。 1 2 4 辅助消化 动物消化道酶有淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等，而非消化道酶有纤维素酶、1 3 葡 聚糖酶、木聚糖酶、果胶酶和植酸酶等，这些酶不是由动物消化道分泌的，而可能 是由消化道中的微生物分泌的，它们可以通过破坏植物细胞壁、消除抗营养因子、 降低肠道食糜黏度、提高养分消化率、增强机体代谢、提高动物的免疫力等方面来 促进动物的生长( 郑腾等，2 0 0 4 ) 。动物肠道细菌主要是通过自身分泌的胞外酶来 辅助宿主消化，其对碳水化合物、脂类、蛋白质、维生素和矿物质等代谢的影响过 程都有酶的参与。方面，细菌分泌的胞外酶可直接参与宿主对营养物质的消化； 另一方面，肠道细菌本身及其分泌物可以刺激宿主自身消化酶的分泌。 1 9 8 7 年r i m m e r 和w i e b e 报道了2 种草食性鱼( k y p h o s d a e 科k y p h o s u s 属) ， 发现它们具有独特的盲肠和复杂肠道定居茵群，肠道中有高浓度的挥发性脂肪酸， 从而在鱼类中首次证实了细菌的发酵消化作用。a s f i e 等( 2 0 0 0 ) 研究了从牙鲆仔稚 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 鱼消化道中分离出的弧菌生产蛋白酶的能力，结果表明，牙鲆孵化后第3 d 即可从其 肠道内分离出产蛋白酶的弧菌，孵化后1 0 9 d 时分离出的弧菌产酶能力最强，产酶弧 菌所占比例最高。 鱼类消化道中各种细菌，在鱼类分解和吸收食物中的作用已日益受到科学家的 关注。早在3 0 年代，b e n t o n ( 1 9 3 5 ) 首先报道了在蜊蛄鱼的消化道中分离到降解几 丁质的细菌。后来，s e k i 和t a g a ( 1 9 6 5 ) 等从南大洋鲸鱼的消化道中也分离得到这 种细菌。此夕 g o o d r i c h 和m o r i t a ( 1 9 7 7 ) 和k o n o 等( 1 9 8 7 ) 分别从大头鱼、比目鱼 和日本鳗鱼的消化道中分离到几丁质分解菌。 有关杂食性鱼类消化道细菌菌群的研究，也已有一些学者做过报道。s t i c k n e y ( 1 9 7 4 ) 研究了6 2 种鱼类，发现其中1 7 种鱼具有纤维素酶活性，并证实这种酶是鱼 肠道细菌产生的。t r u s t 等( 1 9 7 9 ) 从草鱼肠道中分离到一种能分解纤维素的细菌。 d a s ( 1 9 9 1 ) 研究草鱼消化酶时，发现投喂抗生素能有效降低肠道内羧甲基纤维素酶 ( c m c ) 的活性，推断是由于产c m c 酶的细菌受抗生素抑制、酶分泌量减少的缘故。 上述学者一致认为肠道细菌产生的纤维素分解酶及其他非消化道酶类对肠内物 质的分解作用都有利于鱼类对营养物质的消化和吸收。 s u g i t a 等( 1 9 9 6 ) 在沿海一种梭子蟹和7 种鱼肠道中分离到肠道细菌，发现其中 的一些菌株具有产酶能力，产酶能力随菌株种类、鱼种类不同而不同，说明了产酶 菌在海产鱼蟹肠道中广泛存在。s u g i t a 等( 1 9 9 7 ) 分析了香鱼、日本鳗鲡、鲤、罗 非鱼、斑点叉尾鲴等淡水鱼类肠道菌群的产酶能力，结果表明肠道菌群在淡水鱼的 淀粉消化中占有重要的地位。 周宗澄等( 1 9 9 7 ) 将从黄鳍鲷消化道和天然海水中分离到的细菌进行了生理生 化测定比较，结果表明，从消化道分离出的细菌对蛋白质、淀粉、脂肪等有机质的 分解率要明显高于天然海水中的细菌。由此推知，鱼类消化道中的细菌，能帮助分 解鱼类自体摄食的营养物质的消化和吸收营养成分，有利于鱼的生长和发育。 周宗澄等( 1 9 9 7 ) 分别对杂食性鲻鱼和肉食性黄鳍鲷消化道细菌进行了分离， 并测定了其生化特性，比较了两种不同鱼类消化道细菌对4 种有机质分解能力，结果 表明，肉食性黄鳍鲷比鲻鱼消化道细菌对有机质的分解能力更强。这说明不同食性 鱼类消化道细菌存在不同，而且对有机质的分解能力也不同，但若将肠道细菌进行 投喂测定其对消化酶的影响是否存在不同，目前还未见相关报道。 总之，鱼类消化道细菌对有机质的分解能力相当强，这种特性有利于鱼类本身 对营养物质的消化和吸收。而且使我们有理由认为分离消化道有益细菌制成酶制剂， 可做为鱼类饵料添加剂，有助于加速鱼类生长和发育。 1 3 本研究的目的意义 水产动物微生态制剂研究在短短几十年内从无到有，并逐渐成为一个学术活跃 的研究领域，微生态制剂无论作为饲料添加剂还是作为环境改良剂和生态调节剂其 4 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 正面效果已被广泛接受。但微生态制剂在水产动物体内的作用机理、益生菌在水产 动物体内与其他菌群的相互作用、益生菌在水产动物体内的定植和更替的机理仍然 存在争议。 水产动物肠道内的正常菌群作为开发微生态制剂的天然菌源，更有利于在肠道 内定植。不同食性的鱼类由于摄食习惯和消化特性的差异，肠道内可分泌胞外消化 酶细菌的种类和数量也存在显著差异。探讨不同食性鱼类肠道中产消化酶细菌的组 成和分布特点，对于进步研究鱼类肠道的微生态环境及其与消化机能的关系具有 重要意义。此外，将取自鱼类肠道内的分泌胞外消化酶的细菌，进行投喂，测定其 对宿主消化能力的影响，并对其性质及其功能进行研究，旨在探讨肠道细菌促进宿 主消化的作用机理，为进一步的科学研究，开发新的微生态制剂，提高水产动物的 饲料利用率提供基础。 5 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 第二章草鱼和银鲫肠道产消化酶细菌的研究 细菌是水生生物群落的重要组成之一，但其在鱼类肠道有何功能，甚至在鱼类 肠道内是否存在稳定的细菌群落，都曾经是有争论的问题。目前，比较统一的认识 是鱼类肠道都有其固有的细菌群落，这些微生物群为宿主创造生存的微环境，同时 宿主也为它们提供生长繁衍的条件，两者相互依赖、相互制约，形成了统一的整体。 鱼类肠道内存在的微生物在鱼类的生长过程中起着重要的作用，这些作用包括屏障、 免疫、营养以及辅助消化。鱼类肠道细菌分泌的各种酶类可以促进宿主对营养物质 的消化吸收，但目前对其作用机理的研究仍然很少。对鱼类肠道细菌辅助消化作用 及其机理的研究，将对提高鱼类对饲料的消化利用率，降低饵料系数，开发新的微 生态制剂提供重要的参数。 本文以草食性的草鱼( c t e n o p h a r y n g o d o ni d e u u s ) 和杂食性的银鲫( c a r a s s i u s a u r a t u sg i b e l i o ) 为研究对象，通过对其肠道内产消化酶菌群的测定，为研究鱼类肠 道细菌参与消化作用的机理提供资料。 2 1 材料与方法 2 1 1 实验动物 实验用草鱼和银鲫，平均体重草鱼约2 5 0g ，银鲫约1 0 0g ；取自汤逊湖渔场， 取样前置于水族箱中暂养3d 。 2 1 2 菌种分离 各取3 尾鱼按无菌操作分离前肠、中肠、后肠，匀浆，采用1 0 倍稀释法，取1 0 。4 、 1 0 、1 0 r 6 三个稀释度涂板分离细菌，分离用培养基为淡水琼脂培养基( f w a 培养基) 。 在细菌的分离平板上，选取清晰、分散良好的菌落，纯化后接种到f w a 斜面上，2 8 培养2 4 2 8h 后置4 保存备用。 2 1 3 菌株产酶能力的检测 将纯化后的细菌，分别在下述四种筛选平板上通过划线法形成单菌落。2 8 培 养4 8h 后观察并测量水解圈直径和菌落直径。细菌分泌胞外酶能力的大小，通过比 较水解圈直径菌落直径( h d ) 数值来判断，该值越大，菌株产酶能力越强，每个 菌株测定5 个菌落，重复3 次，以确定产酶的稳定性。 测定菌株产蛋白酶的培养基：酪蛋白1 0g ；n a 2 h p 0 4 2 g ；琼脂1 3g ；水1 0 0 0i i l l ； 0 4 溴麝香草酚蓝溶液1 2 5r i l l ；p h = 7 2 7 4 。 测定菌株产脂肪酶的培养基：蛋白胨1 0g ；n a c l5g ；c a c l 2o 1g ；t w e 冶n 8 01 0 m l ；琼脂1 3g ；水1 0 0 0 m l ；p h = 7 2 7 4 。 测定菌株产淀粉酶的培养基：蛋白胨5g ；酵母膏1 0g ；n a c l5g ；可溶性淀粉 l og ；琼脂1 3g ；水1 0 0 0i n l ；p h = 7 2 - 7 4 。 6 华中农业丈学2 0 0 8 届硕士学位论文 测定菌株产纤维素酶的培养基：( n m ) 2 s 0 42g ；m g s 0 4 0 5g ；k 2 h p 0 41 g ； n a c lo 5g ；羧甲基纤维素钠( c m c n a ) 2g ；刚果红0 4g ；琼脂1 3g ；水1 0 0 0m l ； 自然p h 值 2 1 4 细菌鉴定 菌种的鉴定参照常见细菌系统鉴定手册的方法。 2 1 5 数据统计与分析方法 原始数据经e x c e l2 0 0 3 初步整理后，利用计算机s a sv 8 软件，样本率比较用f 检验。 2 2 结果 2 2 1 草鱼肠道产酶细菌的组成特点 分离自草鱼肠道的9 0 株菌中，可分泌胞外消化酶的细菌共有3 3 株，占肠道菌 总数的3 6 6 7 。产酶菌的分布前肠6 株，c p 肠2 0 株，后肠7 株，分别占产酶菌总 数的1 8 1 8 、6 0 6 1 和2 1 2 l ，中肠产酶菌的数量与前肠和后肠存在显著差异( p o 0 5 ) 。在分离出的3 5 株气单胞菌中，可分 泌消化酶的菌株为2 3 株，占所有气单胞菌的6 2 8 6 ，而分离出的7 株弧茵均可分 泌胞外消化酶。详见表2 1 。 2 2 1 1 蛋白酶 从草鱼肠道中共检测到2 1 株菌可分泌蛋白酶，占2 3 3 3 ，分别是气单胞菌1 2 株、弧菌6 株、芽孢杆菌3 株，其中气单胞菌所占比例最高，占2 1 株菌中的5 7 1 4 ， 但气单胞菌在整个肠道中所占的比例也最高。另外，前、中、后肠相比，中肠具有 蛋白酶活性的菌共有1 3 株，占总产蛋白酶菌株的6 1 9 ，显著多于前肠( p 0 0 5 ) ，前肠和后肠分别是3 株( 1 4 2 9 ) 和5 株( 2 3 8 1 ) 。 2 2 1 2 脂肪酶 由表2 1 可以看出，草鱼肠道分泌胞外脂肪酶的菌株最少，仅有1 0 株，占1 1 1 l 。从脂肪酶分泌茵的分布来看，草鱼同样是中肠最多，后肠次之，前肠未发现可 分泌胞外脂肪酶的细菌，但中、后肠差异并不显著( p o 0 5 ) 。草鱼肠道内产脂肪 酶能力最强的是取自中肠的c r o _ 2 4 ，水解圈直径比可达到4 7 9 ，鉴定结果同样为气 单胞菌。 2 2 1 3 淀粉酶 草鱼肠道淀粉酶分泌菌数量最多，有3 0 株，占肠道菌总数的3 3 3 3 。另外， 前、中、后肠相比较，草鱼肠道中淀粉酶分泌菌同样是中肠最多，且与前、后肠差 7 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 异显著( p o 0 5 ) 。其中c h 4 ( a e r ) 的水解圈与菌落的直径比值最大，达到5 9 ， 表明该菌分泌纤维素酶的能力最强，另外还检测到弧菌和芽孢杆菌中的种类也可分 泌纤维素酶。 表2 1 草鱼肠道细菌产消化酶能力 t a b l e2 - 1d i g e s t i v ee n z y m e - p r o d u c i n ga b i l i t yo fs t r a i n si s o l a t e df r o mci d e l l u s i n t e s t i n e - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - - - - - _ i l l l l l i m _ _ - _ - - _ - - _ - - - - _ - _ _ _ _ _ - _ - - - - _ - - _ _ _ - _ _ _ - _ - _ _ _ _ - _ _ _ - _ _ _ - _ _ _ _ _ - - _ _ _ _ - - _ _ _ - _ - - - _ _ _ _ _ - _ - - - - _ _ _ _ _ _ - - - - - _ - _ _ - - - _ _ - l _ _ - _ - _ _ _ 一 细菌产消化酶水解圈与菌落直径比( h ，d ) 菌株 s t r a i n s 蛋白酶脂肪酶淀粉酶纤维素酶细菌类群 p r o t e a s e l i p a s ea m y l a s e c e l l u l a s e s p e c i e s c f 6 c f 9 c f l 2 c f l 3 c f 2 0 c f 2 1 c m 3 c m 4 c m 6 c m 7 c m 8 c m l 0 c m l 2 c m l 3 c m l 4 c m l 5 c m l 6 c m l 8 c m 2 0 c ：m 2 1 c m 2 2 c m 2 4 c m 2 5 c m 2 6 c m 2 8 c m 2 9 c h l c h 4 c h 9 c h l l c h l 5 c h l 9 3 1 6 0 1 8 4 0 1 0 0 1 4 5 4 0 0 8 2 7 3 0 0 8 2 7 4 0 0 5 2 3 4 0 0 4 3 9 2 0 0 6 3 1 4 o 0 9 3 3 4 0 0 4 2 5 4 0 0 4 3 5 0 o 2 1 5 1 3 0 0 9 4 0 3 x - - o 0 4 2 4 3 0 0 0 5 3 5 8 0 3 0 4 2 6 - 0 0 6 3 1 9 0 1 3 3 9 6 0 2 3 3 3 2 5 4 0 1 l1 4 3 6 5 0 1 4 2 6 l 0 7 7 3 0 7 o 0 7 3 5 8 o 1 3 3 0 4 0 0 4 8 4 7 9 0 3 7 3 7 l 0 0 8 2 4 4 0 0 6 4 1 2 0 0 8 2 3 l 0 0 7 2 5 5 o 1 l 3 3 6 0 1 4 2 7 0 o 1 5 3 4 0 0 1 l 2 7 6 0 0 7 4 2 2 0 1 5 4 6 3 o 0 9 4 0 9 - 4 - 0 12 2 4 8 0 0 4 9 2 5 7 0 0 7 8 4 4 8 0 1 1 2 8 2 0 0 7 3 6 5 0 1 1 3 7 5 o 0 7 3 0 9 0 1 2 4 1 0 0 0 8 3 7 4 0 0 6 3 7 7 0 0 4 2 6 5 0 1 2 2 8 5 0 0 5 3 5 3 0 0 9 2 2 8 0 o l 2 6 1 0 0 7 2 6 7 o 0 6 2 4 8 0 0 4 4 9 0 0 3 3 3 6 0 1 l 2 1 9 0 0 8 2 4 2 0 0 7 4 4 1 0 0 7 3 5 5 o 0 9 3 5 3 o 0 8 4 5 7 0 4 7 4 6 5 o 1 8 5 3 2 o 3 3 3 5 6 o 0 8 2 2 6 o 0 8 5 4 0 0 2 4 3 5 0 o 1 2 3 4 7 0 1 5 3 5 9 0 1 4 4 3 6 0 1 6 4 3 8 0 4 3 5 9 0 o 2 3 3 4 7 4 - 0 1 1 2 5 l 0 1 2 3 9 6 0 2 3 v i b r w a e r o m o n a s a e r o m o n a s a e r o m o n a s a e r o m o n a s a e r o m o n a s a e r o m o n a s a e r o m o n a s a e r o m o n a s b a c i l l u s a e r o m o n a s a e r o m o n a s a e r o m o n a s 6 r w a e r o m o n a s 6 r i o a e r o m o n a s a e r o m o n a s 6 r i o a e r o m o n a s 易r i o a e r o m o n a s a e r o m o n a s b a c i l l u s a e r o m o n a s 扫r w a e r o m o n a s a e r o m o n a s b a c i l l u s 厶r i o a e r o m o n a s a e r o m o n a s c h 2 9 一一41 l 0 0 4 一 a e r o m o n a s 1 ) c f 、c m 、c h 分别分离自草鱼前肠、中肠和后肠。一示无水解现象或水解现象很弱( h d 1 ) 1 ) t h es e r i e so fc f c ma n dc hw e f ei s o l a t e df r o mf o r e g u t m i d g u ta n dh i n d g u to fci d e l l u s ，r e s p e c t i v e l y 一n o h y d r o l y z a t i o no rl i t t l eh y d r o l y z a t i o n ( 盹，d 1 ) 8 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 2 2 2 银鲫肠道产酶细菌的组成特点 本研究结果显示，银鲫肠道内的产酶菌比例与草鱼相比差异不显著( p 0 0 5 ) ， 共有4 3 株可分泌胞外消化酶，占肠道菌总数的4 7 7 8 。包括前肠l o 株菌，中肠 1 5 株，后肠1 8 株，占产酶菌总数的比例分别是2 6 2 6 、3 4 8 8 、4 1 8 6 ，前中 后肠差异不显著( p o 0 5 ) 。银鲫肠道内消化酶分泌菌包含四个种类，分别是气单 胞菌2 8 株、弧菌1 2 株、芽孢杆菌2 株和假单胞菌1 株。具体产酶能力的测定结果 见表2 2 。 2 2 2 1 蛋白酶 银鲫肠道内同样检测出2 l 株菌可分泌胞外蛋白酶，除在草鱼肠道内检测出的三 个类群的菌外，还发现一株假单胞菌也具有蛋白酶活性，四种菌所占比例最高的仍 为气单胞菌，有1 6 株，占所有胞外蛋白酶分泌菌的7 6 1 9 。但在分布上，银鲫后 肠中分离出的蛋白酶产生菌要显著多于前肠和中肠( p 可溶性淀粉；较好的因素水平搭配可溶性淀粉1 、牛肉浸 膏+ 大豆蛋白胨3 o 、n a c io 5 。详见表3 2 。 表3 - 2l 9 ( 3 ) a 3 正交试验 t a b l e3 - 2l 9 ( 3 ) 3o r t h o g o n a le x p e r i m e n t 1 一? | | | 一一一一 j ：j | | | | 一j 莎| l | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | _毯i| _ | |们| |隧| | l | | !|y|鬣|r_2 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 3 3 小结 3 3 1 芽孢杆菌c h 9 的最适培养条件为温度3 9 。c ，p h 7 4 ，最适培养转速是1 5 0 r m i n 左右。 3 3 2 芽抱杆菌c h 9 的最适碳源是可溶性淀粉，最适蛋白胨为大豆蛋白胨，最适 氮源是大豆蛋白胨和牛肉浸膏组合，最适种子培养基为可溶性淀粉1 ，牛肉浸膏+ 大豆蛋白胨3 o ，n a c l0 5 。利用最适发酵条件和该种子培养基培养2 4 h 后，菌 量可以达到1 0 9 1 0 9 c f u m l 。 华中农业人学2 0 0 8 届硕士学位论文 第四章芽孢杆菌c h 9 对草鱼肠道菌群的影响 一般认为，芽孢杆菌为水产动物的非致病菌，近年来被作为益生菌广泛应用于 水产养殖业，它分泌的各种消化酶类可提高养殖品种的消化机能，促进其对营养物 质的吸收。另有报道芽孢杆菌可分泌抑菌物质，抑制有害菌的生长，提高机体免疫 力( k o n oe ta 1 ，1 9 8 7 ) 。但大多数芽孢杆菌都来源于土地、水体等，鱼源芽孢杆菌 研究相对较少，而作为益生菌饲料添加剂开发的菌种，取自鱼体投于鱼体，是否更 利于芽孢杆菌在鱼类消化道内定植，还有待更进一步的研究。 本实验以分离自草鱼肠道的芽孢杆菌c h 9 为实验菌种，将其添加于饲料中投喂 草鱼，以检测该细菌对草鱼肠道菌群的影响。 4 1 材料与方法 4 。1 1 实验动物及分组饲养 实验用草鱼由湖北武汉东湖渔牧二场提供，体重约5 0 9 ，于水泥池中暂养2 周 后，挑选规格一致、体质健康的随机分养于l m 3 圆形水族箱中。实验设一个对照组 f o ( 不添加芽孢杆菌) ，三个实验组f l 、f 3 、f 5 ，分别添加芽孢杆菌1x1 0 9 c f u k g 、3 1 0 9 c f u k g 、5 1 0 9 c f u k g 饲料。每组两个平行，每个缸投放2 5 尾鱼。正式实验前 置于缸中暂养3 d 。在整个实验期间，保持微流水，每日喂食两次( 8 ：3 0 9 ：0 0 ， 1 6 ：0 0 1 6 ：3 0 ) ，日投饵率为3 左右，试验期间水温2 2 2 8 ，p h6 8 7 5 。 4 1 1 1 供试菌种 实验用芽孢杆菌c h 9 取自草鱼肠道，由本实验室分离保存，经发酵收集后用于 本实验。 4 1 1 2 饲料制备 将购买的商品饲料( 武汉高龙混养1 # 膨化料) ，按需要量加入芽孢杆菌c h 9 ，f l 、 f 3 、f 5 组添加量分别为1 o 1 0 9 c f u k g 、3 0 x1 0 9 c f u k g 和5 o 1 0 9 c f u k g ，f o 组则 加入相等量的生理盐水。将其充分拌匀，于4 5 下烘干，保存备用。 4 1 2 实验方法 4 1 2 1 试样收集 于投喂芽孢杆菌c h 9 前和投喂后的第1 4 d 、2 8 d 、4 2 d 、5 6 d 的上午进行试样收 集。取样时，先用7 5 酒精棉球消毒鱼体表，打开腹腔，再用酒精棉球拭擦肠管外 壁，并用无菌水冲洗数遍后，用无菌棉线分别结扎肛门和前、中、后肠的交界处， 分离出前、中、后肠，剪碎匀浆，准确称取o 5 9 肠段的匀浆物，加4 5m l 无菌水， 制成原液。每次采样3 尾鱼。 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 4 1 2 2 细菌计数 将各段肠原液作1 0 倍系列稀释，取其中3 个稀释度，每个梯度在3 个淡水琼脂 培养基( 刑队) ( 吉水等，1 9 7 6 ) 平板上涂布，2 8 培养2 4 h - 4 8 h 后计数，然后换算 成每g 肠所含细菌数量。 4 1 2 3 好氧及兼性厌氧菌鉴定 在各肠道细菌的分离平板中，选取菌落清晰、分散且菌落数在3 0 3 0 0 之间的平 板，随机地挑取3 0 一5 0 个菌落，接种在f w a 斜面培养基上，2 8 培养2 4 - 4 8 h 后置4 冰箱中备用。菌种的鉴定参照一般世界细菌常用鉴定方法( 中国科学院微生物 研究所细菌分类组编，1 9 7 8 ) 、伯杰氏鉴定细菌学手册( b e r g e y sm a n n u a lo f d e t e r m i n a t i v eb a c t e r i o l o g y ) ( 第9 版) ( h o l te ta 1 ，1 9 9 4 ) 以及滨口等( 1 9 9 2 ) 的方法 进行，其步骤见图4 1 。 4 1 2 4 厌氧菌的培养与计数 b h i 、b d s 、l b s 和b s 分别用于专性厌氧菌总数、双歧杆菌、乳酸杆菌和拟 杆菌的培养和计数，培养基购于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。厌氧菌 取样与培养均在b a c t r o n l 5 厌氧操作系统中完成。试样收集与细菌计数方法与好氧 及兼性厌氧菌相同。 4 2 结果 4 2 1 芽孢杆菌c h 9 对草鱼肠道好氧及兼性厌氧菌数量的影响 投喂芽孢杆菌c h 9 后草鱼肠道好氧及兼性厌氧菌数量的变化见表4 1 。 如表4 1 所示，投喂芽孢杆菌c h 9 前草鱼肠道内的细菌数量为5 1x1 0 6 c f u g ， 后肠的细菌数量显著高于前肠，中肠次之，前、中、后肠的细菌数量分别是2 1 8 1 0 6 c f u g 、3 2 4 x1 0 6 c f u g 、9 8 9 1 0 6 c f u g 。投喂芽孢杆菌c h 9 后，f 1 、f 3 、f 5 组 草鱼肠道内的细菌均呈现出不同程度的上升趋势，在第2 8 d 达到最高，分别是7 。2 3 1 0 6 c f u g 、7 3 1 0 6 c f u g 、7 2 2 1 0 6 c f u g ，并且三组间差异不显著，2 8 d 后细菌数 量变化趋于平缓。 投喂芽孢杆菌c h 9 后，f l 组草鱼前肠细菌的数量随着投喂的天数逐渐上升，在 第2 8 d 达到最高，为4 2 3 1 0 6 c f u g ；f 3 组草鱼前肠细菌的数量则在第1 4 d 达到最高， 数量为4 5 2 x1 0 6 c f u g ，随后略有下降，到第5 6 d 达到4 2 1 1 0 6 c f u g ；f s 组前肠细 菌数量在第4 2 d 最高，为4 9 7 1 0 6 c f u g 。 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 待测菌株 t e s t e ds t r a i n s i 革兰氏染色 g 姗i 燃“0 n # 吾上 球菌动性 一胞色素氧化酶。氧左发酵试验厂1细胞色素氧化酶氧化发酵试验ii c v t o c h r o m eo x i d a s eo ft e s t+一 j 。 _ 习f细胞笔素氧化酶化发毒试验 o f t e s t0 f t e s t 假量胞菌属 p s e u d o m o n o s 产d 菌属 a l c a l i g e n e s 不动一菌属 a c i n e t o b a c t e r f 生长钠试验 广竺譬毗 fl 弧菌属 恸r o 图4 - 1 分离菌株鉴定程序 黄杆菌属i f l a v o b a c t e r i u m 气单胞菌属 a e r o m o n a s f i g 4 1s c h e m ef o ri d e n t i f i c a t i o no fi s o l a t e ds t r a i n s 华中农业大学2 0 0 8 届硕上学位论文 表4 1 投喂芽孢杆菌c h 9 前后草鱼肠道好氧及兼性厌氧菌数量的变化 t a b l e 4 - 1v a r i a t i o no fa e r o b i ca n df a c u l t a t i v ea n a e r o b i cb a c t e r i a lq u a n t i t yi nt h e d i g e s t i o nt r a c to fc i d e l l u sb e f o r ea n da f t e rt r e a t e dw i t hb a c i l l u sc h 9 组别 g r o u p s 部位 业坐型型垡筌逖望鍪墨型业出丛咝po s i t i o n f o 前肠f o r e - g u t 中肠m i d - g u t 话肠h i n d - g u t 全肠w h o l e g u t f 1 组 前肠f o r e - g u t 中肠m i d - g u t 后肠h i n d - g u t 全肠w h o l e - g u t f 3 组 前肠f o r e - g u t 中肠m i d - g u t 后肠h i n d g u t 全肠w h o l e - g u t f 5 组 前肠f o r e - g u t 中肠m i d - g u t 后肠h i n d - g u t 全肠w h o l e g u t 1 0 8 7 7 1 3 1 0 5 6 6 8 4 草鱼中肠细菌的数量，投喂芽孢杆菌c h 9 后，f l 组在第4 2 d 达到峰值5 3 2 1 0 6 c f u g ：f 3 组和f 5 组则在第2 8 d 就达到最高，分别是6 3 4 1 0 6 c f u g 、5 7 9 1 0 6 c f u g ， 到第5 6 d 数量略有下降，但仍显著高于对照组f 1 。 从表4 1 中还可看出，投喂芽孢杆菌c h 9 前后，草鱼后肠细菌数量的变化，投 喂芽孢杆菌c h 9 后后肠细菌的数量仍显著高于前肠和中肠，并且f l 、f 3 、f 5 组同样 呈现先上升后平缓的变化趋势，f 1 组和f 5 组在第2 8 d 达到最高，分别是1 2 3 4 x 1 0 f u g 、1 1 0 2 x1 0 6 c f u g ：f 3 组的最高值出现在第4 2 d ，数量是1 1 5 2 1 0 6 c f u g ， 但是在第1 4 d 时已经表现出非常明显的上升趋势。 总体来看，投喂芽孢杆菌c h 9 后，草鱼肠道内细菌数量均出现明显的上升趋势， 一般在第2 8 d 达到最大值，2 8 d 后细菌数量略有下降，但基本趋于平缓。数量上升 的程度前、中、后肠略有不同，但组间差异不明显。 4 2 2 芽孢杆菌c h 9 对草鱼肠道好氧及兼性厌氧茵组成的影响 芽孢杆菌c h 9 对草鱼肠道好氧及兼性厌氧菌组成的影响见表4 2 和表4 3 。 由表4 3 可知，f o 组未投喂芽孢杆菌c h 9 的草鱼前肠共检测到1 0 个种属的细菌， 主要菌群为气单胞菌( 占3 8 2 6 ) 、肠杆菌( 占3 2 0 3 ) 、弧菌( 占6 4 5 ) 、棒杆 菌( c o r y n e b a c t e r i u m , c o r ) ( 占7 7 1 ) ；中肠内包含7 个种属的细菌类群，主要 傍 好舯舛m岱忽拓殂叮m 2 跎d 王 屯m & t i 坦t t & n 7 t i 协 凹懿舛侉匏m砣蝤m彪卯钳 置 t m t i 屹t t e n t 曼 拍 舛捌筋”n筋凹弘刀3嘶 m 毖 王 王t屯i屹z禾7 t 蔓 1 跖”朋配螺g邡钇鲍趵蕊巧卵弱 鹏 昭 z 屯屹& 王i m & t i n z 禾置 m & 掩m眇m墙m豹m埽m眇加掩m 鹳 m 2 3 9 5 2 3 9 5 2 3 9 5 2 3 9 5 华中农业大学2 0 0 8 届硕上学位论文 菌群为气单胞菌( 占4 6 8 4o a ) 、肠杆菌( 占3 0 3 7 ) 、弧菌( 占6 6 5 ) ；后肠内也 包含7 个种属的细菌，主要菌群仍为气单胞菌、肠杆菌和弧菌，所占比例分别是4 1 8 9 、3 2 6 7 、8 5 1 。此外，在不同的肠段中还检测到了所占比例不同的芽孢杆菌、 葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u s ，s t a ) 、产碱菌( a l c a l i g e n e s , a l c ) 、黄杆菌( f l a v o b a c t e r i u m , f l a ) 、假单胞菌。 饲料中添加了芽孢杆菌c h 9 的实验组f l 、f 3 、f 5 肠道内的细菌组成会随着添加 量的不同而有所不同。f ，组气单胞菌和肠杆菌在前、中、后肠内仍处于绝对优势， 在整个肠道内所占的比例分别是3 3 6 1 和2 2 3 0 ，其次处于优势地位的是芽孢杆 菌，在整个肠道中的比例是1 7 0 2 ，与f o 组( 4 1 1 ) 相比，差异显著；f 3 组的情 况与f 。组相同，同样是气单胞菌和肠杆菌在肠道中占有绝对优势，其次是芽孢杆菌； 在f 5 组中，前肠芽孢杆菌所占比例高于肠杆菌，而次子气单胞菌，气单胞菌、肠杆 菌和芽孢杆菌所占的比例分别是2 4 1 4 、2 0 6 9 、2 7 5 8 ，后肠芽孢杆菌所占的比 例仍在上升，并高于气单胞菌和肠杆菌，占3 1 2 5 。 各实验组，除优势菌群气单胞菌、肠杆菌、弧菌和芽孢杆菌外，还检测到所占 比例不同的葡萄球菌、产碱菌、黄杆菌、假单胞菌，组间差异不明显。 表4 2 投喂芽孢杆菌c h 9 后草鱼肠内细菌组成排序情况 t a b l e 4 - 2s e q u e n c eo ft h ec o m p o s i t i o no ft h ei n t e s t i n a lm i c r o f l o r ao fc d e u sf e dw i t h b a c i l l u sc h 9 组别 部位 不同菌群组成百分数的排序( 从高到低) g r o u p d o s i t i o n o r d e ro fc o m p o s i t i o np e r c e n t a g eo fd i f f e r e n ts t r a i n s f 0 组前肠f