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(分析化学专业论文)有机染料铜配合物在半胱氨酸荧光分析中的应用.pdf.pdf 免费下载
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文档简介
摘要 摘要 巯基化合物是生物体内的重要生物活性物质,可作为细胞内的抗氧化剂,参 与蛋白质和d n a 的合成以及物质的运输和新陈代谢等。半胱氨酸是生物体内 非常重要的巯基类物质,具有抑菌作用和解毒等独特的功能。生物体内半胱氨酸 含量的变化或代谢失调均会导致一些疾病的发生。通过测定生物体内半胱氨酸含 量,可作为某些代谢疾病诊断的依据,因此实现半胱氨酸快速、灵敏的检测具有 十分重要的意义。半胱氨酸具有较强的还原性,而c u ( i i ) 离子具有氧化性,利用 氧化还原反应可实现对半胱氨酸高选择性识别。据此本论文选择易与铜离子配位 的含有邻二羟基或相似结构的芳香有机荧光染料如钛铁试剂、营素红和桑色素等 作为研究主体;研究了此类试剂的铜离子配合物与氨基酸分子阿的作用,探讨了 芳香环结构对半胱氨酸测定灵敏度的影响;建立了系列灵敏度高、选择性好的半 胱氨酸的荧光光度分析方法。本论文分为五个章节进行阐述。 第一章简单介绍了半胱氨酸、谷胱甘肽等巯基化合物分析的发展现状。对目 前应用于半胱氨酸分析的主要方法作了较详细评述,其中包括高效液相色谱法、 电化学方法、流动注射化学发光法、毛细管电泳法、紫外可见分光光度法、荧光 光度法等。 第二章采用荧光光谱法和紫外可见吸收光谱法研究了具有邻苯二酚结构的 钛铁试剂铜配合物与半胱氨酸间的作用。钛铁试剂与铜( i i ) 在8 0 c 时方能形成 稳定配合物,在p h8 0 的b r 缓冲溶液中该配合物的激发波长和发射波长分别 为2 9 0n r l l 和3 5 0n l n 。加入半胱氨酸后钛铁试剂铜配合物在3 5 0n r i 处的荧 光显著增强,并且在一定浓度范围内体系荧光强度的增大与半胱氨酸浓度呈良好 的线性相关性。据此建立了一种测定半胱氨酸的新方法,检测限为7 4 6 x 1 0 m o l l i ,线性范围为7 4 6 x 1 0 。7 也2 0 x 1 0 m o l l 1 。该方法用于测定混合氨基酸样 品中的半胱氨酸,回收率为9 4 0 1 0 0 7 。 第三章研究了茜素红与铜离子间的相互作用,并建立了测定铜离子的荧光方 法。为了进一步优化及简化测定半胱氨酸的条件,提高方法在生物体系中的应用 前景,我们选择了具有葸环结构的茜素红作为铜离子的配位体,由于其结构特点 i l 摘要 配合物的激发波长及发射波长均会较钛铁试剂向长波方向移动。实验结果显示: 在p h6 5 5 的b r 缓冲溶液中,茜素红与缓冲液中的h 3 8 0 3 形成强荧光体,其 激发波长徼发射波长分别为4 3 5n n l 和5 8 7n l t i 。c u ( i i ) 的加入使a r s h 3 8 0 3 配 合物在5 8 7n l n 处的荧光猝灭,并且溶液颜色由黄色变为红色。研究结果表明: c l l ( i i ) 对a r s 的强结合能力使a r s h 3 8 0 3 配合物分解,同时形成a r s c u ( i i ) 配合物,致使体系的荧光光谱猝灭。c u ( n ) 浓度在1 0 x 1 0 - 6 2 4 x 1 0 5 m o l l - 1 范围 内,体系荧光强度变化与c u 0 i ) 浓度呈现良好的线性关系,方法检测下限为 1 0 1 x 1 0 - 7m o l l - 1 。该方法用于废水中c u ( i i ) 含量的测定,回收率为9 5 5 , - , 1 0 1 0 。 第四章研究了茜素红铜配合物与半胱氨酸与之间的相互作用。理想的生物 体系荧光探针需要发光主体的荧光量子产率高、激发波长和发射波长位于长波长 处( 可见光区) ,这样既能提供高的灵敏度又可有效避免生物体被灼伤及荧光漂 白。茜素红h 3 8 0 3 体系的激发波长和发射波长分别为4 3 5n m 和5 8 7n n l ,满足 理想荧光探针要求。在p h6 5 1 的b r 缓冲溶液中,a r s c u ( i i ) 的发光很弱, i 广半胱氨酸的巯基将c u ( i i ) 还原为c u ( i ) 并形成配合物,从而破坏a r s 与 c u ( n ) 的络合,使配合物中的茜素红游离出来并与缓冲体系中的h s b 0 3 结合,形 成强荧光体。实验发现在1 0 8 x 1 0 。6 4 0 x 1 0 5 m o l l 1 浓度范围内,荧光强度的增 加与半胱氨酸的浓度成良好的线性关系,该方法检测限为1 0 8 x 1 0 m o l l 1 。本 方法用于测定新鲜猪血水解液中的半胱氨酸,回收率为9 3 2 - - - 1 0 0 2 。 第五章采用荧光光谱法和紫外可见吸收光谱法研究了l 半胱氨酸与桑色素 铜配合物的作用过程。桑色素具有超离域度,整个分子形成一个大n 键共轭体系, 有较强的荧光发射。尽管桑色素不含有邻二羟基,但分子中吡喃环的氧原子和苯 环上的羟基对铜离子有强配位能力,在常温下能形成稳定的铜配合物。在p h7 4 的b r 缓冲溶液中,桑色素铜配合物在5 3 9r i m 处发射弱荧光。半胱氨酸的加 入导致体系在5 3 9n l t l 处的荧光显著增强,并且在一定浓度范围内体系荧光强度 的增大与半胱氨酸浓度呈良好的线性关系,同时吸收光谱也发生明显的变化。据 此建立了半胱氨酸的荧光测定方法,线性范围为6 5 2 x 1 0 7 2 2 0 x 1 0 - 5m o l l - 1 ,检 测限为6 5 2 x 1 0 一m o l l 。该方法用于测定猪血蛋白水解液中的半胱氨酸,回收率 为9 1 3 9 4 9 。 关键词:有机染料;铜离子;l 广半胱氨酸;荧光增强 1 1 1 a b s t r a c t a b s t r a c t t h i o lc o m p o u n d sa l ei m p o r t a n tb i o l o g i c a l l ya c t i v em a t e r i a l si n o r g a n i s m t h e y s e r v ea sa n t i o x i d a n ti nc e l la n d p a r t i c i p a t ei nav a r i e t yo f i m p o r t a n tc e l l u l a rf u n c t i o n s s u c ha ss y n t h e s i so f p r o t e i na n dd n a , m a t e r i a ld e l i v e r ya n dm e t a b o l i s mp r o c e s s a sa v e r yi m p o r t a n tt h i o l c o n t a i n i n gc o m p o u n d ,l - c y s t e i n ep l a y sk e yr o l e si nc e l l u l a r f u n c t i o n s ,f o ri n s t a n c ea n t i b a c t e r i a la n dd e t o x i f i c a t i o n , e t c s o m ed i s e a s e sa r ei n d u c e d b yc y s t e i n ed e c o m p c n s a t i o nr e s u l t i n gi nt h ec h a n g eo fc y s t e i n ec o n c e n t r a t i o ni n o r g a n i s m t h u s ,s o m ed i s e a s e sc a nb ed i a g n o s e dv i ac y s t e i n ed e t e r m i n a t i o ni n b i o l o g i c a ls y s t e m s d e v e l o p m e n to fs i m p l e , q u i c ka n de x a c tm e t h o df o rq u a l i t a t i v e a n dq u a n t i t a t i v ea n a l y s i sf o rc y s t e i n ei so f i m p o r m c e c y s t e i n ea c t sa sr e d u c i n ga g e n ta n dc o p p e r ( i ds e r v e sa so x i d a n t r e d o xr e a c t i o n b e t w e e nt h e mi se a s i l yo c c u r r e dw h i c hc o u l db eu s e df o rr e c o g n i z i n gc y s t e i n e i ti s w e l lk n o w no r t h o - d i h y d r o x ya r o m a t i ch y d r o c a r b o no rs i m i l a rs t r u c t u r ec o m p o u n d s c a nb i n d 丽t hc o p p e r ( i da n df o r ms t a b l em e t a lc o m p l e x t h u s s o m eo r g a n i c f l u o r e s c e n tc o m p o u n d sc o n t a i n i n gt h es t r u c t u r ea st i r o n , a l i z a r i nr e dsa n dm o r i n a n dt h e i rc o p p e rc o m p l e xw g r es e l e c t e da sh o s tf o r s e n s i n ga l l l i n oa c i d t h e i n t e r a c t i o nb e t w e e no r g a n i cm e t a lc o m p l e xa n da m i n oa c i dw a si n v e s t i g a t e d t h e e f f e c to fa r o m a t i ch y d r o c a r b o ns t r u c t u r eo nd e t e r m i n i n gs e n s i t i v i t yf o rc y s t e i n ew a s d i s c u s s e d s e v e r a lh i g h l ys e l e c t i v ea n ds e n s i t i v ef l u o r e s c e n c ea s s a y sf o rl - c y s t e i n e w e r ed e v e l o p e d t h i st h e s i sc o n s i s t so f f i v e c h a p t e r s i nc h a p t e r1 ,t h ed e v e l o p m e n to fs t u d yo ne y s t e i n ea n dg i u t a t h i o n ew a sr e v i e w e d e s p e c i a l l y , v a r i o u sd e t e r m i n a t i o nm e t h o d so fc y s t e i n ew e r ed i s c u s s e di nd e t a i lt h a t i n c l u d e dh i 【g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , f l o wi n j e c t i o n ,v o l t a m m e t r y , c h e m i l u m i n e s c e n c em e t h o d ,c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ,s p e c t r o p h o t o m e t r ya n d s p e c t r o f l o u r i m e t r y i nc h a p t e r2 ,t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt i r o n c u ( i i ) a n dc y s t e i n e w a si n v e s t i g a t e dv i a f l u o r e s c e n c ea n da b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p y t h ec o m p l e xt i r o n c u ( 1 1 1f o r m e da t8 0 。c a n di te m i t t e dw e a kf l u o r e s c e n c ei np h8 0b f i t t o n r o b i n s o nb u f f e rw h i c he x c i t a t i o n i v a b s t r a c t w a v e l e n g t ha n de m i s s i o nw a v e l e n g t hw a s2 9 0n n la n d3 5 0i l n l ,r e s p e c t i v e l y t h e a d d i t i o no fl - e y s t c i n ei n t ot i r o n c u ( i i ) s y s t e mr e s u l t e di nf l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n t a t3 5 0n l nw h i c hw a sp r o m o t i o n a lt ot h el c y s t e i n ec o n c e n t r a t i o n an o v e l s p e c t r o f l u o r i m e t r i cm e t h o d 斯t h ed e t e r m i n a t i o no fc y s t e i n ew a sd e v e l o p e dw i t h g o o dl i n e a rc a l i b r a t i o no f c y s t e i n e c o n c e n t r a t i o nr a n g i n gf r o m7 4 6 1 0 7t o2 2 0 1 0 - s t 0 0 1 l la n dt h ed e t e c t i o nl i m i t 勰7 4 6 1 0 s m o l l - 1 t h ep r o p o s e dm e t h o dw a s a p p l i e dt od e t e r m i n ec y s t e i n ei ns y n t h e t i ca m i n oa c i ds a m p l e sw i t ht h er e c o v e r y 9 4 o l o o 7 i nc h a p t e r3 ,t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e na l i z a r i nr e ds ( a r s ) h 3 8 0 3a n dc u ( i i ) w a s i n v e s t i g a t e dv i af l u o r e s c e n c ea n da b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p y i n o r d e rt oo p t i m i z e d e t e r m i n i n gc o n d i t i o na n dm a k et h ed e t e r m i n a t i o ne a s yo p e r a t e , a l i z a r i nr e dsw 勰 s e l e c t e da sal i g a n df o rc o p p e r o b v i o u s l y , a l i z a r i nr e dsc o n t a i n sa n t h r a c e n eg r o u p w h i c hp r o m i s el o n g e re x c i t a t i o na n de m i s s i o nw a v e l e n g t ht h a nt h a to ft i r o n i np h 6 5 5b rb u f f e r , a r s h 3 8 0 3e m i t t e ds t r o n gf l u o r e s c e n c ew h i c he x c i t a t i o na n d e m i s s i o nw a v e l e n g t hw a s4 3 5n n la n d5 8 7 姗r e s p e c t i v e l y t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y a t5 8 7 n mw a sq u e n c h e db yt h ea d d i t i o no fc u ( i i ) i n t oa r s - h 3 8 0 3s y s t e ma n dt h e c o l o rc h a n g e df r o my e l l o wt or e d i tw a sa s s u m e dt h a tt h ea d d i t i o no fc u ( 1 1 ) l e da r s 。 h 3 8 0 3t od e e o m p o u n da n da r s - c u ( i dc o m p l e xf o r m e d ag o o dl i n e a rr e s p o n s eo f f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ya saf u n c t i o no f c u ( i i ) c o n c e n t r a t i o nw a so b t a i n e dr a n g i n gf r o m 1 0 1 0 币m 0 1 l 1t o2 4 1 0 m o l l 1 ( r = 0 9 9 6 ) w i t ht h ed e t e c t i o nl i m i t 1 0 1 x 1 0 7 m o l 1 t h e p r o p o s e dm e t h o d w a s a p p l i e d t od e t e r m i n ec u ( i i ) i n d i s c h a r g e d w a t e r a n d t h er e c o v e r y w a s9 5 5 1 0 1 o i nc h a p t e r4 ,t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e na l i z a r i nr e ds ( a r s ) c u ( i i ) a n dc y s t e i n ew a s i n v e s t i g a t e dv i af l u o r e s c e n c ea n da b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p y a ni d e a lf l u o r e s c e n tp r o b e p o s s e sh i g hq u a n t u my i e l d ,l o n g e re x c i t a t i o nw a v e l e n g t ha n dl o n g e r e m i s s i o n w a v e l e n g t hw h i c hp r o m i s et op r o v i d es e n s i t i v em e t h o da n da v o i db u mo ft i s s u ea n d f l u o r e s c e n tb l e a c h i n g a c c o r d i n g l ya r s h 3 8 0 3s y s t e mw a sag o o df l u o r e s c e n ta s s a y f o rc y s t e i n e i np h6 5 1b f i t t o n - r o b i n s o nb u f f e r , a d d i t i o no fl c y s t e i n ei n t o a r s c u ( i i ) s y s t e mr e s u l t e di naf l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n tb e c a u s ec y s t e i n er e d u c e d c u ( i i ) t oc u ( i ) w h i c hl e da r s c u ( i i ) d e c o m p o u n da n da r s w a sr e l e a s e d ag o o d v a b s t r a c t l i n e a rr e s p o n s eo ff l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ya saf u n c t i o no fc y s t e i n ec o n c e n t r a t i o nw a s o b t a i n e dr a n g i n gf r o m1 0 8 x 1 0 6t o4 0 x 1 0 。5m o l l 1 ( r = 0 9 9 9 4 ) w i t ht h el i m i to f d e t e c t i o n 嚣1 0 8 x 1 0 t o o l l t h ep r o p o s e dm e t h o dw a sa p p l i e dt od e t e r m i n e c y s t e i n ei np r o t e i nh y d r o l y s a t eo f f l e s hp o r c i n eb l o o dw i t l lr e c o v e r yo f 9 3 2 1 0 0 2 i nc h a p t e r5 ,t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nm o r i n - c u ( i i ) c o m p l e xa n dc y s t e i n ew a s i n v e s t i g a t e dv i af l u o r e s c e n c ea n da b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p y m o r i np o s s e s s e sl a r g e 正 c o n j u g a t e ds y s t e ma n de m i t ss t r o n gf l u o r e s c e n c e a l t h o u g ht h ec o m p o u n dd o e s n t c o n t a i no r t h o d i h y d r o x yg r o u p ,o x y g e no f p y r a na n dh y d r o x y lo f p h e n y lc o o p e r a t et o b i n dw i mc o p p e ra n df o r ms t a b l em e t a lc o m p l e x i np h7 4b r i t t o n - r o b i n s o nb u f f e r , a d d i t i o no fc y s t e i n ei n t om o r i n - c u ( i i ) s y s t e mr e s u l t e di ni m m e d i a t ef l u o r e s c e n c e e n h a n c e m e n ta t5 3 9n l nw h i c hw l h ;p r o m o t i o n a lt ot h ec y s t e i n em o u n t an o v e l s p e c t r o f l u o r i m c t r i em c :i h o d f o rt h ed e t e r m i n a t i o no fc y s t e i n e ( c y s ) h a sb 嘲 d e v e l o p e dw i t hg o o dl i n e a rc a l i b r a t i o no fc y s t e i n ec o n c e n t r a t i o nr a n g i n gf r o m 6 5 2 x l o - 7t o2 2 0 x 1 0 一t 0 0 1 l - 1a n dt h ed c t o c t i o nl i m i ta s6 5 2 x 1 0 4 m 0 1 l - 1 t h e p r o p o s e dm e t h o dw a sa p p l i e dt od e t e r m i n ec y s t e i n ei np r o t e i nh y d r o l y s a t eo ff l e s h p o r c i n eb l o o da n dt h er e c o v e r yw a s9 1 3 9 4 9 k e yw o r d :o r g a n i cd y e ;c o p p e r ( 1 i ) ;l - c y s t e i n e ;f l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n t 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地 方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含 为获得吏鱼盘堂或其他教育桃梅的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名( 手写) :再工l :l 签字日期:圳7 年,声月,孑日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解吏墨塞堂有关保留、使用学位论史 的规定,有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁 盘,允许论文被查阅和借阅。本人授权直昌盔堂可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采甩影印、缩邻或扫描 等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究 所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库,并通过网络向 社会公众提供信息服务。 0 9 9 9 ) ,此法快速简 便,有较好的专属性和准确度。o g w u 和c o h e i l t o t 用酰基转移酶将乙酰半胱氨水 解成半胱氨酸再用茚三酮显色,残留的乙酰半胱氨很少,几乎不干扰测定,从而 利用吸光度之差求出乙酰半胱氨和半胱氨酸的含量。z a i a i o s 等用苯醌与半胱氨 酸反应,生成物在3 5 2 锄和5 0 0 姗处有吸收峰,而苯醌与羧乙基半胱氨反应 的生成物只在5 0 0n m 处有吸收。半胱胺酸在0 4 0m g m l l ,羧乙基半胱氨在 0 1 5 0 m g m l 1 范围符合朗伯比耳定律,该方法用于药物中半胱氨酸的测定回收 率为1 0 0 ,其它氨基酸和盐不干扰。利用金属离子和有机染料形成显色络合物 测定半胱氨酸也有报道。f 矿+ 与半胱氨酸反应生成f e 2 + 与邻二氮菲形成红色配 合物,在5 1 0m i l l 处有特征吸收。冯世龙【l l 发现半胱氨酸浓度在1 0 x 1 0 一一 1 8 x 1 0 4 m o l l - 1 范围内其产物吸光度值符合朗伯比耳定律。检测限为1 o 1 0 4 t o o l l 1 ,表观摩尔吸光系数7 9 1 0 3 l m o l 4 锄一。采用本法可测定谷氨酸、赖氨 酸、半胱氨酸混合试样中半胱氨酸含量。蓝金贵和罗登柏o 】利用半胱氨酸的还 原性将磷钼杂多酸还原成磷钼杂多蓝,在7 1 0 姗最大吸收波长处测其吸光度, 吸光度与半胱氨酸的浓度在o 4 - 1 6 0 m g l 1 范围内呈线性关系,方法检测限为 0 2m g l 1 。此方法在长波长处检测,可避开一些干扰,但检测限高。s t r o n g i n 等 【卜2 】报道了含醛基的氧杂蒽与半肮氨酸成环发生颜色变化,但测定必须在碱性 条件下进行。m e n gz h a n g - 等 3 j 合h i t n ,n 二甲氨基苯基偶氮苯甲醛和n ,n 二 甲氨基苯基偶氮硝基苯甲醛,二者都与半胱氨酸和同型半胱氨酸形成环状化合 物,导致二者的吸收光谱明显蓝移。由于硝基的拉电子效应受硫原子影响而减弱, n ,n 二甲氨基苯基偶氮硝基苯甲醛的颜色由粉红色变成黄色,从而可以在生理条 件下对半胱氨酸和同型半胱氨酸进行裸眼检测。y o n gg u o 和s h i j u ns h a o 4 】等用 d i p y r r o m e t h a n e 和黄绿色t c n q 发生弘兀电荷转移作用生成蓝色配合物。加入 半胱氨酸后,巯基与t c n q 发生n 讯电荷转移形成无色配合物,从而实现对半 胱氨酸的比色传感,并可裸眼进行检测。 1 5 2 荧光法分光光度法 荧光法是巯基化合物测定的又一类主要方法。1 9 5 9 年,s h o r e 等人报道了利 用组胺和邻苯二甲醛( o p a ) 反应来测定生物组织中次微量级的组胺。1 9 6 3 年c o h n 第一章半胱氨酸分析方法的研究进展 和l y l e 建立g s h o p a 测定还原型谷胱甘肽的方法,1 9 6 6 年v i c t o r 等又对该方 法进行了更详细的描述。其原理是o p a 在碱性介质中,当有g s h 存在条件下 ( 巯基有还原性) ,同氨基酸、肽反应产生荧光化合物( 见图4 ) ,可以定量测定。在 激发波长为3 5 0l l m ,最大荧光波长在4 2 0n n l 时,在0 0 6 3 2 5 1 u n o l m l 。1 范围 内荧光强度与谷胱甘肤浓度呈线性关系;反应在p h8 0 ,室温下进行,反应时 间1 5m i n ,产生的荧光物质在3 0m i n 内保持稳定,测定中氧化型谷胱甘肽、含 硫氨基酸、肽、嘌呤等其它物质对g s h 的测定没有影响。1 9 7 6 年,p a u l 等人 曾采用荧光法测定组织中的g s s g ,但是1 9 7 7 年b e u t l e r 等人证明了荧光法测定 g s s g 的值比酶法高很多,证明很多有机物使得测定值升高,所以o p a 不能作 为测定组织g s s g 的方法,除非在测定前通过色谱等方法对g s s g 进行分离, 此外研究者还应用了其它和谷胱甘肽产生荧光加合物的反应,如卜氯2 ,4 二 硝基苯( c d n b ) 、m b r b ( m o n o b r o m o b i - m a n e ) 、芘马来酰亚胺、4 ( 氨基磺酰) 7 氟2 ,l ,3 苯并二唑、7 氟2 ,1 ,3 苯并二唑4 磺酸酯、丹磺酰氯、4 二氯卜( 萘基4 乙氧基) s 三嗪( e d t n ) 6 1 、5 ( 五氟苯甲酰胺) 荧光黄 ( p f b f ) 【7 l 等。其中e d t n 方法也可以用紫外检测。通过多年的发展改进,荧 光法测定巯基化合物已经变成了一个较为成熟的方法,该方法不需要加热,反应 速度快,氨基酸和荧光物质通常在室温下5m i n b p 可测定,灵敏度较高,荧光物 质有一定稳定性,一些荧光加合反应有一定的专一性。但是该方法还存在一些不 足,如果没有较好的分离方法配合,测定受到外来的干扰会比较大。半胱氨酸的 巯基对锌离子、镉离子等金属离子有很强的络合能力。z h a n g h u a s h a n “孓“6 l 等 用8 羟基喹啉5 磺酸与锌,镉形成的配合物分别与半胱氨酸作用,半胱氨酸竞争 出配合物中的金属离子使配合物的荧光猝灭。据此建立了测定半胱氨酸的方法, 方法的检测限分别为1 7 n g m l l 和4 8 n g m l l 。z h c n g p i n g l i l l ”j 用半胱氨酸的 巯基和氨基与金纳米粒子的共价结合和静电吸附作用将金纳米粒子自组装成网 状结构,导致其共振散射增强。该方法可选择性地测定半胱氨酸,检测范围0 0 1 0 2 5 p g m l l ,检测限为0 2n g m l - 1 ,蛋白质中的其他氨基酸不干扰测定。z h e n g p i n gl i 还将金纳米粒子用于吸光光度法【1 1 8 】钡9 定半胱氨酸,但荧光法比吸光光度 法的检测限低十倍。t a n a k a 1 1 9 等用荧光性的醛类与半胱氨酸作用而使醛类物质 的荧光增强来测定半胱氨酸。m a n y ul i f l 2 0 等合成了一种双光子激发荧光传感器, 它在近红外区被激发,背景光小、光对物质的损伤小、光的转换率高,这些特点 使双光子发色团适用于生物成像标记。半胱氨酸与这种传感器的醛基作用生成环 状化合物,导致它的荧光发射光谱发生蓝移,荧光峰从5 3 5n n l 移到4 9 8n l n , 溶液由绿色变成青蓝色。反应在常温下进行,其他氨基酸不干扰,可用做半胱氨 酸和同型半胱氨酸的荧光探针。但该方法在有机溶剂中进行,不能达到满足人体 1 4 第一章半胱氨酸分析方法的研究进展 的生理条件。s b d f 用于荧光光度法测定毓基化合物的方法也有报道【9 5 - 9 6 1 。 t o y o o k a 等1 9 6 1 将s b d f 用于荧光光度法测定c y s ,g s h 和其它巯基化合物的 检出限( s n r = 2 ) 为4 3 5 2 0 p m o l m l l 。h i d d ”】用s b d f 直接测定了摄影用胶 中的c y s 。s b d f 和a b d f 联用可以同时测定毓基和二硫键化合物。t o y o o k a 等【9 8 l 先用a b d f 在含有e d t a n a 2 的碱性介质q 6 c o h 、 蚕冬 c 第五章基于铜桑色素配合物荧光光谱法测定半胱氨酸 在实验条件下,含5 0 1 0 4m o l l 1c y s t c i n e 溶液中下列量的离子共存时不干 扰其测定( 士5 ) :m 9 2 + ( 2 0 0 倍) 、c a 2 + ( 2 0 0 倍) 、n i 2 + ( 5 0 倍) 、c d 2 + ( 1 5 倍) 、z n 2 + ( 1 0 倍) 、h 9 2 + ( 1 0 倍) 、a 矿( 1 0 倍) 、a l ( 5 倍) 、f e 3 + ( 5 倍) ;i 。( 5 0 倍) 、c 0 3 ( 5 0 0 倍) 、 1 0 3 。( 1 0 0 倍) 、s 2 0 3 + ( 5 0 倍) 、s 0 3 。( 5 0 倍) 、c 1 0 3 + ( 5 0 倍) 、b r 0 3 。( 5 0 倍) 、e d t a ( 5 0 倍) 、s c n ( 5 0 倍) 、c n 一( 2 0 倍) ;蛋氨酸( 5 0 倍) 、甘氨酸( 5 0 倍) 、胱氨酸( 1 0 倍) 、 色氨酸( 1 0 倍) 、酪氨酸( 2 0 倍) 、b s a ( 1 0 倍) 、h a s ( 1 0 倍) ,大量的b f 、c i 、f 、 s 0 4 2 。、h p 0 4 2 、c h 3 c 0 2 。在碱性条件下,碱金属离子不会与桑色素反应。尽管 f e + 、a l ”、z n 2 + 会和桑色素反应并干扰半胱氨酸的测定,但它们在生物样品中几 乎不存在或含量很少,因此这些离子的干扰可以排除。 5 3 5 样品分析 取8 克新鲜猪血分散在1 0 0 m l 水中,加入a s l 3 9 8 中性蛋白酶,使酶与猪血 之比为8 0 0 0 g 。控制p h 为7 5 ,在氮气保护条件下4 0 c 恒温水解7 小时后 用活性炭于7 0 。c 脱色4 0 分钟,过滤后得清液备用。在荧光分光光度计上测定水 解液中半胱氨酸的含量,结果见表l : 表1 猪血水解液中半胱氨酸的测定结果 5 3 6 机理探讨 含氧、氮、硫的有机染料易与铜离子形成稳定的配合物,且配合能力逐渐增 强。桑色素通过氧原子与铜离子之问的电荷转移形成稳定的配合物。当加入半胱 氨酸时,半胱氨酸的巯基中的硫原子与桑色素的氧原子竞争结合铜离子,从而破 坏桑色素与铜离子的结合,生成桑色素和c u 2 + - c y s 。同时,具有强还原性的巯基 将c u ( i d 还原成c a 0 ) ,并且生成c u o ) c y s 和胱氨酸【1 4 l 。因此反应机理可简示如 下: 4 r s h + 2 m o r i n 2 - c u ( i i ) - 2 r s c a ( d + r s s r + 4m o r i n + 4 h + 为了进一步阐明上述作用过程,在同样条件下详细考察m o r i n 、c u ( i i ) 和c y s 相互作用时其荧光光谱和吸收光谱的变化。图3 分别为c u 7 i i ) 对m o r i n 激发光谱 和发射光谱的影响。在p h7 4 的b - r 缓冲溶液中,m o r i n 发射强荧光,其最大激 发和发射波长分别为4 5 0n i n 和5 3 9n r f l 。因为铜离子的顺磁性效应和重原子效应 第五章基于铜一桑色素配合物荧光光谱法测定半胱氨酸 以及桑色素和铜离子之间的电荷转移作用,导致桑色素的激发光谱和发射光谱随 着c u ( i i ) 的加入发生猝灭,但光谱形状亦未见明显变化。但是随着半胱氨酸的加 入,铜离子被半胱氨酸竞争而桑色素游离出来,导致体系的荧光激发和荧光发射 强度增大。 w a v e l e n g t h ,n m 图3 半胱氨酸对m o r i n - c u ( 1 1 ) 激发光谱和发射光谱的影响 f i g u r e 3 f l u o r e s c e n c es p e c t r ao fm o r i n c u ( i i ) i nt h ep i ( m c ca n da b s e n c e o fc y s 1 , 2 ,3 : e x c i t a t i o ns p e c t r ao fm o r i n c u ( d ,m o r i n - c u ( i i ) + c y sa n dm o r i n ,r e s p e c t i v e l y , 1 。,2 3 :e m i s s i o n s p e c t r ao f m o r i n - c u ( i d 。m o r i n - c u ( 1 1 ) + c y sa n dm o r i n , r e s p e c t i v e l y m o r i n5 x l f f t o o l l - 1 ,c u ( 1 1 ) 2 5 x 1 0 j m o l l - i c y s 3 o x l o m o l l - i 图4 a 图4 b 分别为c u ( i i ) 对m o r i n 和c y s 对m o r i n - c u ( i d 吸光光谱的影 响。c u ( i d 的加入使m o r i n 在3 9 0 h m 处的吸光度下降,4 5 6 n m 处的吸光度上升, 在2 7 6 n m 、3 2 5 n m 、和4 3 0 n m 处出现等吸收点,说明m o r i n 与c u ( i i ) 形成了配 合物;而c y s 的加入使m o r i n c u ( i i ) 配合物在3 9 0n l n 处的吸光度上升,4 5 6 n l n 处的吸光度下降,吸收蜂的位置没有明显的移动。图l ,图3 和图4 a ,图4 b 的 光谱变化说明在基态时m o r i n 与c u ( i i ) 形成稳定的会属配合物,但c y s 可与 c u ( i i ) 形成更为稳定的配合物而释放出m o r i n ,引起吸收光谱和荧光光谱的变 化。吸收光谱和荧光光谱的变化均为所提出的作用机理提供了有力的实验依据。 5 5 备一cm_cmucmu蚺巴o:一!| 第五章基丁铜桑色素配合物荧光光谱法测定半胱氨酸 叭咖“”州莲 惫& 埘
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