（分析化学专业论文）聚甲基丙烯酸酯类有机聚合物整体柱的制备及应用.pdf

南开大学硕士学位论文摘要 摘要 本硕士毕业( 学位) 论文共分为三个部分，包括绪论、四环素分子印迹整 体柱的制备及其作为固相萃取工具在测定牛奶中四环素类抗生素中的应用、间 氨基苯硼酸( a p b a ) 表面修饰阳离子交换整体柱的制备及应用。 第一章为绪论部分。对整体柱的发展历史、不同种类整体柱的制备及其在 疏水、亲水、离子交换、亲和色谱领域中的应用进行了综述。 第二章是四环素分子印迹整体柱的制备及其作为固相萃取工具在测定牛奶 中四环素类抗生素中的应用。以四环素为模板分子、甲基丙烯酸( m a a ) 为功能 单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯( e d m a ) 为交联剂、环己醇和十二醇为混合致孔剂， 在极性溶剂甲醇中首次采用原位分子印迹技术通过优化条件得到对四环素类化 合物均有特异性吸附的分子印迹整体柱。对四环素整体柱的印迹效果进行了研 究并与液相色谱联用，测定了牛奶中的四环素类抗生素，对四种四环素类抗生素 都取得了较高的回收率。 第三章是间氨基苯硼酸( a p b a ) 表面修饰阳离子交换整体柱的制备及其在蛋 白质分离中的应用。以甲基丙烯酸( m a a ) 、乙二醇二甲基丙烯酸酯( e d m a ) 制得 有机聚合物骨架，并优化混合致孔剂比例得到同时具有高比表面积和高渗透性 的整体柱。然后以一种简单有效的方法在该基质表面接枝间氨基苯硼酸( a p b a ) 使骨架上带有负电荷，从而得到阳离子交换整体柱，该整体柱拥有生物大分子 分离所需的大孔结构( 7 7 3 衄) 、良好的机械强度、对带正电荷蛋白质的强烈吸 附( 对l y s o z y m c 的动力学吸附量为3 6 5 r a g g ) 等优点，将其用于阳离子交换色谱 中对蛋白质进行分离，三种蛋白都得到了良好的基线分离。 关键词：整体柱分子印迹整体柱四环素离子交换整体柱蛋白质分离 南开大学硕士学位论文a b s t r a c t a b s t r a c t t h i st h e s i sc o n s i s t so ft h r e ec h a p t e r s ，i n c l u d i n gt h ei n t r o d u c t i o n ，t h ep r e p a r a t i o n a n da p p l i c a t i o no ft e t r a c y c l i n ei m p r i n t e dm o n o l i t h i cc o l u m n ，a n dt h ep r e p a r a t i o na n d a p p l i c a t i o no f3 - a m i n o p h e n y l b o r o n i ca c i ds u r f a c e - f u n c t i o n a l i z e dm o n o l i t h s i nc h a p t e ro n e ，t h e d e v e l o p i n gh i s t o r yo fm o n o l i t h i cc o l u m n , t h ep r e p a r a t i o n m e t h o d so fd i f f e r e n tm o n o l i t h i cc o l u m n s ，a n dt h e i ra p p l i c a t i o n si nh y d r o p h o b i c ， h y d r o p h i l i c ，i o n e x c h a n g ea n da f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yw e r ed e s c r i b e di nd e t a i l i nc h a p t e rt w o ，u s i n gt e t r a c y c l i n e ( t c ) a st h et e m p l a t e ，m e t h a c r y l i ca c i d ( m a a ) a s t h ef u n c t i o n a lm o n o m e r ，e t h y l e n eg l y c o ld i m e t h a c r y l a t e ( e d m a ) a st h ec r o s s l i n k e r , m e t h a n o la st h es o l v e n t ，c y c l o h e x a n o la n dd o d e c a n o la st h em i x e d p o r o g e n i cs o l v e n t s ， at e t r a c y c l i n ei m p r i n t e dm o n o l i t h i cc o l u m nw a sp r e p a r e db yi n - s i t um o l e c u l a r i m p r i n t e dt e c h n i q u ef o rt h ef i r s tt i m e t h es y n t h e s i sc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d ，a n d t h es e l e c t i v i t yo ft ci m p r i n t e dm o n o l i t h i cc o l u m nw a si n v e s t i g a t e d m o l e c u l a r l y i m p r i n t e ds o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ( m i s p e ) c o u p l i n gw i t hc 18c o l u m nw a su s e dt o d e t e r m i n a t et h et c si nm i l k t h eh i g hr e c o v e r i e sf o rf o u rt e t r a c y c l i n e sa n t i b i o t i c si n m i l ks a m p l e sw e r eo b t a i n e d i nc h a p t e rt h r e e ，m o n o l i t hs k e l e t o nw a sp r e p a r e db ym e t h a c r y l i ca c i d ( m a a ) a n d e t h y l e n eg l y c o ld i m e t h a c r y l a t e ( e d m a ) ，h i g hs u r f a c ea r e aa n dh i g hp e r m e a b i l i t y w e r eo b t a i n e dt h r o u g ho p t i m i z i n gt h em i x e dp o r o g e n i cs o l v e n t s as i m p l ea n d e f f e c t i v em o d i f i c a t i o nm e t h o dw a su s e df o rt h es y n t h e s i so f3 - a m i n o p h e n y l b o r o n i c a c i d ( a p b a ) m o d i f i e dm o n o l i t h s t h ec h a r a c t e r i z a t i o n s ，a d s o r p t i o np r o p e r t i e so ft h e f u n c t i o n a l i z e dm o n o i l i t hw e r ei n v e s t i g a t e d t h es p e c i f i cs u r f a c ea r e aw a s15 0 9m 2 g ， a v e r a g ep o r es i z ew a s0 7 7 3l x m ，w h i c hp r o v i d e dt h e b e t t e rp e r m e a b i l i t yf o r s e p a r a t i o n ；a n dt h ed y n a m i cb i n d i n gc a p a c i t yo fl y s o z y m ew a s3 6 5 m g g f i n a l l y , t h e b a s el i n es e p a r a t i o no ft h r e ep r o t e i n sw a so b t a i n e db yu s i n gt h em o d i f i e dc o l u m nf o r c a t i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y k e y w o r d s ：m o n o l i t h i cc o l u m n ；m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dm o n o l i t h i cc o l u m n ；t e t r a c y c l i n e ； c a t i o n e x c h a n g em o n o l i t h i cc o l u m n ；p r o t e i ns e p a r a t i o n i i 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：今搁埤乃目 加o 年争月) 日。 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均己在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名：槲惘 硼年 月沈日 南开大学硕士学位论文第一章 第一章整体柱技术的研究进展 引言 近几年来，一种新颖的固定相形式：整体柱( m o n o l i t h i cc o l u m n ) ，因其制备简 单、易于改性、柱压低及传质速度快等优点得到了极大的关注。整体柱，又称 连续床( c o n t i n u o u sb e d ) 或连续棒( c o n t i n u o u sr o d ) 。其早期发展可以追溯至i 6 0 年代 后期，k u b i n 等使用聚( 2 羟乙基甲基丙烯酸酯) 基质代替多糖凝胶，在低压下， 以体积排阻模式分离蛋白质。但是这种连续的聚合物溶胀性很大，渗透性很差， 难以实际应用。7 0 年代初r o s s 等【l 】制备了具有通孔的聚氨酯泡沫，用作气相色谱 和液相色谱的固定相。尽管这类固定相具有良好的通透性，但是在有些溶剂中 易于溶胀和软化，未能得到实际应用。在8 0 年代末期，发展出了压制的编织材 料基质【2 j ，纤维素薄片【3 1 、经压缩的聚丙烯酰胺凝胶 4 】等整体柱形式的分离介质。 其中h j e n 6 n 及其同事【4 5 j 于2 0 世纪8 0 年代末发展出了被称为“连续床”的经压缩的 软凝胶基质，是整体柱在色谱分离上的一个里程碑。通过在空管柱中加入单体、 引发剂及致孔剂的混合溶液“原位”( i n s i t u ) 聚合后制得聚丙烯酰胺凝胶，再将其 高压压入一空色谱柱制得软基质“连续床”色谱柱，成功地用于蛋白质及多肽的分 离。但是这种填料仅在溶胀情况下才存在大孔结构，所以不能用于流动相极性 变化太大的分离过程，应用受到一定的限制。f r 6 c h e t 等人【6 】随后进一步发展了这 项技术，在空管柱中“原位”聚合制得一种全新的刚性聚合物整体柱，鉴于其具有 优异的通透性、高空间利用率、制备简单等优点，得到了广泛的应用。1 9 9 6 年 后，f i e l d s 等人和m i n a k u c h i 等人分别发展出基于硅胶的整体柱【7 8 1 使这项技术得 到全面的发展。另外，在毛细管中采用整体柱的形式可以避免复杂的装填过程 和塞子的制作，进一步推动了整体柱的发展。目前，已有多种整体色谱柱实现 了商品化，例如无机硅骨架的整体柱s i l i c ar o d t m 【9 1 、p r e p r o d s t m 1 0 】和 c h r o m o l i t h t ml l ，以及有机聚合物整体柱c m t m 【1 2 ，1 3 】。最近，有多篇关于整体 柱在高效液相色谱及毛细管电色谱中应用的优秀综述被发表【1 4 埘】。 南开大学硕士学位论文 第一章 1 1 整体柱的制备 目前整体材料己被广泛用于高效液相色谱柱、毛细管电色谱柱及毛细管液 相色谱柱的制备，对于整体柱的研究和应用是当前色谱研究的一大热点。根据 所制备的整体材料的不同，整体柱可被分为有机聚合物整体柱和无机硅胶整体 柱。此外，在毛细管电色谱中还有一种特殊的整体柱形式：颗粒固定化整体柱。 1 1 1 有机聚合物整体柱的制备 整体柱在高效液相色谱和毛细管电色谱中的制备有不同之处。 1 1 1 1 有机聚合物高效液相色谱整体柱的制备 有机聚合物整体柱的制备是非常简单的。将单体、交联剂、致孔剂和引发 剂的混合溶液加入空管柱中通过热或光引发聚合反应。待反应完全后用有机溶 剂除去致孔剂及其它可溶性化合物，即可得到大孔聚合物整体柱。然后通过对 其进行化学改性以满足各种色谱模式的要求。根据所用单体的不同，有机聚合 物整体柱可分为以下几种。 1 1 i 1 i 基于聚苯乙烯的整体柱 聚苯乙烯整体柱的制备一般选用苯乙烯或氯甲基苯乙烯为单体，二乙烯基 苯为交联剂。由于聚苯乙烯表面具有较强的疏水性，因此可直接用于小分子、 肽、生物大分子的反相色谱以及聚合物的沉淀溶解色谱分离1 2 2 讲】。然而苯乙烯 表面无活性官能团，改性困难。而氯甲基苯乙烯与二乙烯苯的共聚物不仅具有 聚苯乙烯的机械强度和化学稳定性，而且含有氯甲基活性官能团易于改性。另 外，通过调节氯甲基苯乙烯的比例，可以改变配体的键合密度。f r 6 c h e t 等人口纠 对聚氯甲基苯乙烯整体柱进行两步修饰，首先用乙二胺与氯甲基反应，然后再 与y g l u c o n o l a c t o n e 反应，得到了表面亲水性很强的整体柱。将聚氯甲基苯乙烯整 体柱与乙二胺反应后，再与氯乙酸或溴乙酸反应可得到弱阳离子交换柱【z 6 | s v e c 等人f 2 7 ，2 8 】选用高含量的二乙烯基苯单体以及合适的致孔剂制得了比表面达4 0 0 2 南开大学硕上学位论文第一章 m 2 g 的整体柱，且依然具有较好的通透性。此外他们还利用活性引发剂( t e m p o ) 制得了比表面积大于3 0 0m 2 儋的整体柱【2 8 - 3 0 1 。 1 1 1 1 2 基于聚丙烯酸酯的整体柱 聚甲基丙烯酸缩水甘油酯p o l y ( g m a c o e d m a ) 是应用最为广泛的聚丙烯酸 酯类整体柱。由于它具有环氧活性官能团易于改性，因此可被用于制备多种色 谱填料。s v e 等人【3 1 , 3 2 】用二乙胺与聚甲基丙烯酸缩水甘油酯整体柱反应制得弱阴 离子交换柱。用e t h y l e n e d i a m i n e 反应后再与i d a 反应，或者直接嫁接i d a 可制得 弱阳离子交换柱 3 3 , 3 4 】v i l d u n d 3 5 1 用聚2 丙烯酰胺2 甲基丙磺酸( p o l y ( 2 a c r y l a m i d o 一2 m e t h y l 一1 - p r o p a n e s u l f o n i ca c i d ) 在经过水解的聚甲基丙烯酸缩水甘油 酯整体柱上接枝，得到了强阳离子交换柱。最近，w i e d e r 等【3 6 】毛e p o l y ( g l y c i d y l m e t h a c r y l a t e c o d i v i n y l b e n z e n e ) 表面首先用二乙胺打开环氧基团得到一个叔胺， 然后用二乙基硫酸盐烷基化就得到带正电荷的季铵盐p o l y f n ，n ，n t r i e t h y l a m m o n i u m 一2 - h y d r o x y p r o p y l - m e t h a c r y l a t e - c o d i v i n y l b e n z e n e ) 阴离子交换柱，成功分离了 7 种核苷酸 尽管分析型聚合物整体柱的制备技术己经比较成熟，但合成制备型的整体 柱还存在很多问题。由于整体柱的制备一般采用热引发聚合反应，同时聚合反 应是一个放热反应，所以当柱管的直径超过一定范围时，径向存在的温度梯度 会导致所合成的聚合物孔结构不均匀。因此采用这种方法合成的整体柱的直径 最大不能超过2 5 m m p e t e r s 等人【37 j 通过逐步加入单体混合液降低聚合速度以消 除由于聚合放热而导致温度升高的影响。他们采用这种方法制备了孔结构均匀 的规格为2 0 0 5 0i l l n li d 的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯整体柱。p o d g o m i k 等人【3 8 】 设计合成了环柱状的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯整体柱，将其用于径向色谱。 1 1 1 1 3 基于聚丙烯酰胺的整体柱 丙烯酰胺是一个亲水性很强的单体，通常在水相中聚合制备凝胶，用于凝 胶电泳。h j e n 6 1 1 【3 9 1 制得含有异丙基的丙烯酰胺凝胶用于疏水色谱分离蛋白质， x i e 4 0 用丙烯酰胺与甲基丙烯酸丁酯共聚合成了聚丙烯酰胺甲基丙烯酸丁酯疏 水整体柱，并成功地用于蛋白质的分离。这种聚合物的疏水性可方便的通过改 3 南开人学硕士学位论文 第一章 变反应液中甲基丙烯酸丁酯的含量加以控制。 1 i 1 2 有机聚合物毛细管电色谱整体柱的制备 毛细管电色谱整体柱不仅同样具备高效液相色谱整体柱优越的色谱性能， 同时还避免了填充毛细管电色谱柱繁杂的装填过程和两端需烧塞子的问题，并 且也克服了开管毛细管柱相比小的不足。因此，毛细管电色谱整体柱在最近几 年得到了迅速发展【4 卜4 引。 毛细管电色谱聚合物整体柱的制备与液相整体柱的制备有些不同：( 1 ) 在电 色谱整体柱的表面需要引进带电的基团，以产生电渗流；( 2 ) 由于毛细管没有类似 于h p l c 中的筛板，因此需要将聚合物填料共价连接在石英毛细管的内壁上。所 以，聚合反应液组成以及制备的过程都不能简单的引用液相色谱整体柱的制备 方法。一般是将待聚合的反应混合物( 反应单体、交联剂、致孔剂及用于产生电 渗流的带电物质) 用注射器移入毛细管中，通过加热或紫外光照射使其在管内形 成连续多孔的有机聚合物床层，然后将反应完成的毛细管用压力泵等将未反应 完成的反应单体及致孔剂冲洗干净。有机多孔聚合物型电色谱整体柱也可根据 反应所用单体的不同而分为：聚丙烯酰胺整体柱、聚苯乙烯整体柱、聚甲基丙烯 酸酯整体柱等。 电色谱整体柱的应用最早是在1 9 9 5 年，由f 匈i m o t o 等【47 j 提出，他将丙烯酰胺 的水溶液注入毛细管内进行聚合反应，生成充满毛细管的连续多孔介质。柱效 可达1 5 0 0 0 0n m ，但出峰时间很长。后来f u j i m o t o 4 8 又在a n a l y t i c a lc h e m i s t r y 上著文指出初期的聚丙烯酰胺整体柱它的作用机理仍是筛分作用，而不是色谱 所要求的溶质与固定相之间的一种相互作用。为此f u j i m o t o 将丙烯酰胺用疏水性 更大的n i s o p r o p y l a c r y l a m i d e 代替，在内壁己键合上双键活性基团的毛细管中进 行聚合反应，得到具有疏水性的毛细管电色谱凝胶柱。同时，h j e r t o a 等也对交 联丙烯酰胺聚合物整体柱作了报道。n j e r t 6 n 的方法相对比较复杂，需要经过毛 细管内壁的预处理、二次聚合反应及键合官能团等反应步骤。为此他们后来对 以上方法作了改进【4 9 1 ，在表面活性剂作为稳定剂条件下将疏水性的甲基丙烯酸 丁酯或甲基丙烯酸十八烷酯与亲水性的乙烯基磺酸聚合生成含c 4 或c 1 8 疏水官 能团的床层。并由于磺酸基团的存在，使其可在较宽的p h 值范围内维持较大的 电渗流。最近，h o e g g e r 并 h f r e i t a 5 0 】用一系列不同链长的单体制备聚酰胺整体柱， 4 南开人学硕士学位论文 第一章 其使用的单体包括甲基丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺、丙烯酸丁酯和丙烯酸己酯。 由于f u j i m o t o 及h j e r t 6 n 等人所提出的聚丙烯酰胺连续床毛细管电色谱柱的反应 都是在水溶液中进行的，为了能在聚合物中引入疏水官能团，其聚合反应单体 就必须在连续超声乳化下匀化，为此n o v o t n y 等【5 1 提出了在有机相溶液中( n 一甲 基甲酰胺水溶液) 进行聚合反应的连续床毛细管柱的制备方法。与在水相或在有 机相溶液中反应生成聚丙烯酰胺连续床层不同的是，h o b t l l 等【5 z 】报道了多孔刚 性聚苯乙烯二乙烯基苯为基体的毛细管电色谱整体柱。他们对毛细管内管壁用 甲基丙烯酸三甲氧基硅烷的二甲基甲酰胺溶液处理引入双键，以氯甲基苯乙烯 与二乙烯基苯为单体、偶氮二异丁睛为引发剂的混合物引入毛细管中，聚合成 连续床毛细管整体柱，然后由活性氯甲基基团与叔胺反应，生成带正电荷的季 胺盐，电渗流的方向为从阴极到阳极。由于甲基丙烯酸酯类聚合物在毛细管内 原位合成后，其机械强度较大而且溶涨性能优于苯乙烯二乙烯基苯类聚合物， 所以在毛细管电色谱中此类聚合物型毛细管电色谱整体柱正引起越来越多研究 者的兴趣。f r 6 c h e t 等【5 3 1 于1 9 9 7 年报道了此类毛细管电色谱整体柱的制备及应用 文章，根据他们的报道整体柱可在未经处理的毛细管内进行直接合成，而柱床 不会移动，为了使连续床层能产生电渗流，在反应中加入a m p s ( 2 - 丙烯酰胺一2 一 甲基1 丙磺酸) 1 s 4 , 5 5 】，这样可在较宽的p h 范围内保持足够的电渗流强度。 1 1 2 分子印迹整体柱的制备 分子印迹技术( m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u e ，m i t ) 起源于免疫学，其 理论依据最初来源于p a u l i n g 在研究抗体生物相互作用时所提出的关于抗体的假 设5 6 1 。自从德国的w u l f f 5 7 - 6 0 等对分子印迹技术进行了初步的尝试后，近几十年 该项技术得到了蓬勃的发展，其中m o s b a c h 【6 1 - 6 4 d 、组所做的工作尤为突出。 分子印迹技术是指为获得在空间结构和结合位点上与某一分子( 模板分子) 完全匹配的聚合物的实验制备技术。它是通过以下方法实现的：( 1 ) 首先使具有适 当功能基的功能单体与模板分子结合形成单体一模板分子复合物；( 2 ) 选择适当的 交联剂将功能单体互相交联起来形成共聚物，从而使功能单体上的功能基在空 间排列和空间定向上固定下来；( 3 ) 通过一定的方法把模板分子脱去。这样就在高 分子共聚物中留下一个与模板分子在空间结构上完全匹配，并含有与模板分子 专一结合功能基的三维孔穴。这个三维孔穴可以选择性地重新与模板分子再结 5 南 大学硕士学位论文第一章 合，即对模板分子具有专一性识别作用。过程如图l1 所示。这个三维空穴的空 间结构和功能单体的种类是由模板分子的结构和性质所决定的。 h 于用不同的 模板分子制备的分子印迹聚台物具有不同的结构和性质，所咀一种印迹聚合物 只能与一种分子结合，类似于“锁”与“钥匙”的关系，也就是说印迹聚合物 对该分子具有选择性结合作用。与传统的分离分析介质相比，m i p 的最大特点 是具有高度的特异选择性”一。近年，分子印迹技术在色谱分离分析1 、膜分 离”、固相萃取州、仿生传感器【7 0 1 等领域中均展现出良好的应用前景。其中， m i p 在色谱领域中应用较多，主要作为高效液相色谱、薄层色谱、毛细管电色 谱的固定相以及毛细管电泳的流动相添加剂等【7 “。 m d l * 乞q宙 i 0 兰 圄1 1 分子印迹过群示意幽 f i g l1s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o n o f m o l e c u l a r i m p r i n t i n g p r o c e s s ( 引用臼欧倥杰博士毕业论文：新型分午印迹整体拄的制备和应用) 分子印迹整体柱( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e d m o n o l i f f 6 cc o l u n m ) 结合了分子印迹技 术和整体柱的优点，采用原位聚合的技术，即在宅色谱柱管中注入模扳分子、 功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂的混合物通过热引发，生成一根整体柱。 分子印迹整体柱简化了色谱固定相的制备过程，具有特异选择性好及传质阻力 广 广0 麓 南开大学硕上学位论文第一章 低等优点。 1 9 9 3 年m a t s u i 掣7 2 】首次报道了在不锈钢柱管内原位聚合制备分子印迹整体 柱。将模板分子( l 和苯丙氨酸) 、功能单体( 甲基丙烯酸) 、交联剂( - - 甲基丙烯酸 乙二醇酯) 、引发剂( 偶氮二异丁腈) 和致孔剂( 环己醇和十二醇) 的混合物脱气后注 入不锈钢柱管中，7 0 水浴中放置6 h 。以l 和d 苯丙氨酸为模板分子时，分离 因子分别为1 7 和1 4 。s e l l e r g r e n 等 7 3 】采用改进的分散原位聚合技术，在1 5 c m x 3 m m i d 的玻璃管中制备多孔的分子印迹整体柱。以抗艾滋病药物戊脒为模板分 子，在0 3 m l m i n 的流速下，戊脒与其类似物苄脒的校正分离因子为6 8 。h u a n g 等【7 4 】认为分子印迹整体柱的孔结构是影响柱压的关键因素，他们采用甲苯和正 十二醇作为致孔剂，氨基酸( c b z l t r p 、f m o e l t r p ) 和金鸡纳生物碱( 辛可宁、 辛可尼丁、奎宁、奎尼丁) 作为模板分子，制备了6 种分子印迹整体柱，其中非对 映体辛可宁和辛可尼丁得到完全分离，采用梯度洗脱，分离因子最高可达3 1 8 ， 由于制备的整体柱里面存在所谓的超大孑l ，故柱压低，流速2 m l m i n 时柱压仅为 1 0 8 m p a 。在y i n 等【7 5 j 制备的那格列萘印迹整体柱上，那格列萘及其l 对映体分 离良好。而且，与用本体聚合方法制备的那格列萘分子印迹柱相比，整体柱的 选择性和分离速度均明显提高。h u a n g 等【_ 7 4 】认为对孔径影响最大的因素是致孔 剂，致孔剂应满足3 个条件：( 1 ) 模板分子、功能单体、引发剂和交联剂均溶于致 孔剂；( 2 ) 致孔剂能使聚合物产生大孔，保证整体柱良好的通透性；( 3 ) 致孔剂极 性应较低，以减少对模板分子和功能单体形成复合物的影响。h j e f t 6 i l 等【_ 7 6 ，。7 7 】做了 蛋白质分子印迹整体柱方面的开创性工作。 1 1 3 硅胶整体柱的制备 硅胶整体柱的制备相对复杂一些，主要有以下两种方法：一种是先将硅酸钾 的溶液注入石英毛细管在1 0 0 反应1 h ，然后用1 0 的o d s ( d i m e t h y l o c t a d e c v l c h l o r o s i l a n e ) 甲醇溶液与其反应，得到反相硅胶整体柱【7 8 1 ，但是采用这种方法得 到的硅胶整体柱结构不均匀。为了解决这个问题，m i n a k u c h i 7 9 】采用了另一种方 法，即溶胶一凝胶法( s o l g e l ) ：首先在p e o p o l y ( e t h y l e n e o x i d e ) 的水溶液中加入 四甲氧基硅烷( t e t r a m e t h o x y s i l a n e ，t m o s ) 及催化剂醋酸，在o c 搅拌3 0 m i n ，然后 将此混合液加入一聚碳酸酯的柱管中4 0 反应1 天，待反应完成后，将所得的硅 胶整体柱浸泡在氨水中以产生中孔( m e s o p o r e ) ，最后经热处理除去其中的有机组 7 南h 大学顾十学位论文 # 一女 分，完成后再用硅烷化试剂反应市i 得反相色谱柱。 由于硅胶在老化和下燥时会收缩，因此得到的硅胶整体柱必须放入聚醚醚 酮( p e e k ) 柱管中用外压使管壁与柱体紧贴，以防止产生侧壁穿漏。采用这种方 法得到的硅胶整体柱的比表面积高达3 0 0 - 4 0 0o 幢。这种柱子目前己被m e r c k 公司商品化。最近，d u l a y 搴 ”1 在3 6 5 n m 紫外线照射下在毛细管中单步原位合成 了多孔硅连续床，此柱表现出了反相色谱的特性，可用于低分子量中性化合物 如p a h s 烷基苯、烷基苯基酮及类固醇的分离分析。c h e n 等口”则在溶胶一凝胶法 韦柱的基础上再键合上l 一苯丙酰胺，并在配体交换模式下成功拆分了十二对丹酰 化氨基酸消旋体。 d 。目。向 曹 篱雨瘟薹 o e 三三司 图12 砖胶整体柱的制备过程 f i g l2 s c h e m a t i c f l o wc h a no f t h e p r e p a r a t i o np t o c c d l l r e o f as i l i c a m o n o l i t h ( 引用自o u i o c h o ng m o n o l i t h i cc o l u m n si nh i 曲p e f f c cl i q u i de h r o m a t o g r a p h yj c h i f o m a t o g r 2 0 0 7 ，1 1 6 8 ：l 们- 1 6 8 ) 14 颗粒固定化型整体柱的制备 南开大学硕+ 学位论文 第一章 在毛细管电色谱整体柱制备中除有机聚合物和无机硅胶聚合物外还包括一 种特殊的整体柱形式：颗粒固定化整体柱( p a r t i c l e f i x e dm o n o l i t h i cc o l u m n ) 。它是 将传统固定相颗粒用溶胶一凝胶技术 8 2 - 8 7 1 、烧结方法【8 8 , 8 9 1 或利用有机聚合物聚合 州j 使其固载到毛细管内形成颗粒固定化整体柱。此方法制备得到的整体柱同样 具有聚合物型整体柱无塞子的优点，在电色谱中得到了较广泛的应用。烧结法 无塞电色谱整体柱( p a r t i c l e s i n t e r e dm o n o l i t h i cc o l u m n ) 8 8 , 8 9 是将色谱用硅胶微球 固定相装入毛细管柱，然后经过n a h c 0 3 及丙酮冲洗，氮气吹干处理，最后在 1 2 0 - 3 6 0 下加热使硅球熔结在一起。此法的缺点是硅球固定相表面在颗粒加热 烧结过程中遭到破坏，需对其进行重新硅烷化处理，操作步骤太多、耗时。 溶胶凝胶法是在传统溶胶凝胶混合液中加入待填充的电色谱固定相颗粒， 形成含有此颗粒的悬浮溶液，然后将其充入毛细管中，在经过干燥处理后，颗 粒固定相将通过硅氧键紧密结合在一起，形成无塞子电色谱整体柱【8 4 1 。但是这 种柱子和填充柱相比柱效较低，这可能是由聚合的不均匀造成一些固定相颗粒 被包结所引起。 另外一种固定化方法( p a r t i c l e e n t r a p p e dm o n o l i t h i cc o l u m n ) 8 5 。8 7 】是先将填料 装入毛细管内，干燥处理后，再将固载用溶胶凝胶溶液或者聚合物单体溶液充 入管内，聚合后形成整体柱。溶胶一凝胶法制得的整体柱不仅不需塞子来固定颗 粒填料，而且还可避免颗粒填充时在柱内形成空隙。但是，这些方法都会不可 避免地使固定相表面受到影响，降低其表面性能。 1 2 整体柱的特征 整体柱对流动相的通透性与它的孔结构密切相关。整体柱中的大孔越多， 流动相流过时的柱压就越低。但是孔径大于5 0 蛳l 的大孔对基质材料的表面积贡 献很小。然而对于色谱分离，填料的表面积要求越大越好。为了获得大的表面 积，基质材料中小于2 n m 的小孔和介于2 5 0n m 的中孔应尽可能多。因此，必须 兼顾低柱压和大表面积两方面的要求。传统大孔微球表面孔内停滞流动相的传 质阻力是影响柱效，导致峰变宽的主要因素。特别对于生物大分子，缓慢的分 子扩散传质过程是分离速度难以提高的主要原因。由于整体柱中存在着特有的 大孔通道允许流动相直接流过，并以对流传质取代了缓慢的扩散传质，使得样 9 南开大学硕士学位论文第一章 品的传质阻力大大减小。w a i l g 等【9 l 】考察了表面接枝聚乙烯亚胺链p o l y e t h y l e n e i m i n e ( p e i ) 的p o l y ( g m a c o e d m a ) 阴离子交换柱整体柱在不同流速下对牛血清 白蛋白、细胞色素c 和溶菌酶三种蛋白的分离情况，当线流速从0 6 m l m i n 提高 至u 6 m l m i n 时，其柱效基本保持不变。突破曲线是考察传质动力学的有效工具， 理想的突破曲线应该是_ 条垂直的曲线，当样品的吸附速率低于流动相的流速 时，突破曲线会变得平缓。传统填充柱的另一个缺点在于填充柱的柱效受很多 因素的影响，重复性差。甚至对于同一批次的填料相同的人装填的柱子，柱效 也会有所差别，而整体柱不但制备过程简单而且重复性也非常好。l i a o 9 2 】考察了 四种溶质在2 3 批u n o q 整体柱上保留时间的差别，相对误差小于1 3 。此外，有 机聚合物整体柱除了有优异的通透性、高空间利用率、制备简单等优点外，它 在制备时可以通过选择不同的单体以达到各种表面属性，因而具有不同的选择 性。 1 3 整体材料的应用 1 3 1 整体材料在亲水色谱中的应用 亲水作用色谱( h y d r o p h i l i ci n t e r a c t i o nc h r o m a t o g r a p h y ，h i l i c ) 的命名源于 a l p e r t 9 3 j 的工作，在分离极性化合物方面可与反相色谱媲美，有机聚合物整体柱 在此机制下使用较少 9 4 。9 8 】，且大多数工作都围绕聚丙烯酰胺整体柱而展开 4 5 。4 8 1 。 t e g e l e r p 4 j 等以丙烯酰胺、亚甲基双丙烯酰胺、2 - c y a n o e t h y l a c r y l a t e 和v s a 共聚 得到亲水整体柱并以其在c e c 模式下分离复杂多聚糖混合物，经修饰后又成功 分离了胰蛋白酶酶解的卵清白蛋白消解产物，h o e g g e r 并1 ：i f r e i t a g 9 5 】报道了以 n ，n 二甲基丙烯酰胺和哌嗪二丙烯酰胺共聚得到混合模式整体柱的制备，并用 该柱在c e c 模式下分离了带正电荷的氨基酸和肽，通过改变流动相中盐浓度及有 机相的组成来考察了分离机理。f r e i t a g 9 6 】制备了n ，n 二甲基丙烯酰胺整体柱用于 纳升色谱分别在l c 和c e c 模式下分离不带电( 极性芳香族化合物) 和带电( 氨 基酸) 分析物，对于带电荷分析物，静电作用和亲水作用同时有效，对于不带 电分析物只有亲水作用有效。x i e 【9 1 7 】等制备了基于亲水单体丙烯酰胺和n ，n 亚 甲基双丙烯酰胺的孔径大于1 0 0 0n l i l 的大孔整体柱。 前期的工作说明亲水色谱可用于生物大分子分离、固相萃取以及固定化蛋 l o 南开大学硕士学位论文第一章 白。目前此方面研究较少主要基于以下原因：第一，极性单体在常用溶剂中的 溶解能力有限；第二，可用的极性单体种类很少。 1 3 2 整体材料在疏水色谱中的应用 疏水性整体柱的制备，可由具有一定疏水性的基质与交联剂一步合成，也可 经衍生后得到基于甲基丙烯酸丙烯酸和苯乙烯的整体柱都被常用作疏水色谱， 近期的工作都集中在反相h p l c 和c e c 的模式中的发展和应用。 c o u f a l 【9 圳等在毛细管( 3 2 0 b t mi d ) 中以甲基丙烯酸丁酯( b u t y l m e t h a c r y l a t e ，b m a ) 和乙二醇二甲基丙烯酸酯( e t h y l e n e d i m e t h a c r y l a t e ，e d m a ) 共聚，并 用毛细管液相色谱测试其性能。b a n d i l l a 个和s k i n n e r 1 0 0 】等使) j b u t y la c r y l a t e ( b a ) 和1 ，3 b u t a n e d i o ld i a c r y l a t e ( b d d a ) 聚合整体柱在c e c 模式下分离蛋白，理论塔 板数在11 , 0 0 0 至u 3 3 ，0 0 0 之间。f r 4 e h e t 1 0 1 】等也制备了b m a 和e d m a 整体柱，并 用在快速微柱h p l c 中分离混合蛋白，使用8 7m m s 的流速在4 0 s 内就可完成分析。 g u a n 1 0 2 j 等在1 丙醇、1 ，4 丁二醇和水混合致孔剂存在下以b m a 和e d m a 制备了 1 0 0c n l 长的毛细管整体柱( 3 2 0 1 t mi d ) ，并在微柱h p l c 模式下进行考察致孔 剂占5 0 的柱子柱效很低，而致孔剂占7 5 的柱效就有大幅提高，使用脲嘧啶、 苯、甲苯和乙基苯混合物进行测试，该柱对极性和非极性的小分子可达到3 3 ，0 0 0 塔板数m 的柱效，而且展现出很好的渗透性。h u a n g 1 0 3 等在1 丙醇、1 ，4 丁二醇 混合致孔剂存在下制备了甲基丙烯酸辛酯( 0 m a ) 和e d m a 的整体柱( 5 3 0 i _ t m i d ) ，并用其在毛细管液相色谱( c l c ) 模式下分离酸、中、碱性分析物，另外， 三种金属离子( m g ( i i ) ，z n ( i d 和c d ( i i ) 也可以在该柱上得到分离。z e n g 等k 1 0 4 】 采用哌嗪二丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺及异丙基丙烯酰胺为单体一步聚合得到疏 水相互作用整体柱，这种水相互作用整体柱的固定相表面疏水性可以通过改变 异丙基丙烯酰胺的比例任意调节。x i e 4 2 】制备的交联聚丙烯酰胺甲基丙烯酸丁酯 整体柱同样也被用于蛋白质的疏水色谱分离，当进样量从0 3 6 增加至5 8 4m g 时， 蛋白的保留时间仅发生微小变化，且蛋白的质量回收率超过9 0 刘彤等 1 0 5 】合成 了丙烯酰胺甲基丙烯酸丁酯“- 亚甲基双丙烯酰胺基质的疏水整体柱，考察了 聚合物单体中甲基丙烯酸丁酯的含量对于标准蛋白质的分离效果和介质疏水性 的影响。卫引茂等d 0 6 制备了甲基丙烯酸缩水甘油酯一甲基丙烯酸丁酯一乙二醇二 甲基丙烯酸酯三元共聚物疏水整体柱，考察了聚合条件对聚合物孔结构及介质 南开大学硕士学位论文第一章 疏水性的影响，应用该色谱柱对标准蛋白混合样及基因工程药物g i n f 和胰岛素 的前驱体p r o i n s u l i n 提取液进行了分离纯化，效果良好。u m e m u r a 1 0 7 j 等报道了具 有低背压和不同疏水性的整体柱，具有不同链长的甲基丙烯酸酯在i s o a m y l a l c o h o l 和1 ，4 丁二醇存在下与e d m a 共聚，所用的甲基丙烯酸酯种类主要有c 2 ， c 4 ，c 6 ，c 1 2 和c 1 8 。用所有的整体柱分离一系列烃基苯，疏水性随着确增大 而增加，然而4 0 t 时背压达至u 1 0 m p a , 这就限制了高流速下的使用，对c 1 8 甲 基丙烯酸酯整体柱而言，2 5 t 时，背压、柱效和选择性都较为合适。 1 3 3 整体材料在离子交换色谱中的应用 通过涂敷得到的离子交换整体柱，由于制备简单和分离性能好而成为目前 离子交换整体柱制备的主要途径。用于制备阴离子型整体柱的涂敷试剂一般为 含有长链烷基的阳离子型表面活性剂，h a t s i s 等 1 0 8 】用双十二烷基二甲基溴化铵 为涂敷试剂，对硅胶基质的反相c 18 整体柱( 5 0i i l i nx 4 6n l i ni d ) 进行涂敷，所得 到的阴离子交换整体柱不但保持了原来整体柱的高通透性能，而且对一些常见 无机阴离子具有较好的分离性能，他们以四丁基邻苯