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上海师范大学硕士学位论文 e t 克隆的应用及脚船基因敲除小鼠模型的初步建立 摘要 目的：一，为了研究e t 克隆的应用技术，同时研究人类未知功能分泌肽基f g - c o l e c l l 的基因功能。我们需要构建小鼠该基因打靶载体。二，人类基因组中，r e s p l 8 是一种功能 未知的分泌肽基因，该基因具有n - 端信号肽结构，且无跨膜区域。本研究拟通过获得该基 因敲除的小鼠来实现对其功能的研究。从而进一步评估该基因成药的可能性。为药物筛选 的靶位点寻找做好基础。本研究的总目标是进一步展开对e t 克隆技术的应用和建立 r e s p l 8 基因敲除小鼠模型，从而为研究该基因的功能和成药可能性打下基础。 方法：首先，我们从含有c o l e c l l 基因的b a cd n a 中扩增获得大片段的基因组d n a ， 然后用携带有两个小同源臂的选择性m a r k e r 来替换该片断中的欲敲除区域，最终获得 c o k l l 的基因打靶载体。另外，本研究通过生物信息学方法查询到小鼠中该基因的基因 组序列、转录信息、及翻译后蛋白的详细信息，并查到包含r e s p l 8 基因的b a c 克隆号。 通过e t 克隆的方法经过在大肠杆菌体内的r e t r i e v e 和n e ok n o c k - i n 两次同源重组获得三个 不同大小同源臂的r e s p l 8 打靶载体。构建好的打靶载体我们选用了同源臂最长的 p b r 3 2 2 - r e s p l 8 r 一2 0 k - n e o 去打靶e s 细胞。经药物筛选后仍能生存的克隆经过p c r ， r e a l t i m ep c r 鉴定其是否在预期的位置发生了重组。鉴定后的e s 克隆显微注射到预先准 备好的囊胚中，然后移植到假孕母鼠体内。生出的嵌合体小鼠再经过与c 5 7 b l 6 j 小鼠交 配，便可获得r e s p l 8 基因敲除的杂合子小鼠，进一步的遗传育种便可获得包括纯合子、杂 合子及野生型三种基因型小鼠。从获得杂合子时开始观注基因敲除后该小鼠的表型变化， 包括怀孕情况，生育情况，小鼠的精神及行动、饮食情况。然后再根据该基因在小鼠体内 的组织表达图谱，进一步深入对该基因敲除小鼠模型进行表型分析。 结果：成功地运用e t 克隆技术获得了对小鼠c o l e c l l 基因进行敲除的载体，并建立了 f r 克隆的技术平台。在此基础上展开了对r e s p l 8 基因剔除小鼠模型的建立。f r 克隆方法 在r e t r i e v e 及r i c o k n o c k - i n 两步同源重组中的正确率分别在5 0 左右和9 0 以上。获得的最 长司源臂的载体打靶e s 细胞后，同源重组的正确率在1 0 左右。囊胚注射后获得的嵌合 体小鼠嵌合度大于5 0 的雄鼠有8 只。获得杂合子小鼠3 6 只，未见纯合子。 结论：c o e c l l 基因打靶载体的成功构建，即为进一步深入研究该基因的功能做好基础， 也证实了e t 克隆技术在构建基因打靶载体中的高效性、实用性。e ，r 克隆作为种快速构 建基因打靶载体的方法，能很轻松的从b a c d n a 上获得2 0 k 以内的同源臂且不会引入突 变，这也为提高e s 细胞的同源重组率提供了保证。r e s p l 8 作为一种调节内分泌的蛋白， 在小鼠的生长发育中具有其特定功能，尤其是在胚胎的发育过程中也发挥重要作用，这可 能导致了纯合子致死的表型。该基因敲除的小鼠的表型分析仍在进一步研究中。 关键词：c o l e c l l 打靶载体e t 克隆r e s p l 8 同源重组 基因敲除 上海师范大学硕士学位论文 e t 克隆的应用及氘驴j 8 基因敲除小鼠模型的初步建立 a b s t r a c t o b j e c t ：t os t u d ye tc l o n et e c h n o l o g ya n di t sa p p l i c a t i o n ，a sw e l la st h ef u n c t i o no fs e c r e t e d g o n ec o l e c l l w h o f u n c t i o ni sr e m a i nu n k n o w l i w en e e dt oc o n s t r u c tag e n e - t a r g e t t i n gv e c t o r o fm i c e i nh u m a ng e n o m e ，r e s p l 8i sas e c r e t e dp r o t e i ng o n e ，w h i c hf u n c t i o ni su n k n o w ny e l t h i sg e n eh a st h es t r u c t u r eo fs i g n a lp e p t i d ea tt h en t e r m i n a l ，w i t h o u tt r a n s m e m b r a n ed o m a i n o u rs t u d ya i m e dt oi n v e s t e g a t et h ef u n c t i o no ft h i sg o n eb yo b t a i n t h er e s p l 8g e n ek n o c k o u t m i c e t h e r e b ye v a l u a t e t h ep o s s i b i l i t yo fd e v e l o p p i n gan e wm e d i c i n eb yt h eg o n e ，a n d e s t a b l i s hf o u n d a t i o nf o rs e a r c h i n gd r u gs c r e e n i n gs i t e s t h eg e n e r a lo b j e c to ft h i ss t u d yi st o d e v e l o pt h ed n ae n g i n e e r i n gp l a f f o n n - - - e tm c o m b i n e e r i n ga n de s t a b l i s hr e s p l 8g o n e k n o c k o u tm i c em o d e l ，a n dp r o v i d ef u n d a t i o nf o rt h ef u t h u ri n v e s t i g a t i o no ft h ef u n c t i o no f r e s p l 8g o n ea n dt h ep o s s i b i l i t yo fd e v e l o p m e n to fn e wd r u g s m e t h o d s ：f i r s t , w eo b t a i nt h el a r g ef r a g m e n tg e n o m i cd n af r o mb a cd n ab yp c r a m p l i f i c a t i o n ，t h e nr e p l a c e dt h ea r e ao fk n o c k o u tb ys e l e c t i o nm a r k e r - 一n g o f i n a l l yw eg o tt h e g o n et a r g e t t i n gv e c t o ro fc o l e c l l a n di nt h i ss t u d y , w eg e tt h ed e t a i l e di n f o r m a t i o no f s e q u e n c e ，t r a n s c r i p t i o na n dp r o t e i no fr e s p l 8g o n ei nm o u s eg e n o m i cb yb i o i n f o m a t i c s ，a n d o b t a i n t h e n u m b e r o f b a cc l o n e w h i c h c o n t a i n s w h o l e g e n eo f r e s p l 8 b y t h ea p p l i c a t i o no f e t r e c o m b i n a t i o ni nt h ee c o l i ，w h i c hi n c l u d et w or e c o m b i n a t i o n s - - r e t r i e v ea n dn e ek n o c k i n ，w e g o tt h r e eg o n et a r g e t i n gv e c t o r so f r e s p l 8g o n ew i t hd i f f e r e n tl e n g t ho fh o m o l o g o u sa r m s t h e n ， w ec h o s et h et a r g e t i n gv e c t o r - - p b r 3 2 2 - r e s p l 8 r - 2 0 k o , w h i c hh a v et h el o n g e s th o m o l o g ya n n ， t ot a r g e tt h ee sc e l l t h ec l o n e ss u r v i v e di nt h ec u l t u r ee sc e l lm e d i aw i t hg 4 1 8a n dg a n c i c l o v i r w e r ec o n f i r m e dt oh a v er e c o m b i n a t i o na tt h ee x p e c t e ds i t e sb yp c ra n dr e a l t i m ep c r l a t e r , w e h a v et h e p o s i t i v ec l o n e sm i e r o i n j e e t e di n t ot h eb l a s t o c y s tp r e p a r e da n dt r a n s p l a n t e dt h e b l a s t o c y s ti n t op s e u d o p r e g n a n c yf e m a l em i c e t h eo f f s p r i n g so ft h e s ep s e u d o p r e g o a n c ym i c e w o r ec h i m e r i cm i c e a n dg o tt h eh e t e r o z y g o t em i c eb yc h i m e r i cm i c ei n t e r c r o s s i n gw i t h c 5 7 b j 6 lm i c e f u r t h e rd e s c e n db r e e d i n gb ym a t i n go fh e t e r o z y g o t em i c e w e 啪g e tt h r e e t y p e so fr e s p l 8 k om i c ei n c l u d i n gh o m o z y g o t e , h e t e r o z y g o t ea n dw i l dt y p e w es t a r tt oo b s e r v e t h e p h e n o t y p oo ft h e s em i c es i n c ew eg o tt h eh e t e r o z y g o t em i c e ，i n c l u d i n gc o n d i t i o no f g e s t a t i o n ，b r e e d i n g ，s p i r i t ，a c t i o n , f o o d i n t a k i n g f i n a l l y ，a c c o r d i n gt ot h ee x p r e s s i o np a t t e mo f r e s p l 8i nd i f f e r e n tt i s s u r e s , w ef u r t h e ra n a l y s e st h ep h e n o t y p eo f r e s p l 8 k om o u s em o d e l r e s u l t ：w eo b t a i n e dg e n et a r g e t t i n gv e , c t o ro fc o l e c l lb yt h em e t h o do fe tc l o n et e c h n o l o g y s u c c e s s f u l l y , a n de s t a b l i s ht h ep l a t f o r mo fe t c l o n et e c h n o l o g y f u r t h e r m o r e ，i nt h es t u d yo fg o n e r e s p l 8 ，t h ee f f i c i e n c yo fr e t r i e v ea n dn e ek n o c k - i ni nt h ee tr e c o m b i n a t i o ni sa b o u tf i f t yp e n c e n t a n da b o v en i n e t yp e r c e n la f t e rm i c r o i n j e c t i o no fr e s p l 8g o n et a r g e t i n gv e c t o rw i t ht h el o n g e s t 上海师范大学硕士学位论文e f 克隆的应用及脚招基因敲除小鼠模型的初步建立 h o m o l o g ya r m si n t oe sc e l l s t h ee f f i c i e n c yo fh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o ni sa b o u tt e np e r c e n l a n dw eg o te i g l l tm a l em i c ew i t hm o r et h a nf i f t yp e r c e n to fg o m p h o s i sa f t e rt r a n s p l a n to ft h e b l a s t o c y s t w eo b t a i nt w e n t y - t h r e eh e t e m z y g o t em i c ef r o mt h eo f f s p r i n g so ft h ec h i m e r i cm i c e ， a n dn oh o m o z y g o t em i c ew e r ci d e n t i f i e di nt h eo f f s p r i n g so fh e t e r o z y g o t em i c ey e t c o n c l u s i o n ：t h es b o s so fc o n s t r u c t i o no fg o n et a r g e t t i n gv e c t o rn o to n l yp r o v i d et h eb a s ef o r t h el u t h e ri n v e s t i g a t i o no ft h ef u n c t i o no fc o l e c l lg o n e ，b u ta l s op r o v e dt h eh i g he f f i c i e n c ya n d p r a c t i c a l i t y o fe td o n et e c h n o l o g yi nt h e c o n s t r u c t i o no fg e n et a r g e t i n gv e c t o r e l r e c o m b i n a t i o ni sah i g he f f i c e n tm e t h o di nt h ec o u s t u c t i o no fg o n et a r g e t i n gv e c t o r , w h i c he a r l e a s i l yr e t r i e v eh o m o l o g ya r mw i t h i n2 0k bf r o mb a c d n aw i t h o u ta n ym u t a t i o n t h i sm e t h o d a l s oi n s u r et h eh i g be f f i c e n c yo fh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n a sas e c r e t e dp r o t e i n ，r e s p l 8h a s c e r t a i nf u n c t i o ni nt h eg r o w t ha n dd e v e l o p m e n to fm i c e ，e s p e c i a l l yi nt h ep r o c e s so fe m b r y o d e v e l o p m e n t ，w h i c hm a yl e a dt ot h el e t h a lo fh o m o z y g o t em i c e t h ea n a l y s e st h ep h e n o t y p eo f r e s p l 8 k om o u s em o d e li ss t i l li nt h ep r o g r e s s k e yw o r d ：c o l e c l l g o n et a r g e t i n gv e c t o re tr e c o m b i n a t i o n r e s p l 8h o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o nk n o c ko u t 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 作者签名：孑旅扛争日期：z 。方 b 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者躲橛缔师签名：i 亟日期沙t 7 一“ 上海师范大学硕士学位论文 e r 克隆的应用及r e s p l 8 基因敲除小鼠模型的建立 第一章：文献综述 一基因打靶技术综述 0 引言 利用细胞染色体d i n a 可与外源性d n a 同源序列发生同源重组的性质定向修饰、改造染色 体上某一基因的技术叫做基因打靶( g e n et a r g e t i n g ) ，它是2 0 世纪8 0 年代后半期发展起来的一 种按预期方式精细改造生物遗传信息的研究技术手段，又称为基因定点同源重组( s i t e - s p e c i f i c h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n ) t 1 l 。基因打靶最常用的策略是通过同源重组使靶定基因失活，以 研究该基因的功能，称基因敲除( g e n ek n o c k - o u t ) ；而基因敲( g e n ek n o c k - i n ) 贝j j 是通过同源重 组用一种基因替换另一种基因，以便在体内测定它们具有相同的功能，或将正常基因引入基 因组中置换突变基因以达到靶向的基因治疗的目的1 4 , s i 。根据所用的靶细胞的不同，基因打靶 分为胚胎干细胞( e s 婀靶和体细胞( s o m a t i cc e l l ) 打靶两类。e s 细胞取自小鼠早期胚胎( 囊胚期) 的内细胞团，它可在体外长期培养并保留发育成各类细胞的全能性，即只有分裂但不分化。 通过对e s 细胞进行基因打靶使得人们更为方便的将某种缺失突变引入小鼠体内，以传统的实 验手段无法比拟的速度获得各种突变体小鼠，作为进行遗传分析的材料，由此而产生了一个 活跃的研究领域，促进了分子生物学的发展，为人类疾病模型的建立和基因治疗打下了基础， 并给生命起源与进化的探讨研究工作带来了曙光。应_ l j 体细胞进行的基因打靶的优点是技术 操作比较简单，可直接对人的体细胞进行打靶，研究人类特定基因的功能悔碉】。 1 基因打靶技术的形成发展 早在2 0 t 仕纪初，m o r g e n 等人通过果蝇眼色遗传的分析揭示了同源染色体之间的d n a 重组 时产生交换的基础。早在2 0 世纪7 0 年代，基因打靶技术就在酿酒酵母( s e e r e v i s i a e ) d p 得以应用。 1 9 7 8 年，h i n n e n 等首先描述了酵母中的o 型一步插入型基因打靶。在随后的研究中人们利用酵 母的r d n a 作为同源序列构建了一系列高转化效率、高拷贝插入及高度表达的打靶载体。自从 1 9 8 1 年美国的m a r t i n 和英国的e v a n s 等分别成功地分离培养小鼠的胚胎干细胞0 三s 细胞) 之后， e s 细胞基因打靶技术已被广泛地应用于建立转基因动物之中。1 9 8 4 年b r a d l y 等成功地用显微 注射法将e s 细胞移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠，获得生殖系嵌合体，经过适当的交配，获得 了源于e s 细胞系的纯系小鼠。此实验首次证实体外培养的e s 细胞能在体内分化发育成生殖系 嵌合体并可获得小鼠纯合体子代。1 9 8 7 年，t h o m a s 等选择了x 连锁的h p r t 基因作为靶基因，首 次在e s 细胞中成功地进行了基因打靶。同年，美国犹他大学的c a p e c c h i 教授领导的研究组对 小鼠中的h p r t 基因进行定点突变，是早期基因打靶中经典的实验之一。1 9 8 8 年，m a n s o u r 等创 建了一种正、负选择法，用以筛选同源重组体与随机整合重组体。由h u a g u 和j d m a r t h 等人 在1 9 9 3 年首先提出的c r e 1 0 x p 重组系统是一种有大肠杆菌噬菌体p 1 缩编码的位点特异性的重 组系统，能够精确的移除d n a j z 的上位于两个特定重组位点之间的片断【9 ，“。2 0 世纪9 0 年代后， 不同的打靶载体策略相继出现与应用，确立了基因打靶技术在前瞻性生物技术中的地位，拓 宽了该技术的应用空间。 2 基因打靶的基本原理、操作过程 上海师范大学硕士学位论文 e t 克隆的应用及r e s p l 8 基因敲除小鼠模型的建立 2 1 基因打靶的基本原理 生物中的基因重组分为同源重组o i o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n ) 和非同源重( n - h m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o n ) 两种外源d n a 片段可与宿主基因组的相应同源区互补结合，结合区的任何部分 囊1 转纛固竞i 和薹因破除技术发震历史中的t 大侔 t a b l elm i l e s t o a e shl ki 白糖r yo ft r a a s s e a e d o i l l 矗露a n d 掌e _ et a r g e u q 1 年份事件研究人员参考文瓤 9 s 2 首次搜穆檀技术成功 1 9 8 1 转基因羲术诞生 1 9 8 1 肺腑于组蠢技术饕生 】9 8 5 同蠢熏组拄拳开持墩用 9 8 7 小飘中进行纂因麓臁 1 9 9 7 体缉鞠兜障缩革鼍唯 1 9 9 7 转蔗因克藏缩羊鼍堆 2 0 0 0 基因打靶绵羊撼肇 z 0 0 0 体绷胞克拜客错落生 2 0 0 2 蓐囡打靶茹c 猪诞肇 b r i g g sr & k i n gt c t o p s l m i t e rr db “n s t e rr ll e v s 眦s m j & t i l m 啪m h2 s m l h i 档暑lr t i d ( ；7 s m z h i e s & c * p e c c h i 8 w i l m u t l & m c w h i tj s c h n i e k ea e & a jk i n d1 2 m c c r e a t hg j & i - l o w e rj1 3 a k l r ao n i s h ；甜a 1 1 4 i i 蝴i el n 舯k s 甜， 1 5 1 6 有可能与基冈组的相应片段发生交换( 即重组) ，这类重组为同源重组；外源基因也可随机性整 合、插人到基因组中基因的同源重组是较普遍存在的生物学现象，从噬菌体、细菌到高等真 核生物都有存在1 1 1 】。虽然其分子机理尚不清楚，但细胞内确实存在一类酶系可促进重组的发 生。 援转攘 细臆技术 圈l 转基因技术、胚胎睾绸胞技术和基霸敲豫的关系 f 喙lr e l a t i o n s h i pa m o n gt l l l b 擎n e 。麟c e l lt e c h n i q u e a n d 辨雌t s r g e t i n l l 2 上海师范大学硕士学位论文 e t 克隆的应用及r e s p l 8 基因敲除小鼠模型的建立 2 2 基因打靶的基本环节 基因打靶的技术要点如下：( 1 ) 基因打靶载体的构建：把目的基因和调控序列等与内源靶 序列同源的序列都重组到带标记基因的载体上；( 2 ) 打靶载体的导入：用电穿孔和显微注射等 方法将打靶载体导入受体细胞内；( 3 ) 同源重组子的筛选：用选择性培养基筛选打靶击中的重 组阳性细胞：( 4 ) 将重组阳性细胞转入动物胚胎，产生转基因动物，并进行形态观察和分子生 物学检测f 6 j 。 2 3 载体构建及打靶策略 基因打靶载体包括载体骨架、靶基因同源序列和突变序列及选择性标记基因等非同源序列， 其中同源序列是同源重组效率的关键因素。基因打靶载体的同源重组序列一般先通过特异性 探针从基因组d n a 文库中分离得到含有目标基因( 靶基因) 的克隆后，选取适当d n a 片段而得 到。也可利_ i j p c r 对基因组目标位点的d n a 序列进行扩增得到。基因打靶载体有基因插入型 载体( g e n e i n s e r t i o n v e c t o r ) 和基因置换型载( g e n e r e p l a c e m e n t v e c t o r ) 1 2 , t 3 1 。插入型载体中与靶 基因同源的区段内含有特异的酶切位点，线性化后，同源重组导致基因组序列的重复，从而 干扰了目标基因的功能。置换型载体进行线性化的酶切位点在引导序列和筛选基因外侧，线 性化后，同源重组使染色体d n a 序列被打靶载体序列替换。大多数基因敲除突变都采用置换 型载体进行基因打靶。 由于以上两种载体的构建策略都有可能将打靶载体上阳性选择基因和外源d n a 片段同时 导入染色体，9 0 年代又推出了两种新的打靶策略，打了就走策略( h i ta n dr u ns t r a t e g y ) 和标记 置换策略( t a ga n de x c h a n g es t r a t e g y ) t ”i 。 2 3 1 构建插入型载体( 又称o 塑载体) 囊l 打辣蓑律前薹奉掏簟一 l m h l e2f 蛐c n m l 甜h t 曩i 盯f a r 轴f l 弦n n 霉w 钾o m t r 删o n 麓辨黉童简霉扭述 群囊位点饽r 黼耀序，| l 内最拇麓饿譬锥鲥蒜秘蚺 瓣 鬟篡搏序列。曩体d n 瞄曩序列与套色体奄位赢麓窀一 趺辩蠢薰塌。曩个藏体量合辩叠色体花位点上 联囊位矗甜下鲥落堆搿馋蚪赫城耕捌薅棒墓罔位 鬟穗瓣麓体毒茹嚣呈慧毒2 霪；：譬黑盖釜：登警嚣瑟盖 鞭球朝取代密色体祀扯摩列 构建的插入型载体包含靶基因的同源区，及选择标记基因( n e o ) ，并且在该同源区内有特 异酶切位点，在进行同源重组时在载体同源区内制造一个线性化缺口，同源重组的发生将导 致整个载体插入到染色体同源区内，此插入序列能够抑制正常基因的功能。然后用含有g 4 1 8 的培养基进行筛选携有n e o 基因的克隆，此方法比较简单，但是其最大缺点是不能直接区别和 筛选出外源d n a 定点整合的细胞克隆和随机插入的细胞克隆，另外两个拷贝的串联重复序列 不稳定，可能发生染色体内重组。 2 3 2 构建置换型载体( 又称为。型载体) 3 上海师范大学硕士学位论文 盯克隆的应用及r e s p l 8 基因敲除小鼠模型的建立 为了更好地筛选发生同源重组的克隆，1 9 8 8 年m a n s o u r 等人设计了正负双向选择系统 ( p o s i t i v e n e g a t i v e - s e l e c t i o n ，p n s ) ，解决了定点整合与随机整合的鉴别问题。同源重组时，只 有载体的同源区以内部分发生重组，同源区以外部分将被切除。随机整合时。是在载体的两 端将整个载体连入染色体内。q 型载体含有正负选择基因各一，正选择基因多为r i c o 基因，位 于同源区内，其在随机整合和同源重组中均可正常表达。负选择基因在靶基因同源区之外， 位于载体的3 末端，常用h s v - t k 基因，在同源重组时，t k 基因将被切除而丢失，相反在随机整 合时，所有的序列均保留( 包括c k ) 。胸苷激酶蛋白( 嘲可使无毒的丙氧鸟苷( g a n c ) 转变为毒 性核苷酸，而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合的细胞株。故同源重组时，g 4 1 8 和g a n c 都有抗性，随机整合时对g 4 1 8 有抗性，但对g a n c 敏感，细胞将被杀死，无整合的 将被g 4 1 8 杀死。用g 4 1 8 作正筛选，选出含有r t e o 基因的细胞株，再用丙氧鸟苷作负筛选淘汰 含有t k 基因的细胞株，保留未含t k 基因的同源重组细胞株。此方法是目前应用较广泛的一种策 略。 囊j ，t 鼍簟_ 蕾舟 1 袖k3 fi 科r 删- 科ho ff r e e _ - 日脚h _ 扛i f 2 3 3 打了就走策略( h i ta n d1 1 1 1 1s t r a t e g y ) 这是分别由h a s t y 等和v a l a n c i u s 等几乎同时提出的一个应用插入型载体、由两步同源重 组构成的策略。第一部重组被用于将一个经修饰而含理想突变序列( 同时含o h s v - t k ) 的 插入型载体整合到靶位点上，由g 4 1 8 筛选；第二步重组是自发进行的，它能从靶位点上再 移除一个在结构上等同于上述插入型载体的片断( 但理想突变序列有可能被保留) ，由嘌呤类 似物g a n c 抗性( o a s c ) 或1 一( 2 脱氧一2 氟- b - d 阿拉伯呋喃糖) - 5 一碘尿嘧啶抗性( f i a u ) 筛选。这两步重组过程分别被称为整合和移除。如图2 。 2 3 4 标记置换策略( t a ga n de x c h a n g es t r a t e g y ) t 1 6 1 a s k e w 等设计了一个应用取代型载体，由两步同源重组构成的策略。在这两步重组中分 别使用被称为标记和突变的两种取代型载体，在标记载体的同源序列中含有n e o h s v - t k ，在 突变载体的同源序列中含有突变序列。第一步重组被用于以n e 啪s v - t k 对靶基因进行标记， 由g 4 1 8 筛选；第二步重组被用于以含突变序列的载体序列再替换( 靶位点上的) 含 n e o f m s v - t k 的序列，由g a n c ( 或f i a u ) 筛选。这两步重组过程分别被称为标记和交换。 如图3 。 2 3 5 c r e 1 0 x p 重组系统策略 晤l o x p 系统是由h 岫g u 和j dm a r t h 等人在1 9 9 3 年首先提出的【”。它包括c r e 重组酶和 l o x p 位点两部分，前者为来自e c o l i l r 整菌体p 1 的c r e 基因编码，l o x p t 扫两个1 3 b p 的反向重复序列和 4 8 b p 的间隔区域构成的3 4 - b p 的序列 ( 5 a t a a c t r c g t a t a g c a t a c a t t a t a c 诅g ，丌a t _ 3 ) 。c r e 重组酶可介导3 4 b p 的重复 单元，切除同向重复的两个i o x p 位点间的d n a 片段和一个l o x p 位点，保留一个l o x p 位点。有两 种操作方法应用c 口叫o x p 系统：在构建打靶载体时。将标记基因放在靶基因内部，标记基因 的两侧放上相同方向排列的l o x p 序列，而后既可以在细胞水平上用c r e 重组酶表达质粒转染中 靶细胞，通过识别l “p 位点将抗性标记基因切除；或者在个体水平上将打靶杂合子小鼠与c r e 转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。已发表和正 在研究的c r e 转基因小鼠已近百种，它是将c r e 基因与各种组织( 位点、时间、发育阶段) 1 寺异性 的启动子连接构建载体，用传统的转基因技术或基因敲除技术获得相应的转基因小鼠。当c m 重组酶基因与可诱导的启动子连接时，即可通过诱导表达c r e 重组酶而将l o x p 位点问的基因切 除，从而实现特定基因在特定时问的失活。然而，现阶段可利用的组织特异性表达c r e 重组酶 的转基因小鼠还很有限，c r e - - - l o x p 系统的应用还将依赖于更多组织特异性标志基因的发现以 及人工调控基因表达系统的进一步研究。该策略如图4 。 2 3 6 条件性基因打靶( c o n d i t i o n a lg e n et a x g e t i n g ) 传统的基因打靶技术是直接灭活e s 细胞中的靶基因，如果这种基因对胚胎发育有至关重 要的作用，常常导致死亡，打靶后由e s 细胞发育成的个体，其组织器官细胞中的此基因都将 灭活。条件性基因打靶能将这种灭活面局限于特定时间和某一特定组织细胞内，这将具有很 大的应用价值。条件性基因打靶也是基于c r e l o x p 或f 1 旷f r t 的系统，它不仅能通过重组酶 将选择性标记去除，还能使打靶产生的变异在时间、空间是或时空上都具有特异性。g u 等利 用这种策略首先实现了d n a 聚合酶b 基因在t 细胞的灭活。现在进行条件性基因打靶，一般需 要制各两种转基因小鼠。一种能在不同的特定组织或时间内表达重组酶，另一种鼠系在靶基 因的两侧带有能被重组酶识别的位点，将这两种小鼠交配，便可获得所需的条件性基因打靶 小鼠。此外，将c r e 基因置于可诱导的启动子控制下时，可以通过诱导表达c r e 重组酶而将i j 0 ，【p 位点之间的基因切除，从而实现时空特异性的基因打靶。例如s t o n g e 等利用四环素基因 l e m l v 正靠 疑失 固2o l o 心打靶策略示意图( ( h - i o x pg e n et a r g c d n g ) f i g 2s k e t c hm 印o f c m - l o x pg e n et a r g e t i n g 5 上海师范大学硕士学位论文 e t 克隆的应用及r e s p l 8 基因敲除小鼠模型的建立 ( t e t r a c y c l i n e ，t e t ) 的诱导基因表达系统，首先获得了在某一组织器官特异性表达c r e 和四环素 转录激活子( t t a ) 的转基因小鼠，再将该鼠与携带打靶载体的l o x p 修饰小鼠交配，所产后代若 服用t e t ，可引起t t a 蛋白构型发生变化，从而阻断四环素反应因子f r g e ) 的转录；若在某一发 育阶段停止服用t e t ，则t t a 激活t r e ，使t r e 下游的c r e 基因在某一组织器官特异性表达，经 c r e w 导的位点发生特异性重组，从而以时空的方式进行了基因打靶。现在人们利用其他诱导 系统如基于脱皮激素( e c d y s o n c ) 或化学性诱导二聚体( c h e m i c a i n d u c e r fd i m e r i z a t i o u ，c i d s ) 的诱 导系统等也能实现对空特异性基因打靶i l ”。 2 4 基因打靶的靶细胞 基因打靶最常用的靶细胞是小鼠e s 细胞。e s 细胞一般是指从附植前胚胎内细胞团0 c m ) 或原始生殖细胞畔s ) 经体外分化抑制培养分离出来的具有全能性( t o t i p o t e n t y ) 和多能性各 种组织发育潜力，即能发育成完整动物个体的能力。多能性是指e s 细胞具有发育成多种组织 的能力，参与部分细胞的形成。加入滋养层细胞( f e e d e r c e n ) 或白血病抑制因子( l i d 可在体外 分化抑制培养e s 细胞使其保持全能性或多能性并可在体外扩增、遗传操作、选择、克隆和冻 存等。体外定向改造e s 细胞，可使基因的整合数目、位点、表达程度、插入基因的稳定性和 筛选工作等均在细胞水平上进行。用于基因打靶的e s 细胞系遗传背景一般为1 2 9 s v 、c 5 7 b l 6 j 和b a l b c 近交系小鼠。虽然已建立了大鼠、鸡、猪、灵长类和人的e s 细胞，但却只有小鼠 e s 细胞进入囊胚才能重新分化形成生殖细胞，这限制了对大型哺乳动物e s 细胞基因打靶突变。 近年来，随着核移植和体细胞克隆技术的发展，人们已能对体细胞进行基因打靶。1 9 9 7 年， m a t e y a k 利用体细胞基因打靶成功地获得了基因缺失导致的细胞表型。 2 5 打靶载体的导入 外源d n a 导人的方式主要有磷酸钙d n a j t l 沉淀法、显微注射法、电穿孔法、精子载体法 和逆转录病毒法等。目前应用最广的是显微注射法。c a p e c c h i 报道，用显微注射法导人可得到 很高的转染效率，占接受外源d n a 细胞的1 0 - - 2 0 ，但显微注射每次只能注射一个细胞，而 电穿孔法可同时使许多细胞得到转染。m a r l s o u r 等研究发现电穿孔可使1 的e s 细胞稳定转 染。1 9 9 3 年，s q u i r e s 等用精子载体法制作转基因鸡，其阳性率为1 5 - - 2 5 逆转录病毒载体法 利用某些病毒与组织细胞有特异的亲合力，可用于时空特异性基因打靶，在人类疾病的基因 治疗方面具有较大的发展潜力【”。 2 6 同源重组子的筛选 囊4 基因打靶的生娶筛选策赡 t a b l e4 s e l e e t l o ns t r s k l l yo fg e n e 细 g e t l a g 6 上海师范大学硕士学位论文 e t 克隆的应用及r e s p l 8 基因敲除小鼠模型的建立 2 6 1p c r 筛选方法 p c r 方法可以用来筛选基因打靶操作中的阳性克隆。通过在目的突变基因序列中引入特 定的p c r 引物序列，利用p c r 方法直接检测转化细胞的d n a 结构。以特定扩增d n a 片段的有 无，鉴别同源重组细胞克隆。此方法d a k i m 和s m i t h e s 首先应用于小鼠e s 细胞h p r t ( h y p o x a n t h i n e g u a n i n ep h o s p h o r y b o s y lt r a n s f e r a s e ) 基因突变 2 6 2 启动子缺失筛选 它是在基因敲除载体的目的片段中插入启动子缺失的正向选择 嚣n e o ( n e o m y c i n ) ，目的 基因片段也不包含该基因的启动序列。如果打靶载体和细胞基因组发生同源重组，则正向选 择基因能在靶位点的基因启动子的驱动之下，表达功能性产物，使阳性细胞具有( 3 4 1 8 抗性， 从而可以在药物选择培养基中得到同源重组阳性克隆。考虑到n e o 基因在转化细胞中的有效表 达，一般有两种插入方式。一种是以一致的可读框插入目的基因片段中，另一种方法是在r i c o 基因翻译起始密码子5 上游引入终止序列。前一种方式将在基因组靶位基因启动子的作用下 表达n e o 基因融合蛋白，使转化细胞具有g 4 1 8 抗性；后一种办法通过核糖体重新启动或翻译起 始表达独立的n e o 基因产物，转化细胞同样获得g 4 1 8 抗性。 启动子缺失方法可能是使用频率最高且最为可靠的一种方法。c h a r r o n 等人在小鼠e s 细胞 中对n _ 一m y c 基因进行了定点突变，在g 4 1 8 抗性细胞中得到