15__糖化血红蛋白A1c的HPLC测定方法建立与多克隆抗体的制备硕士论文

分类号 U D C R 4 4 6 1 6 16 密级坌珏 编号1 哩四S 哩增Q ! 璺 江薄大擎 硕士学位论文 M A S T E R SD I S S E R T A T I O N 论文题目糖化血红蛋白A l c 的H P L C 测定方法建立与多 学科专业 作者姓名 指导教师 答辩日期2 0 11 年0 6 月1O 日 学位论文版权使用授权书 江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国 学术期刊( 光盘版) 电子杂志社有权保留本人所送交学位论文 的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保 存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致，允许 论文被查阅和借阅，同时授权中国科学技术信息研究所将本论 文编入中国学位论文全文数据库并向社会提供查询，授权 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社将本论文编入中国优秀 博硕士学位论文全文数据库并向社会提供查询。论文的公布 ( 包括刊登) 授权江苏大学研究生处办理。 | 本学位论文属于不保密刨。 指导教师签名：旷F 嘶k 汕“年6 月L 日 人爪l 刘 r卦， 狲 名 ， 别 侣辎作月 文厶 。，、 、砑 一- 一 蛐年 学 沙 4 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导 下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内 容以外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过 的作品成果，也不包含为获得江苏大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和 集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律结果由本人承担。 参 日 翁 v 匆 寻 L 月 孙 毛 签 E 懿 年 ，叩 ) 刘 沙 论 ： 位 期 学 日 6 分类号 B 垒垒鱼：! U D C6 1 6 多扁号l Q 2 窆窆S Q 墨! 垒Q ! 窆 硕士学位论文 糖化血红蛋白A 10 的H P L C 测定方法建立与 多克隆抗体的制备 E s t a b l i s h m e n to f H i g h P r e s s u r eL i q u i dC h r o m a t o g r a p h yM e t h o d a n dP r e p a r a t i o no f P o l y c l o n a lA n t i b o d y f o rG l y c o s y t e dH e m o g l o b i nAlc 作者姓名：涂国华 指导教师：陈盛霞教授姜旭淦副教授 申请学位：硕士 学科专业：临床检验诊断学 论文提交日期：2 0 1 1 年0 4 月2 6 日 论文答辩日期：2 0 1 1 年0 6 月1 0 日 学位授予单位：江苏大学 学位授予日期：2 0 1 1 年0 6 月 答辩委员会主席：许化溪 评阅人： 8 江苏大学硕士学位论文 摘要 目的：建立糖化血红蛋白A l e 的H P L C 测定方法。从正常人红细胞 中分离和纯化A l c ，并制备糖化血红蛋白A l c 的多克隆抗体。 方法：以B i o R e x7 0 j H 离子交换树脂为填料，在H P L C 仪上采用梯度 洗脱分离测定H b A l c ，对5 0 例健康人和5 0 例糖尿病患者H b A l c 进行测定。 采集健康人全血，分离红细胞并制备溶血液，采用离子交换层析法和硼 酸琼脂糖亲和层析法，分离和纯化H b A l c 和H b A 0 。合成H b 的p 链氨基末 端六肽，经加入葡萄糖基团后，偶联到B S A 上，制备免疫抗原。将该抗 原( 1 2m g m 1 ) 与等体积福氏完全佐剂乳化后，每只小鼠0 1 2m g 抗原皮 下多点免疫B a l b c d 、鼠，于第3 周、第5 周和第7 周加强免疫并采集尾静脉 血测定效价，第8 周摘取小鼠眼球收集血液，以酶联免疫吸附实验检N d , 鼠血清H b A lc 抗体效价。 结果：H b 、H b A l c 和H b A 0 的吸收光谱一致，吸收峰均为4 1 5n m ， H P L C 离子交换层析方法能使H b A l c 与H b A l ( a + b ) 、H b A 0 清楚分离， H b A l c 峰面积或峰高与标本中H b A l c 含量成正比。5 0 例健康人H b A l c 检测 结果为3 3 6 1 ，5 0 例糖尿病患者H b A l c 检测结果为6 8 1 4 4 。健 康人红细胞溶血液，采用离子交换层析手工装柱分离提取H b A lc 和H b A O 峰值部分，H P L C 法测定纯度分别为7 9 7 8 和9 7 4 2 ，再经亲和层析纯化， H b A l c 纯度可达9 4 5 ，H b A O 纯度可达9 9 7 。纯化抗原H b A l c 可作为 E L I S A 包被抗原来检测抗体效价，纯化抗原H b A 0 可作为E L I S A 包被抗原 来检测交叉反应。合成抗原与福氏佐剂乳化后免疫B a l b C d , 鼠4 次后，抗 体效价达1 ：1 00 0 0 - - - 1 ：1 0 00 0 0 。 结论：B i o R e x7 0 H P L C 法测定糖化血红蛋白具有精密度好、准确度 高、线性范围宽等优点，可用于G H b 或H b A l c 常规方法的评价和临床标本 糖化血红蛋白A l c 的H P L C 测定方法建立与多克隆抗体制备 的分析。合成的葡萄糖基H b p 链氨基末端六肽偶联到B A S 制备免疫抗原， 免疫动物获得高效价的特异性抗体。实验结果提示，单一的离子交换方 法分离糖化血红蛋白并不理想，必须与亲和层析结合，才能得到较高纯 度H b A l c 和H b A O 。 关键词：H P L C ，糖化血红蛋白，离子交换树脂，亲和层析，抗体 江苏大学硕士学位论文 A B S T R A C T O b j e c t i v e ：T oe s t a b l i s hah i g hp r e s s u r el i q u i dc h r o m a t o g r a p h ym e t h o d f o rd e t e r m i n gg l y c o s y l a t e dh e m o g l o b i nAle T os e p a r a t ea n dp u r i f yA lef r o m t h er e db l o o dc e l l so f h e a l t h yp e o p l ea n dp r e p a r e t h ep o l y c l o n a la n t i b o d i e sf o r g l y c o s y l a t e dh e m o g l o b i nA le M e t h o d s ：T a k i n gt h eB i o R e x7 0c a t i o ni o ne x c h a n g er e s i na sf i l l e r , G H bw a ss e p a r a t e da n dd e t e r m i n e dw i t hH P L Ca n a l y z e rb yg r a d i e n te l u t i o n T h eH b A l cc o n t e n t so f5 0h e a l t h ya n d5 0d i a b e t i cp a t i e n ts a m p l e sw e r e d e t e r m i n e d C o l l e c t i n gw h o l eb l o o df r o mh e a l t h yp e o p l e ，t h er e db l o o d c e l l s w e r e s e p a r a t e d ，a n dh e m o l y s i sw a sp r e p a r e d H b A lca n dH b A 0w e r e s e p a r a t e da n dp u r i f i e db yi o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y a n db o r i ca c i d a g a r o s ea f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yr e s p e c t i v e l y T h eg l u c o s e b a s e dw a sa d d e d t oN t e r m i n a lh e x a p e p t i d eo fH bI B - c h a i nt of o r mg l y c a t e dh e x a p e p t i d e ，w h i c h c o n j u g a t e dw i t ht h eB A S t op r e p a r et h ei m m u n o g e n T h ei m m u n o g e n ( 1 2 m g m 1 ) W a se m u l s i f i e dw i t he q u a lv o l u m eo fF r e u n d Sc o m p l e t ea d j u v a n t B a l b Cm i c ew e r ei n je c t e dw i t ht h ee m u l s i f i e d - i m m u n o g e n ( e a c h0 12m g ) b y s u b c u t a e o u sm u l t i p o i n t ，a n dt h e nr e i n f o r c e di m m u n i t ya t3 ，5 ，7w e e k T h e t a i lv e i nb l o o do fm i c ew a sc o l l e c t e dt od e t e r m i n ea n t i s e r u mt i t e r A t8w e e k , m i c ee y e b a l lw a sr e m o v e d ，a n dt h eb l o o dw a sc o l l e c t e dt od e t e c ta n t i b o d y t i t e ro fH b Alcb ye n z y m e 1 i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y R e s u l t s ：T h ea b s o r p t i o ns p e c t r u m so fH b ，H b A 0a n dH b A lcw e r e c o n s i s t e n t ，a n dt h ea b s o r p t i o np e a k sw e r e4 15n m U s i n gt h eH P L Cm e t h o d ， H b A lcc o u l db ec l e a r l ys e p a r a t e df r o mH b A l ( a + b ) a n dH b A 0 ，a n dH b A lc p e a ka r e ao rp e a kh e i g h tw a sp r o p o r t i o n a lt ot h eH b A lcc o n t e n ti ns a m p l e s H b A lcc o n t e n t so f5 0h e a l t h ya n d5 0d i a b e t i cp a t i e n t sw e r e3 3 - 一6 1 a n d I I I 糖化血红蛋白A 1 c 的H P L C 测定方法建立与多克隆抗体制备 6 8 14 4 r e s p e c t i v e l y U s i n gh a n d - l o a d e dc o l u m nw i t hi o ne x c h a n g c h r o m a t o g r a p h yt os e p a r ea n dc o l l e c tt h ep e a ko fH b A lca n dH b A 0f r o m h e a l t h yr e db l o o dc e l lh e m o l y s i s ，t h ep u r i t yw e r e7 9 7 8 a n d9 7 4 2 b y H P L Cr e s p e c t i v e l y A f t e rp u r i f i e db ya f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ，t h ef i n a lp u r i t y o fH b Alca n dH b A 0w e r e9 4 5 a n d9 9 7 r e s p e c t i v e l y T h e p u r i f i e d H b Alcc a nb es e r v e da sE L I S A c o a t i n ga n t i g e nt od e t e c ta n t i b o d yt i t e r s ，a n d t h e p u r i f i e d H b A Oc a nb e u s e da sE L I S Ac o a t i n g a n t i g e nt od e t e c t c r o s s - r e a c t i o n s A f t e ra p p l y i n gt h es y n t h e t i ca n t i g e na n dF r e u n d Sa d j u v a n tt o i m m u n i z eB a l b Cm o u s ew i t h4t i m e s ，t h ea n t i b o d yt i t e r sc a nr e a c h1 ：10 0 0 0 一- 】：1 0 00 0 0 C o n c l u s i o n s ：B i o R e x7 0 - - H P L Cm e t h o dh a s a d v a n t a g e so fg o o d p r e c i s i o n ，h i g ha c c u r a c ya n dw i d el i n e a rr a n g e I tc a nb eu s e df o re v a l u a t i n g c l i n i c a lG H bo rH b Alcc o n v e n t i o n a lm e t h o d sa n d a n a l y z i n g c l i n i c a l s p e c i m e n s S y n t h e t i cg l u c o s e - b a s e dN t e r m i n a lh e x a p e p t i d eo fh e m o g l o b i n I B - c h a i nc o u p l e dt oB A Sc a np r e p a r et h ei m m u n ea n t i g e n s ，a n di m m u n e d a n i m a l sc a na c q u i r eh i g ht i t e rs p e c i f i ca n t i b o d i e s T h er e s u l t ss u g g e s tt h a tt h e s i n g l ei o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ym e t h o df o rs e p a r a t i o nt h eg l y c o s y l a t e d h e m o g l o b i n i sn o t i d e a l ，a n d i tm u s tb ec o m b i n e dw i t h a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h yt oo b t a i nah i g h e rp u r i t yo fH b A lca n dH b A 0 K e yw o r d s ：H P L C ，g l y c o s y l a t e dh e m o g l o b i n ，i o ne x c h a n g er e s i n ，a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y ，a n t i b o d y I V 江苏大学硕士学位论文 目录 第一章引言1 1 1 糖尿病的分型和诊断标准1 1 1 1 糖尿病的分型1 1 1 2 糖尿病的诊断标准2 1 2 糖化血红蛋白的概念与形成的分子基础2 1 2 1 正常血红蛋白组成3 1 2 2 糖化血红蛋白形成的分子基础3 1 3 糖化血红蛋白检测方法的研究现状与进展4 1 3 1阳离子交换层析法4 1 3 2 电泳法5 1 3 3 亲和层析法6 1 3 4 免疫法6 1 3 5 比色法6 1 4 国际相关组织推荐的参考方法7 1 5 糖化血红蛋白检测应注意的问题8 1 5 1 不稳定H b A l o 干扰及去除方法8 1 5 2 季节差异8 1 5 3 红细胞寿命的影响8 1 5 4 异常血红蛋白以及药物的影响8 1 6H b A l c 与糖尿病的诊断和控制目标9 1 7 本课题的研究意义1 0 第二章B i o - - R e x7 0 离子交换H P L C 测定糖化血红蛋白的建立与评价1 1 2 1 实验仪器和材料，：1 1 2 1 1 实验仪器1 1 2 1 2 实验耗材1 1 2 1 3 实验试剂1 2 2 1 4 试剂配制1 2 2 2 实验方法1 3 2 2 1临床标本的采集1 3 2 2 2 溶血液的制备1 3 2 2 3 血红蛋白浓度的测定1 3 V 糖化血红蛋白A 1 c 的H P L C 测定方法建立与多克隆抗体制备 2 2 4H P L C 法分离G H b 实验条件的建立1 3 2 2 5H P L C 法检测G H b 的方法学评价1 4 2 2 6 临床标本的检测1 5 2 3 结果1 5 2 3 1H b 、H b A O 和H b A l 0 的吸收光谱1 5 2 3 2 H P L C 法分离G H b 效果观察15 2 3 3 H P L C 法测定G H b 的方法学评价1 6 2 3 4 临床标本的检测结果17 2 4 讨论1 8 第三章糖化血红蛋白A l e 和H b A O 的分离与纯化1 9 3 1 实验仪器和材料1 9 3 1 1 实验仪器1 9 3 1 2 实验耗材1 9 3 1 3 实验试剂1 9 3 1 4 试剂配制2 0 3 1 5 实验标本2 1 3 2 实验方法2 1 3 2 1B i o - R e x7 0 树脂的活化与装柱2 1 3 2 2 透析袋使用前的处理2 1 3 2 3 临床标本采集及溶血液的制备2 2 3 2 4H b A l 0 和H b A O 的分离2 2 3 2 5H b A l O 和H b A O 的纯化2 2 3 2 6 S D S - P A G E 电泳2 3 3 3 结果2 3 3 3 1H b A l o 和H b A O 离子交换层析的分离2 3 3 3 2 H b A I c 和H b A O 经亲和层析分离后的纯化鉴定2 3 3 3 3S D S - P A G E 电泳2 4 3 4 讨论2 5 第四章糖化血红蛋白A 1 0 抗血清的制备2 7 4 1 实验仪器和材料2 7 4 1 1 实验仪器2 7 4 1 2 实验耗材2 7 4 1 3 实验试剂2 8 江苏大学硕士学位论文 4 1 4 试剂配制2 8 4 1 5 实验动物2 9 4 2 实验方法2 9 4 2 1 半抗原合成2 9 4 2 2 全抗原的制备3 0 4 2 3 全抗原的鉴定3 1 4 2 4H b A l o 多克隆抗体制备与鉴定3 2 4 3 结果3 2 4 3 1 合成六肽分子质量的测定3 2 4 3 2 合成六肽纯度鉴定3 3 4 3 3 糖基化六肽的分子质量和纯度测定3 4 4 3 4 糖基化六肽- B S A 层析鉴定3 4 4 3 5 糖基化六肽- B S A 吸收光谱分析3 4 4 3 6 糖基化六肽- B S A 的S D S P A G E 分析3 6 4 3 7 糖基化六肽- B S A 免疫抗血清效价检测3 7 4 4 讨论3 7 4 4 1 免疫原的选择3 8 4 4 2 蛋白质载体的选择3 8 4 4 3 偶联方法的选择3 9 4 4 4 抗血清的制备4 0 结论与展望4 1 参考文献4 3 致谢4 9 读硕期间发表论文、参加课题5 1 测定方法建立与多克隆抗体制备 V I I I 江苏大学硕士学位论文 第一章引言 糖尿病( d i a b e t e sm e l l i t u s ，D M ) 是一种常见的以血浆葡萄糖( 简称血糖) 水平 升高为特征的内分泌代谢疾病。随着生活方式的改变和社会老龄化进程的加速，我国 糖尿病的患病率正在呈快速上升趋势，成为继心脑血管疾病、肿瘤之后的另一个严重 危害人民健康的重要慢性非传染性疾病。糖尿病的病理生理机制是由于胰岛素分泌缺 陷及( 或) 胰岛素作用缺陷，以血糖升高为特征。随机血浆葡萄糖、空腹血浆葡萄糖 浓度和口服葡萄糖耐量试验被用于诊断糖尿病，糖化血红蛋白( g l y c a t e d h a e m o g l o b i n ，G H b ) 是长期控制血糖最重要的评估指标，也是临床决定是否要更换治 疗的重要依据。2 0 0 7 年中国2 型糖尿病防治指南【l 峙，指出，我国糖尿病以2 型为主， 占9 3 7 ，并将G H b 作为血糖控制状态的指标。国外临床实验室G H b 的常规测定始 于1 9 7 7 年【2 1 。 1 1 糖尿病的分型和诊断标准 1 1 1 糖尿病的分型 正常人空腹血糖浓度在3 8 9m m o l L - - - 6 1 1m m o l L 范围内，受多种因素影响，但 在神经、内分泌激素和肝脏等因素的调节下，仍然保持在相对恒定。血糖浓度高于空 腹水平上限6 1m m o l L 时，称为高血糖症( h y p e r g l y c e m i a ) 。高血糖分为生理性和病 理性，临床上常见的病理性高血糖有空腹血糖受损( i m p a i r e df a s t i n gg l u c o s e ，I F G ) 、 糖耐量减低( i m p a i r e dg l u c o s et o l e r a n c e ，I G T ) 和糖尿病( d i a b e t e sm e l l i t u s ，D M ) ， I F G 和I G T 均有发生糖尿病的倾向，是发生心血管病变的危险因素，代表了正常葡萄 糖稳态和糖尿病高血糖之间的中间代谢状态。 目前，糖尿病的分型采用1 9 9 9 年W H O 糖尿病专家委员会提出的病因学分型标 准，共分为四大类型【l 】，即：l 型糖尿病( t y p e1d i a b e t e sm e l l i t u s ) 、2 型糖尿病( t y p e 2d i a b e t e sm e l l i t u s ) 、其他特殊类型糖尿病( o t h e rs p e c i f i ct y p e so fd i a b e t e sm e l l i t u s ) 和 妊娠期糖尿病( g e s m t i o n a ld i a b e t e sm e l l i t u s ，G D M ) ，见表1 1 。1 型糖尿病患病率远 低于2 型糖尿病，据2 0 世纪8 0 年代以来W H O 报告的结果，2 型糖尿病占糖尿病患 者的9 0 左右。2 型糖尿病起病时症状比较隐蔽，很难在初发时即获确诊。近年来， 口服葡萄糖耐量试验2h 血浆葡萄糖i 1 1 1m m o l L ( 2 0 0m g d 1 ) 注：其中任何一种出现阳性结果，需用上述方法中的任意一种进行复查，予以证实，诊断才能成 立。 1 2 糖化血红蛋白的概念与形成的分子基础 2 江苏大学硕士学位论文 糖化血红蛋白是糖类物质( 主要是葡萄糖) 与红细胞内的血红蛋白 ( h a e m o g l o b i n ，H b ) 之间形成的非酶催化的稳定糖基化产物，糖化血红蛋白占总血红 蛋白的比例与血糖的浓度成正比。因红细胞的寿命为1 2 0 天，因此糖化血红蛋白的浓 度可以反映约1 2 0 天内的血糖平均水平。 1 2 1 正常血红蛋白组成 血红蛋白由4 条多肽链构成的珠蛋白和4 个血红素辅基组成，珠蛋白的肽链共有 0 【、1 3 、丫、6 、和六种，a 链由1 4 1 个氨基酸残基组成，p 、丫和6 链均由1 4 6 个氨 基酸残基组成。正常成人血红蛋白有3 种【3 】：血红蛋白A ( H b A ) ，为正常人的主 要血红蛋白，由一对Q 链和一对p 链组成( a 2 1 3 2 ) ，占血红蛋白总量的9 5 以上； 血红蛋白A 2 ( H b A 2 ) ，由一对0 L 链和一对6 链组成( a 2 8 2 ) ，约占血红蛋白总量的2 5 ；胎儿血红蛋白( H b F ) ，由一对a 链和一对丫链组成( a 2 7 2 ) ，约占血红蛋白总 量的O 5 。 1 2 2 糖化血红蛋白形成的分子基础 临床上最重要的血红蛋白糖基化修饰是由血红蛋白翻译合成后的非酶促加糖反 应形成的，即血红蛋白与碳水化合物的加成反应。血红蛋白的糖基化反应可以发生在 仅链氨基末端、p 链氨基末端以及a 、p 链赖氨酸残基的氨基上。据张新沂【4 J 报道， 在体内和体外H b 糖基化位点概率排序不同，体内为I B V a l 1 1 3 L y s - 6 6 a L y s 一6 1 I S L y s - 1 7 小，a l 一1 ，体外为I B V a l 一1 a L y s - 1 6 1 3 L y s - 6 6 1 3 L y s 一1 7 a V a l - 1 a L y s - 7 f l L y s 一1 2 0 。 早期用离子交换层析法分离H b A 时，将其分为结合糖的部分和未被糖结合部分， 含糖成分命名为H b A l ，包括H b A l a l 、H b A l a 2 、H b A l b 、H b A l c 等，未被糖结合部 分命名为H b A 0 5 1 。H b A l a l 为血红蛋白p 链与1 , 6 二磷酸果糖缩合物，H b A I a 2 为血红 蛋白1 3 链与6 磷酸葡萄糖缩合物，H 1 ) A l b 为丙酮酸与1 3 链结合物【6 】，H b A l c 为p 链 氨基末端缬氨酸与葡萄糖结合物【7 1 。国际临床化学联合会( I n t e r n a t i o n a lf e d e r a t i o no f c l i n i c a lc h e m i s t r y ，I F C C ) 把H b A l c 定义为H b A 0 一条或两条1 3 链氨基末端与葡萄糖 形成的稳定、不可逆的的四聚体加成化合物( N 1 脱氧果糖基H b ) i s ，其糖基化反 应分两步：首先葡萄糖羰基与H b 的p 链氨基末端缬氨酸残基的自由氨基缩合，生成 不稳定醛亚胺即希夫式碱( S c h i f fb a s e ，前H b A l c ) ，此反应可逆；第二步醛亚胺经不 可逆的A m a d o r i 重排形成稳定的酮胺【9 】。 3 糖化血红蛋白A l c 的H P L C 测定方法建立与多克隆抗体制备 H e - - - - - 0M C = a - R 镑铲髯耖R l I l 。 N C 0 t lH e 罐 C - - 0 lll R - n a l + H O C lH = 二哟P叫鳓P H C O IH 6 溅 A d e m a r i N 亡翎 ll r e a r r a n g e m e n t l 抟C O HH e O 雏辩e O 辩 lll e 魄O HC 如0 t 4e 嘞0 1 - I I I - N - t e r a i a t lT a l i a eg l u c o s e 图1 1 糖化血红蛋白形成反应示意图 F i g1 1 S c h e m a t i cd i a g r a mo fG H bf o r m a t i o nr e a c t i o n k e t e a m i a e 在H b A l 组成中，H b A l c 含量最多，约占8 0 t 1 0 】，其含量和平均血糖波动有直接 关系。因为葡萄糖可自由透过红细胞，H b 可在红细胞的1 2 0 天生命期内持续糖基化， 因此糖化血红蛋白形成速率与葡萄糖浓度成正比。研究表明【1 1 1 ，对血糖控制稳定的病 人，H b A l c 有5 0 在采集样本前一个月形成，2 5 在采集前2 个月形成，2 5 在采集前 3 4 个月形成。所以H b A l c 反映了过去2 3 个月血糖控制水平，H b A l c 每增加1 平均 血糖水平大约增加3 5m g d l ( 2m m o l L ) t 1 2 J 。 1 3 糖化血红蛋白检测方法的研究现状与进展 G H b 定量检测通常使用各种方法将糖化和非糖化血红蛋白分离开来，以其占总 H b 的百分比来报告结果。临床上检测方法按原理可分为三大类【1 3 】：以糖基化与非 糖基化组分电荷差异为基础的方法，如阳离子交换层析、电泳、等电聚焦等：以结 构特征为差异的方法，如亲和层析、免疫法等：依据化学反应性质不同的方法，如 硫代巴比妥酸比色法、酶法等。 1 3 1阳离子交换层析法 该类方法基于H b 各组分等电点不同，在弱酸性条件下所带电荷性质和数量存在 差异，与离子交换树脂的吸附和交换能力不同而分离。血红蛋白各组分中，H b A l a 的p I 为6 8 8 ，H b A l b 的p I 为6 9 2 ，H b A l c 的p I 为6 9 4 ，H b A O 的p I 为6 9 5 【13 1 。因此在P H 6 0 6 5 时，H b 均带正电荷，G H b 带正电荷较少，而非糖化H b 带正电荷较多。采用不同p H 和离子强度的洗脱液，可将H b A l a 、H b A l b 、H b A l c 、H b A 0 和H b A 2 分别洗脱并监测， 计算H b A l c 的含量。按分离柱的大小和检测装置可分为微柱法、大柱法和高效液相色 4 江苏大学硕士学位论文 谱法( H P L C ) 。微柱法操作简单不需要贵重仪器，已有商品化的微柱商品供应。但该 法对温度敏感，据报道【2 】同一样本在1 6 测定值为3 7 ，而在3 5 测定值为2 4 ；只 有在2 2 - - 。2 4 C 微柱法的结果与大柱法接近。大柱法操作时室温最好控制在2 5 ，在 2 3 C 精密度高( C V 2 ) ，但缓冲液的离子强度和p H 对测定结果影响很大，尤其是 离子强度的影响。以离子交换树脂为固定相的H P L C 法是测定G H b 的金标准，可实时 监测层析洗脱过程吸光度，具有快速、简便、准确等特点，并可发现异常血红蛋白， 目前已有多种专用糖化血红蛋白H P L C 仪器。常用的阳离子交换树脂有如下几种： ( 1 ) B i o R e x7 0 树脂：它是将弱的羧酸功能基团连接到丙烯酸上的非球形微粒 【1 4 】，使用不同离子强度和P H 值的磷酸盐缓冲液来洗脱分离G H b 。糖尿病控制与并发 症试验( D i a b e t e sc o n t r o la n dc o m p l i c a t i o n st r i a l ，D C C T ) 推荐的参考方法H P L C 法即 采用该树脂【1 5 1 。不少学者对该树脂分析条件进行了研究，S c h i f r e e n 报道加入一定 比例酒精可缩短柱平衡时间，层析柱使用后经氢氧化钠处理活化再生可重复使用一定 次数【l 刀。该法H b A l c 峰可能包含H b A l c 、H b F 与氨基甲酰化H b 等，所以H b F 增加 以及异常血红蛋白对测定有干扰。尿毒症病人氨基甲酰化血红蛋白增多、临床使用阿 司匹林病人乙酰化血红蛋白增多时均有不同程度干扰【1 8 】。G o o d a l l 报道1 2 该树脂分离 H b A l c 峰部分经亲和层析仅仅6 5 - 7 5 是糖基化部分，非糖基化峰部分经亲和层析 后有4 7 5 7 是糖基化部分。可见分离效果并不理想，需要对结果进行校正。 ( 2 ) 其他树脂：M i e d e m a 等报道了分离效果优于B i o R e x7 0 的几种树脂【l 9 1 。 p o l y C A T 树脂是以聚天门冬氨酸连接到二氧化硅颗粒上，含有弱羧酸功能基团，多 采用不同离子强度和p H 值的B i s T r i s 缓冲液洗脱【2 们。瑞典的标准化方案使用M o n oS 树脂，它是经过高度磺化反应形成的多聚微粒，属于强酸离子交换树脂，主要使用氯 化锂梯度洗脱【2 1 1 。日本临床化学委员会开发的日本国家标准化方案采用K 0 5 0 0 离子 交换层析树脂【2 2 1 。1 9 9 1 年N a k a t a n i 报道【2 3 1 了T S K g e lS P - N P R 离子交换剂，它是表面 为丙基修饰的无孔球形亲水性树脂。W a t e r s 公司生产P r o t e i n P a kS P 8 H Rc o l u m n 阳 离子交换柱，采用丙二酸盐缓冲液，效果优于磷酸盐缓冲液【2 4 1 。M i c r o p e a r lS F W 是 连接到球形有机甲基丙烯酸聚合物的阳离子交换树脂，含离子基团和疏水基剧”】，结 构不明。 1 3 2 电泳法 利用血红蛋白各组分等电点不同，在酸性条件下带正电荷不同，向负极泳动速度 糖化血红蛋白A l c 的H P L C 测定方法建立与多克隆抗体制备 不同而分离【2 6 1 ，有琼脂糖凝胶电泳旧、醋酸纤维素电泳、聚丙烯酰胺电泳、毛细管 电泳和等电聚焦电泳。该类方法操作时间长，可批量测定，温度、缓冲液浓度和p H 值的轻微改变对结果影响不大【2 8 1 ，但氨基甲酰化血红蛋白与H b F 影响测趔2 9 1 。近来 报道毛细管电泳【3 0 1 用于G H b 分析，在高压电场中以石英毛细管为通道，能分离检测 G H b 和血红蛋白的变异体，结果精确，快速简便。等电聚焦电泳【3 1 1 样品用量少，分 辨率高，重复性好，不受胎儿血红蛋白的影响；缺点是要求用无盐溶液，蛋白质可能 发生沉淀，需要专用仪器。 1 3 3 亲和层析法 该类方法采用交联了氨基苯硼酸的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶作为介质，利用硼酸 基团可与G H b 分子上葡萄糖的顺位二元醇可逆结合，将G H b 与非糖化血红蛋白分离， 测定总糖化血红蛋白【3 2 1 。该法对温度不敏感，操作简单快速，应用盐酸洗涤层析柱可 使之再生重复使用【3 3 】。但应注意： H b F 超过2 0 会影响分析结果【2 9 】；与硼酸基 团结合的不完全是二元醇结构，并且二元醇结构与硼酸基团也不是完全结合。比色法 分析显示【2 J ，与树脂结合的糖基化部分含有1 0 的H b A l a + b 、5 2 的H b A l c 、3 8 的 H b A 0 ，未结合的非糖化部分经则含有2 6 的H b A l a + b 、6 7 的H b A 0 、7 的H b A l c 。 1 3 4 免疫法 采用能识别糖化血红蛋白D 链氨基末端几个糖基化氨基酸的特异性抗体来进行 检测。该法快速简单，可在自动化仪器上检测，在临床已广泛使用，但需要做标准曲 线，H b F 超过2 0 会影响检测结果【2 9 1 。用不同物质标记抗体可衍生出不同方法，如 胶乳凝集免疫比浊法【3 4 1 、胶乳凝集抑制法、酶联免疫吸附法、放射免疫法、荧光免疫 法和离子捕获法【3 5 1 等。乳胶凝集比浊法使用最广泛，不受胆红素、甘油三酯、H b F 和不稳定的H b A l c 等干扰，可直接用自动生化分析仪对样品进行快速测定【3 4 】。离子 捕获法即化学发光法，利用糖基化血红蛋白与相应抗体结合后联以荧光标记物，形成 反应复合物进行测定，简便快速，且精密度高，特异性强，标本中甘油三酯、胆红素、 葡萄糖均不影响测定结果【3 5 】。 1 3 5 比色法 早期的比色法是利用1m o l L 草酸在1 0 0 5h 水解糖化血红蛋白释放出5 羟甲基 糖醛，与硫代巴比妥酸反应来进行测定。尽管H b F 对测定没有影响，N a y a k 等 3 6 1 改进 以苯酚和硫酸显色，但费时，临床现已不用。2 0 1 0 年S a h u 报道【3 7 1 在碱性条件下，糖基 6 江苏大学硕士学位论文 化蛋白可还原四唑氮蓝( N i t r ob l u et e t r a z o l i u m ，N B T ) 为紫色结晶物甲臌，在5 3 0n m 波长监测吸光度变化来测定糖化血红蛋白。近来酶法分析技术亦应用到G H b 上来，利 用蛋白酶如胰蛋白酶、谷氨酸内切酶、特异金属蛋白酶等分解糖化血红蛋白，释放果 糖基氨基酸，经果糖胺氧化酶( F r u c t o s y l a m i n eo x i d a s e ，F A O D ) 特异性催化产生过氧化 氢，H 2 0 2 再经过氧化物酶( P e r o x i d a s e ，P O D