（微生物与生化药学专业论文）富含谷胱甘肽面包酵母菌株的选育.pdf

天津科技大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得 的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包括任何其他个 人或集体已经发表或撰写的成果内容。对本文的研究做出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承 担。 作者签名：峙衲_ ， 日期：钿诺年1 月o ! ，日 专利权声明 本人郑重声明：所呈交的论文涉及的创造性发明的专利权及使用权完全归 天津科技大学所有。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：时加扩m 日期：如g 年f 月如日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权天津科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口( 请在方框内打“ ) ，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密口( 请在方框内打“4 ) 。 作者签名： 导师签名： 日期：籼扩年f 月ke t 日期：舢f 年，月c i be l 摘要 本论文对谷胱甘肽的提取方法进行了比较和优化，通过复合诱变育种筛选到了富 含谷胱甘肽的酵母菌株、并进一步对发酵培养基和发酵条件进行了优化。 通过对谷胱甘肽测定方法的重现性试验，证明此方法重现性好，准确度高，是测 定酵母中谷胱甘肽合适的测定方法。对两种谷胱甘肽提取方法的比较表明：热水抽提 法更适合提取酵母胞内谷胱甘肽。进一步对热水抽提法的提取条件进行了优化，优化 后的条件为：温度9 0 - 9 5 ，时间8 m i n ，p h 自然，提取液量4 0 m l 。 对1 5 株酵母菌的菌体干重及谷胱甘肽产量、含量进行了比较，确定了面包酵母 b y 一1 4 作为诱变出发菌株。对该菌株进行紫外诱变，以z n c l ：为筛子进行筛选，获得了 一株诱变效果较好的菌株b 一3 ，谷胱甘肽产量达n 7 8 2 3m g l ，比出发菌株提高了1 2 ； 谷胱甘肽含量达到1 4 8 2 m g g ，比出发菌株提高了1 1 。 采用均匀分析法优化了突变株b - 3 的发酵培养基。在此基础上，优化了摇瓶分批 发酵条件。与初始条件相比，在优化条件下菌株b - 3 发酵生产谷胱甘肽的产量为 9 6 7 2 m g l ，比优化前提高了2 3 6 3 ，谷胱甘肽含量为1 8 9 6 m g g ，比优化前提高了2 8 。 以提高突变株b - 3 的谷胱甘肽产量为目的，采用低能氮离子注入技术，以乙硫氨 酸抗性筛选法进行了诱变选育研究。获得了一株具有乙硫氨酸抗性的突变株b l - 2 3 ， 该菌株谷胱甘肽产量比出发菌株提高了1 7 3 ，达到1 1 3 4 6m g l ；谷胱甘肽含量达到 2 0 8 6 m g g ，比出发菌株提高了1 0 。 关键词：面包酵母；谷胱甘肽；氮离子注入技术；诱变育种 a b s t r a c t i nt h ep a p e r , t h ee f f e c t so f t w od i f f e r e n te x t r a c tm e t h o d so fg l u t a t h i o n ef r o my e a s t w e r ei n v e s t i g a t e da n de x t r a c t i o n c o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d t h eh i 曲g s hp r o d u c i n g s t r a i nw a sc o n s t r u c t e db yc o m p l e xm u t a g e n e s i sa n d o p t i m i z a t i o no fm e d i u ma n d f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta l l o x a nm e t h o di st h e s u i t a b l em e t h o di l l e x t e r m i n a t i n g i n t r a c e n e rg l u t a t h i o n eb e c a u s eo fi t sg o o dr e c u r r e n c ea n dv e r a c i t y c o m p a r e d 、j l ，i 廿lt w o e x t r a c t i o nm e t h o d s ，h o tw a t e re x t r a c t i o nm e t h o di sav a l i dm e t h o do f e x t r a c t i n gi n t r a c e l l e r g l u t a t h i o n e c a r r i e so nt h eo p t i m i z a t i o nt o i t se x t r a c t i o nc o n d i t i o n ，t h ed e t e r m i n a t i o n o p t i m i z e sa f t e rt h ee x t r a c t i o nc o n d i t i o ni s ：t h ee x t r a c t i o nt e m p e r a t u r e9 0 - - 9 5 ，e x t r a c t i o n t i m e8 m i n ，e x t r a c t i o np hn a t u r ea n de x t r a c t i o nl i q u i dv o l u m e4 0 m l b i o m a s s ，g l u t a t h i o n ey i e l da n dc o n t e n to f15s t r a i n so fy e a s tw e r ed e t e r m i n e d ；s t r a i n b y 二1 4w a ss e l e c t e da so r i g i n a ls t r a i nt ob em u t a g e n i z e d az i n cc h l o r i d e - r e s i s t a n tm u t a n t b 一3w a so b t a i n e df r o mi t sp a r e ms t r a i nb yu vt r e a t m e n t t h eg l u t a t h i o n ep r o d u c t i o no ft h e m u t a n tr e a c h e d7 8 2 3m g lb yf l a s kc u l t u r e ，w h i c hw a s1 2 h i g h e rt h a nt h ep a r e n ts t r a i n a n dt h eg l u t a t h i o n ec o n t e n ti nt h ed r i e dc e l l sr e a c h e d1 4 8 2 m g g ，w h i c hw a s11 h i g h e r t h a nt h ep a r e n ts t r a i n t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nm e d i u mi sg a i n e db yu n i f o r me x p e r i m e n td e s i g n b a s e dt h e a b o v ec o n d i t i o n s ，t h eb a t c hf l a s k - s h a k i n gi sp e r f o r m e d 埘t l lb - 3m u t a t i o n t h ey i e l do f g l u t a t h i o n eh a sr e a c h e d9 6 7 2 m g li nt h eo p t i m a lp r o c e s s ，w h i c hw a s2 3 6 3 h i g h e rt h a n t h a to fn o n o p t i m i z e dm e d i u m ，a n dt h eg l u t a t h i o n ec o m e mr e a c h e d18 9 6 m g g ，w h i c hw a s 2 8 h i g h e rt h a nt h a to fn o n - o p t i m i z e dm e d i u m t oo b t a i nh i g h - y i e l dg l u t a t h i o n es t l a i n ，l o we n e r g y 矿i o ni m p l a n t a t i o nt e c h n o l o g y a n ds c r e e n i n go fl e t h i o n i n e - r e s i s t a n t m u t a n t sa r eu s e di nt h es t u d yo nb r e e d i n gm u t a t i o n ae t h i o n i n e r e s i s t a n tm u t a n tb l 2 3w a so b t a i n e dw i t hg l u t a t h i o n ey i e l dh a v eb e e ng r e a t l y i n c r e a s e d ，i t sg l u t a t h i o n ey i e l dh a si n c r e a s e db y1 7 3 ，c a i lr e a c h11 3 4 6 m g l ，t h e g l u t a t h i o n ec o n t e n tr e a c h e d2 0 8 6 m g g ，w h i c hw a s10 h i g h e rt h a nt h ep a r e n ts t r a i n k e yw o r d s ：b a k e r sy e a s t ，g l u t a t h i o n e ，i o ni m p l a n t a t i o n ，m u t a t i o nb r e e d i n g 目录 1 前言。：l 1 1 食用酵母概述：j i 1 1 1 酵母的营养意义。l 1 1 2 食品酵母概念及产品种类1 1 1 3 食用酵母的营养价值：二2 1 1 4 国内外生产与研究概况3 1 2 谷胱甘肽概述5 1 2 1 谷胱甘肽的生理功能与营养价值。5 1 2 2 谷胱甘肽在酵母体内的代谢途径- 6 1 2 3 谷胱甘肽的应用6 1 2 4 谷胱甘肽的测定方法7 1 3 富含谷胱甘肽面包酵母菌株的选育o 7 1 3 1 面包酵母的种类_ 7 1 3 2 面包酵母的工业生产：。8 1 3 3 富含谷胱甘肽酵母菌株的选育9 1 4 本论文的立题依据与研究内容1 l 1 4 1 立题依据。：1l 1 4 2 研究内容：。1 2 2 材料与方法1 3 2 1 材料与仪器- 1 3 2 1 1 菌种。1 3 2 1 2 主要试验材料。13 2 1 3 主要仪器设备1 4 2 1 4 主要试剂1 4 2 1 5 培养基j j 一1 4 2 2 分析方法：。l5 2 2 1 细胞生物量的测定k 1 5 2 2 2 胞内谷胱甘肽含量的测定1 5 2 2 3p h 值的测定：1 6 2 3 实验方法。：1 6 2 3 1 培养方法1 6 2 3 2 谷胱甘肽的提取1 6 2 3 3 生长曲线的绘制。j 。1 6 2 3 4 紫外诱变育种及筛选方法1 7 2 3 5 离子注入诱变育种及筛选方法1 7 2 3 6 金属离子的影响均匀设计_ ：1 8 3 结果与讨论：2 0 3 1 谷胱甘肽测定方法的验证2 0 3 1 1 样品含量的测定。2 0 3 1 2 谷胱甘肽提取方法的确定2 0 3 1 3 热水提取条件的优化2 0 3 2 出发菌株的确定2 3 3 3 富含谷胱甘肽酵母菌株的紫外诱变选育2 4 3 3 1 面包酵母菌株的生长曲线j 2 4 3 3 2 紫外线照射剂量的选择：。2 5 3 3 3 初筛平板药物浓度的确定“2 6 3 3 4 抗氯化锌菌株的筛选2 6 3 4 突变株发酵条件的研究2 7 3 4 1 培养基成分的优化“j 。2 7 3 4 2 培养条件的优化j ：3 4 3 4 3 优化条件下谷胱甘肽含量产量的测定：- ：3 7 3 5 离子注入诱变选育富含谷胱甘肽酵母菌株：3 7 3 5 1 氮离子( n + ) 注入对b - 3 菌株存活率的影响3 7 3 5 2 出发菌株乙硫氨酸最小抑制浓度( m i c ) 测定3 8 3 5 3 诱变前后菌株在含致死浓度平板上的生长情况。3 8 3 5 4 抗乙硫氨酸突变株的筛选3 9 3 6 菌株诱变前后谷胱甘肽含量、产量的比较3 9 3 7 遗传稳定性实验4 0 4 结论。4 1 5 展望4 2 6 参考文献：4 3 7 论文发表情况，4 8 8 致谢。4 9 天津科技大学硕士学位论文 l前言 1 1 食用酵母概述 1 1 1 酵母的营养意义 酵母是一种营养丰富的单细胞微生物，含有较多的蛋白质( 干物质的4 0 6 0 ) ， 消化吸收率很高。酵母富含人体必需的8 种氨基酸，特别是谷物中含量较少的赖氨酸 含量较高，其所含氨基酸的组成比例接近联合国粮农组织( f a o ) 推荐的理想氨基酸组 成。酵母中b 族维生素含量高于鸡蛋、鱼、肉，还含有海藻糖、辅酶a 等特殊疗效物 质，且营养成分比较稳定。酵母目前作为营养添加剂加入到食品中，成为保健食品， 对健脑、美容、解酒、治疗糖尿病、预防肝坏疽、改善肝脏功能、延缓衰老、降血压 等均有一定效果。另外，随着经济的快速发展和人民生活水平的提高，酵母味素类产 品作为天然复合调味料将逐渐取代味精的作用而占领市场【1 1 。 1 1 2 食用酵母概念及产品种类 食用酵母( 营养酵母) 的定义是专门用于营养补充的酵母，即不需要提取，也不 需要附加物。目前，国内外出现的食用酵母产品种类比较多，总的说来有以下几种分 类方式。 ( 1 ) 按酵母菌种来源来分，有三种：啤酒酵母、产朊假丝酵母和乳酸酵母。 啤酒酵母最早把食用酵母用于治疗用途的国家是埃及、希腊，然后是整个欧 洲。在这些国家中的药典上对食用酵母都进行了描述。从二十世纪开始，啤酒发酵液 中的废酵母作为食用酵母加以开发利用，但是由于在啤酒生产中使用了啤酒花，啤酒 废酵母有苦涩味，所以作为食品利用的仅是一小部分。目前，人们已知道对啤酒酵母 进行分离、洗涤即可去除其苦涩味，而不改变其营养成分，这样食用酵母的消费量便 大大增加。用啤酒酵母生产的食用酵母中，维生素b l 的含量是最丰富的。 产朊假丝酵母主要是用造纸厂的亚硫酸纸浆废液生产的。目前只有瑞士和瑞 典两国还在生产。 乳酸酵母主要由法国的b e l 干酪厂生产，其生产商标为p r o t i b e l 。这种酵母的 特点是维生素c 的含量高。 以上三种食用酵母的生物效价差不多是相等的。 ( 2 ) 按产品形状可分为三类：片状酵母、粉末状酵母和块状酵母。 片状酵母片状酵母可直接食用，亦可添加到汤、炒菜、色拉、调味汁、酸奶 等中食用。 细或粗的粉末状酵母用法与片状酵母相同。粉末状酵母主要用于饮料，如果 汁、牛奶中。 块状酵母可用水、果汁或其它液体吞咽。这种块状酵母重2 0 0 , - 一3 0 0 m g 。 1 前言 ( 3 ) 根据营养功能和菌种培养方法的不同，又可以将其分为三种：普通食用酵 母、富集微量元素酵母和富含维生素酵母。 普通食用酵母一般是从工业发酵液中回收酵母，经过清洗脱去苦昧，用双辊 筒干燥法或喷雾干燥法工艺进行干燥，可得含水分在8 0 左右的干燥酵母粉末【2 】。 富集微量元素酵母主要是利用酵母容易富集微量元素的特性，选用含有目的 微量元素的培养基进行培养，通过酵母的代谢作用而使微量元素得到富集或有机化。 这些微量元素包括锌、铁、铬和硒等。这些酵母在很大程度上都具有特殊的药用价值， 如硒酵母以酵母作为载体，将无机硒载入酵母细胞，并使其转变成有机态硒，用来治 疗克山病和癌症效果明显。 富含维生素酵母一般都要对菌种进行精心的培育，在酵母生长的各个阶段， 通过严格控制环境以增加其特定营养成分的含量，特别是维生素的含量，从而满足人 们特定的营养需求1 3 】。 1 1 3 食用酵母的营养价值 食用酵母广泛运用于食品工业中，可改善食品的风味和性能，并有针对性地开发 新食品。一方面将食用酵母以1 - - 3 配比加入肉制品中，能提高水与脂肪的结合， 增加持水性，防止脱油；另一方面，可用来生产低热量巧克力，并在脂溶性维生素中 起抗氧化作用。还有酵母蛋白可增加谷类产品的蛋白质效价，并提高食品中的维生素 和矿物质含量。在改进食品物理性能方面，将食用酵母加入到意大利烘饼中，可提高 其延展性能。而针对酵母的食用问题，西方的一些营养学家就食用酵母对人体的作用 进行了很多次营养试验。事实证明，因为食用酵母中蛋白质、维生素以及各种通过人 体可同化的生物成分含量是非常丰富的，因此，在医疗监督下服用食用酵母总是有益 的。所以，大多数营养专家将食用酵母定义为营养酵母( n u t r i t i o n a ly e a s t ) ，以说明 食用酵母在很多方面所起到的重要作用。 ( 1 ) 在素食谱中食用酵母可提供食物中所缺少的蛋白质，在无动物蛋白质的 素食中，每天最好食用3 0 克的食用酵母。这样，食用酵母可提供1 2 - 1 5 克的蛋白质， 即相当于7 5 克肉类所提供的蛋白质。在医院里，对于患癌症的病人经常给以食用3 0 克 的食用酵母，以补充所需的蛋白质含量。 ( 2 ) 在体力消耗过度或用脑过度恢复期对于恢复阶段的人来说，食用5 - - - 1 0 克 的食用酵母可刺激机体的一般活动；对于贫血者来说，食用同样量的食用酵母可使红 血球惊人的上升；对用脑过度的人来说，服用食用酵母主要是利用酵母中丰富的氨基 酸及b 族维生素；对于体力消耗过度的人来讲，如运动员，每天食用1 0 克食用酵母， 可大大提高抗疲劳的能力。 ( 3 ) 在老年人中从5 0 岁以后，老年人其体内所需要的赖氨酸每天高于青壮年 2 3 克。在这种情况下，含有丰富赖氨酸的酵母可为每日的食物补偿所需的赖氨酸。 天津科技大学硕士学位论文 目前，食用营养酵母已作为营养添加剂广泛应用于食品工业中。可以肯定，食用 酵母的生产在今后会有很大发展，它必将成为2 1 世纪深受人们欢迎的一种营养保健 品。 1 1 4 国内外生产与研究概况 从上世纪初开始，俄罗斯、日本、匈牙利、加拿大、印度、美国、英国、德国、 罗马尼亚、意大利等国组织大量科研力量对酵母进行研究，取得了一定进展。如日本 科学家从5 0 0 种土壤混合肥料中分离出5 种微生物，可在纤维素培养基上大量繁殖。又 如美国伊利诺思研究中心( 世界上最大的酵母菌研究中心) 对1 4 2 0 0 个不同品系酵母 菌进行了研究和试验，认为酵母菌是酶及化学物质的宝库，可以被广泛运用在医药工 业中【4 】，有助于人体血凝，调节人体的代谢过程和排除人体内致险因子，并在基因移 植技术中将酵母作为一种载体用于生产药品中的激素。另外，全世界众多国家针对酵 母菌产品的研制与开发集中于酵母中的生物活性物质，如超氧化物歧化酶( s o d ) 、 核糖核酸( r n a ) 、海藻糖、谷胱甘肽( g s h ) 、1 ，6 二磷酸果糖( f d p ) 、b 族维生 素等，它们具有生物效价高、应用广泛等多种优点。近年来还有一些国家如美国、日 本、荷兰、丹麦、法国等投入大量人力、物力研制另一种酵母产品食用酵母( e d i b l e y e a s t ) ，用于婴儿食品、仿肉制品、烘焙食品、烹调、饮料及保健方面，从而将酵母 的使用范围扩大了【5 订】。 。 1 9 3 8 年德国瓦尔特霍夫在多特蒙德创立了第一个生产食用酵母的工厂，该厂采用 连续发酵法培养食用酵母，采用间断发酵法生产面包酵母。在第二次世界大战期间， 由于食品的缺乏给食用酵母带来了巨大的发展空间，那时除德国生产食用酵母外，其 他国家从工业发酵液( 啤酒，酒精发酵) 中回收酵母。从2 0 世纪5 0 年代开始，食用酵 母的生产在欧洲得到了迅猛的发展胪j 。 1 1 4 1 国内外研究概况 富集微量元素酵母是近几十年来研究的比较热门的课题，现在的市场已经出现了 诸如锌酵母、铁酵母、铬酵母、硒酵母、碘酵母、钴酵母、锗酵母等等【9 以们。 比如锗酵母的研究，美国唯瓦公司生产的锗酵母是一种新型的、易被人体新陈代 谢的产品，可作为膳食营养添加剂i 】。国内唐博恒等【1 2 】研究的锗酵母是通过逐渐加大 培养基含锗量的方法驯化选育出1 株富锗能力强的酵母，然后在含锗麦芽汁培养基中 培养获得锗酵母，菌体锗含量达至u 8 1 0 m g k g ，其有机化程度达到9 6 7 ，从而证实了 利用酵母做载体能较好地将二氧化锗转化为生物有机锗。这些产品具有吸收快、利用 率高、无毒、安全性好等特点，因而受到人们的青睐。 另外，富硒酵母的研究，由于硒元素的生物学作用而越来越引起人们的重视，硒 可以预防克山病、大骨节病等，并具有保护心脏及延缓衰老等功能。近来研究表明， 硒的摄入量和癌症发病率呈负相关性，并且硒还具有拮抗汞、镍、镉等多种有毒元素 的功能。因此近十多年来，世界上许多发达国家已把含硒制品作为多种功能的营养品 公开在市场上出售；这些含硒制品有三种：一是有机硒的酵母，二是人造含硒酵母， l 前言 三是无机硒- 亚硒酸钠片剂。比较其效果，第一种最好，这种形式的硒，生物活性高， 毒性极小，且利于人体和动物的吸收和利用【1 3 】。 锌是人体生长发育和生理代谢的重要元素，人体缺锌会引起一系列生理障碍，锌 缺乏是一种世界范围的营养缺乏病。在我国锌营养缺乏问题尤为突出。安琪酵母自行 开发研制的康普力星系列保健食品是继无机、有机补锌剂之后出现的新型生物补锌产 品，它是利用酵母作为载体，提高人体对锌元素的利用率。其生物利用度高达3 7 ， 除补锌外，还可消除单一补锌各元素间的平衡失调。陈远才等【1 4 】生产一种富集营养元 素酵母，其生产工艺具有特殊性。一种营养元素酵母生产工艺，它包括下列工艺生产 过程：菌株培养、f 瓶接种、卡氏罐接种、纯培养罐接种、种子罐接种、商品罐接种、 分离洗涤、板框压滤、自溶保温、喷雾干燥和成品包装，其特征在于：在生产富锌酵 母时，菌株培养过程采用的经过筛选的耐锌酵母菌株，种子罐接种和商品罐接种过程 分别在培养基中添加硫酸锌；或者在生产富铁酵母时，菌株培养过程采用的是经过筛 选的耐铁酵母菌株，种子罐接种和商品罐接种过程分别在培养基中添加硫酸亚铁。 富含维生素酵母是从8 0 年代开始研究，这种酵母能较好的平衡人体的维生素需求。 在一些国家，特别是发展中国家的一些地区还严重存在维生素缺乏的问题，因此结合 酵母容易富集维生素的特性，世界上一些先进国家特别是美国、中国和日本的一些科 学家在这方面进行了大量的研究和投产。在日本，用来制造富含维生素酵母最多的菌 种是啤酒酵母，根据k a w a i 、t a k a o 的一些专利文献来看，一般过程都是首先对酵母用 诱变或基因工程的方法进行处理选择有特殊营养需求的菌株，然后再通过流加培养的 方法生产【”一们。在英国和美国选择最多的菌种是假丝酵母，f o s t e r 等采用原生质体融 合的方法，选用带有h i s 和m e t 遗传标记的融合子来富集维生素【r 7 1 9 】。陈远才在生产维， 生素d 2 酵母时，菌株培养过程采用的是经过筛选的富麦角固醇酵母菌株，以制成的富 麦角固醇酵母作半成品，进行湿润与筛分处理，经过紫外线照射和低温干燥过程，获 得维生素d 2 酵母成品。其特征在于：生产维生素d 2 酵母时，将富麦角固醇酵母用水或 酒精进行湿润处理，水分或酒精含量达5 至8 0 ；采用具4 0 目筛网进行筛分处理：用、 波长为2 8 0 r i m 至3 1 0 n m 的紫外线照射3 0 分钟至9 0 分钟；在5 0 c 至6 0 。c 温度下完成低温 干燥过程【1 4 】。 1 1 4 2 食用酵母的生产方法 目前食用酵母的生产主要有两种方法。一种是从工业发酵液中回收酵母( 一般是 将啤酒酵母泥进行回收) ，经过清洗脱去苦味，用双辊筒干燥法或喷雾干燥法工艺，就 可得水分含量低的干燥酵母粉末。 另一种方法是流加培养的方法，一般需要对酵母进行精心选育后，再选用合适的 培养基进行流加。这种生产方法是在1 9 世纪末至本世纪2 0 年代大约5 0 年左右的时间内 逐步形成的。 天津科技大学硕士学位论文 1 2 谷胱甘肽概述 谷胱甘肽( g l u t a t h i o n e ，g s h ) 是由l 谷氨酸、l 半胱氨酸和甘氨酸缩合而成的一种 同时含有谷氨酰基和巯基的生物活性三肽化合物【2 0 j 。其相对分子质量为3 0 7 3 2 ，熔点 1 8 9 - 1 9 3 c ，晶体呈无色透明细长柱状，等电点为5 9 3 。它易溶于水、烯醇、液氨和二 甲基甲酰胺，但微溶于醇、醚和丙酮等。谷胱甘肽在自然界中分布很广，动物组织、 许多植物如蔬菜、豆类、谷物、薯类、菇类，以及部分微生物中均有谷胱甘肽存在， 其中酵母、小麦胚芽中含量比较丰富，其含量高达l o o l o o o m 1 0 0 9 【2 1 1 。人和动物的 心脏、肝脏、肾、血液和眼睛晶状中也含有较多的谷胱甘肽，正常人体内全血中谷胱 甘肽的正常浓度约为3 7 1 m g d l 。而植物组织中的谷胱甘肽含量则较低。 1 2 1 谷胱甘肽的生理功能与营养价值 谷胱甘肽最初是作为生物体内一种高效的抗氧化剂而被关注的。它的氧化还原电 位非常低( e o = - 2 4 0 m y ) ，可以非常容易地与二硫化物进行巯基交换，体内的蛋白质巯 基被氧化失活时，可以通过谷胱甘肽“解救”出来。还原态谷胱甘肽由谷胱甘肽还原酶 来维系，这一酶依赖n a d p h 。谷胱甘肽的s h 上的s 原子上有未共用电子，具强亲核 性，可与亲电体结合，尤其是那些对生物体而言属于外源性的化合物，所以谷胱甘肽 又被喻为生物体内的“清道夫”。 g s h 的生理功能与其分子结构有密切关系，如分子中的巯基具有中和自由基、解 毒等重要功能；铲谷氨酰胺基参与氨基酸的转运；甘氨酸和半胱氨酸残基参与胆酸的 代谢。g s h 在动植物和微生物细胞中直接或间接参与蛋白质和d n a 的合成、物质的运 输、酶的活性、新陈代谢及细胞的保护等。具体表现为：1 2 2 2 4 】 ( 1 ) 抗自由基，保护细胞：g s h 是许多酶反应的辅基，可作为抗氧化剂保护生物分 子蛋白的巯基，清除体内过多的自由基，机体代谢产生的过多自由基会损伤生物膜、 侵袭生命大分子、加快机体衰老、诱发肿瘤或动脉硬化的产生。g s h 可以通过巯基与 体内的自由基结合转化成易代谢的酸性物质，加速自由基的排泄，对细胞起到强有力 的保护作用。 ( 2 ) 解除外源有毒物质的毒性：g s h 能与进入机体的有毒化合物、重金属离子等直 接结合，并促其排出体外，起到中和解毒的作用。 ( 3 ) 促进细胞合成蛋白质：g s h 可通过丫谷氨酰基转运酶直接进入细胞内，并通过 y 谷氨酰基循环参与众多氨基酸向细胞内转运，进而促进蛋白质的合成。 ( 4 ) 参与转甲基、转丙氨基反应维持肝细胞正常功能：g s h 胄匕力i 强转甲基和转丙基 反应，促进a t p 和凝血因子的合成，并能促进氨基酸及脂肪代谢。 ( 5 ) 参与胆红素代谢：g s h 可以在谷胱甘肽硫转移酶的作用下，将未结合胆红素 载入微粒体，使其与葡萄糖醛酸结合成结合型胆红素排出体外。 ( 6 ) 参与体内三羧酸循环及糖代谢：作为机体内重要的生物活性巯基物质，谷胱甘 肽对于维持生物体内合适的氧化还原环境起着至关重要的作用。 1 前言 1 2 2 谷胱甘肽在酵母体内的代谢途径 2 5 2 7 1 谷胱甘肽在酵母菌中的合成由两步酶促反应构成：谷氨酸、半胱氨酸在y 谷氨酰 半胱氨酸合成酶( g s i - i i ) 催化下合成y 谷氨酰半胱氨酸，然后在谷胱甘肽合成酶 ( g s n - i i ) 作用下，7 一谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸合成谷胱甘肽，合成在胞内进行。 谷胱甘肽在结构上与其它多肽相比有两个特点：不象大多数多肽被多肽酶在n 端 氨基酸的0 【羧基处分解，它的n 端肽键由谷氨酸的丫羧基和半胱氨酸的氨基构成，这一 结构保证它不被细胞内一般的蛋白酶水解，只能由定位于细胞膜上的卜谷氨酰转肽酶 ( v - g t ) 来执行分解。) - g t 是惟一的谷胱甘肽降解酶。 葡萄糖经糖酵解途径变成丙酮酸，并产生能量。由丙酮酸产生的乙酰辅酶i 进入 t c a 循环，能量再次释放，t c a 循环第五步反应产生的仅戊酮二酸转变成谷氨酸，谷 氨酸和甘氨酸及半胱氨酸合成谷胱甘肽。过量的葡萄糖可导致产生的丙酮酸产生乙 醛，进而生成乙醇，抑制菌体生长。当葡萄糖量不足时，乙醇可被同化生成谷胱甘肽。 因此，控制葡萄糖的量对于高产谷胱甘肽是至关重要的。 1 2 3 谷胱甘肽的应用 ， 由于谷胱甘肽在细胞中的重要作用，它在食品、临床上的应用越来越受到人们的 重视。谷胱甘肽现在已广泛应用于食品加工的各个领域 2 8 - 3 0 ：( 1 ) 在调味食品中，谷 胱甘肽与l 一谷氨酸钠、核酸等呈味物质或它们的混合物共存时，具有很强的肉类风味； ( 2 ) 将谷胱甘肽用于肉类、鱼类和海鲜类食品中可抑制核酸分解、强化食品风味、延长 保鲜期；( 3 ) 在奶制品中添加谷胱甘肽可强化风味、提高奶酪质量，防止酪蛋白的褐变； ( 4 ) 将谷胱甘肽加入酸奶和婴儿食品中相当于维生素c 的作用起稳定作用；+ ( 5 ) 由于谷胱 甘肽具有氧化还原性，因此将谷胱甘肽加入面制品中，在起到还原作用的同时还能强 化氨基酸：( 6 ) 利用谷胱甘肽能够防止色素沉积的作用，在水果罐头中加入谷胱甘肽可 起到防止水果的褐变；( 7 ) 将它制成不同类型的功能性食品，如将其添加到饮料、嗜好 品( 糖果) 、乳制品、面类制品和发酵食品中作为保健、营养强化剂，还可应用于孕妇、 乳幼儿、病人的口服保健品，在日本，谷胱甘肽被认为是2 1 世纪最有希望的保健食品 专一【3 l 】 一 谷胱甘肽在临床上也有着广泛的应用【3 2 3 3 】：( 1 ) 对细胞有保护作用，可防止红细胞 溶血，从而减少高铁血红蛋白的损失；( 2 ) 抑制脂肪肝的形成，改善中毒性肝炎和感染 性肝炎的症状；( 3 ) 对丙烯腈、氟化物、一氧化碳、有机溶剂、重金属等中毒具有解毒 作用；( 4 ) 对缺氧血症的不适、恶心、呕吐、搔痒等症状以及由于肝脏疾病引起的其他 症状具有缓解作用；( 5 ) 维持乙酰胆碱、胆碱脂酶的平衡，起到抗过敏作用；( 6 ) 对放射 线治疗、放射性药物、肿瘤药物引起的白血球减少以及由于放射线引起的骨髓组织发 炎等能起到保护作用；( 7 ) 可以抑制进行性白内障及控制角膜和视网膜疾病的发展；( 8 ) 可以防止皮肤色素沉积，改善皮肤光泽：( 9 ) 最近发现谷胱甘肽可能具有抗爱滋病毒的 功效。 天津科技大学硕士学位论文 1 2 4 谷胱甘肽的测定方法 谷胱甘肽的测定方法主要有碘量法、纸层析法、差热分析法、高效液相色谱法、 紫外吸收法和荧光法等。 碘量法【3 4 1 ：具有分析方便，快速等优点，但由于它的终点判定误差较大，导致 分析结果不准确，因此该法的应用受到了一定的限制。 纸层析法【3 副：纸层析法可对谷胱甘肽进行定性和定量分析。 差热分析法1 3 q ：热分析图早已被地质学家和冶金学家作为鉴定物质的依据之 一，其具体步骤是：( 1 ) 标准谷胱甘肽溶液热分析图的制作。( 2 ) 样品中谷胱甘肽的含量 测定，测定样品各组分的转变温度和峰值，与标准谷胱甘肽热分析图谱进行对照，即 可得出样品中谷胱甘肽的含量。 高效液相色谱法：利用高效液相色谱法测定谷胱甘肽的报道很多，程敬君【3 7 】等 进行了一定的研究，发现该法测定谷胱甘肽的效果较好，回收率达8 7 3 。b r e n t 3 8 】等 利用邻苯二甲醛和谷胱甘肽络合生成一种高荧光物质的原理，用荧光检测器进行检 测，发现谷胱甘肽的回收率可达9 9 2 。王荣民【3 6 】等采用衍生化法用h p l c 测定谷胱 甘肽的衍生物，取得了较好的效果。 紫外吸收法【3 9 】：该方法需使用紫外扫描分光光度计来进行测定。例如，岛津 u v 2 4 0 紫外扫描分光仪。所需试剂为a l l o x a n 试剂( o 2 4 m o l l ) ，磷酸缓冲液( p h 7 6 ) 和甘氨酸( o i m o l l ) 以及4 0 的乙醇溶液。具体操作为：取g s h 标准样品，用4 0 的乙醇 溶液溶解并配成不同浓度的g s h 标准溶液，用a l l o x a n 试剂( o 2 4 m o l l ) 在上述磷酸 缓冲液中及甘氨酸存在下反应2 0 分钟使g s h 衍生化，此时在3 0 5 r i m 波长处测其吸光度 吸收峰，求得标准工作曲线，然后取g s h 样品液，用测定标准工作曲线的同样方法测 其吸光度，最后对照标准工作曲线就可求出样品中g s h 的含量。紫外分析法具有简单、 快速、准确、稳定等优点，因此国内外大多数学者采用该法测定谷胱甘肽的含量。本 文也采用此方法进行谷胱甘肽含量的测定。 荧光法：曹新志【4 1 】等利用荧光法测定黄瓜及小麦中谷胱甘肽的含量，发现此测 定方法在0 u g m l - 4 0 u g m l 的浓度范围内具有良好的线性关系，且操作方便、灵敏度高、 重现性好，其测定回收率可达9 9 7 3 。 1 3 富含谷胱甘肽面包酵母菌株的选育 1 3 1 面包酵母的种类 面包酵母( b a k e r sy e a s t ，学名s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 在分类学上属于酿酒酵 母。面包酵母在工业产品中包括新鲜酵母( 又称为压榨酵母) 、乳浆状酵母和活性干 酵母。压榨( 新鲜) 酵母( c o m p r e s s e d f r e s hy e a s t ) 是活性微生物，发酵力强，使用方 便，但必须保存在2 - - 一4 的低温下才能防止它在贮存期间发生发酵现象。在温热的环 境下会诱发酶活化作用，把贮存于酵母内的养分消耗掉，使其活性丧失。乳浆状酵母 ( c r e m t ly e a s t ) 是一种液态面包酵母，适合大规模自动化的焙烤加工厂使用，它是一 种天然产品，可存放于存罐里，使用时自动定量输送到混合机中。和压榨酵母一样， l 前言 必须存放在2 - - 4 的卫生环境下。活性干酵母( a d y ) 毋须冷藏，运送方便，在2 0 干燥环境下其保质期可达2 年。使用前要经活化处理，即与含适量糖和酵母营养剂的 温水( 3 0 。c ) 混合均匀，活性较鲜酵母差【4 2 】。目前，酵母工业的发展已使活性干酵母 控制了销售市场，广泛地应用于食品行业中【4 3 1 。 1 3 2 面包酵母的工业生产附啪】 现今的面包酵母生产技术大约就是在1 9 世纪末至2 0 世纪2 0 年代的大约5 0 年左右 的时间内形成的。包括有三个方面：通气培养；流加培养；糖蜜代替粮食作为原料。 通风培养：1 9 世纪7 0 年代，巴斯德发现在有氧条件下，酵母繁殖速度加快，而 酒精产率下降，这就是巴斯德效应，为通风培养生产酵母奠定了理论基础。1 8 7 7 年， 哥本哈根的e u s e b i u sb r u u n 提出了通风培养生产酵母的方法，1 8 6 6 年在德国柏林建立 了工厂。采用连续通风培养，降低了培养基中的酒精含量，最大限度地获得酵母产量， 从而使酵母工业与酒精和啤酒工业分离。 流加培养：由于酵母受到的克雷布特效应，若培养基中糖浓度较高，抑制了酵 母的呼吸作用，即使加大通风也不会提高酵母的收得率。因此，在1 9 1 5 年至1 9 2 0 年， 丹麦和德国的科学家提出了连续补料的方法，即按照酵母具体的消耗糖量，在发酵过 程中不断地补加糖液来控制培养基中糖浓度，使之维持在较低的范围内。采用通风培 养和流加培养大大提高酵母对糖的收得率，获得了较高的酵母产量。 糖蜜作为培养基：f 1 2 0 世纪2 0 年代开始，糖蜜代替玉米、麦芽等粮食作为了酵 母生产的主要原料。糖蜜是制糖工业中的废品，此法进一步降低了生产成本，简化了 生产工艺，取消了以粮食为原料生产工艺中复杂的原料处理过程。此外，糖蜜中还含 有多种维生素，如生物素、泛酸盐、肌醇、硫胺素等，营养要比粮食为原料水解的糖 丰富，有利于酵母生长繁殖和酵母质量的提高。 生产的新鲜酵母含有的水分大，在贮存期间易导致活力降低，所以制作成活性干 酵母使用。它的特点：可在常温下长期贮存而不失去活性；将其在一定条件下加 复水活化后，即恢复成自然状态并具有正常酵母活性。原始的活性干酵母起源于1 9 世 纪上半世纪，随着干燥技术的完善，添加剂或保护剂的使用，使得活性干酵母技术有 了重大的发展，活性干酵母的种类也呈现多样化，以适应不同的产品需求。 将培养成熟的酵母从发酵醪中分离出来，用水洗涤，将细胞表面及酵母乳液中残 存的糖蜜色素、营养物质、消泡剂和杂菌洗去，获得酵母乳。将酵母乳冷却到4 c 左 右后进行过滤或暂时存放在4 c 酵母乳贮藏桶中。过滤的目的，对于鲜酵母产品，使 酵母乳不再具有流动性，便于成型、包装和运输；对于活性干酵母而言，便于造粒成 型，降低干燥能耗，缩短干燥时间，有利于提高产品质量。之后，在干燥器内干燥成 产品，其间加入一定量的保护剂。加入保护剂，可在细胞周围形成一层保护膜，提高 渗透压，避免细胞在干燥过程中受到损伤，使酵母产品具有较高的稳定性，减少活性 的丧失洲。 天津科技大学硕