毕业设计（论文）-安全高效絮凝剂的开发及应用研究.doc

密级：安全高效絮凝剂的开发及应用研究Study on development and application of safe and high-efficient bioflocculant 学 院：理学院专 业 班 级：环境工程0801学 号：080704015学 生 姓 名：韩 洋指 导 教 师：崔 丽 （讲师）2012年 06 月 摘 要由微生物产生具有絮凝活性的高分子絮凝剂称为高分子絮凝剂，其具有对环境和人体无害、易于生物降解等优点，因此在废水处理中日益受到关注和重视。目前我国微生物絮凝剂的发展仍停留在实验室阶段尚未投入到工业生产，其主要原因在于产絮凝剂效率较低、成本较高。本文首先研究能利用常用营养物质配制的培养基而产生絮凝物质微生物的筛选、培养及优化。本实验首先以花土和树下土为菌种来源，取浸出液经稀释与平面接种，选取表面光滑、粘稠的菌落转接到斜面和液体培养基中，液体培养基经恒温摇床培养后得发酵液，测定发酵液的絮凝和能力，选取表现出絮凝性能的菌株作为粗选菌种。粗选菌种经多次转接、测定，得到絮凝能力较强的优选菌种MBF-3。得到优选菌种后，本文探讨的主要问题及结论如下：首先，通过正交试验方法确定了最佳C/N为15、初始pH值为7.5、温度为30，得出了这三个基础的培养条件对絮凝菌培养的影响大小及规律，从而奠定了培养条件选择基础。其次，通过离心分离的方法得到菌体和上清液，再分别测定菌体悬浊液和上清液的絮凝率从而确定了絮凝活性部分不是菌体而是絮凝菌分泌的胞外物质。第三，通过多组实验确定了投加量、pH值、温度、金属离子对絮凝效果的影响及规律。得出每100ml高岭土悬浊液发酵液和上清液最佳投加量分别为5ml、6ml，最佳絮凝pH值为56，最佳絮凝温度为40，证明了对絮凝有促进的离子有Ca2+、 Al3+ 、Fe3+。关键词：微生物絮凝剂；菌株筛选；最佳条件；絮凝效果影响IIAbstractA kind of macromolecular flocculant secreted by microorganisms is called bioflocculant. These kinds of microbial polymers are expected to be useful in flocculating wastewater due to their bio-degradability and the harmlessness of their degradation products toward humans and environment. However, the bioflocculants identified so far in laboratories have not yet practically applied in industry because of the high cost and low productivity. In this study the screening, optimization, and prioritization of a new flocculant-producting strain were carried out. These strains were derived from the lixivium of soil which extracted below flowers and trees in the study. Diluted lixiviums were vaccinated on plating mediums. Smooth and ropy bacterial colonies were screened and vaccinated to fluid nutrient mediums. The strains which turned out to be with flocculation efficiency by flocculation test were chosen as mass-election strains. A plant of optimized strain,MBF-3 with the highest flocculation efficiency was chosen out by a mass of vaccinating and test. We have carried out three aspects of study on the optimized strain. One of them is choosing the optimum situation including C/N which was 15, original pH which was 7.5, and temperature which was 30 and finding the level and law of their effects. Another aspect is ensuring effective part between bacterium and secretion by separation and test of bacterium and secretion with centrifuge. The last aspect is influencing factors of flocculation efficiency. We ensured the influence and law of dosage which is 5ml and 6ml, temperature which is 40, pH which is 56, and helpful metal ion which are Ca2+、 Al3+ 、Fe3+.Keywords: bioflocculant; strain screening; optimum situation; influencing factors of flocculation目 录摘 要IAbstractII第1章 绪论21.1 絮凝剂简介21.2 微生物絮凝剂简介21.2.1 微生物絮凝剂的发展21.2.2 微生物絮凝剂的絮凝机理21.2.3 微生物絮凝剂的应用21.3 研究内容2第2章 实验材料和方法22.1 实验基本条件21.2.1 实验菌种21.2.2 实验药品及仪器设备21.2.3 基本操作22.2 实验方法22.2.1 菌种的粗选和优选22.2.2 优选菌种培养条件的优化22.2.3 絮凝特性及絮凝效果影响因素研究22.2.4 絮凝剂对含藻污水的处理效果研究2第3章 微生物絮凝剂的开发23.1 MBF菌种的粗选23.1.1 菌种的接种和培养23.1.2 絮凝菌产絮凝剂能力的测定23.2 MBF菌种的优选23.3 MBF-3菌株培养条件优化23.4 MBF-3发酵液絮凝活性部分研究2第4章 微生物絮凝剂的应用研究24.1 微生物絮凝剂絮凝效果的影响因素研究24.1.1 投加量对絮凝效果的影响24.1.2 pH值对絮凝效果的影响研究24.1.3 絮凝剂对不同浊度的适用研究24.1.4 温度对絮凝效果的影响研究24.1.5 金属离子对絮凝效果的影响研究24.2 微生物絮凝剂处理含藻污水2第5章 结论25.1 微生物絮凝剂开发25.2 絮凝剂应用研究2参 考 文 献2致 谢2沈阳工业大学本科生毕业设计（论文)第1章 绪论1.1 絮凝剂简介简单而言，凡是能够使水溶液中的溶质、胶体或者悬浮物颗粒产生絮状物沉淀的物质都叫做絮凝剂 （或统称混凝剂）。目前，对于混凝沉淀过程的药剂的定义一般有两种。一是根据水体中胶体颗粒脱稳聚集过程的不同阶段的作用机理，将主要通过表面电荷中和或双电层压缩而使胶体颗粒脱稳的药剂称作凝聚剂，而将使在脱稳后的胶体颗粒支架产生架桥作用以及在沉降过程中产生卷扫作用药剂统称为絮凝剂。二是行业习惯统称，如在工业用水处理的混凝沉淀过程中，常将所用的药剂统称为絮凝剂；而在废水处理过程中，则将起凝聚作用的药剂统称混凝剂 （或凝聚剂），凝聚剂或助凝剂特指主要起架桥作用的有机高分子化合物1。在絮凝处理过程中，絮凝剂的种类、性质、品种的好坏是关系到絮凝处理效果的关键因素，也是絮凝技术的关键部分和核心基础。开发优质、高效的絮凝剂一直是絮凝技术发展的重要组成部分。目前应用的絮凝剂主要有两类：（1） 一类是无机絮凝剂，主要包括无机盐类以及无机高分子聚合物，如硫酸亚铁、硫酸铁、氯化铁、硫酸铝、聚合氯化铝、聚合氯化铁、聚合硫酸铝、聚合硫酸铁、聚合硫酸氯化铁及聚合氯化铝铁等。其中聚合氯化铝和聚合硫酸铁应用最为广泛。无机絮凝剂的特点是运行可靠，但耗费大、有一定的危害，在消除一种污染物的同时又带来另一种污染物等问题。有资料2表明：水中铝含量高于0.20.5/L即可使鲑鱼致死；土壤中铝含量过高会影响植物生长，甚至身亡，并随着农作物进入食物链，影响人类身体健康，导致铝性脑病、铝性骨病和铝性贫血病等，其中老年痴呆就是铝性脑病的一种。铁盐对金属有腐蚀作用，可造成处理水中带有颜色，高浓度的铁对人类健康和生态环境造成不利影响。（2）另一类是有机高分子絮凝剂。它又分为人工合成的和天然高分子的两种。合成的有机高分子絮凝剂尤其是聚丙烯酰胺，因其具有高絮凝性和低生产成本而得到广泛的利用。这类絮凝剂投加少，絮凝速度快，适应范围广，但在水中残留的单体不易降解，具有强烈的神经毒性，而且还有很强的“三致”效应，对环境和人类健康不利，存在二次污染。天然高分子絮凝剂作为一种水处理剂，是利用蛋白质、多聚糖、木质素、几丁质等天然有机高分子物质，通过化学改性制成。由于它具有无毒、能安全降解的特点，所以引起科研机构的重视。但絮凝活性低，单独用于絮凝净化效果不理想，因此，急需开发无毒、无二次污染、处理效果高的絮凝剂。微生物絮凝剂是利用生物技术，通过微生物发酵、提纯、精制而成的一种具有可生物降解性和安全性的新型、高效、无毒的水处理药剂，是天然高分子絮凝剂的重要种类3，4。其独特的生物可降解性质源于微生物絮凝剂特有的机能性蛋白质及机能性多糖类物质，是无机和有机合成高分子絮凝剂所不具备的。1.2 微生物絮凝剂简介1.2.1 微生物絮凝剂的发展自美国科学家Butterfield从活性污泥中筛选到絮凝剂产生菌以来，对微生物絮凝剂的研究逐步深入。特别是20世纪70年代以来，美国、日本等许多国家对微生物絮凝剂进行了大量的研究，取得了初步的研究成果。1976年，J.Nakamura等从霉菌，细菌，放线菌，酵母菌等菌种中筛选出19种具有絮凝能力的微生物，其中以酱油曲霉AJ7002产生的絮凝剂效果最好。1985年，H.Takagi等研究了拟青霉属微生物产生的絮凝剂PF101，它对枯草杆菌，大肠杆菌，啤酒酵母，血红细胞，活性污泥，纤维素粉，活性炭，硅藻土，氧化铝等有良好絮凝效果。1986年，R.Kurane等利用红平红球菌研制出微生物絮凝剂NOC1，它的絮凝和脱色效果很好，被认为是当时发现的最好的微生物絮凝剂，现已商品化。美国也研制出一些高絮凝性菌株，与其他微生物一起制成生物活性液，可快速消除下水道淤积，水体富营养化和污泥膨胀等。至今发现的具有絮凝性的微生物种类有霉菌，细菌，放线菌和酵母菌5。目前国内外微生物絮凝剂研究主要包括：絮凝微生物的来源和筛选，微生物絮凝剂的产生条件，微生物絮凝剂絮凝性能试验研究，微生物絮凝剂的成分结构分析和生物学研究。1.2.2 微生物絮凝剂的絮凝机理（1）电性中和作用机理6微生物絮凝剂是带有电荷的生物大分子，借助离子键和氢键，与水中带相反电荷的胶粒发生作用，中和其表面上的部分电荷，使胶粒脱稳，从而胶粒之间、胶粒与絮凝剂之间易发生相互碰撞，通过分子间作用力凝聚而沉淀。加入金属离子或调节pH值可显著增强影响某些微生物絮凝剂的絮凝效果，主要就是通过影响其带电性而起到助凝作用的。（2）桥联作用机理微生物絮凝剂的大分子结构可以结合多个悬浮微颗粒物质，即在颗粒之间起到“桥梁”作用，把这些颗粒联结在一起，从而使之絮凝成较大颗粒，易于沉降下来。一般认为，高分子量微生物絮凝剂与低分子量相比，在絮凝过程中有更多的吸附点和更强的桥联作用，因此有更高的絮凝活性。有线性结构的大分子絮凝剂的絮凝效果较好，如果分子结构是交联或支链结构，其絮凝效果就差。另外，絮凝剂分子中的一些特殊基团，由于在絮凝剂分子中的特殊作用，对絮凝活性的影响也很大，如某些絮凝剂分子结构中的氨基，被氧化释放出氨后絮凝剂的活性就消失。（3）化学反应作用机理该理论认为微生物絮凝剂的絮凝活性大部分依赖于生物大分子中某些活性基团，与被絮凝物质相应的基团发生了化学作用，生成较大分子而沉淀下来。通过对生物大分子改性和处理，使其添加或丧失某些活性基团，那么絮凝活性就大受影响。除了上述三种被广泛接受的机理外，还有其他机理相继提出，但他们无法对一些现象进行解释，所以还有待于继续研究。1.2.3 微生物絮凝剂的应用微生物絮凝剂作为一类新型絮凝剂，其广谱的絮凝活性、可生物降解性及应用安全性显示了它在水处理、矿物分离、食品加工和发酵工业等方面的应用前景。但这些絮凝性研究只处于实验室阶段，还未投入到实际生产中。即使如此，已有的研究表明，微生物絮凝剂确有很好的絮凝性，适用方面广，处理对象多，包括活性污泥、粉煤灰、木炭、墨水、泥水、饮用水、河底沉积物、高岭土、粪尿水、印染废水、果汁、细菌、酵母菌以及各种生产废水等。微生物絮凝剂对悬浊液（如果汁、血细胞悬液、菌悬液、泥水浆等）絮凝速度快、用量少、效果好，对胶体（如碳素墨水）、溶液（如多种染液）均有较好的絮凝效果，对富含有机质的屠宰废水河血水也有较好的絮凝、去色效果。例如6，（1）废水悬浮颗粒的去除在含有大量极细微悬浮固体颗粒的焦化废水中加入Alcaligenes latus（MF6）微生物培养物，并加入钙离子做助凝剂，然后在废水中形成肉眼可见的絮凝体，这些絮凝体可得到有效的沉淀去除，沉降后上清夜的SS为80/l,去除率为78。而用铁絮凝剂的效果并不好，SS的去除率仅为477。（2）废水脱色通常用现在常用的絮凝剂难以去除有色废水中的有色物质，而用上述培养物处理某造纸厂的有色废水时（在80ml废水中加入2ml Alcaligenes latus培养物和1.5ml 1的聚氨基葡萄糖），即可在废水中形成肉眼可见的絮凝物质浮于水上，脱色率为94.6，下层清水的透光率几乎与自来水相近7。（3）乳化液的油水分离用Alcaligenes latus培养物可以很容易地将棕榈酸从其乳化液中分离出来，向100ml含0.25的乳化液中加入10ml Alcaligenes latus培养物和1ml聚氨基葡萄糖后，在细小均匀的乳化液中即可形成可见的油滴，这些油滴浮于废水表面，有明显的分层，下层清液的COD值从原来的450mg/L降为235mg/L，去除率为48，无论是无机絮凝剂还是人工合成高分子絮凝剂都未有过这样好的絮凝效果。这种微生物絮凝剂不仅有望用于乳化液的油水分离，也可为海上溢油的控制提供一种安全有效的絮凝剂。（4）污泥沉降性能的改善活性污泥处理系统的效率常因污泥的沉降性能变差而降低。从微生物中分离出的絮凝剂能有效地改善污泥的沉降性，防止污泥解絮，提高整个处理系统的效率。将从Rhodococcus erythropolis中分离的絮凝剂加入已发生膨胀的活性污泥中，可以使污泥的SVI（污泥体积指数）从290下降到50。在活性污泥中加入絮凝微生物可以促进污泥的沉降，但不会降低有机物的去除率。（5）畜牧场废水的处理畜牧场废水中含有较高浓度的总有机碳（TOC）和总氨（TN），试验证明，微生物絮凝剂可有效地去除畜牧废水中的TOC和TN。在80ml畜牧废水中加入100mlCa2溶液（1%）和5mlR.erythropolis的培养物，可以使TOC从原来的1420mg/L下降到425mg/L，使TN从420 mg/L降为215 mg/L，去除率分别为70和40。同时废水的OD560值从8.6降为0.02，出水基本是无色澄清的。（6）污泥脱水用R.erythropolis的培养物2ml和5ml的含量为1的Ca2溶液，处理95ml浓缩后的污泥，可使污泥体积在20min内浓缩为原来的92，上清液的OD560值小于0.0510。（7）瓦厂废水瓦厂废水主要有坯体（含黏土）和釉药废水（黏土和釉药）两种，添加R.erythropolis产生的絮凝剂5min，坯体废水的OD560从1.40降为0.043，釉药废水的OD560从17.20降为0.35，处理后的上清液几乎是透明的。（8）其他方面的应用已有的研究表明，微生物絮凝剂可以包括细菌、真菌、放线以及藻类在内的大多数产生絮凝作用的微生物。因此，微生物絮凝剂不仅可以应用于废水处理，更可以成为发酵工业和食品工业中安全有效的絮凝剂，为取代传统工艺中离心和过滤分离细胞的方法提供了可能。将R.erythropolis的絮凝剂用于回收发酵废液中有用的产品，使用时添加金属阳离子或保持在酸性条件下（pH值为3.9）。使用絮凝剂后，出水的COD为15600mg/L，SS为114mg/L；而不使用絮凝剂时，出水中的COD为17800mg/L，SS为5190mg/L。由此可见，使用絮凝剂可以大幅度降低出水的SS值，并回收有益的物质。此外，在其他领域部分微生物絮凝剂具有高选择性，可用于分离矿物。目前可利用微生物絮凝剂处理高岭土、赤铁矿、膨闰土等多种矿物8，9。而其他絮凝剂由于各自的特点而在这些领域的应用受限。微生物絮凝剂（microbial flocculant,简称MBF）,是指由微生物的自身产生的、具有高效絮凝作用的天然高分子物质。具有分泌絮凝剂能力的微生物称为絮凝剂产生菌。最早的絮凝剂产生菌是1935年Butterfield从活性污泥中分离出来的,该菌的培养液具有一定的絮凝力。1971年,Zajic和Knetting从煤油中分离出了一株棒状杆菌,该菌可分泌对泥水具有絮凝作有用的多聚物。1975年,Junji Nakamura等从霉菌、细菌、放线菌和酵母菌等菌株中,最终分离筛出19株产絮凝剂的微生物,包括霉菌8株、细菌5株、放线菌5株和酵母菌1株,其中以酱油曲霉（As-pergillus sojae）产生的絮凝剂AJ7002效果最好。20世纪80年代,日本的仓根隆一郎等人从日本的旱田土壤中分离筛选到红平红球菌（Rodococ-cus erythropolis）,并将菌株产生的微生物絮凝剂命名为NOC_1。1985年,Hironki Takagi等对拟青霉属菌（Paecilomycessp.I_1）产生的絮凝剂进行的试验表明,它对各种微生物细胞均有絮凝沉淀作用,并且可以去除溶液中几乎所有的悬浮颗粒,包括有机物和无机物,如血红细胞、碳粉、纤维素和硅藻土等。由于微生物絮凝剂的非特异性的絮凝和沉淀性能,它在废水处理方面的巨大潜能已引起人们的普遍重视。1986年PyichiroKurane等人将NOC_1用于畜产废水、膨胀污泥和砖场生产废水等的处理,均取得了很好的效果,被认为是目前发现的最好的微生物絮凝剂。1991年,Kurane从土壤中分离出一株革兰氏阴性菌-产碱杆菌AL_201,该菌在含有蔗糖的培养基中生长并分泌絮凝剂。我国对于微生物絮凝剂的研究起步较晚。国内较早开展微生物絮凝剂研究的单位有中国。科学院成都生物研究所、大连理工大学、南开大学和江苏微生物研究所等,他们是在1993年才开始这方面的研究。目前,微生物絮凝剂的研究主要停留在实验室研究阶段,还未见大规模的工业应用。1.3 研究内容（1）产絮凝剂微生物的粗选和优选；（2）微生物絮凝剂培养条件的优化； （3）微生物絮凝剂絮凝特性的研究及絮凝效果影响因素；（4）微生物絮凝剂处理实际废水，考查其实用性。第2章 实验材料和方法2.1 实验基本条件1.2.1 实验菌种本文中菌种来源于花土和树下土，经稀释、接种、培养、絮凝性测定择优选取而得。1.2.2 实验药品及仪器设备本实验用于微生物培养、产絮凝剂性能测定及其他相关实验所采用的实验药品如表2-1所示。表2-1 实验所用药品药品名称类别生产厂家高岭土牛肉膏酵母膏蛋白胨琼脂氯化钠葡萄糖尿素蔗糖氯化钾磷酸二氢钾硫酸锌硫酸锰硫酸镁磷酸氢二钾盐酸氢氧化钠化学纯生物制剂生物制剂生物制剂生物制剂分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯上海五四化学试剂有限公司北京奥特性生物技术有限公司北京奥特性生物技术有限公司北京奥特性生物技术有限公司北京奥特性生物技术有限公司沈阳市试剂五厂沈阳市试剂五厂开原化学试剂厂沈阳市试剂五厂沈阳奥吉娜化工有限公司沈阳奥吉娜化工有限公司上海博奥化学试剂厂上海博奥化学试剂厂营口鼎际得化学品有限公司上海博奥化学试剂厂沈阳市试剂五厂营口鼎际得化学品有限公司实验室用于菌种培养、筛选、培养条件优化、絮凝剂提纯分离、絮凝剂絮凝性能测定等相关实验所用设备如表2-2所示。表2-2 实验所用仪器及设备仪器及设备名称生产厂家设备用途数显电热恒温培养箱电子分析天平磁力搅拌器冰箱电热压力蒸汽灭菌器自速台式离心机电子万用炉浊度测定仪旋涡混合器数显恒温摇床微量移液器90mm玻璃培养皿250ml锥形瓶250ml、1000ml烧杯10ml、100ml量筒上海博讯实业有限公司医疗设备厂梅特勒托利多仪器有限公司海门市其林贝尔仪器制造有限公司海尔集团合肥华泰医疗设备有限公司梅特勒托利多仪器有限公司余姚市广播电视设备六厂上海嘉惠仪器仪表有限公司海门市其林贝尔仪器制造有限公司苏州威尔实验用品有限公司上海求精生化试剂仪器有限公司如皋市天泰玻璃制品有限公式深圳市三利化学仪器有限公司辽宁博拓化玻仪器有限公司辽宁博拓化玻仪器有限公司菌种培养称量药品搅拌混合保藏菌种仪器及培养基灭菌菌体和上清液分离培养基加热浊度测定梯度稀释迅速混合液体发酵培养微量液体移取菌种分离及培养发酵容器盛装液体量取液体1.2.3 基本操作（1）培养基及配制法10： 器皿：试管、培养皿、锥形瓶。 培养基配制：（A）固体培养基：此处的固体培养基的配比和配制方法适用于本文所用平面和斜面。按培养配方进行称药间表2-3，然后用蒸馏水溶解，再在电炉上加热至沸腾，使药品充分溶解。表2-3 固体培养基配方（100ml蒸馏水）成 份牛肉膏/g蛋白胨/gNaCl/g琼脂/g用 量0.51.00.52.0（B）液体培养基：本文在初选和优选过程中使用的液体培养基即发酵用培养基11如表2-4所示，产絮凝剂菌株培养条件优化继续拧特性研究用培养基12如表2-5所示。表2-4 粗选及优选用液体培养基（100ml蒸馏水）成分葡萄糖K2HPO4KH2PO4NaClMg2SO47H2O酵母膏含量/g1.00.50.20.010.020.05表2-5 产絮凝菌培养条件优化及絮凝特性研究用液体培养基成分含量蔗糖尿素MgSO47H2OKClKH2PO4ZnSO47H2OMnSO4H2O蒸馏水100g1g0.5g0.15g0.08g0.01g0.02g1000ml pH值：因为氢离子浓度与营养物质进入细胞体内有直接关系，所以在培养基中对微生物的生活有很大的影响13。当氢离子浓度不同时，组成原生质半透膜的胶体所带的电荷即发生变化。每种微生物都要求最适宜的pH值，细菌、放线菌、藻类、原生动物等的最适pH值为6.57.5，酵母菌、霉菌最适pH值为36，本实验以细菌为主，选取pH值为7.27.5 分装：（A）固体培养基根据培养基用途的不同，配得的培养基分装培养皿或试管中，培养皿用于产絮凝剂菌的粗选，试管用于优选和保藏。试管的个数根据优选与保藏过程中的菌种数量不同而定，一般每个菌种不少于两个试管，粗选过程中培养皿数量如表2-6所示。表2-6 粗选阶段平面浇注情况表菌种来源树下土树下土树下土花土花土花土稀释倍数平面个数10-4310-5310-6310-4310-5310-63（B）液体培养基根据培养基药品量的不同，配得的培养基分装在容量一样的锥形瓶中，玷污管口和内壁，以免污染棉花纤维，分装后灭菌放入无菌台，以备接菌。 灭菌：将培养基装入锥形瓶后，用纱布包好，放入灭菌锅内，在110、30min条件下进行灭菌，灭菌后放入无菌台。操作步骤：（A）检查灭菌锅、盖、压力表、温度计、排气阀、安全阀等是否有损坏。（B）向锅内加适量的清水。直接通入蒸汽的压力锅则不需加入水。（C）将欲灭菌的培养基和其它物品放入锅中。（D）盖好锅盖，打开排气阀，加热或通入蒸汽。（E）用蒸汽将锅内冷空气排出，约35分钟关小排气阀。达到110，压力上升，灭菌30min。（F）时间用尽，关闭开关停止加热，开大排气阀，使压力降低，务必在压力为0，蒸汽排尽时才能打开灭菌锅。（G）打开锅盖后将锥形瓶等物品从灭菌锅移至无菌台。（2）接种：平面培养基接种：在无菌台点燃酒精灯，在酒精灯附近，将稀释好的菌种用微量移液器吸取1ml于培养皿内，然后将温度适中的培养基注入培养皿2025ml待冷却凝固后置于恒温培养箱中培养。斜面培养基的接种：在无菌台上点燃酒精灯，将培养基注入试管使其为容量的1/3，塞上胶塞与台面15倾斜放置直到冷却定型。在无菌台内，将铂丝或镍丝接菌环在酒精灯上灭菌，然后将其在平面培养基上稍稍降温，之后在平面培养基挑取少量菌种，在斜面上按蛇形轻轻划过，将试管口在酒精灯上灼烧后塞上胶塞放入恒温培养箱培养。液体培养基接种：在无菌台内，将铂丝或镍丝接菌环在酒精灯上灭菌，然后将其在试管内壁上稍稍降温，之后挑取少量菌种，在锥形瓶中液体和壁面交界处划线。并且这一切的操作在酒精灯附近（无菌区）。若从液体培养基中取菌种，则需将移液管与配好的培养基一起灭菌，然后在无菌台内，用移液管取菌种，接到配好的培养基中。（3）菌种的培养：固体培养基应置于恒温培养箱中恒温培养48小时，温度选取30。液体发酵培养基置于恒温摇床中培养48小时，温度为30,转速100120r/min。（4）絮凝率14.15的测定：絮凝率在本实验中以高岭土选悬浊液的浊度去除率衡量，高岭土悬浊液浊度由浊度计测得。两个盛有相同浓度高岭土悬浊液的锥形瓶中，一个加入一定量的发酵液或发酵液上清液为实验组而另一个加入等量的水为对照组，在电磁搅拌器上搅拌5min，静置10min后测定两只锥形瓶中高岭土悬浊液的浊度。去除率以百分比表示如下：E=（D2-D1）/D2100%E-浊度去除率D2-对照组浊度/NTUD1-实验组浊度/NTU（5）菌体和胞外物质絮凝活性的甄别16：这里首先使用离心机将菌体和胞外物质分离，然后分别测得上清液和菌体的絮凝活性。具体操作：用微量移液器移取1.5ml发酵液于离心管中，然后将离心管放入离心机，盖好机盖，设置转速8000r/min，定时5min。离心完毕后取出离心管，倒出上清液，然后用铁丝小心取出菌体，并将菌体溶于上清液等量蒸馏水中，最后分别测定菌体悬浊液和上清液的浊度去除效果。（6）菌种产絮凝剂速率的测定：在此以最高絮凝率与发酵时间的比值来表征菌种的产絮凝剂速率。2.2 实验方法2.2.1 菌种的粗选和优选利用花土和树下的浸出液进行稀释、平面接种、恒温培养，48小时后观察菌落形态和生长状况，选取表面光滑、质地粘稠的菌落分别接种在液体培养基和斜面培养基上，并对应标记，斜面培养基和液体培养基均培养48小时后测定发酵液的絮凝率。选取具有相对明显絮凝率的菌种作为粗选菌种。将若干粗选菌种进行多次转接，然后经发酵得到各自发酵液，测定各自发酵液的絮凝率，选取絮凝效果最佳的菌种作为优选菌种。2.2.2 优选菌种培养条件的优化C/N、初始pH值、温度为微生物生长的重要外界条件，找寻优选菌株培养过程中合适的C/N、初始pH值及温度对于产絮凝剂菌的培养，絮凝剂特性研究及应用都具有重要意义。在此将对C/N、初始pH值、温度做三水平三因素正交实验16，然后经求和和极差分析找寻最佳的C/N、初始pH值和温度，并分析三者对于优选菌种影响程度大小17.18。2.2.3 絮凝特性及絮凝效果影响因素研究通过离心的方式将菌体和胞外物质（即上清液）分离开来分别测定上清液及菌体悬浊液的浊度去除效果，来甄别具有絮凝效果的是菌体还是胞外物质。絮凝剂投加量、pH值、温度、高岭土悬浊液浊度以及金属离子都是絮凝过程中影响絮凝效果的重要因素19，笔者对以上几个因素做单变量实验，以确定其各自对絮凝过程的影响程度大小和变化规律。2.2.4 絮凝剂对含藻污水的处理效果研究本絮凝剂在实验室条件下对高岭土悬浊液具有明显的浊度去除效果，笔者利用实际污水来测试其实用性。这里选择的是含藻废水，旨在积累实际应用的经验和第一手数据，指导今后的研究。第3章 微生物絮凝剂的开发3.1 MBF菌种的粗选3.1.1 菌种的接种和培养将来自于花土和树下土的菌种液接种到平面培养基上，经恒温培养后选取具有产絮凝剂潜质转接到液体和斜面培养基上。然后分别转入恒温摇床和恒温培养箱中平培养。3.1.2 絮凝菌产絮凝剂能力的测定对恒温培养后的发酵液进行絮凝性能的测定。笔者通过六轮的接种、培养、测试后选出具有一定浊度去除效果的菌株共四株，在此称其为MBF-1、MBF-2、MBF-3、MBF-4。以MBF-1为例，每100ml高岭土悬浊液加入一定量发酵液测定浊度，其初步测定结果如表3-1：表3-1 MBF-1菌株絮凝活性的测定发酵液投加量/ml初始浊度/NTU对照组浊度/NTU实验组浊度/NTU浊度去除率/%123451651681701661711221251201181211057265595813.942.445.850.052.1从表3-1我们可以清晰的看出该菌种发酵液对高岭土悬浊液具有相对显著的浊度去除效果，所以我们将其对应的斜面培养基上的菌种作为优选对象。3.2 MBF菌种的优选先将MBF-1、MBF-2、MBF-3、MBF-4四株菌种经多次转接后测定其絮凝性能。以100ml高岭土悬浊液加入不同菌株发酵液先搅拌5min后静置10min，各自絮凝效果如表3-2、3-3、3-4、3-5所示。表3-2 MBF-1发酵液絮凝性能测定组别发酵液投加量/ml初始浊/NTU对照组浊度/NTU实验组浊度/NTU去除率/%1116912510218.4221691268631.7331721206942.5441651195950.4551671225654.1从表3-2我们可以清晰地看出随发酵液投加量的增大浊度去除率也在增大，发酵液投加量为5ml时浊度去除率最大为54.1%。表3-3 MBF-2发酵液絮凝性能测定组别发酵液投加量/ml初始浊/NTU对照组浊度/NTU实验组浊度/NTU去除率/%1116612210018.0221661218430.6331711196247.9441681195454.6551691215058.7从表3-3我们可以清晰地看出随发酵液投加量的增大浊度去除率也在增大，发酵液投加量为5ml时浊度去除率最大为58.7%。表3-4 MBF-3发酵液絮凝性能测定 组别发酵液投加量/ml初始浊/NTU对照组浊度/NTU实验组浊度/NTU去除率/%111701288136.7221671286251.6331711264961.1441691214265.3551651203868.3从表3-4我们可以清晰地看出随发酵液投加量的增大浊度去除率也在增大，发酵液投加量为5ml时浊度去除率最大为68.3%。表3-5 MBF-4发酵液絮凝性能测定组别发酵液投加量/ml初始浊/NTU对照组浊度/NTU实验组浊度/NTU去除率/%111631239919.5221641238233.3331651226943.4441691276251.2551661185950.0从表3-5我们可以清晰地看出随发酵液投加量的增大浊度去除率也在增大，发酵液投加量为5ml时浊度去除率最大为50.0%。在直角坐标系中表示出以上四株菌种发酵液浊度去除率和发酵液投加量关系如图3-1所示，无论从单独某个投加量还是平均水平显然第三组浊度去除效果显著，在相同培养及实验条件下在四株粗选菌种中可以证明菌株MBF-3具有较高的产絮凝剂能力，所以以其作为优选菌株，对其进行培养条件优化及后续实验。图3-1 浊度去除率与发酵液投加量之间的关系3.3 MBF-3菌株培养条件优化将优选得到的MBF-3菌种接种到液体培养基中，笔者将对C/N、pH值、温度、三因素三水平正交试验20.21。测定产絮凝剂的速率（最高絮凝率/发酵时间），测试因素及水平如表3-6。表3-6 正交水平因素表 因素水平C/N初始pH值（灭菌前）温度（）1106.5252157.0303207.535将C/N、初始pH值、温度三因素做三平水共9组实验，其中个水平以代号表示，实验安排如表3-7。表3-7实验安排表 因素试验号C/N初始pH值（灭菌前）温度（）111121223133421252236231731383219332按照以上所安排的实验分组，以对高岭土浊度去除效率与发酵时间比值为检测指标（产絮凝剂速率22）的实验结果如表3-8所示。表3-8 正交试验结果 因素试验号C/N初始pH值（灭菌前）温度（）产絮凝剂速率%/h11111.5321221.6931331.6142121.6352231.6862311.6273131.5883211.6693321.62针对产絮凝剂速率的正交试验的结果做求和及极差分析分析如表3-9。表3-9 正交试验结果分析表23 因素数据C/N初始pH值（灭菌前）温度（）（一水平实验结果总和）4.834.774.81（二水平实验结果总和）4.935.034.94（三水平实验结果总和）4.864.854.87/31.611.581.60/31.641.681.65/31.621.621.62极差（R）0.030.100.05从正交实验结果可以看出三因素对实验结果影响次序为初始pH值温度C/N,而个因素水平对絮凝剂合成的影响如图3-2、3-3、3-4所示。图3-2 产絮凝剂速率与初始pH水平间关系如图3-2所示，由极差可以看出初始pH值对产絮凝剂速率影响最大，当初始pH为6.5时产絮凝剂速率为1.58，处于三水平最低，所以菌种MBF-3在偏酸条件下产絮凝剂速率较低，而pH为7.07.5时产絮凝剂速率较高，所以最佳pH应在7.07.5之间，由于絮凝菌在生长过程中产酸所以选择pH为7.5。图3-3产絮凝剂速率与温度水平间关系如图3-3所示，考查温度因素影响，在25和35时产絮凝剂速率皆相对低下，而在30时产絮凝剂速率为1.65，说以最佳温度可选择30。图3-4产絮凝剂速率与初始C/N水平间关系而图3-4则显示了C/N对产絮凝剂速率的影响，虽然不显著，但为了排除其对实验结果的影响笔者严格按照实验数据选择最佳C/N为15时最佳。3.4 MBF-3发酵液絮凝活性部分研究为测定具有絮凝活性的是菌体还是细胞外代谢产物，采用离心的方式将菌体和清液分离。然后测定各自浊度去除效果。其结果如图3-5所示。图3-5发酵液、上清液、悬浊液的浊度去除率与投加量关系由图3-5我们清晰的看到发酵液和上清液有较高的絮凝活性而菌体悬浊液却对浊度去除并无明显效果，有这样的分布格局我们可以得出絮凝活性物质存在于细胞外代谢产物的结论。另外我们可以看出清液的浊度去除效果要优于发酵液，分析其原因是因为菌体存在引入浊度。第4章 微生物絮凝剂的应用研究4.1 微生物絮凝剂絮凝效果的影响因素研究4.1.1 投加量对絮凝效果的影响投加量是絮凝效果最为直接的影响因素24，考虑到第6章的研究结果显示出上清液和悬浊液的差异，在此我们分为发酵液和上清液两部分进行研究。在室温和自然pH条件下，分别向100ml浊度为120左右的高岭土悬浊液中投加不同量的发酵液和上清液，搅拌5min静置10min测定其浊度，并与空白组对照，计算浊度去除率。图4-1、4-2分别为发酵液和上清液投加量对应的浊度去除率。图4-1不同发酵液投加量下的浊度去除率由图4-1我们可以知道投加量并不是越多越好，每100ml高岭土悬浊液中加入约5ml左右去除率最高，也就是说存在去除效果的最佳投加量。与图4-1相似，图4-2同样显示出一个最好去除率的投加量，与发酵液不同的是多次试验表明这个最佳投加量都要大于发酵液，这与相关文献25显示相符，其原因在于是否存在菌体，菌体的理化性质导致其不易絮凝引入浊度，这也是很多研究为了排除其影响选择分离提纯后进行的原因，所以笔者之后的研究均采用上清液。图4-2浊度去除率与上清液投加量关系4.1.2 pH值对絮凝效果的影响研究考虑到絮凝剂的物理性质、化学组成及絮凝机理，pH必将成为絮凝过程中一个相对重要的影响因素。这里我们在不同酸度条件下，向100ml浊度为120NTU左右的高岭土悬浊液中投加最佳上清液量5ml。测定其浊度去除率如图4-3所示。实验结果显示当pH值处于56之间时絮凝效果最佳，浊度去除率达80%以上,由图4-3所示pH值对絮凝效果影响相当大，这和絮凝剂以蛋白质、多糖。多肽等物质的化学组成有关。4.1.3 絮凝剂对不同浊度的适用研究之前很多相关研究表明微生物絮凝剂对不同浊度最佳投加量和去除效果有较大差异，所以笔者将其作为一个重要方面做以研究。100ml悬浊液不同上清液投加量下浊度去除率如表4-1所示。图4-3浊度去除效率与pH之间的关系表4-1不同上清液投加量、高岭土浊度对应的浊度去除率NTU4ml5ml6ml7ml8ml9ml10ml平均20040060080010000.670.760.770.620.590.780.780.770.710.630.820.830.820.750.620.790.860.840.760.680.720.730.790.810.720.680.720.700.790.76