（生态学专业论文）重楼属几种重要植物的遗传多样性和化学指纹图谱研究.pdf

摘要 重楼属( p a r i s ) 隶属延龄草科( t i r l l i a c e a e ) ，共有2 4 个种，我国有 1 9 个种，主要分布在西南地区。本属植物是重要的中草药，在植物 系统发育和化学指纹图谱的研究中都有着重大意义。 m a t k 基因和而吐基因均为叶绿体基因。m a t k 基因位于t r n k 基 因的内含子中，编码的成熟酶参与r n a 转录本中1 1 型内含子的剪切。 r b c l 基因编码核酮糖1 ，5 一二磷酸羧化a n 氧酶( r u b i s e o ，r b e ) 的大 亚基，目前这两个基因己广泛用于植物系统发育分析。 本文从三方面对重楼属植物进行了研究。 ( 1 ) 基于m a t k 基因的重楼属几种植物遗传关系的分析。本研究 测定了分布于湖南省、云南省和吉林省的七叶一枝花p a r i s p o l y p h y l l a v a r c h i n e n i s ( f r a n c h ) h a r a 、狭叶重楼pp o l y p h y l l av a r s t e n o p h y l l a f r a n c h 、短梗重楼p p o z y p h y h av a ea p p e n d i c u l a t ah a r a 、巴山重楼 p b a s h a n e n s i sw a n ge tt a n g 、凌云重楼p c r o n q u i s t i i ( t a k h t ) h l i 、多 叶重楼pp d 切砂l av a r p o 切砂h as m i t h 、宽叶重楼e p o z y p h y h av a r s t e n o p h y l l af 1 a t i f o l i a ( w a n ge tc h a n g ) h l i 、北重楼p v e r t i c i l l a t am b i e b 、滇重楼p p o t y p h y a av a r y u n n a n e n s i s ( f r a n c h ) h a n d 一m a z z 、长 药隔重楼尸p d 切砂av a r p s e u d o t h i b e t i c ah l i 等1 0 种重楼属样品的 m a t k 基因序列，比较了该基因的差异，构建了基于m a t 基因序列的 遗传进化树。这1 0 个重楼属植物样品可以划分为4 个组群，m a r k 基 因序列的结果不支持长药隔重楼、滇重楼、短梗重楼、七叶一枝花成 为独立的变种，建议作为多叶重楼的变型处理。在m a t ( 基因的序列 上，凌云重楼与多叶重楼( 及其7 个分类群) 关系较近，说明这两个种 之间确实存在较近的亲缘关系。 ( 2 ) 基于柏吐属几种植物遗传关系分析。测定了上述1 0 个重要的重 楼类群样品的而吐基因序列，比较了该基因的差异，构建了基于砌以 基因序列的遗传进化树。长药隔重楼、滇重楼、短梗重楼、七叶一枝 花、多叶重楼、宽叶重楼、狭叶重楼等7 个分类群有很近的亲缘关系。 从分子水平上支持了李恒分类系统中把宽叶重楼、狭叶重楼作为多叶 重楼的变种，巴山重楼单独分为一支和北重楼分别单独分为一支的观 点。同时也说明生境对重楼属植物表型有较大环境饰变作用。基于 m a t k 、而吐基因的重楼属几种植物遗传关系的分析得到的结果基本 一致。本研究将为重楼的保护和合理利用提供基本理论依据。 ( 3 ) 通过高效液相色谱对重楼属几种植物进行化学指纹的分析：重 楼属植物，其主要化学成分是甾体皂苷，具有祛痰、抗菌、镇痛、镇 静、抗癌和止血等活性，是云南白药、宫血宁等多种中成药和新药的 主要原料。h p l c 指纹图谱分析可以直观地为重楼属植物的化学成分 定性。通过对几种重楼的化学指纹进行比较，结果发现重楼属植物茎 叶中也含有有效成分，重楼属植物根中的有效成分的含量比茎叶中 多，地理环境对重楼属植物有效成分含量的影响比较大，重楼用药应 在固定产地和品种的前提下，才能保证药品质量的一致性。 关键词：遗传多样性，重楼属，m a r k 基因，而吐基因，化学指纹 a b s t r a c t t h e r ea r e2 4s p e c i e si nt h eg e n u sp n r i so ff a m i l yt r i l l i a c e a e ，19o f w h i c hd i s t r i b u t ei nc h i n a p a r sd i s t r i b u t e si nt h et e m p e r a t ea n dt r o p i c z o n e si ne u r a s i a c h i n ai sa ni m p o r t a n tc e n t e ro fi t sd i s t r i b u t i o n ， e s p e c i a l l yt h es o u t h w e s to fc h i n a s o m es p e c i e so fp a r & a r ec h i n e s e t r a d i t i o n a lc r u d ed r u g sa n du s e dw i d e l y t h e ya r e s i g n i f i c a n t f o r p h y l o g e n e t i cr e s e a r c ho f a n g i o s p e r m m a t kg e n e sa n d 而c lg e n ea r ec h l o r o p l a s t i cg e n e s m a t kg e n el i e di n t h et r n ki n t r o na n dt h em a t u r a s ee n c o d e db yt h i sg e n ep a r t i c i p a t e st h e r n a lli n t r o n ss p l i c i n g 而c lg e n ee n c o d e sl a r g es u b u n i to fr u b i s c o n o wt h e s et w og e n e sh a v eb e e nw i d e l yu s e di nt h ep h y l o g e n i ca n a l y s i s o f p l a n t o u rr e s e a r c hw o r kf o c u s e do nt h ef o l l o w i n gt h r e ea s p e c t s ( 1 ) g e n e t i ce v o l u t i o no fs o m ei m p o r t a n t p a r i s s p e c i e s b a s e do n s e q u e n c e so f m a t k g e n ew a sa n a l y z e d t h ep a r i si sag e n u si nt r i l l i a c e a e w i t hi m p o r t a n tt r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e s t h em a r kg e n e so fp a r i s p o z y p h y z z av a r c h i n e n i s ( f r a n c h ) h a r a ，尸p o l y p h y z z av a r s t e n o p h y l l a f r a n c h ，pp o l y p h y l l av a r a p p e n d i c u l a t ah a r a ，尸b a s h a n e n s i sw a n ge t t a n g ，pc r o n q u i s t i i ( t a k h t ) h l i 、pp o l y p h y l l av a r p o l y p h y l l as m i t h ， 户p o l y p h y l l av a r s t e n o p h y l l af 1 a t i f o l i a ( w a n g e tc h a n g ) h l i ， pv e r t i c i l l a t am b i e b 、pp o l y p h y u av a r y u n n a n e n s & ( f r a n c h ) ， h a n d 一m a z z 、pp o z y p h y l l av a t p s e u d o t h i b e t i c ah l i ，10s a m p l e si n p a r i sf r o mh u n a n ，y u n n a na n dj i li np r o v i n c e sw e r es e q u e n c e da n d c o m p a r e d t h ep h y l o g e n e t i ct r e ew a sc o n s t r u c t e db a s e do nt h em a r kg e n e s e q u e n c e sa n dt h et e np a i r ss a m p l e sw e r ed i v i d e di n t of o u rg r o u p s t h e r e s u l t sd i dn o ts u p p o r tt h er e a l i t yo ff o u rt a x an a m e dp a r i sp o l y p h y l l av a r p s e u d o t h i b e t i c ah l i ，p a r i sp o l y p h y l l av a r y u n n a n e n s i s ( f r a n c h ) h a n d m a z z ，p a r i sp o l y p 砂l l as m i t hv a t a p p e n d i c u l a t ah a r a ，a n d 尸 p o l y p h y l l av a r c h i n e n i s ( f r a n c h ) h a r a t h e ya r es u p p o s e dt ob et r e a t e d a sd i f f e r e n tf o r m so fp a r i sp o l y p h y l l av a r p o l y p h y l l a t h i sr e s u l t sw e r e s i m i l a rw i t hj ie ta l s w h i c hw e r eo b t a i n e dt h r o u g ht h ep s b a t m h ， t r n l t m f ，p s b a t r n ha n di t s t h o s ep r o v ec l o s er e l a t i o n s h i pb e t w e e n t h et w os p e c i e s ( 2 、) g e n e t i c e v o l u t i o no fs o m ei m p o r t a n t p n r i s s p e c i e s b a s e do n s e q u e n c e so f r b c lg e n ew a sa n a l y z e d t h er b c lg e n e so f 10s a m p l e si n p 口n sf r o mh u n a n ，y u n n a na n dj i l i np r o v i n c e sw e r es e q u e n c e da n d c o m p a r e d t h ep h y l o g e n e t i ct r e ew a s c o n s t r u c t e db a s e do nt h er b c lg e n e s e q u e n c e sa n dt h et e np a i r ss a m p l e sw e r ed i v i d e di n t ot h r e eg r o u p s p a r i s p d 切砂l l av a r c h i n e n i s ( f r a n c h ) h a r a ，尸p o t y p h y l av a r s t e n o p h y l l a f r a n c h ，pp o l y p h y l av a la p p e n d i c u l a t ah a r a ，户p o r y e h y l av a r s t e n o p h y l l a fl a t i f o l i a ( w a n ge tc h a n g ) h l i ，pp o t y p h y l l a v a r y u n n a n e n s i s ( f r a n c h ) ，h a n d 一m a z z 、pp o l y p h y l l av a r p s e u d o t h i b e t i c a h l i ，7t a x ah a v ec l o s er e l a t i o n ，s u p p o r t i n gt h ec l a s s i f i c a t i o ns y s t e mo f l ih e n g a tt h es a m et i m et h er e s u l ta l s os h o w e dt h a te n v i r o n m e n th a da g r e a t e r o l eo f p h e n o t y p e o fp a r i s t h er e s u l to b t a i n e df r o mt h e p h y l o g e n e t i ca n a l y s e s o fs o m ei m p o r t a n tp a r i s s p e c i e s b a s e do n s e q u e n c e so fm a t kw a sb a s i c a l l yc o n s i s t e n tw i t ht h er e s u l tb a s e d o nr b c l g e n e t h e s er e s u l t sw o u l db e u s e f u li nt h eu s a g ea n dp r o t e c t i o no fp a r i s ( 3 ) c h e m i c a lf i n g e r p r i n t so fs o m ei m p o r t a n t 砌r 括s p e c i e sw e r ea n a l y z e d t h r o u g hh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) ：t h em a i n c h e m i c a l c o m p o s i t i o n o fp a r i sw a ss t e r o i d a l ，w h i c hc o u l dr e m o v e p h l e g m ，r e s i s tc a n c e r , e a s ep a i n ，a n ds t o pb l e e d i n g ，e ta 1 i ti st h em a j o r m a t e r i a lo fm a n yp r e p a r e dc h i n e s em e d i c i n e s h o w e v e rw ea r ef a c i n gt h e c r i s i so fi t s g r a d u a l l yd r y i n gu p h p l cf i n g e r p r i n ta n a l y s i s c o u l d l v q u a l i t a t i v e l ya n a l y s ec o m m e r c i a lp a r i ss a m p l ew i t h o u tg e n o m i cd n a ， w h i c hp r o v i d e da na l t e r n a t i v et o o lf o rt h es t a n d a r d i z a t i o no fq u a l i t y c o n t r 0 1 w ec o m p a r e dt h eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) f i n g e r p r i n t so fp a r 函, a n df o u n dt h a ta c t i v ei n g r e d i e n te x i s t e di n s t e m sa n dl e a v e s a c t i v ei n g r e d i e n t si nt h er o o tw e r em u c hm o r et h a nt h a t i nt h es t e m sa n dl e a v e s g e o g r a p h i c a le n v i r o n m e n ti sav e r yi m p o r t a n t c h a r a c t e rt ot h eq u a n t i t yo ft h ea c t i v ei n g r e d i e n t f i x e do r i g i na n ds p e c i e s ， t h ec o n s i s t e n c yo ft h eq u a l i t yo fm e d i c i n e sc a nb eg u a r a n t e e d k e yw o r d s ：g e n e t i cd i v e r s i t y , p a r i sm a t kg e n e ，而吐g e n e ，g e n e t i c e v o l u t i o n ，h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) v 中央民族大学研究生学位论文作者声明 本人声明：本人呈交的学位论文是本人在导师指导下取得的 研究成果。对前人及其他人员对本文的启发和贡献已在论文中作 出了明确的声明，并表示了谢意。论文中除了特- 另t j d n 以标注和致 谢的地方外，不包含其他人和其它机构已经发表或者撰写过的研 究成果。 本人同意学校根据中华人民共和国学位条例暂行实施办 法等有关规定将本人学位论文向国家有关部门或资料库提交， 允许论文被查阅和借阅。 作者签名：二单日期：毕年月血 第一章文献综述 第一节遗传多样性及其研究方法 一、遗传多样性的概述 遗传多样性是生物多样性的基础，也是生物多样性的重要内容之一。广义的 遗传多样性( g e n e t i cd i v e r s i t y ) 或称基因多样性( g e n ed i v e r s i t y ) 是指地球上所有 生物携带的遗传信息的总和，也就是各种生物拥有的多种多样的遗传信息。狭义 的遗传多样性是指生物个体所包含的各种遗传物质和遗传信息【l 】，即包含了同一 种的不同种群的基因变异，也包含了同一种内的基因差异【z 1 。遗传多样性的本质 是生物体在遗传物质上的变异，即编码遗传信息的核酸( d n a 或r n a ) 在组成或 结构上的差异【3 】。遗传多样性研究的主要对象集中在物种可遗传的变异上。遗传 多样性体现在不同水平上：居群水平( p o p u l a t i o n ，又译种群、群体) 、个体水平、 组织和细胞水平以及分子水平。遗传多样性最直接的表达形式就是遗传变异性的 高低。在自然界，由于个体生命短暂，有其特定分靠格局的居群或居群系统( 宗、 亚种、种) 才是其进化的基本单位【5 】，因此遗传多样性不仅包括遗传变异高低，也 包括遗传变异分布格局，即居群的遗传结构。例如，对大范围分布的杂交植物来 说，遗传变异的大部分存在于居群之内，而对于以自交为主的植物来说，居群之 间的遗传变异明显增大【铺】。对那些更为极端的以无性繁殖为主的植物来说，无 性系( c l o n e ) l 为大部分位点上都是一致的，形态变异也很小，但不同的无性系之间 可能有很大差异【9 1 。因此，居群遗传结构上的差异是遗传多样性的一种重要体现， 一个物种的进化的内在源泉。抵御不良环境的能力取决于种内遗传变异的大小， 也有赖于遗传变异的居群结构【2 】。遗传多样性在一定程度上决定了物种的分布以 及数量的多样性。 遗传多样性产生的主要原因是复杂的生存环境和多种生物起源。人们估计世 界上的生物大约存在1 0 9 种不同的基因，其中控制生命基础的生活过程的基因在 不同种的差异并不大，而其他一些特殊的基因则表现出明显的变异，遗传多样性 产生的基础是突变和重组。突变包括点突变和染色体突变；重组包括微观层次上 d n a 分子间的重组，以及宏观层次上染色体的重组【2 j 。 遗传多样性被认为是生物多样性的核心问题。蕴藏于物种内或种问的分子、 细胞和个体水平的遗传变异，是遗传多样性的基础，也是物种保持进化潜能的基 本条件，与生物多样性的形成、消失和发展息息相关。遗传多样性的研究工作是 生物多样性就地保护的基础，更是迁地保护计划的关键。遗传资源的保护和利用， 不仅是生物多样性保护的关键因素，也是农业持续发展的需要，关系到世界未来 的食物供应问题。因而，遗传多样性的研究也是生物多样性研究中发展较快的领 域。一方面，现代生物学的理论、技术和方法( 尤其是分子生物学和生物技术) 被 广泛应用于遗传多样性的研究；另一方面，研究结果和新方法的应用又形成了一 些新的理论和学科，同时也使遗传多样的保护理论和方法得到很大的发展【1 0 1 。 遗传多样性具有十分重要的实践意义：第一，遗传多样性是生物界几十亿年 来进化的宝贵资源，是人类生存和社会发展的基础【1 1 1 2 1 ；第二，对遗传多样性掌 握和有效利用是现代医学生物学、农业技术研究的一个前沿领域，主要表现在动 植物优良品种的选育、新药的开发、人类遗传疾病的诊断和治疗、生物活性物质 基因工程的生产、生物资源的鉴定和利用、有害生物的检测和防治等；第三，对 遗传多样性的研究是保护生物学研究的核心之一。第四，人类在长期的实践中， 为了满足一时一事的需要使遗传多样性大量流失，造成了许多品种的单一性和均 一化，使其抵御突如其末的干旱、病毒或寄生虫侵害的能力明显下降l l 引。所以， 揭示物种遗传多样性可以帮助我们了解种质资源多样性状况，了解品种的遗传背 景、遗传结构及品种问的亲缘关系，为种质资源的利用与开发提供帮助，为育种 材料的选择提供信息【1 9 j 。 二、 遗传多样性的取样方法 物种自身的生物学特性在很大程度上影响其整个基因组的进化和遗传变异 的格局。这些特性包括物种的生活史、种子散播和传粉机制、交配系统、生殖模 式、突变率和突变机制等。这些特性及其对物种和居群遗传多样性的影响，在很 大程度上会影响我们的取样策略，因此要想获得丰富的多样性，就需要可能多地 捕捉每一个特异性。由于生物界最基本的组成单位是个体【2 0 】，因此在遗传多样性 的研究中需要以个体为单位进行取样。尽管个体是构成物种的基本单位，但它却 不是物种生存与进化的基本单位。任何生物个体尤其是有性繁殖的生物个体，都 离不开居群而独立存在、繁衍和进化，所以种群才是物种生存与进化的基本单位。 由于每个种群是由一个个具有特异性基因库的个体所组成，同时不同的种群往往 2 占据不同的地域或不同的生境，这样就又造就了种群间遗传结构的不同，形成了 各自的种群特异性【2 1 2 2 】。换句话说，一个物种的遗传结构不仅具有个体特异性 而且还具有种群特异性，这些所有的特异性加起来才能构成一个生物物种的遗传 多样性。因此，遗传多样性研究的取样方法，应该是以个体为单位的居群取样方 法。在实施取样策略时，取样居群要尽可能跨越该种的整个分布区、各种生境和 不同海拔。统计学检验表明，在物种水平上影响遗传变异大小的因素依次为：分 类地位 分布范围 生活型 繁育系统 种子散播机制；而在居群水平上同样是 这五个因素，但重要性变为：繁育系统 分布范围 生活型 分类地位 种子散播 机制。对这些关系的认识是我们制定特定物种取样策略的重要参考。 取样策略的制定与许多因素有关，但有两方面的信息是最为重要的：一是研 究对象本身的特性，如物种的遗传多样性水平和分布、居群遗传结构、基因流和 繁育系统以及由环境因素引起的变化等；二是取样的目的，是为了遗传多样性的 保护和可持续利用，还是为了进行某一方向的研究；是考虑整个物种，还是该物 种在特定区域的居群之间或者是居群内的遗传多样性等【2 3 也4 1 。如果研究对象是 整个物种，那么样本要能够代表该物种的整体遗传多样性水平，应该尽可能覆盖 该物种的分布区【2 5 】；如果研究对象是物种在特定区域的居群间的遗传多样性水 平，那么就应该在该区域合理地选取具有代表性的居群；如果同时还要考虑其他 因素对该物种的影响，则取样时要设计各因素的梯度或对照。针对不同的研究对 象和研究目的应该制定相应的取样策略。 三、遗传多样性的研究方法 遗传多样性的测度是目前遗传多样性研究的一个核心问题，检测方法随生物 学、尤其是遗传学和分子生物学的发展而不断提高和完善，从形态学水平、细胞 学( 染色体) 水平、生理生化水平逐渐发展到分子水平【2 1 1 。其检测手段同益成熟和 多样化，可以从不同角度和层次来揭示物种的变异性。然而，目前任何检测方法 在理论上或在实际的研究中都有各自的优点和局限，还找不到一种完全取代其他 方法的技术。因此，包括传统的形念学、细胞学，以及蛋白质标记和d n a 技术 在内，各种方法都能提供有价值的资料，都有助于我们认识遗传多样性及其生物 学意义。 ( 一) 形态学水平 长期以来，种质资源的分类、鉴定及育种材料的选择都是依据形态学或表型 性状。由于表现型和基因型之间存在着基因表达、转录、翻译、调控、个体发育 等复杂的中间环节，如何根据表现型上的差异来反应基因型上的差异就成为用形 态学方法检测遗传变异的关键所在【2 6 1 。通常利用的表型性状有两类，一是符合孟 德尔遗传规律的单基因性状( 质量性状、稀有突变等) ，另一类是由多基因决定的 数量性状。但是，形态学性状由于受环境的影响，遗传表达不太稳定。数量性状 的研究则由来己久，通过对数量性状的研究同样可以分析居群的遗传变异水平和 遗传结构。此类研究己在大量的动植物居群中展开并获得了许多有价值的结果。 所研究的表型性状既包括具有系统学价值的形态性状，也包括与生物适应性相关 的生理和生化特征，由于数量性状的变异往往具有适应和进化上的意义，对其进 行研究不仅能初步了解遗传变异的大小，更有助于了解生物适应和进化方式、进 化机制及其影响因烈2 7 1 。形态特征的调查数据通常是通过计算均值( m e a n ) 、标准 差( s t a n d a r dd e v i a t i o n ) 和变异系数( c o e f f i c i e n to fv a r i a t i o n ) 等来度量物种在形态 上所表现出的多样性。 ( 二) 细胞学水平 染色体是遗传物质的载体，是基因的携带者。染色体的变异必然导致遗传变 异的发生，它是生物遗传多样性的重要来源。研究表明，任何生物天然群体中都 存在着或多或少的染色体变异，这些染色体变异在生物进化过程中起着十分重要 的作用。染色体变异主要表现为染色体组型特征的变异，包括染色体数目的改变 ( 整倍数、非整倍数) 和染色体结构变异( 缺失、易位、倒位和重复) ，染色体结构 变异在种内更常见，缺失、易位、倒位和重复都是构成染色体多样性的重要因素。 除了染色体数目和结构上的变异，染色体水平的多样性还体现在染色体着丝点位 置、缢痕和随体等核型特征上，这些特征的变异使种内出现了细胞水平的多样性。 染色体多样性检测主要对细胞分裂时期染色体的数目和形态特征等观察并加以 分析，但有些物种对染色体结构和数目的变异的耐受性较差，难以获得相应的标 记材料【2 8 】；某些物种虽己有细胞学标记材料，但常常伴有对生物有害的表型效应 或观察和鉴定比较困难。细胞学标记主要包括核型( 染色体数目、大小、随体、 4 着丝点位置等) 和带型( c 带、n 带、g 一带) 和染色体组型的研究。细胞学研究方法 不仅克服了形态性状研究受环境影响的缺点，而且操作也较简单，费用也不高。 但仍存在着标记数量少的缺陷，且需要花大量时间和精力来培育染色体分析的材 料，同时，某些物种对染色体数目和结构变异反应敏感，适应变异的能力较差， 材料的保存较困难【2 9 3 2 1 。更重要的是，一些不涉及染色体数目、结构变异或带 型变异的性状，难以用细胞学方法检测。 i 三) 生化水平 在生化水平上研究遗传多样性主要是应用同工酶标记和非同工酶形式的蛋 白质标记( 种子贮藏蛋白) 两种方法，这两种方法都从蛋白质水平揭示居群的遗传 结构和遗传变异，解决形态学和细胞学方法所不能解决的一些问趔3 3 】。种子贮藏 蛋i 兰t ( s e e ds t o r a g ep r o t e i n s ，简称s s p ) 是近年来应用较为广泛的一种生化标记， 可分为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。禾本科植物种子贮藏蛋白主要由醇 溶蛋白组成，豆科植物种子贮藏蛋白主要由球蛋白组成。球蛋白是一种盐溶性蛋 白，依沉降系数不同，球蛋白又分为2 s 、7 s 和1 1 s 蛋白，它们在大部分被子植 物的种子都有存在，但以双子叶植物种子中的含量较多。豆科植物的种子贮藏蛋 白主要为球蛋白，包括豆球蛋白( l e g u m i n ) 和豌豆球蛋i 刍( v c i l i n ) 。豆科植物的豌 豆球蛋白的沉降系数为6 s 8 s ，豆球蛋白的沉降系数是9 s 1 2 s 。这些蛋白质可 以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行分析，根据电泳显示的蛋白质谱带确定其分 子结构和组成差异。种子贮藏蛋白取样方便，不受生长季节和环境条件的影响， 多念性也相对较高，电泳结果稳定，避免了同工酶活性易受时空影响的局限性， 这些优越性使种子贮藏蛋白电泳技术在遗传多样性检测的研究中得到了广泛的 应用 3 4 3 5 。 ( 四) 分子水平 随着遗传多样性研究的深入发展，遗传多样性标记以从传统的以表型识别为 基础的形态标记、以染色体的结构和数目为特征的细胞学标记以及具有组织、发 育和物种特异性的蛋白质标记拓展到了目前广泛开展的以d n a 多态性为基础的 d n a 分子标记【3 7 1 。d n a 分子标记是建立在d n a 序列多念性基础之上的，它 是基因的直接反应。与经典的遗传标记相比，d n a 标记具有显著的优越性：( 1 ) 具有高的多态性；( 2 ) 能明确辨别等位基因；( 3 ) 共显性遗传，即利用分子标记可 鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；( 4 ) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀 分布于整个基因组；( 5 ) 选择中性( 即无基因多效性) ；( 6 ) 检测手段简单、快速( 如 实验程序易自动化) ；( 7 ) 开发成本和使用成本尽量低廉；( 8 ) 重复性好( 便于数据交 换) 。一般依其所用的分子生物学技术大致可以分为两大类：一类是s o u t h e m 杂 交技术为核心的分子标记，如r f l p ，这类分子标记被称为第一代分子标记。另 一类是以p c r 技术为核心的分子标记，如r a p d ，a f l p ，s s r ，i s s r 等，这类 分子标记被称为第二代分子标记；单核苷酸多态性( s n p ) 标记被称为第三代分子 标记。随机扩增多念性d n a ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，凡心d ) ，就 是以随机序列的寡核苷酸为引物【3 8 卅】，以基因组d n a 为模板进行p c r 扩增， 从而进行d n a 多态性研究【4 引。它是由w i l l i a m s 和w e l s h 领导的两个研究小组同 时提出的，w i l l i a m s 称其为r a p d ，w e l s h 称之为a p p c r 。其基本原理是利用 一个随机序列的寡聚核苷酸作引物，通常为l o 个核苷酸，以基因组d n a 作为 模板进行p c r 扩增反应，经琼脂糖凝胶电泳来检测d n a 序列的多态性【拍l 。 四、遗传多样性的测定 d n a 构成了基因的基础，基因构成了染色体并决定了蛋白质的种类和性质。 遗传多样性可以在任何一个能量等级上进行测定。遗传多样性的功能等级包括4 个水平。第一，形念学水平的变异。它通常是遗传变异的主要线索，通过形态学 水平来测定是传统的方法，可以测定种群内外的形态学变异、种群间和种族间的 形态学变异以及物种间的形态学变异；第二，染色体水平的变异。染色体是基因 的携带者，其排列受到自然选择的影响。染色体的变异包括基因的重新排列以及 重新组合。第三，等位酶水平的多样性。在等位酶水平上测定遗传多样性是利用 等位酶带和等位基因之间的明晰关系来实现的。这是测遗传多样性最常用的方 法；第四，d n a 水平的多样性。就是对d n a 直接测序。遗传多样性的测定可以 分为种群内以及m e t a 种群或者总种群内亚种群的遗传多样性测定。主要测定丰 富度和均匀度【4 7 巧3 1 。丰富度是指同一种群内在一个位点上等位基因的数目。均 匀度是一个种群某个等位基因的频度。 6 五、 遗传多样性研究在生物多样性保护中的应用 植物遗传多样性研究中，王洪新【33 j 等分析辽东栎的遗传多样性后指出，只要 停止人为的破坏，植物群体以及生态系统的恢复和重建是可以实现的。唐顺学唧】 等在研究中发现，保护生存环境，防治生态系统的破坏和退化，是最有效的遗传 多样性的保护途径。动物遗传多样性的研究中，张亚平【5 5 】等对大熊猫遗传多样性 进行系统的研究，结果表明，大熊猫体内遗传多样性的程度十分低，提示了种群 内可能存在近交。这种格局可能是由于历史上气候剧变使大熊猫受到严重的“瓶 颈效应”，使其遗传背景变的比较单一。同时由此产生的近亲交配进一步降低了 群体的生存能力，在环境变迁中仍然十分脆弱。大熊猫遗传多样性的贫乏可能是 导致其难以适应外界环境影响，从而衰退致危的原因。种群遗传结构的研究主要 评估濒危物种种群间和种群内的遗传变异水平、分布及其产生的遗传多样性。因 为在自然种群中，种群数量下降和生境片段化会明显地改变种群遗传结构，增加 近亲繁殖和遗传漂变【5 6 1 ，导致遗传异质性和基因多样性一代代地丧失，从而使物 种适应环境的能力下降。因而通过评估遗传变异水平，保护工作者能够估计种群 水平上的近亲繁殖程度、有效种群大小、亲系鉴定、种群间迁移和基因流程度、 检测种群问杂交和基因渗透等情况。这些参数对制定合适的保护策略将起着十分 重要的作用。具有保持物种的进化潜力，才能真正达到保护的目的。因为遗传多 样性是物种具有进化潜力的物质基础，如果遗传多样性贫乏，则该物种在环境变 迁中易受到致命的打击。 遗传多样性的研究一直是进化理论的基础，是群体生物学和进化生物学的核 心。遗传多样性也是遗传分析的基础，包括染色体连锁图到基因图谱直至全序列 分析。群体遗传学的理论和连锁图谱曾为各种生物育种方案的确定做出了贡献。 分子标记大大加快了育种进程【5 7 - - 6 0 ，以及对病原鉴定、疾病诊断，尤其是遗传病 的诊断。遗传多样性的研究也可为濒危物种的保护提供理论依据，更好地保护物 种多样性。 第二节中药化学指纹图谱概述 我国是天然药物的故乡，有雄厚的中医理论和丰富的临床用药经验，但中药 在天然药物国际市场中仅占3 5 的份额。长期以来，一直困扰着我国中药发 展的一个重要问题就是如何找到一个既符合中医临床传统用药习惯，又能揭示中 7 药内在特质的方法，从而使中药( 中药材、中成药) 的质量达到稳定、可控，确保 中医临床疗效的稳定。中药指纹图谱正是这样一项技术。目前，以指纹图谱作为 质量控制方法之一，已成为一种国际共识。 一、中药指纹图谱的定义和性质 药用植物化学指纹技术中“指纹”一词借用法医学指纹鉴定的概念，表明图 谱具备不同种之间的绝对唯一性和同种不同个体之间的相似可比性。这种具有物 种唯一性和个体相似性的图像即具有了指纹意义，可以鉴定辨别药用植物的真 伪优劣，而且从整体和实际出发反映在一定条件下其内部的完整特征化学信息， 强调同一群体的相似性，即物种群体内的相似性。中药指纹图谱是借用d a n 指纹 图谱发展而来的【6 3 1 。中药材或中成药经过适当处理后，利用现代信息采集技 术和质量分析手段得到的能够显现中药材或中成药性质的图像、图形、光谱的图 谱及其数据，即为中药指纹图谱。它可以较全面地反映中药所含化学成分的种类 与数量，进而反映中药的质量和中医用药所体现的整体疗效。由于指纹图谱既有 质的特征，又有量的大小，整个谱图表征了该样品所含化学成分的多少和量的大 小】。近年来在中药物质基础研究中也发挥了重要作用。中药指纹图谱按测定 手段可分为中药化学( 成分) 指纹图谱和中药生物指纹图谱，最先发展起来的，目 前最主要和常用的是中药化学指纹图谱，中药化学( 成分) 指纹图谱系指采用光 谱、色谱和其他分析方法建立的用以表征中药化学成分的特征的指纹图谱。化学 指纹图谱技术可分为光谱( 波谱) 和色谱指纹图谱技术，其中色谱指纹图谱技术具 有分离和鉴别的双重功能，真实、有效地从整体角度反映样品内部化学特征信息， 集系统性、概率统计性和多元性互补于一身【6 5 1 。近年来，越来越多地从化学计量 学、系统生物学、药效学等多学科的研究角度，为药用植物化学成分和质量鉴定 研究、药用植物化学成分和药效功能研究之间搭建了重要的桥梁。 中药指纹图谱研究须经过制各、分析、比较、评价和校验等过程。分析色谱 指纹图谱要求“准确的辨认”丽不是“精密的测量”；比较供试品与对照品的色 谱指纹图谱是要求“相似”而不是“相同”；评价色谱比较的结果，是根据色谱 指纹图谱的模糊属性，着眼于宏观的规律的特征分析，全面、综合地反应和控制 中药或天然药物质量，它不能代替含量测定，但比含量测定提供的信息更多，更 全面。其中应用最为广泛的是h p l c ( 高效液相色谱指纹图谱技术) 。总的来说， 中药指纹图谱是一种综合的、宏观的和可量化的鉴别手段，用以对中药材和中成 药进行鉴别真伪，评价原料药材、半成品和成品质量的均一性和稳定性【矧。 二、中药指纹图谱研究内容 ( 一) 中药指纹图谱测试 针对中药材( 炮制品、饮片) 以及各类中药复方制剂，研究不同的样品制备方 法及有效组分的分离方法。主要包括以下内容： ( 1 ) 中药有效组分提取及分离方法研究及其规范化； ( 2 ) 色谱分离分析条件优化技术研究； ( 3 ) 多维、联用分析新技术方法学研究； ( 4 ) 指纹图谱中活性成分分析与鉴定； ( 5 ) o o 药指纹图谱分析方法规范化研究。 ( 二) 指纹图谱鉴别方法 指纹图谱鉴别方法研究主要包括： ( 1 ) 中药指纹图谱化学特征信息的提取方法研究； ( 2 ) 同一分析方法不同检测方式及不同分析方法获得的多源检测数据间的相关 性； ( 3 ) 指纹图谱相似度计算方法； ( 4 ) 中药指纹图谱的快速处理方法； ( 5 ) 建立中药指纹图谱鉴别计算方法体系。 ( 三) 中药药效组分筛选及检测方法学 针对研究药材、方剂的功效和所涉及的有关作用靶位或靶点，开展从整体、 器官、细胞和分子生物学等不同层次和水平药理学研究，寻找能够较准确反映方 剂药效或功能主治，并具备快速、准确、样品用量小的活性筛选指标，在建立快 速中药体内外组分检测方法的基础上，寻找中药的药效组分群，并建立中药药效 指纹图谱，从而形成一套完整的中药药效组分快速筛选体系和方法。主要包括： ( 1 ) 中药药效组分靶细胞动态高密度培养技术和模型的建立； 9 ( 2 ) 中药药效组分细胞反应器计算机控制及在线检测的研究； ( 3 ) 中药药效组分快速筛选方法关键技术研究； ( 4 ) 中药复方体内组分的多指标检测方法学研究。 ( 四) 中药指纹图谱组效学 在中药化学指纹图谱、药效物质成分鉴定和中药药效活性测定的基础上，充 分利用现代化学与生物信息学研究的成果，开展指纹图谱信息与药效活性信息的 相关性研究，以实现中药化学指纹图谱向中药药效组分指纹图谱的转化，从而建 立中药指纹图谱组效学研究体系。 ( 五) 中药指纹图谱质量控制 将中药指纹图谱应用于中药材的真伪鉴别及质量评价、中药制剂生产工艺全 过程的质量控制和最终产品的质量评价、中药新药开发研究。主要包括： ( 1 ) 在中药材的真伪鉴别及质量评价中的应用； ( 2 ) 在中药制剂生产工艺全过程的质量控制和最终产品的质量评价； ( 3 ) 在中药新药开发中的应用研究。 三、 现行中药色谱指纹图谱研究工作的一般流程【6 7 “8 】 步骤l ：供试品收集，获取中药或中药材并编号，标明产地、来源等( 收