（分析化学专业论文）配合物型电化学活性非活性转换分子信标的设计及其性质研究.pdf

谭雪莲：2 0 0 8 届华东师范大学硕士学位论文申请 论文摘要 d n a 电化学传感器是由特定序列的d n a 和电化学识别物质组成的。特定 序列的d n a 起着选择性识别特异靶基因的作用，根据电化学识别物质在杂交 前后的电化学信号变化可以测得靶基因是否存在和含量的多少。这种利用d n a 双链的碱基互补配对原则发展起来的d n a 生物传感技术，受到生物分析工作 者的高度重视。同时电化学检测方法以其灵敏度高、轻巧便宜、携带方便、耗能 少、能与现代微电子技术联用、易于实现微型化等优点，受到了研究者们的广泛 关注。d n a 电化学传感器在疾病控制，环境检测和药物筛选等方面的研究必将 具有深远的意义和应用价值。 分子灯塔也叫分子信标，它是近几年兴起的利用核酸杂交技术对核酸分子进 行检测的新技术，具有快速、简便的特点。它的建立为研究核酸分子的组成、含 量提供了快速、特异、方便的新手段，在基因检测领域有着广阔的应用前景。传 统的分子信标( m o i e c u i a rb e a c o n s m b ) 是基于荧光共振能量转移原理设计的 寡核苷酸探针。随着对m b 特性的深入研究，m b 已被设计成各种形式和不同功 能的探针，并成功地应用于p c r 实时监控、基因突变的快速分析、d n a 和r n a 的检测、d n a 杂交的动力学研究以及d n 蛋白质相互作用研究等。 本论文利用电化学技术，结合分子信标技术制备配合物型电化学活性一非活 性转换分子信标，并对其热力学和电化学行为进行研究。该配合物型电化学活性 一非活性转换分子信标既保留了分子信标本身的高灵敏性，高特异性；又引入了 电化学检测方便可靠的优点，具有较高的专一性和灵敏度；同时形成配合物型电 化学活性非活性转换分子信标大大提高了电化学分子信标的热稳定性，改善了 电化学分子信标的熔链温度，为实时p c r 检测及在溶液中直接进行生物分子识 别提供了思路。这种配合物型电化学活性一非活性转换分子信标为基因诊断，蛋 白分析和p c r 实时监控及基因芯片的研制提供了很好的思路和有效的依据。 本论文分为四章： 谭雪莲：2 0 0 8 届华东师范大学硕士学位论文申请 第一章绪论 主要介绍分子信标的结构、原理、主要影响因素、应用以及发展前景：同时 概述了电化学分析方法的特点、分类和在d n a 检测中的应用，介绍了电化学和 分子信标结合的最新进展及展望。最后阐述了本论文的研究目的和意义以及新颖 之处。 第二章配合物型电化学活性一非活性转换分子信标( m n + c a s - mb ) 的设计及表征 本章详细阐述了高热稳定电化学活性一非活性分子信标的设计和合成：将具 有灵敏电化学响应信号的胭脂红酸偶联到分子信标上，作为电化学活性非活性 信号分子，利用分子信标发卡结构和它与目标序列作用后发生构型改变，使胭脂 红酸分子可在缔合状态和解离状态( o f f 0 n ) 间变化，从而令其具有在电化学 活性一非活性间切换的能力，用于构建新型非固定性电化学分子信标：再加入金 属离子形成配合物，以提高分子信标的热稳定性。同时利用紫外一可见光谱对胭 脂红酸金属配合物以及胭脂红酸金属配合物型电化学活性一非活性转换分子信 标进行表征。结果表明，金属离子的加入有效地提高了电化学分子信标的热稳定 性。由于金属、配体可以改变的特点，因此对电化学分子信标的结构设计具有广 泛的灵活性。而这一系列的研究工作对电化学活性一非活性转换分子信标的发展 具有重要的意义。 第三章配合物型电化学活性一非活性转换分子信标( m n + c a s - m b ) 热力学研究 热力学研究可以对反应过程的热行为及影响因素进行深入的了解和探索，目 前有关分子信标热力学方面的研究已有报道。本章对设计的配合物型电化学活性 一非活性转换分子信标进行了详细的热力学探究，计算了配合物型电化学活性一 谭雪莲：2 0 0 8 届华东师范大学硕士学位论文申请 非活性转换分子信标的热力学参数，同时，对不同配合物组成的电化学活性一非 活性转换分子信标的差异性进行了研究；从理论上推导了不同金属离子配合物组 成的电化学活性一非活性转换分子信标对热稳定性的影响，结果证明金属配合物 型电化学活性一非活性转换分子信标具有高的热稳定性，可直接在溶液中进行杂 交识别，实现对活体细胞进行直接电化学识别检测，以及实时p c r 电化学检测。 第四章配合物型电化学活性一非活性转换分子信标( m n + c a s m b ) 分子信标的电化学行为研究 将电化学检测技术与高特异性的分子信标技术结合是d n a 分析检测的趋 势，而如何将电化学分子信标用于溶液检测，提高热稳定性，进行实时p c r 检 测是关键所在。本章对热稳定电化学活性一非活性转换分子信标进行了电化学行 为研究，结果表明金属离子的加入改善了电化学活性一非活性转换分子信标的热 稳定性，提高了其熔链温度t m 。同时金属离子的加入并没有改变分子信标的杂 交过程。另外，金属离子对分子信标热循环的回环率也有一定影响：金属离子地 加入使得电化学分子信标在开始阶段受热循环的影响明显减小。 关键词：胭脂红酸，配合物，电化学分子信标，电化学分析，电化学传感器，热 力学研究，活性非活性转换 a b s t r a c t d n af - r o mas p e c i f i ce l e c t r o c h e m i c a ls e n s o r si sm ed n as e q u e n c et 0i d e n t i 匆 m a t e r i a ja r l de l e c t r o c h e m i c a lc o m p o n e n t s s p e c i f i cs e q u e n c eo fd n ap l a y sas e l e c t i v e r e c o g n i t i o no ft l l er o l eo fs p e c i f i ct a 玛e tg e n e s ，a c c o r d i n gt oi d e n t i 母m a t 耐a l i nt h e e l e c t r o c h e m i c a lh y b r i de l e c t r o c h e m i c a ls i g i l a l sb e f o r ea i l d 啦e rt h ec h a n g eo ft a 唱e t g e n ec 锄 b em e a s u r e di i lt h en u m b e ra i l dw h e t h e rt h e r e 1 1 1 i su s eo ft h e d o u b l e s t r a n d e dd n ac o m p l e m e n t a d rb a s ep a i r so fd n ai np r i l l c i p l et od e v e l o p b i o l o g i c a ls e n s i n gt e c h n o l o g y ；b i o a n a l y s i so fw o r k e r sb yt h eh i g hd e g r e eo fa 骶r l t i o n a tt 1 1 es a m et i m ee l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o nm e t h o df o ri t sh i g hs e n s i t i v i 坝1 i g h t 、e i g h t c h e a p ，e a s yt oc 锄吼l e s se n e 玛y - c o n s u m i n g ，a n dc 锄b ec o m b i n e dw i t hm o d e m m i c r o e l e c t r o n i c st e c h n 0 1 0 9 y ，e a s yt or e a l i z e l ea d v a n t a g e so fm i n i 砌z a t i o 玛t h e r e s e a r c h e r sh a v eb e e nw i d e s p r e a dc o n c e m d n ae l e c t i o c h e m i c a ls e n s o r si nd i s e a s e c o n t r o l ，e n v i r o 眦e n t a lt e s t i n ga n dd r u gs c r e e n i n g ，a 1 1 do t h e ra s p e c t so ft h es t u d yw i l l h a v ef a r - r e a c h i n gs i g n i f i c a n c ea n dv a l u e m o l e c u l a rb e a c o ni sa j s oc a l l e dm o l e c u l a rb e a c o n s ，i ti st h er i s ei nr e c e n ty e a r s m eu s eo fi m c l e i ca c i dl l y b r i d i z a t i o no fm ed n am o l e c u l ef o rt e s t i n gt h en e w t e c l m o l o g y ，i sf 瓠t ，c o n v e m e n tf e a t l l r e s t h ee s t a b l i s h m e n to fd n a m o l e c u l e st os t u d y t h ec o m p o s i t i o n ，c o n t e n tt op r o v i d ear 印i d ，s p e c i f i ca n dc o n v e n i e n tn e wm e t h o d ，i 1 1 t h ef i e l do fg e n e t i ct e s t i n gh a u sb r o a dp r o s p e c t s 7 n l et r a d i t i o n a le l e m e n t sb e a c o n s ( m o l e c u l a rb e a c o n s ，m b ) i sb a s e do nt h ep r i n c i p l eo fn u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e 唱y 乜。a n s f - e rd e s i g no l i g o n u c i e o t i d e ，w i t ht h em bo fi n d e p t hs _ t l j d y ；m bh a sb e e nd e s i g n e d i n t 0av a r i e t yo fd i 虢r e n tf o m l sa j l d 劬c t i o n so ft h ep r o b ea n ds u c c e s s 如l l ya p p l i e d t om o n i t o r r e a l t i m ep c r ，ar 印i da n a l y s i so fg e n em 吡l t i o n ，d n aa n dr n a t e s t i n g ， d n a h y b r i d i z a t i o na n dt h ek i n e t i c so fd n a p r o t e i ni n t e r a c t i o ns t u d i e s t m sp a p e ru s ee l e c t r o c h e m i c a lt e c h n o l o g y ，c o m b i n e dw i t hm o l e c u l a rb e a c o n s t e c l u l o l o g yc o m p l e xt y p eo fe l e c t r o c h e m i c a la c t i v 时- a c t i v i t ) ro fn o n - c o n v e r s i o no f b e a c o n s ，t h e i ra c t so ft h e 彻o d y i l 锄i c sa n de l e c t r o c h e m i c a ls t u d yo ft h ec o m p l e x e l e c 仃o c h e i l l i c a la c t i v e i n a c t i v eac o n v e r s i o no fm 0 1 e c u l a rs u p e r s c r i p tb o t l lm e m o l e c u l a rb e a c o n sr e t a i nt h e i ro w n1 1 i 曲- s e n s i t i v i 吼h i 曲s p e c i f i c 时a n dt h e i n t r o d u c t i o no f l ee l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o no ft h ea d v 锄t a g e so fc o n v e l l i e n ta 1 1 d r e l i a b l e ，h a sah i 曲s e n s i t i v 时a n ds p e c i f i c i t y ，w 1 1 i l eac o m p l e xo fe l e c t r o c h e m i c a l a c t i v i t y -a c t i v i t ) ro fn o n c o n v e r s i o nm o l e c u l a rb e a c o n sg r e a t l yi n c r e a s i n gt 1 1 e e l e c t r o c h e 血c a lm o l e c u l a rb e a c o n sm e n n a ls t a b i l 峨i i l 】【p r o v et h ee l e c t r o c h e m i c a l m o l e c u l a rb e a c o n sm e l t i n gt e m p e r a ：t u r el i n k e dt 0r e a l t i m ep c ra n di ns o l u t i o n d i r e c t l y t om ei d e n t i f ；i c a t i o no f b i o l o g i c a l m o l e c u l e si d e a s t h i sc o m p l e xo f e l e c t r o c h e m i c a la c t i v i t y - a c t i v i t yo fn o n c o n v e r s i o nm o l e c u l a rb e a c o nf o rg e n e t i c d i a g n o s i s ，a i l dp c ra i l a l y s i so fr e a l - t i m em o 血t o r i n gp r o v i d e dag o o di d e af o rt h e d e v e l o p m e mo fg e n ec h i p st op r o v i d ea j le f ! l e c t i v eb a s i s t h i sp 印e ri sd i v i d e di n t of i o u rc h a p t e r s ： c h a p t e rl i n t r o d u c t i o n m o l e c u l a rb e a c o n so nt h em a i ns t m c t u r e ，州n c i p l e ，t h em a i nf a c t o r s ，a p p l i c a t i o n a 1 1 dd e v e l o p m e n tp r o s p e c t sa tt h es 锄et i m eo u t l i n e dt h ee l e c t r o c h e m i c a la n a l y s i so f t l l e c h a r a c t e r i s t i c s ， c i a s s i f i c a t i o na 1 1 di nt h ea p p l i c a t i o no fd n at e s t so nt h e e l e c t r o c h e m i c a ja n dm 0 1 e c u l a rb e a c o n sw i mm el a t e s td e v e l o p m e n t sa 1 1 dp r o s p e c t f i n a l l yt h i sp a p e rd e s c r i b e dt 1 1 ep u 印o s ea n ds i g m f i c a n c eo fr e s e a r c ha n dn e w i ni t c h a p t e r2s y n t h e s i z a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no ft h ee l e c t r o c h e m i c a l a c t i v e - i n a c t i v em o l e c u i a rb e a c o n sb a s e do nc o o r d i n a t i o nc o m p o u n d s t 1 1 i sc h a p t e re l a b o r a _ t eo nt h es t a b i l i t yo fh i 曲f e v e re l e c t r o c h e m i c a la c t i v 时 a c t i v i t ) ，o fn o n - m o l e c u l a rb e a c o n sd e s i g na n ds y n t h e s i s ：as e n s i t i v ee l e c t r o c h e m i c a 】 s i g n a l si nr e s p o n s et oc 锄i n ea c i dc o u p l i n gt 0t 1 1 e m o l e c u l a rb e a c o i l s ，鹊t 1 1 e l i e l e c t r o c h e m i c a la c t i v e i n a c t i v es i g i l a lm o l e c u l e ，u s i n ge l e m e n t sb e a c o nc r e d i tc a r d i s s u e r ss t m c t u r ea n ds e q u e n c eo fi t sr o l ea 1 1 do b j e c t i v e s 世e rt h ec o i 删i o nc h a n g e ， c a r m i n ea c i dm o l e c u l ei nm es t a t ea u s s o c i a t i o n 丘o mt h es t a t eo fr e c o n c i l i a t i o n ( o f f o n ) i n t e r - c h a i l g e s ，w m c hi si ni t se l e c t r o c h e m i c a la c t i v e i n a c t i v e t h ea b i l i t yt ob u i l d an e wn o n - f i x e de l e c t r o c h e m i c a lm o l e c u l a rb e a c o n s ；a d d e dm e t a li o n sf o r mc o m p l e x ， m 0 1 e c u l a rb e a c o n st oi n c r e a s et h e 订n a ls t a b i l i 够a tt h es 锄et i n l eu s i n gi 幽- a r e da i l d u l t 舢i o l e ts p e c t n 肛no fc 锄m i n ea c i dm e t a lc o m p l e x e sa n dc 锄i n ea c i d - m e t a l c o m p l e xe l e c t r o c h e m i c a lm o l e c u l a rb e a c o n s 、e r ec h 蹦l c t e r i z e d t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h ea d d i t i o no fm e t a li o n se 髓c t i v e l yi m p r o v e 也ee l e c t r o c h e m i c a lm o l e c m a r b e a c o n st h e h i l a ls t a b i l i 够a sm e t a l s ，l i g a j l dc a l lc h a n g e ，s ot l l ee l e c 仃o c h e m i c a l m o l e c u l a rb e a c o n ss t n l c n l m ld e s i g no faw i d er a n g eo fn e x i b i l i t y t h i ss e r i e so f s t u d i e so nm ee l e c t r o c h e m i c a la c t i v e i n a c t i v eo fc o n v e r s i o no fn o n d e v e l o p m e n to f m o l e c u l a l rb e a c o n si so fg r e a ts i g n i f i c a j l c e c h a p t e ri i i t h et h e r m o d y n a m i c ss t u d yo nt h ee i e c t r o c h e m i c a i a c t i v e i n a c t i v em o l e c u i a rb e a c o n sb a s e do nc o o r d i n a t i o nc o m p o u n d s t 1 1 i sc h a p t e ro nt h ed e s i g no ft h ec o m p l e xe l e c t r o c h e m i c a la c t i v e - 洫a c t i v eo f n o n - c o n v e r s i o no fb e a c o n sc a 玎i e do u tad e t a j l e dt h e n n o d y n a m i c sr e s e a r c h ， a c o m p l e xc a l c u l a t i o no fe l e c t r o c h e m i c a la c t i v 时 - a c t i v i t ) ro fn o n - c o n v e r s i o no f b e a c o l l st h e n n o ( i y n a m i cp a r 锄e t e r s ，a tt 1 1 es 锄et i m e ，t h ec o m p o s i t i o no fd i 成r e n t c o m p l e x e st h ee l e c t r o c h e m i c a la c t i v i 够- a c t i v i 够o fn o n - c o n v e r s i o no fm o l e c u l a r b e a c o n sd i a e r e n c e sw e r es t u d i e d ； t h e o r e t i c a l l y d i 疗e r e n tm e t a li o n s c o m p l e x c o n s i s t i n go fe l e c t r o c h e m i c a la c t i v e i n a c t i v eo fn o n c o n v e r s i o no fb e a c o n so nm e i m p a c to ft l l e 肌a 1s 切b i l i t y ，r e s u l t ss h o w e dt h a tm e t a lc o m p l e xo fe l e c t r o c h e m i c a l a c t i v e i n a c t i v eo fn o n c o n v e r s i o nm 0 1 e c u l a rb e a c o nh a sah i 曲t h e m l a ls t 乏顺l i 以a n d t h ed i 肫r e n tc o m p o s i t i o no ft h em e t a lc o m p l e xe l e c t r o c h e m i c a lm o l e c u l a rb e a c o n s t h e 咖a ls t a b i l i t yo fd i f f e r e n t c o n l p l e xo fe l e c t r o c h e m i c a la c t i v eac o n v e r s i o no f h i g h - m o l e c u l a rb e a c o n ss t a b i l i 吼t h es o l u t i o nd e m a i l d sal o w 饥i r b i d i 饥e x p e r i m e r 姐l l i i s p e e d ，l o wb a c k 铲o u n ds i g n a l ，w i m o u tw a s h i n g ，e q u i p m e n ts i m p l ea j l de 2 l s yt oo p e r a t e ， f - a c i l i t a t ef i e l dt e s t i n ga n dc h i pt e c h n o l o g y f l u o r e s c e n tm o l e c u l e st 0o v e r c o m et h e l a c ko fs o m eb e a c o n s c o m p l e xo fe l e c t 】o c h e m i c a la c t i v e - i n a c t i v eo fn o n - c o n v e r s i o n o f b e a c o n s 谢ub ed i r e c t i yi nt h eh y b 瑚s 0 1 u t i o nt oi d e n t i 黟a n dr e a l i z em el i v i n gc e l l s t o i d e n t i 矽d i r e c t e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n ， a n dr e a l t i m ep c rd e t e c t i o no f e l e c t r o c h e m i c a la p p l i c a t i o r 塔 c h a p t e r i vt h ee i e c t r o c h e m i c a i s t u d y o nt h ee l e c t r o c h e m i c a l a c t i v e i n a c t i v em o l e c u l a rb e a c o n sb a s e do nc o o r d i n a t i o nc o m p o u n d s w i l lb ee l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o nt e c h n o l o g ya n d1 1 i 曲s p e c i f i c 时o ft h e m o l e c u l a rb e a c o n st e c h n 0 1 0 9 yi st h ec o m b i n a t i o no fd n aa n a l y s i sd e t e c t e dt h et r e n d ， a 1 1 dh o wt oe l e c t r o c h e m i c a lm o l e c u l a rb e a c o n sf o rs 0 1 u t i o nt e s t i n g ，i m p r o v e m e n to f t h e m a ls t a b i l i 吼r e a l - t i m ep c r t e s t i n gi se l e c 仃0 c h e m i c a lm o l e c u l a rb e a c o n sk e y t h i sc h 印t e ro ft h eh e a t - s t a b l ee l e c t r o c h e m i c a la c t i v i t ) ，- a c t i v 埘o fn o n - c o n v e r s i o no f ab e a c o no fe l e c t r o c h e m i c a lr e s e a r c hr e s u l t ss h o wt l l a tt h ea d d i t i o no fm e t a l i o n st o i m p r o v et 1 1 ee l e c 仃o c h e m i c a la c t i v i 够- a c t i v i 够o fn o n m o l e c u l a rb e a c o l l sc o n v e r s i o n o ft h e m a ls t a b i l i 吼i t sc h a i no ft e r n p e r a n _ l i et m a tm es a m et i m em ea d d i t i o no f m e t a l i o n st h e r ei sn oc h a n g ei nm o l e c u l a rb e a c o n sh y b r i dp r o c e s s i na d d i t i o l l ，t h e m e t a li o n so nm em o l e c u l a rb e a c o n so ft h el o o pr a t ec y c l eh a ss o m ei r i l p a c t ：t h e a d d i t i o no fm e t a li o n sm a k e se l e c t r o c h e m i c a lm o l e c u l a rb e a c o n si nt h eb e g i m n g s t a g e so fh e a t i n gs i g n j f i c a r l t l yr e d u c e dt h ei r n p a c to fr e c y c l i n g k e yw o r d s ：c 踟l i n ea c i d ， e l e c t r o c h e m c a lm o l e c u l a rb e a c o n s ， e l e c t r o c h e m i c a l a n a l y s i s ，e l e c t r o c h e m i c a ls e n s o r s ，t h e m l o d y n a m i c so f a c t i v e - i n a c t i v e 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经 发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在 文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名：j 蜓日期：删 学位论文使用授权声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权 将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有 权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要 汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 学位论文作者签名蹿嚆翌导师签 日期： 日期： 第一章绪论 第一章绪论 d n a 是遗传信息的载体，具有储存和传递信息的功能，绝大多数生物体的 遗传信息储存在d n a 分子中，d n a 的复制构成了遗传分子基础【1 】。传统的d n a 检测是基于直链碱基之间的杂交反应1 2 1 。1 9 9 6 年t y a g i 和k r a m e r 首次报道【3 1 了一 种具有发夹结构的新型荧光核酸探针分子信标( m o i e c u i a r b e a c o n ) ，最初目 的是能在液相中定量测定靶标的量。分子信标的特殊发卡式结构使之具有高度的 杂交特异性，能够检测单碱基突变，这是线性探针难以做到的。自由状态时的分 子信标呈发夹结构，此时由于荧光基团与猝灭基团靠得很近，荧光被猝灭；当与 靶序列结合后，分子信标的空间构型发生改变，荧光恢复。分子信标技术操作简 单、灵敏度高、特异性强、可对核酸进行实时定量测定、甚至可以用于活体分析， 不仅在生物学研究中有着广泛的应用，而且在疾病基因检测与诊断等生物医学基 础和临床研究中也将充当重要的角色m 】。近来，人们通过改变经典分子信标的结 构，设计出许多新型的分子信标，如用s s d n a 链做环【刀、用r n a d n a 双链做茎 的r n a d n a 嵌合型分子信标【踟，用p n a 链代替s s d n a 形成的p n a 分子信榭9 】等。 新型分子信标的出现为分子信标的进一步应用拓宽了领域。 电化学分析法以其仪器简单，操作方便，分析速度快，所使用仪器便于与计 算机联机自动化，日益受到人们的关注【1 0 - 12 1 。与常规的d n a 检测相比，电化学 分析法有以下特点：可进行实时检测；可对活体内核酸进行动态检测； 可进行的大量智能化检测；灵敏度高；无污染。目前应用电化学生物传感 器分析法是测定d n a 的研究主要方法之一。电化学分析法检测d n a ，实验速度 快，灵敏度高，检出限低，同时仪器简单，操作方便，实验条件易控制，克服了 光度法等方法的一些不足【1 3 。1 剐。目前电化学生物传感器的研究日新月异，并趋向 微型化、集成化和智能化，在临床、食品、环境、生化工业甚至机器人等方面应 用广泛【僖1 9 1 。但是由于电化学d n a 生物传感器使用的材料和检测的物质都具有 生命活性，他们的寿命常受环境中各种有害气体以及微生物的侵袭而失活，有些 酶生物传感器甚至一旦离开生物体，寿命就大大降低，同时电化学d n a 生物传 第一章绪论 感器稳定性差。因此有些研究还处在探索试验阶段。目前分析工作者从研究新型 电极和新的电化学分析方法入手，改进现有电极和分析方法的不足，深入探讨电 化学分析检测d n a 的机型2 0 1 ，新型电化学d n a 生物传感器方面的研究工作尤其 活跃，使d n a 的检测向高精度、高敏度、高稳定性方向发剧2 化3 1 。 本文绪论部分主要介绍分子信标的结构、原理、主要影响因素、应用以及发 展前景；同时概述了电化学分析方法的特点、分类和在d n a 检测中的应用，介 绍了电化学和分子信标结合的最新进展及展望。最后阐述了本论文的研究目的和 意义以及新颖之处。 1 分子信标技术及其发展 1 1 分子信标简介 1 9 9 6 年t y a g i 和k r a m e r 首次报道了一种具有发夹结构的新型荧光核酸探针一 一分子信标( m o i e c u i a rb e a c o n ) 【3 】，它是一种基于荧光共振能量转移 ( f | u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f er if r e t ) 原理而设计的发夹型寡核苷 酸荧光探针【2 4 1 。通过设计一段与特定核酸互补的寡聚核苷酸序列，两端为3 5 个互补碱基，使分子信标的空间结构呈茎环状，其中分子信标的环状区与靶分子 ( 单核酸) 互补，茎的一端连有一个荧光分子，另外一端连有一个淬灭分子。当 靶分子不存在或不能与环状区完全互补时，分子信标仍呈茎环结构，此时由于荧 光分子和淬灭分子靠的很近，荧光被淬灭，检测不到荧光信号：当靶分子存在时， 它与环序列特异性结合，形成稳定的双链体，分子信标打开，空间结构发生改变， 荧光分子和淬灭分子分开，此时荧光不被淬灭，可以检测到荧光【2 5 - 2 刚。 分子信标具有背景信号低、灵敏度高、特异识别性强、操作简单及不必与未 反应的探针分离即可实时检测、可用于活体内核酸动态检测等优点。它广泛地应 用于生物化学分析及疾病基因检测与诊断等生物医学基础和临床研究【2 7 】。 1 2 分子信标的结构与优点 1 2 1 分子信标的结构 分子信标的设计一般包括三个部分【2 8 3 0 1 ，如图1 所示： ( 1 ) 环状区：一般为长度1 5 3 0 碱基的序列，能与目标分子特异结合； 2 第一章绪论 ( 2 ) 信标茎干区：通常为长度5 8 个碱基的互补序列，由于茎干区与杂交 后环状区一目标分子的双链结构之间存在一定的热力学平衡关系，使分子信标的 杂交特异性明显高于常规的线状探针； ( 3 ) 荧光基团和猝灭基团，荧光基团一般联接在信标分子的5 端；猝灭 基团联接在3 端。图1 为经典的分子信标结构【3 1 ，其中1 氨基萘8 羧酸( e d a n s ) 为荧光素，二甲氨基偶氮苯甲酰( d a b s y l ) 为猝灭剂。分子信标中常用4 ( 4 一二 甲基氨基偶氮苯基) 苯甲酸( d a b c y l ) 作为猝灭基团，德克萨斯红( t e x a s r e d ) 、 荧光素( f i u o r e s e i n ) 等作为荧光基团。 图l 经腆分子信标结构 1 2 2 分子信标的优点 分子信标作为一种新型的检测工具，具有许多优点： ( 1 ) 可进行液相杂交检测：常规核酸检测方法主要为固相杂交，要把未结 合的探针和引物分离后才能利用其他信号对靶核酸进行检测。分子信标可以直接 加入核酸扩增体系进行检测，在紫外灯下或借助荧光光谱仪进行定量检测【3 1 - 3 2 1 。 ( 2 ) 有效消除核酸交叉污染：利用分子信标可以直接对封闭微量离心管或 多孔板中的核酸检测，完全避免核酸中间操作环节，彻底消除核酸交叉污染。 ( 3 ) 特异性强：与线性寡核苷酸探针相比，具有茎环结构的分子信标检测 特异性更高，对靶分子的检测可以达到单碱基的水平，即单个碱基的错配、缺失 或插入突变均能检测出来【3 3 1 。 ( 4 ) 灵敏度高：分子信标可以直接检测核酸，在与p c r 等核酸扩增技术 联合应用时，低至单拷贝的核酸也能检测出来【。 ( 5 ) 可进行核酸实时检测：在p c r 体系中加入分子信标，并把p c r 仪与荧 光光谱相连，可以对p c r 反应过程随时进行实时监测。 第一章绪论 1 3 分子信标的作用原理、设计和标记 1 3 1 分子信标的作用原理 自由状态时，发夹结构的两个末端靠近，使荧光分子与猝灭分子靠近( 约为 7 10n m ) ，此时发生荧光共振能量转移，使荧光分子发出的荧光被猝灭分子吸 收并以热的形式散发，荧光几乎完全被猝灭，荧光本底极低。图2 为分子信标的 工作原理，当分子信标与序列完全互补的靶标分子结合形成双链杂交体时，信标 茎杆互补区被拉开，荧光分子和猝灭分子距离增大。根据f o e r s t e r 理论，中心荧 光能量转移效率与两者距离的6 次方成反比。杂交后，信标分子的荧光几乎1 0 0 恢复。且所检测到的荧光强度与溶液中靶标的量成正比。 + 广飞= _ 、 分二f 信标靶序列猝灭基团杂交荧光基团 图2 分予信标工作原理 1 3 2 分子信标的设计 分子信标中最常用的猝灭剂是d a b s y l ，它对多种荧光素都有较强的荧光猝 灭效率。近来d u b e r t r e t 【3 5 l 等用金纳米粒子簇代替d a b s y l 做猝灭剂，还可以通 过调节金属纳米簇的形状、大小和组成而得到不同的猝灭剂。由于金纳米簇对荧