（作物遗传育种专业论文）大豆细胞质雄性不育系与保持系线粒体DNA的RAPD分子标记.pdf

吉林农业太学硕士学位论文太豆细胞质雄性不育系与保持系线粒体n 瞰的r a p d 分寻标记 摘要 随着分子生物学的发展，有关细胞质雄性不育( c y t o p l a s m i ci l i a l es t e r j l i t y ，c m s ) 机理的研究取得了大量进展。在玉米、矮牵牛、水稻、小麦、油菜、向日葵和菜豆等不 育胞质的线粒体基因组上已找到了可能与c m s 有关的基因座位。同其它作物相比，大豆 c m s 的研究进展缓慢。自1 9 93 年吉林省农科r 完- t , i 、寰等发现世界上第一个大豆细胞质雄性 不育系以来，该领域的研究和应用取得了可喜的进展，但是对其分子机理的研究报道尚 属空白， 本实验以栽培大豆的三对不育系和保持系材料( j l c m s i - i a ，j l c m s l 1 b 、j l c m s 卜2 a 、 j l c m s 卜2 b 、j l c m s l 3 a 、j l c m s l - 3 b ) 为研究对象( 成对材料间为严格的同核异质材料) ， 通过随机扩增多态d n a ( r a n d o m l ya m p l i f i e c tp o l y m o r p h i cd n a ，r a p l ) ) 技术，对走豆不 育系与保持系线粒体基因组进行扩增，旨在探讨大豆不育系与保持系线粒体基因组间的 差异，为大豆细胞质雄性不育相关基因的分离鉴定打下基础，并为揭示大豆细胞质雄性 不育( c m s ) 的分子机制提供理论依据。 对大豆线粒体基因纽进行r a p d 分析，模板d n a 的质量要高，即不能含有蛋白质或 核d n a 等的污染。参考其它作物线粒体d n 的提取方法，经改进后所提取的大豆线粒 体d o a 样品经琼脂糖凝胶电泳分析、0 d 值测定，结果表明其得率和纯度可以满足p c r 扩增g 酶切分析和线粒体特异i 物的扩增结果显示，线粒体硝a 不舍有核d n 的污染。 本研究首先建立了稳定、高效的r a p d 反应体系，然后利用o p e r o n 会司的4 0 0 个随 机单引物( o v a o p t 系列，和1 4 纽双引物对供试材料进行扩增，大部分引物均有清晰稳定 的扩增产物。r a n ) 反应体系具体参数如下：d n t p s 浓度为0 1 啦m 0 1 l ；t a q 酶用量为2 u ； 模板d n 浓度为0 4 r i g “l ；引物浓度为o 8 r i g _ ul 。 r a n ) 分析中，有些特异带只出现在不育系上，而在保持系相应的位置上没有。如引 物o p e o i 、o p l k 0 7 、o p l l 2 、0 p i ( 0 4 、o p p l 7 、o p n 0 3 、o p i ) 0 2 和o p d 2 0 仅在不育系上出现特 异带。植物的线粒体基因组容易因9 n a 片段酌插入、缺失或重组而引起控制花粉可育功 能的基因发生突变，从而使育性发生改变。这些特异扩增的片段只出现在不育系上，说 明不育系的线粒体基因组可能比保持系的线粒体基因组多出莱段序列或发生了基因重 组而引起基因组织结构的改变，并最终引起大豆细胞质雄性不育。 相反，有1 6 个引物( o p a l 2 、o p b 0 6 、o p i ) i l 、o p d l 8 、0 p h l 8 、0 p 1 0 6 、o p l 0 9 、o p k 0 7 、 o p l d s 、o p l l o 、o p l l3 、o p t 0 6 、o p p 0 9 、o p p l5 、o p q l3 、o p r 0 3 ) 仅在保持系上获得了一 蒂或多条特异扩增片段，说明不育系的线粒体基因组比保持系的线粒体基因组缺少莱段 序列使差异产生。这种仅出现在保持系上的特异片段在数量上要多于出现在不育系上的 吉林农业大学硕士学位论文大豆细胞质雄性不育畚与保持系线粒体d n a 的r a p d 分子标记 特异片段数量。可能反映了长期进化过程中，保持系线耘体d n a 具有很强的保守性，而 不育系线粒体d n a 在核质互作中容易受到内在或外在因素的影响，导致序列发生变化， 进而失去与同一引物较多的结合机会。菜豆申，与不肓相关的线粒体基因p v s 就是在不 育系中缺失导致不育产生的。因此，在大豆r a p d 分析中出现在保持系上的特异扩增条 带对细胞质雄性不育的研究具有重大的价值。 在双引物扩增中，1 4 组双引物的r a p e ) 实验结果与对应的两个单引物扩增结果，只 有4 组( o p f 0 3 o p f 0 6 ，o p b 2 0 0 p 1 1 4 ，o p g i3 o p p l 7 ，o p g i3 o p d l8 ) 是完全一致的，其 余1 0 组与原来的单引物扩增结果均有差异。说明r a p d 双引物扩增揭示出了单引物所检 测不到的多态性，双引物扩增实验可以作为单引物扩增的丰富和补充。 另外，本实验申所涉及到的在供试材料间存在差异的引物，有一部分( o p a l2 、o p h 】8 、 o p l0 9 、o p h 0 7 ) 在其它作物( 油菜、大白菜) 不育基因的研究中也存在多态性标记，这 暗示着植物细胞质雄性不育在分子基础上可能存在一些共性。 本研究证明，应用r a p d 技术可以快速高效地检测线粒体d n a 在不育系和保持系 之间的遗传多态性，在分子水平上揭示c m s 的形成机制。通过r a p d 方法研究大豆线粒 体d n a ，初步筛选到一些可能与细胞质雄性不育有关的线粒体d n a 分子标记。针对所获 得的部分差异片段，我们正在进行进一步的验证实验。将这些差异片段回收，克隆，测 序，并分祈基因的序列结构与功能，进一步确定郦些片段与不育相关，从而为在分子水 平上研究大豆细胞质雄性不育的机理奠定基础。 关键词：大豆，细胞质雄性不育，线粒体d n a ，r a m ) 吉林农业大学硕士学位论文 大豆细胞质雄性哥育糸与镶转系线拉体科 的r k p b 分子标：己 a b s t r a c t w i t ht h ed e v e l o p m e n to fm o l e c u l a rb i o l o g y , t h er e s e a r c ha b o u tm e c h a n i s mo f c y t o p l a s m i cm a l es t e r i l i t y ( c m s ) h a sm a d eg e n e r o u sp r o g r e s si nt h em i t o c h o n d r i ag e n o m eo f m a i z e ，p e t u n i a , r i c e ，w h e a t ，b r a s s i c an a p u s ，s u n f l o w e ra n dc o m n l o l lb e a n ，s o m es e a t so fg e n e m a yr e l a t et oc m sh a da l r e a d yb e e nf o u n d c o m p a r e dw i t ho t h e rc r o p s ，s o y b e a nc m s r e s e a r c h e sm a d el i t t l ep r o g r e s ss i n c el i l i na c a d e m yo fa g r i c u l t u r a ls c i e n c e s sh u a ns u n f o u n dt h ef i r s ts o y b e a nc m sl i n es i n c e19 9 3 ，g r a t i f y i n gp r o g r e s so fs t u d y i n ga n du s i n gw a s m a d ei nt h i sf i e l d ，b u tt h er e p o r to f fi t sm o l e c u l em e c h a n i s ms t i l lb e l o n g e dt ot h eb l a n k t h r e ep a i r sc y t o p l a s m i cm a l es t e r i l el i n ea n di t sm a i n t a i n e rw e r eu s e di nt h i se x p e r i m e n t ( j l c m s l 1 a 儿c m s l 1 b ，几c m s l 2 a ，j l c m s l 2 b ，j l c m s 卜3 a ，j l c m s l 一3 b ) w e a m p l i f i e dm i t o c h o n d r i ag e n o m eo fs o y b e a nc y t o p l a s m i cm a l es t e r i l el i n ea n dw i t hr a n d o m l y a m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ( r a p d ) t e c h n o l o g y , a n dw a n t e dt o f i n dd i f f e r e n tb e t w e e n s t e l el i n ea n di t sm a i n t a i n e ft h i sw a st h ef o u n d a t i o nf o rt h ei s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f t h er e l e v a n tg e n e so fc m s s o y b e a n ，a n do f f e r e dt h et h e o r e t i c a lf o u n d a t i o nf o rt h em o l e c u l a r m e c h a n i s mo fa n n o u n c i n gt h es o y b e a nc y t o p l a s mm a l es t e r i l i t y ( c m s ) t h eq u a l i t yo f t e m p l a t ed n ai nr a p da n a l y s eo f t h es o y b e a nm i t o c h o n d r i ag e n o m ew i l l b e h i g ha n dc a n tc o n t a i nt h ep o l l u t i o no fp r o t e i n so rn u c l e a rd n a ，e t c r e f e r e n c i n gs o m e a b s t r a c t i o nm e t h o d so fo t h e rc r o pm i t o c h o n d r i a ld n a , s o m es t e p sw e r em o d i f i e da n d o b t a i n e dh i g hq u a l i t ym t d n a e v a l u a t i o no fm t d n ab yg e le l e c t r o p h o r e s i s ，m e a s u r e do db y u vs p e c t r o p h o t o m e t e ra n dw e l ld i g e s t e db yt h er e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e f i n a l l yi t sr a t ew a s i n d i c a t e da n dt h ep u r i t ym a ys a t i s f yp c ra m p l i f y , t h es o y b e a nm t d n as a m p l e sw e r er e a d yt o b eu s e da st e m p l a t e sf o rr a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ( r a p d ) t h i sr e s e a r c hh a ss e tu ps t e a d ya n dh i g h e f f i c i e n tr e f l e c t e ds y s t e mo f r a p da tf i r s t ，t h e n j l c m s l 1 am a l es t e r i l el i n ea n di t sm a i n t a i n e rl i n ej l c m s l 一l b ，儿c m s l _ 2 am a l es t e r i l e l i n ea n di t sm a i n t a i n e rl i n ej l c m s l - 2 b j l c m s i 一3 am a l es t e r i l el i n ea n di t sm a i n t a i n e rl i n e 。c m s l 一3 bm i t o c b o n d r i a ld n aw e r es c r e e n e db y4 0 0r a p ds i n g l e - p r i m e r sf r o mo p at o o p ta n d1 4p a l r e sd o u b l e - p a l m e r st h eo p t i m u mc o n d i t i o n si n2 5ulv o l u m ew a sa sf o l l o w s ： d n t p sc o n c e n t r a t i o n01m m o l l ：t a qe n z y m ec o n c e n t r a t i o n2 u ；s a m p l ed n ac o n c e n t r a t i o n 04 n g u1 ；p r i m e rc o n c e n t r a t i o n0s n g ul i nr a p da n a l y s e s o m ep e c u l i a rs t r i p so n l yp r e s e n t e do nt h es t e r i l el i n e , a n da b s e n t e do n i t sm a i n t a i n e r a so p e 0 1 ，o p h 0 7 ，o p l l 2 ，o p k 0 4 ，o p p l 7a n do p n 0 3t h e yh a do n e p e c u l i a rs t r i p o ns t e r i l e l i n e ，a so p d 0 2a n do p d 2 0p r e s e n t e dt w os t r i p s m i t o c h o n d r i a l g e n o m eo fp l a n tm a y b et a k ep l a c em u t a t i o na n dm a k ef o rc m s t h e s ep e c u l i a rp a s s a g et h a t 吉林农业丈学硕士学位论文 太豆细胞质雄性不育系与保持系线粒体d n a 的r a p d 分_ 了标记 o n l yp r e s e n t e do nt h es t e r i l el i n e s h o w e dt h a tm i t o c h o n d r i a lg e n o m eo fs t e r i l el i n em a y b e o c c u rs o m eo b t a i n e dm u t i o n st h e s em u t a i n s c a u s e e dt h ec y t o p l a s mm a l es t e r i l i t yo f s o y b e a n sf i n a l l y i na d d i t i o n ，r a p da n a l y s es t i l ls h o w e dt h a tt h e r ew e r e1 6p r i m e r s ( o p a l 2 。o p b 0 6 ， o p d l l ，o p d l 8 ，o p h l 8 ，o p l 0 6 ，o p l 0 9 ，o p k 0 7 ，o p l 0 5 ，o p l l 0 ，o p l l 3 ，o p m 0 6 ， o p p 0 9 ，o p p l 5 ，o p q l 3 ，o p r 0 3 ) k e p to n eo rs o m es p e c i a la m p l i f i e dp r o d u c t i o n t h e s e p e c u l i a rp a s s a g e st h a to n l yp r e s e n t e do ni t sm a i n t a i n e rn o tt h es t e r i l el i n es h o w e dt h a t m i t o c h o n d r i a lg e n o m eo fm a i n t a i n e rl i n em a y b eo c c u rs o m ea b s e n c em u t i o n st h en u m b e ro f o b e a t i o nm u t i o n sw e r em o r et h a na b s e n c em u t i o n s ，t h i sm a yr e f l e c ta m o n gt h el o n g - t e r m e v o l u t i o n ，m a i n t a i n e rl i n em i t o c h o n d r i a ld n a h a das t r o n gc o n s e r v a t i o n ，a n dt h es t e r i l i t yl i n e m i t o c h o n d r i a ld n aw a se a s yt ob ei n f l u e n c e db yi n h e r e n to re x t e r n a lf a c t o ri nt h en u c l e u s a n dc y t o p l a s mf a s h i o n ，c a u s e dt os o m es e q u e n c e so c c u rc h a n g e s ，a n dt h e nl o s e dm o r e c o m b i n a t i o nc h a n c e st ot h es a m ep r i m e r t h ep v sg e n eo ft h ec o m m o nb e a nc a u s e ds t e r i l e b e c a u s eo fi t sa b s e n c ei nt h es t e r i l el i n es ot h es p e c i c a la m p l i f i e dp r o d u c t i o n s0 nt h e m a i n t a i n e rl i n eh a dg r e a tv a l u ef u rt h es t u d yo f c y t o p l a s m i cm a l es t e r i l i t yi ns o y b e a n i n d o u b l e p r i m e ra m p l i f y ，t h e r ew e r e4g r o u p s ( o p f 0 3 o p f 0 6 ，o p b 2 0 o p l l 4 ， o p g l 3 o p p l 7 ，o p g l 3 o p d l 8 ) a m p l i f i e dr e s u l t ss a m et oc o r r e s p o n d i n gs i n g l e p r i m e r s r e s u l t si nt h e1 4g r o u psd o u b l e p r i m e r , t h er e s u l t so ft h eo t h e r1 0g r o u p sh a dd i f f e r e n c et o c o r r e s p o n d i n gs i n g l e - p r i m e r sr e s u l t st h i se x p l a i n e dt h a td o u b l e p r i m e rr a p da n a l y s ec a n r e v e a ls o m ep o l y m o r p h i ct h a ts i n g l e p r i m e rr a p da n a l y s ec a l ln o tr e v e a l t h i sr e s e a r c hp r o v e dt h a tw ec a nm e a s u r ep o l y m o r p h i co fm i t o e h o n d r i a ld n ao fs t e r i l e l i n ea n di t sm a i n t a i n e rw i t hr a p dt e c h n o l o g y w ef o u n ds o m es p e c i a la m p l i f i e dp r o d u c t i o n s o fm i t o c h o n d r i a ld n ao fs o y b c a nt h r o u g hr a p d , t h e s ea m p l i f i e sm a y b er e l a t et oc m so f s o y b e a n t h e s ed i f f e r e n c e sw e r es t u d i e db e t w e e ns t e r i l el i n e a n di t sm a i n t a i n e r r e t r i e v i n g t h e s ed i f f e r e n c ep a s s a g e s ，c l o n e ，s e q u e n c i n ga n da n a l y s i s i n gt h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no f t h e g e n e ，c o n f i r m i n gw h i c ha r et h es t e r i l eg e n ef u r t h e r , a n de s t a b l i s ht h ef o u n d a t i o nf o rt h e m e c h a n i s mo fs t u d y i n gt h ec y t o p l a s mm a l es t e r i l i t yo fs o y b e a r l so nt h em o l e c u l el e v e l k e yw o r d s ：s o y b e a nc y t o p l a s m i cm a l es t e r i l i t y m i t o e h o n d r i a id n ar a p d 独创性声明 奉入声明所呈交的学位论文是本人在导师指导p 进行的研究： 作及取得的研究成 果。掘我所知，除i ，文中特别加以标注和敛谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，l | 土小包含为获得吉林农、l k 大学或其他教育机构的学位证书丽使川 过的材料。与我一同l 一作的吲志对本研究所做的任鲥贡献均己在沦义中作了明确的说叫 并表示谢意。 学位论文作者签名：为、羝 签字慨2 。s 年f i 2 a f j 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全r 解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即吉林农、世大学有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权吉林农 业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：茄、凝 签字日期：zo l s 年月7 - 0 f i 导师签名： 另万刃 签字目期：冲石月沙h 学位论文作者毕业后去向： 工作单位：篆赫塘依咝斟i 誓阮 通讯地址： 电话 邮编 吉林农业大学硕士学位论文大豆细胞质雄性不育系与保持系线粒体b n a 昀r a p d 分子标记 第一章绪论 1 1 引言 从1 7 6 0 年德国农作物杂种优势学者科尔鲁特首先在烟草中发现农作物的杂种优势 以来，人们对农作物杂种优势进行了广泛长期的研究。二十世纪，杂种优势利用的研究 相继在玉米、高梁、水稻、油菜等农作物上取得了成功。细胞质雄性不育在杂种优势利 用中发挥了巨大作用。植物细胞质雄性不育系是研究细胞质与细胞核基因组关系和耜互 作用的极好材料，有重要的理论价值。其研究成果可为应用基因工程手段创新、改良不 育系，解决育性稳定等问题提供有力的理论依据。 与其他作物相比大豆细胞质雄性不育( 叫s ) 的研究进展缓慢，直到1 9 9 3 年吉林省 农科院孙寰等发现世界上第一个大豆c m s 不育系，该领域的研究才有了起色。我国在人 亘铆s 不育系应用研究方面已处于国际领先地位，目前已实现了“三系”配套，并进行 了精确的遗传学和细胞遗传学研究。 本研究的目的是利用现代分子生物学手段( r a p d 技术) ，通过对大豆不育系和保持 系的m t d n a 的比较研究，找到不育系与保持系线粒体基因组问的差异，为大豆细胞质雄 性不育相关基因的分离鉴定打下坚实的基础。本研究所用试材具有独立的知识产权。如 能抓住时机，在不育分子机制研究上取得突破，我国在该领域的理论研究上也将位居世 界领先水平。 1 2 植物雄性不育概述 1 2 1 植物雄性不育的概念与分类 植物雄性不育是一种植物在有性繁殖过程中不能产生正常的花药、花粉或雄配子的 遗传现象，它广泛存在于开花植物中。早在1 7 6 3 年k o l r e u t e r 就观察到雄性不育现象， 一个世纪后，c o l e m a n ( 1 8 7 6 ) 首先引入“植物雄性不育”概念。据k a u l ( 19 8 8 ) 报道， 已经在4 3 科、1 6 2 属、3 2 0 个种的6 j 7 个品种或种间杂种中发现雄性不育。 导致雄性不育的因素是多种多样的，因此，在分类上也因标准不同出现不同的分类 系统。s e a r s ( 1 9 4 7 ) 根据雄性不育材料基因型的差异，将雄性不育划为3 类，细胞质 不育型、细胞核不育型和质核互作不育型，即“三型学说”；e d w a r s o n ( 1 9 5 6 ) 将“j 型学说”修改为“二型学说”，即核不育型和核质互作不育型两类；g a b e i m a n ( 1 9 5 6 ) 根据花粉、雄蕊的形态将雄性不育划分为花粉型、雄蕊型和功能型3 类；h e s l o p - h a r r i s o r l ( 1 9 7 1 ) 按世代交替把雄性不育划分为孢子体不育和配子体不育2 种类型。 吉林农业大学硕士学位论文大豆细胞质雄性不育系与保持系线粒体n n 的r a p d 分子标j e k a u l ( 1 9 8 8 ) 在总结前人研究的基础上将雄性不育类型归纳如下： r 孢子发生型 ，表现型雄性不育 结构型 l ( 根据导致雄性不育的表现型不同可分为jl 功能 型 遗传型 20 ，表明所得的m t d n a 纯度较高，无r n a 和蛋白质的污染。 表3 1 大豆m t d n ao d 值测定结果 t a b l e3 - 1o dv a l u eo f t h em t d n ai ns o y b e a n 3 1 3 大豆线粒体d n a 的酶切分析 限制性内切酶反应一般对d n a 的质量要求较高，只有在不含有蛋白、酚类或氯仿 等杂质的情况下d n a 才能被完全消化。为了证明我们所提取的线粒体d n a 质量较高， 符合分子标记的模板要求。对大豆线粒体d n a 进行b a m i 、e c o r v 及h i n d l 酶切消化 ( 图3 2 ) ，酶切后的大豆线粒体d n a 片段在琼脂糖凝胶电泳上可完全分散开，大小在 几个k b 至十几k b 之间。而大豆基因组d n a 被酶切消化后，则在琼脂糖胶上呈现出完 全弥散的拖尾状带型。 3 。1 4 大豆线粒体d n a 特异引物的p c r 扩增 为了验证所提取线粒体d n a 的真实性且没有核d n a 的污染，用线粒体d n a 特异 引物m t p r i m e r ( 编码线粒体n a d h 基因) 和核d n a 通用引物n u p r i m e r ( 编码核铁结 合蛋白基因) 分别对大豆线粒体d n a 进行p c r 扩增( 图3 - 3 ) ，n a t p r i m e 在15 k b 的位 置出现了一条特异带，与设计引物时的预期扩增产物大小基本吻合，n u p r i m e r 扩增线粒 体d n a 则没有扩增产物。证明我们所提取的确为线粒体d n a ，且不含核d n a 的污染。 吉 丰农业大学硕士学位论文大豆细胞质雄性不育系与保持系线粒体d n a 的r a p d 分子标1 己 图3 2 大豆线粒体d k a ( j l c m s l 1 a ) 的 b a m h l 、e o o f w 及h i n d i i 酶切电泳图谱 r i g3 2 t h ed i g e s f i o n so f s o y b e a n m i t o c h o n d r i a jd n a ( j l c m s i 1 a ) w i t h b a n a h l ，e c o r va n dh i n d l l j m 1 ：x d n ah m d i i i e e o r i 酶切m a r k e r m 2 ：l k bd n a l a d d e r 点样孔l 、2 、3 分别为j l c m s l 1 a 线粒体d n a 经1 3 a 盈h i 、e c o r v 及h i n d h l 酶# y j 的图谱，4 为 j l c m s i 1 a 基豳d n a 的h i n d i i l 酶切图谱 3 2 大豆线粒体d n a 的r a p d 标记 图3 - 3 大豆线救体d 特异引物的p o r 扩增 f i g 3 - 3t h ea m p l i f i c a t i o n so f s o y b e a n m i t o c h o n d r i a ld n a ( 儿c m s l i a ) a m p l i t i e db ys p e c i a lp r i m e r s m ： d n ah i n d m 蚴r i 酶切m 矾口 点群孔1 、2 分别为线粒体特异引物和 核特异引物对j l c m s l 。1 a 线粒体 d n a 的扩增结果 3 2 1r a p d 实验体系的优化 r a p d 实验体系的设计原则是：参考前人结果，确定某一组分的浓度范围，按主次逐个 优化各组分。p c r 反应混合物中，模扳d n a ，引物，t a q 酶，d n t p s 等对反应的影响是主要 的( 表3 2 ) ，其余因素的影响相对较小。循环参数中，变性温度及时间和退火温度是决定 反应成败和特异性的重要因子，所以得首先考虑这些因素。在优化某一因素时，其他因素 为固定值，该值是根据实验室已有的基础和文献确定的。判定扩增效果的标准是电泳结 果，它背景低、谱带清晰、数目适中、稳定可重复。在优化反应条件时，其浓度范围过大 是不必要的。前人关于p c r 反应已经做了大量的工作，积累了丰富的经验，就每成分而 言，都有参考值可寻，过大范围的测试等于浪费时间和财力。所以，我们仅需结合自己的 实验，在一定范围内进行优化即可，这样既兼顾了实验效果，又省时省力。 3 21 1 模板含量对扩增效果的影晌 在r a p d 中，模板d n a 的量不宜太多，模板分子数越多，则错误扩增的机会就越大。 吉林农业大学硕士学位论文大豆细胞质雄性不育系- 5 保持系线粒体o h a 的r a p d 分子标己 为了确定大豆m t d n ar a p d 分析的模板浓度，在2 5ul 反应体系中进行了七个不同浓度 梯度( j ，l o ，2 0 ，3 0 ，4 0 ，5 0 ，6 0 r i g ) 的比较试验。结果表明：在2 5ul 反应体中，d n a 模 板浓度从1 0 - 6 0 n g 对 r a p d 扩增产物没有明显的影响，但当模扳浓度超过4 0 n g 时， 现 r 非特异扩增并出现些弥散状态( 图3 - 4 ) 。说明r a p d 技术对模板d n a 浓度要求不是很 严格，但因r a p d 方法灵敏度高，从增强特异性的角度出发，选取l o n g 为最佳浓度。 图3 - 4 模板含量对扩增效果的影响 f i g3 - 4 e f f e c to f t e m p l a t ed n ac o n c e n t r a t i o no nr a p dp a t t e r n l ，2 ，3 ，4 ，5 ，6 ，7 的模板浓度分虽为5 ，i 0 , 2 0 。3 0 ，4 0 ，5 0 ，6 0 n g ：引物为o p i o r 一 模板d n a 来自“j l c m s l 一i a ”。 t h e c o n c e n t r a t i o n o f t e m p l a t e d n af r o mlt o7i s 5 ，1 0 ，2 ( 1 ，3 0 4 0 、5 0 ，6 0 r i g , r e s p e c t i v e l y ；t h e p r i m e r i s o p l 0 8 ：t h e t e m p l a t e d n a i s 的m “j l c m s l - i a ” 32 1 2d n t p s 含量对扩增效果的影响 d n t p s 是r a p d 反应的底物，当d n t p s 不足时扩增产物减少；但浓度过高时，会增加 碱基的错配率，并且同t a qd n a 聚合酶竞争m f + ，影响t a q 酶的活性。为此设计七个不 同的d n t p s 浓度( o 0 4 ，o 0 6 ，0 0 8 ，0 1 0 ，0 1 2 ，0 1 4 ，0 1 6 n o l l ) 进行比较研究。 结果表明：d n t p s 浓度低于0 0 8 r n m o l l 时扩增信号明显减弱；d n t p s 浓度为0 1 4 r e t o o l 儿 时扩增产物出现非特异性扩增；当d n t p s 浓度在0 0 8 0 1 2 r m n o l l 时，扩增产物条带清 晰。在本实验中，采用0 1 m m 0 1 l ( 图3 - 5 ) 。 32 13 引物含量对扩增效果的影响 引物浓度对r a p d 扩增的效果影响很大，引物的量直接影响扩增产物电泳带型，引 物浓度增加，产生的条带也增加。在2 5ul 体系中，引物的含量一般为1 5 3 0 n g 。为选 择合适的大豆r a p d 引物浓度，设计了5 ，1 0 ，2 0 ，3 0 ，4 0 ，5 0 ，6 0 r i g 七个梯度的引物浓 度。根据我们的测试结果，引物浓度以2 0 5 0 n g 之间都能得到很好的扩增结果( 图3 - 6 ) ， 这说明在一定范围内引物的量有较大的弹性。在本实验中，采用2 0 r i g 。 吉林农业大学硕士学位论文 大豆细胞质雄性不育系与保持系线粒体d 的i t _ p d 分子标记 图3 - 5d n n p s 浓度对r a p d 扩增的影响 f 追5e f f e c to f d n t p sc o n c e n t r a t i o no hr a p dp a t t e r n 1 ，2 ，3 ，4 ，5 ，6 ，7 的d n t p s 浓度分别为0 0 4 ，0 0 6 ，0 0 8 ，01 0 ，0 1 2 ，0 1 4 0 1 6 m m o l l ；引物为o p l 0 8 ；模板d n a 来自“j l c m s l 1 a ”。 t h ec o n c c n 打撕o no f d n t p sf r o m 】t o7i so0 4 ，00 6 ，00 8 ，0 1 0 ，01 2 ，01 4 ，01 6 m m o l p l r e s p e c t i v e l y ；t h ep r i m e r i s o p l 0 8 ；t h e t e m p l a t e d n a i s f r o m “j l c m s ! - 1 a ” 图3 - 6 引物浓度对r a p d 扩增的影响 f i g 6e f f e c to f p r i m e rc o n c m l r a t i o n0 1 1r a p dp a t t e r n 1 ，2 3 ，4 ，5 ，6 ，7 的引物浓度分别为5 ，1 0 ，2 0 ，3 0 ，4 0 ，5 0 ，6 0 n g ：引物为0 p 0 8 ： 模板d n a 来自“j l c m s li a ”。 t h ec o n c e n t r a t i o no f p r i m e rf r o mit o7i s5 ，1 0 ，2 0 ，3 0 , 4 0 ，5 0 t 6 0 r i g ，r e s p e c t i v e l y ；t h e p r i m e ri so h 0 8 ；t h et e m p l a t ed n ai sf r o m “j l c m s l - 1 a ” 3 21 4t a q 酶浓度对扩增效果的影响 t a q d n a 聚合酶在p e r 反应体系中至关重要，t a q d n a 聚合酶的量直接影响扩增反应 的进行和扩增效果。本实验将t a qd n a 聚合酶设计了0 5 ，1 0 ，2 0 ，2 5 ，3 0 ，3 5 ，4 o u 七个梯度。结果表明：在2 5u l 反应体系中，当t a qd n a 聚合酶用量较少( 3 5 ) 时，扩增条带 吉林农业大学硕士学位论文大豆细胞质雄性不育系与保持系线粒体m a 的r a p d 分子标记 开始变得模糊。t a qd n a 聚合酶用量在2 0 - 3 o u 时，扩增带型稳定，且均能得到理想的 扩增产物；从经济和减少非特异扩增的角度出发，选取2 0u 为t a q 酶的最适浓度( 见图 3 7 ) 。 图3 - 7t a q 酶浓度对扩增效果的影晌 n g3 7e f f e c to f t a qd n ap o l y m e r a s ea m o t t n to nr a p dp a t e r n 1 ，2 ，3 ，4 ，5 ，6 ，7 的t a q o n a 聚合酶用量分别为0 5 ，t 0 ，2 0 ，2 5 。3 ，0 ，3 5 ，4 o ij ； 引物为o p l 0 8 ；模板d n a 来自“j l c m s i i a ”。 t h ea m o u n to ft a qd p o l y m e r i s ei n2 5uir e a c t i o nv o l u m ef r o m1t o7i s 05 ，10 ， 20 ，25 ，3 o ，3 5 ，4o u , r e s p e e t i v e l y ；t h ep r i m e ri so p l 0 8 ；t h et e m p l a t ed n ai sf r o m “j l c m s l 1 a ” 图3 - 8 退火温度对扩增效果的影响 f i g 3 - 8e f f e c to f a n n e a l i n gt e m p e r a t u r eo i l 脚p a a e r n l ，4 ，7 的退火温度分别为3 0 ，3 5 ，4 0 ；引物为0 p 1 0 8 ；模板d n a 来自“j l c h s ll a ”。 t h ea n n e a l i n gt e m p e r a t u r ef r o m1t o7i s 3 0 4 0 t h ep r 洫c ri so p i o $ ：t h et e m p l a t ed n ai s f r o m “j l c m s l 1