（作物遗传育种专业论文）大豆脂肪氧化同工酶（Lox1）单克隆抗体的制备及其检测应用.pdf

摘要大豆种子中存在约占总蛋白含量1 的脂肪氧化酶( l i p o x y g e n a s e ，简称l o x ) ，包含3 种同工酶l o x l 、l o x 2 、l o x 3 ，通过催化不饱和脂肪酸氧化，产生共轭的过氧化氢物，可直接与食品中的蛋白和其他营养成分结合，降低豆制品的食用性和营养价值，最后生成醛、酮、醇等有异味的小分子挥发性物质，使豆油及豆制品产生豆腥味，苦涩及青气味。大豆脂肪氧化酶成为限制大豆营养价值和食品风味的主要抗营养因子。近年来，科技工作者就脱腥问题进行了多方面的研究，在加工工艺不理想的情况下，采用回交转育的方法进行遗传改良，利用快捷、灵敏、有效的检测手段筛选缺失脂氧酶的后代，建立缺失品种的近等基因系，将是去除豆腥味和改善大豆营养品质的有效途径。研究表明大豆脂肪氧化酶是球形的水溶性蛋白质，分子量为9 4 9 7 k d ，符合免疫学研究的要求，可作为完全抗原进行免疫。为此，本实验制各大豆脂肪氧化同工酶( l o x l ) 的单克隆抗体，并建立了l o x l 的检测方法。利用薄板等电聚焦凝胶电泳( i e f - p a g e ) 鉴定大豆脂肪氧化酶的缺失近等基因系材料，l o x 2 缺失的情况下，l o x l 向p h 偏小的方向迁移：l o x l 缺失，该酶带消失；l o x 3 缺失，l o x 3 a 存在，l o x 3 b 蛋白带消失。检测后不同缺失类型的子粒分装保存。并设计通过非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳( n a t i v ep a g e ) 进行分离，调整分离胶浓度为1 0 ，浓缩胶的浓度为5 ，经过分析不同缺失类型，推断出代表大豆脂肪氧化酶同工酶l o x l 、l o x 2 、l o x 3 的特异性蛋白条带。本文通过电泳洗脱仪回收三种大豆脂肪氧化同工酶的蛋白条带，考虑到纯化后l o x l的纯度及其酶活均远大于l o x 2 、l o x 3 ，并且适当减少后期繁重韵工作量，仅以l o x l 作为免疫抗原。采用紫外分光光度法测定其浓度：0 0 1 8 9 6 m g m l o 7 6 0 7 m g m l o 0 7 6 9 m g m l ，其酶活为7 6 6 6 8 。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s - p a g e ) 测定该酶蛋白的分子量约为9 40 0 0d a l 左右。以l o x l 作为完全抗原，采取皮下多点注射，并参照适当的程序设计免疫方案，强化其免疫应答反应，经过问接e l i s a 测定免疫血清效价为1 ：1 6 0 0 。同时用完全d m e m 培养液孵育骨髓瘤细胞达到对数生长期，可将已免疫b a l b c 小鼠的脾细胞和s p 2 0 鼠骨髓瘤细胞进行融合，建立间接e l i s a 方法筛选杂交瘤细胞的阳性克隆，通过有限稀释法，获得9 株能稳定传代且分泌抗大豆脂肪氧化酶l o x l 单克隆抗体的杂交瘤细胞，各株单抗的效价均在l ：6 4 以上。仍然采用间接e l i s a测定l o x l 的方法，验证3 株单抗与其他脂肪氧化酶类型没有交叉反应。通过对其特异性的鉴定，确立了产生大豆脂肪氧化酶l o x l 高度特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，进而利用间接酶联免疫技术进行l o x l 缺失与否的鉴定。以期为今后制备l o x 2 、l o x 3 的单克隆抗体提供实验技术基础；为种质资源的创新，食品加工的工艺改良以及辅助遗传育种提供投资少、见效快的鉴定方法；也为进一步研究大豆脂肪氧化酶同工酶的蛋白作用机制提供新的研究方向。关键词：大豆；脂肪氧化酶；单克隆抗体：e l i s a ：检测p r o d u c t i o no fm o n o e l o n a la n t i b o d i e st os o y b e a nl i p o x y g e n a s e ( l o x l ) a n da p p l i c a t i o ni ni s o z y m ed e t e c t i o na u t h o r ：l i uy u a nm a j o r ：c r o pg e n e t i c sa n db r e e d i n gs u p e r v i s e r ：p r o f m az h i y i n gp r o f z h a n gm e n g c h e np r o fz h a n gc a i y i n ga b s t r a c ts o y b e a ns e e d sc o n t a i nt h r e el i p o x y g e n a s ei s o z y m e sd e s i g n a t e dl 1 ，l 2 ，l - 3t h a tc a na c c o u n tf o ra p p r o x i m a t e l y1 o ft o t a ls e e dp r o t e i n l i p o x y g e n a s ew h i c hc a t a l y z e s ，a sap r i m a r yr e a c t i o n ，c e r t a i nu n s a t u r a t e df a t t ya c i d soccuro x i d a t i o n ，a n dt h ea c t i o ng e n e r a t e st h eh y d r o p e r o x i d a t i o n l i p i dh y d r o p e r o x i d e s ，w h i c ha r ef o r m e dd u r i n go x i d a t i o n ，c a nd i r e c t l yb i n dp r o t e i na n do t h e rn u t r i t i o u sc o m p o u n d sa n da l s ol e dt ot h ed e s t r u c t i o no fc e r t a i nv i t a m i na n dp r o t e i n ，a n dt h e i rb r e a k d o w np r o d u c t sc a nh a v et o x i ce f f e c t s t h eo x i d a t i o np r o d u c t sf u r t h e rd e c o m p o s et om i d d l ec h a i na l d e h y d e sa n da l c o h o l se ta lw h i c ha r em a j o rc o n s t i t u e n t so ft h eu n d e s i r a b l eg r a s s y b e a n yf l a v o ra n db i t t e rt a s t ei ns o y b e a np r o d u c t s s o y b e a nl i p o x i g e n a s ei st h em o s tl i m i t i n gf a c t o rt oc o n t r o ls o y b e a nn u t r i e n tv a l u ea n df l o u r a sf o l l o w i n g ，p e o p l ei ns c i e n c er e s e a r c hh a v es t u d i e dt or e d u c et h ep r o b l e md u r i n gf o o dp r o c e s s i n go fs o y b e a nb yv a r i e o u st e c h n i q u e s h o w e v e r ，t h e s et r e a t m e n t sa r ee x p e n s i v ea n dn o te n t i r e l ys a t i s f a c t o r yf o rf o o dm a t e r i a l sb e c a u s et h es o y b e a np r o t e i n sh a v ep o o rs o l u b i l i t yc a u s e db yh e a tt r e a t m e n t t h r o u g hm a k i n ga d v a n t a g eo fs h o r t c u ta n de f f e c i e n c ya s s a y s ，w ec a ns e l e c t i v e l yd e t e c tl i p o x y g e n a s el a c k i n gm u t a n t s a n du s es o y b e a nc u l t i v a r sa sa c c e p t e r sa n dc r o s sw j t hi s o g e n i em u t a n t sa sd o n o r sf o rt h i sc h a r a c t e r ，w h i c hi sa na v a i l a b l ea p p r o a c h i naw o r d ，i ti su r g e n tt od e s i g n a t eas i m p l e ，s e n s i t i v e ，a n dr a p i dm e a no fd e t e r m i n i n gl i p o x y g e n a s ei ns o y b e a ns e e d s b a s e do nc i t i n ga r t i c l e s w eh a v ek n o w nt h a ts o y b c a nl i p o x y g e n a s ei s9 4t o9 7 k de n z y m ew i t hw a t e r s o l u b i l i t y w h i c hi sl a r g e rt h a n6 00 0 0d a la sc o m p l e t ea n t i g e na c c o r d i n gw i t hi m m u n o a s s a y s m o n o c l o n ea n t i b o d i e s ( m a b s ) o fl i p o x y g e n a s e - l ( l o x1 ) w e r ep r o d u c e da n dd e t e c t i o nm e t h o d sw e r ee s t a b l i s h e du s i n gt h em a b s i s o e l e c t r i cf o c u s i n gi nt h i n - l a y e rp o l y a c r y l a m i d eg e l s ( i e f p a g e ) h a sb e e na p p l i e dt ot h ea n a l y s i so ft h ee n z y m e si nn e a ri o s o g e n i cl i n e ( n i l ) o fs o y b e a n s ，f o re x a m p l e l i p o x y g e n a s en u l l 一2 ，l i p o x y g e n a s e - 1b a n di sm o v e dt op o s i t i v e ；g i v e nl i p o x y g e n a s en u l l 一1 ，l i p o x g e n a s e - 1b a n dd i s a p p e a r s ；p r o v i d i n gl i p o x y g e n a s en u l l - 3 ，l i p o x y g e n a s e 一3 ab a n de x i s t s ，b u tl i p o x y g e n a s e 一3 bb a n dd i s a p p e a r s d i f f e r e n tt y p e ss e e d sw e r er e s e r v e d w i t hm a r k i n g n a t i v ep o l y a c r y l a m i d eg e le l e t r o p h o r e t i ct e c h n i q u ei nt h ep a p e r ，w h i c hw a sa d j u s t e dt o10 a n d5 c o n t e n t s ，r e s o l v e dc l e a r l yt h et h r e el i p o x y g e n a s ei s o z y m e si nc r u d es e e de x t r a c t s ，b u tt h es e p a r a t i o no ft h el i p o x y g e n a s ew a ss e n s i t i v et os m a l lc h a n g e si ni o n i cs t r e n g t ho ft h eb u f f e r t h r e ep r o t e i nb a n d sw e r ee l u t e dr i g h ta n do b t a i n e dp u r i f i c a t i o no fl i p o x y g e n a s e c o n s i d e r e dt h r e el i p o x y g e n a s e s c o n t e n ta n dp u r i t y ，o n l yl i p o x y g e n a s e - 1w a sr e g a r d e da sc o m p l e t ea n t i g e n m o l e c u l a r w e i g h to fl i p o x y g e n a s e 1w e r ei d e n t i f i e db yt h es i n g l ed i m e n s i o ns o d i u md o d e c y ls u l f a t e ( s d s ) p o l y a c r y l a m i d eg e le l e t r o p h o r e s i s ，a n de n z y m ea c t i v i t yw e r ed e t e c t e db yu l t r a v i o l e ts p e c t r o p h o t o m e t e rw i t he n z y m ep r o t e i nc o n t e n t ，w h i c ha r e0 18 9 6 m g m l ，0 7 6 0 7 m g m l ，o 0 7 6 9 m g m 1 l o xii si m m u n o l o g i c a la n t i g e n w h i c hw i l li n d u c et oi m m u n o r e a c tt h r o u t hi n j e c t i n gt oe a c hr e g i o n so fb a l b cm i c e ，m o r e o v e r ，a n dt h em i n i m u ma m o u n to fa n t i s e r u mc o u l ds u c c e s s f u l l yd e t e c t10u g m la n t i g e nw i t h1 ：16 0 0d i l u t i o no fa n t i s e r a h y b r i d o m ac e l ll i n e ss e c r e t i n gm a b sa g a i n s tl o xlw e r ep r o d u c e db y f u s i n gm o u s em y e l o m ac e l l s ( s p 2 o ) w i t hs p l e e nc e l l sf r o mb a l b ci m m u n i z e db yl o xlp a r t i c l e sw h e nt e s t e db yi n d i r e c te n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) i n d i r e c te l i s aw a se s t a b l i s h e dw i t ht h ep r o d u c e dn i n em a b sf o rl o x ld e t e c t i o nt h r o u g hl i m i t e dd i l u t i n g ，t h r e em a b sd i dn o tc r o s s r e a c tw i t ho t h e rt e s t e ds o y b e a nl i p o x y g e n a s ep r o t e i n s f i n a l l y ，m o n o c l o n a la n t i b o d i e s ( m a b s ) u s i n gh y b r i d o m af u s i o ni d e n t i f i e di s o z y m el o xlt ob ep r e s e n to ra b s e n tf r o mi n d i r e c te l i s a t h e n ，t op r o d u c el 一2 ，l 3m a b sa b o v ei t ，t h i st e s tr e s u l t sn o to n l ycanp r o v i d ea ne f f i c i e n ta n dc h e a pd e t e r m i n i n gm e t h o dt oa s s i s tb r e e d i n ga n di m p r o v ef o o di n d u s t r yt e c h n i q u e ，b u tf u r t h e r m o r er e s e a r c ha c t i o nm e c h a n i s mo fs o y b e a nl i p o x y g e n a s e k e yw o r d ：s o y b e a n ；l i p o x y g e n a s e ；m o n o c l o n ea n t i b o d y ( m a b ) ；d e t e r m i n a t i o n ；e n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a )缩略语( a b b r e v i a t i o n s )缩略词英文名称中文名称l o xl i p o x y g e n a s e脂肪氧化酶i e f p a g ei s o e l e c t r i cf o c u s i n gp o l y a c r y l a m i d eg e le l e t r o p h o r e s i s 等电聚焦凝胶电泳s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e十二烷基硫酸钠a c ra c r y l a m i d e丙烯酰胺a pa m m o n i u mp e r s u l f a t e过硫酸铵b i sb i s a c r y l a m i d e甲叉双丙烯酰胺t e m e dn n ，n ，n ，- t e t r a m e t h 3 l e n e d i a n f i n e四甲基乙二胺 i r i st f i s h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e三羟甲基氨基甲烷uu n i t单位c f ac o m l p l e t ef r e u n d 。sa d j v a n t弗氏完全佐剂i f ai n c o m l p l e t ef r e u n d sa d j v a n t弗氏不完全佐剂d m s od i m e t h y ls u l p h o x i d e二甲基亚砜e l i s ae n z y m e l i n k e di m m u n e o s o r b e n ta s s a y酶联免疫吸附试验h a th y p o x a n t h e n e a m i n o p t e i n t h y m i d i n e次黄嘌呤一氨基喋呤一胸腺嘧啶核苷h th y p o x a n t h e n e - t h y m i d i n e次黄嘌呤一胸腺嘧啶核苷k d ak i l o d a l t o n千道尔顿m c a bm o n o c l o n a la n t i b o d y单克隆抗体p b sp h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e磷酸盐缓冲液p e a bp o l y c l o n a la n t i b o d y多克隆抗体p e gp o l y e t h y l e n eg l y c o l聚乙二醇s ps t r e p t o m y t i n p e n i c i l l i n青霉素、链霉素r l e i ai c ci g s sr a d i oi m m u n o a s s a y放射免疫分析e n z y m ei m m u n o a s s a yi m m u n o c y t o c h e m i s t r yi m m u n o g o l d s l i v e rs t a i n i n g酶免疫分析免疫细胞化学免疫金银染色法独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑皇垦垒些盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示澍意。、-，学位论文作者签名：别泔签字p t 期：3 畎年6 月3 # 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塑些壅些盘鲎有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权塑些壅些盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：趟州翩虢酗签字日期：知x 年6 月2 牛日签字同期：哆弦占月妒同学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：电话：邮编：大豆脂肪氧化同工酶( l o x l ) 单克隆抗体的制各及其检测应用1 引言大豆对于改善我国人民膳食中蛋白质不足的现状和提高国民素质具有非常重要的意义。作为高蛋白和优质油料作物，其子粒的蛋白质含量高达4 0 左右，且必需氨基酸组成合理，富含多种维生素和矿物质，可为人体提供均衡的营养。近年来已成为世界上最经济的食品蛋白质来源，具有较高的营养特性及保健作用，并著有”植物肉”的美称。但是大豆制品中的豆腥味却制约其作为蛋白质资源的广泛利用1 2 1 。a n d r e 和i l o u ( 1 9 3 2 )首先发现了产生豆腥味的关键酶就是脂肪氧化酶( l i p o x y g e n a s e ，简称l o x ) ，在大豆种子中存在约占总蛋白含量1 1 3 】，含有3 种同工酶l o x 、l o x 2 、l o x 3 ，是一种含非血红素铁的蛋白质。存在于靠近大豆表皮的子时中，遇到空气中的氧，激发其活性，专一催化具有顺，顺- 1 ，4 - 戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸加氧反应，氧化生成脂肪酸氢过氧化物和自由基，经过酶性和非酶性变化，晟后降解成小分子的醛、醇、酮及环状氧化物等挥发性物质( 包括亚油酸、亚麻酸等) h j 。此外，这些小分子物质可与大豆蛋白中的末端氨基和羧基牢固结合形成较复杂的化合物，它们也同样具有豆腥昧。国内外食品加工业和科技工作者就脱腥问题进行了多方面的研究。目前去除豆腥昧的主要手段有加热处理、微波照射、改变介质的p h 、有机溶剂萃取和水解酶处理等，但上述方法皆存在一些不足，即需一定的设备投资、人力和能源消耗。增加加工成本；且废水排放污染环境；降低蛋白质的溶解度和利用率；蛋白质的粘性和保水性等加工性能丧失；许多营养成分和维生素在加工过程中遭到破坏或消失以及脱腥效果也不彻底p “j 。培育无腥味大豆新品种，是探索去除豆腥味，改善大豆营养品质的有效途径1 7 “l 。已知大豆种子中l o x 存在三种同工酶l o x 1 、l o x 一2 、l o x - 3 ，分别受l x l 、l x 2 和l x 3 三个显性基因控制，其缺失性状分别受l x l 、i x 2 和i x 3 三个隐性基因控制：l x l 和l x 2 是紧密连锁的，l x 3 则是独立遗传的p “。因此利用脂肪氧化酶检测技术，筛选缺失脂氧酶的材料，也就是基因水平上去除脂氧酶基因，利用回交育种的手段对优良农艺性状的大豆进行遗传改良，建立缺失品种的近等基因系。目前，研究制定快速、简便、准确检测大豆脂肪氧化酶的鉴定技术势在必行。随着无腥味大豆育种研究的深入，现已育成品种的商品化生产以及食品加工业的蓬勃发展，对大豆脂肪氧化酶鉴定技术的要求也在不断提高和改进j 。日本学者k i t a m u r a ( 1 9 8 4 ) 开发出一种s d s p a g e 电泳技术，分析5 0 0 0 份材料，鉴定出l o x 2 和l o x 一3 自然突变缺失体，即p 1 8 6 0 2 3 和w a s e n a t s ui c h i g o w a s e l i “。虽然能将三种酶鉴别出来，但对脂氧酶( 在种子中有三种类型) 的分离较困难，原因是脂氧酶l o x - 1 、l o x 一2 、l o x 一3 分子量差异较小，均为1 0 0 kd左右。这有可能因p h 值、离子浓度以及聚胶条件等微小的变化影响测定中的各类型的分离，且有时会发生失真的现象【i ”。美国学者n i e l s o n ( 1 9 8 31 9 8 6 ) 采用s d s 法与k i t a m u r a所用的方法相同，后来其采用梯度胶，且在分离上有所改进。但我国现有的一些试剂和实验条件不易满足，经丁安林、孙君明试用亦不稳定。s e i z oy ，r i c h a r dm ( 1 9 8 2 ) 通过亲和色谱法纯化l o x l 和l o x 3 作为抗原，经免疫兔获得抗血清筛选阳性多克隆抗体，并利河北农业大学硕士学位论文用酶联免疫吸附测验定量的检测l o x l 和l o x 3 。l o x l 的酶活性与通过e l i s a 测得的酶蛋白浓度具有一定的线性关系。由于采用的是多克隆抗体，所以检测方法的特异性和灵敏性较差i l ”。s t a r t 等人利用探针对脂肪氧化同工酶进行了n o r t h e r n 印迹检测，此技术可用来鉴定l o x ，可是投资昂贵、技术繁琐i i ”7 1 中国农业科学院作物品种资源研究所从九十年代初开始选育大豆脂肪氧化酶缺失种质，并己制定了一套大豆脂肪氧化酶缺失体鉴定技术，是目前国内识别无豆腥昧大豆种质的核心技术【”“9 1 。傅翠珍、丁安林等2 0 i 利用薄层等电聚焦电泳( i e f p a g e ) 对人豆l o x 同工酶缺失体进行筛选和鉴定，具有分辨率高。特异性强的优点，但因其设备昂贵，所需的主要试剂目前均要进口。操作要求严格，一般育种单位、仓赭单位和加工质检部门不便操作。j a m e sm ，e la l f ”( 2 0 0 0 ) 通过蛋白芯片检测脂肪氧化同工酶的缺失类型，选择全缺的基因型，其中对l 1 和l 一2 染液为亚甲基兰，l 3 的检测试剂为b 胡萝h 素。张瑛、吴敬德等“利用植物脂肪氧化同工酶快速显色法对6 0 个大豆种质资源和后代材料进行筛选，其检测技术已申请国家发明专利。它是利用脂肪氧化酶的偶联氧化还原指示剂而产生显色反应。该技术具有操作简便，结果直观，能进行定性和定量分析的特点。尽管此方法有效，但是需要进行复杂药剂的准备是在育种过程中分析大量样品的限制因素。傅翠真、徐文英和苏震 2 3 - 2 4 - 2 5 应用改进的i e f 电泳方法，通过生物体系超弱发光动力学分析，研究种子发芽前后脂肪氧化酶缺失体活性动态变化，探索用超弱发光强度鉴别脂肪氧化酶缺失体的可能性，可是此方法要对子叶进行测量，同时检测耗费周期长。最近几年，人们对大豆种子l o x 缺失体的研究逐渐深入到分子生物学水平。目前三种脂肪氧化酶同工酶基因的c d n a 序列基本清楚。s h i b a t a 等口”测定了l o x 1 的c d n a全序列，全跃2 8 k b ，含8 3 8 个氨基酸，分子量9 40 3 8 。s h i b a t a 等口7 1 还报道了l o x 2 e d n a全序列，并推导出含8 6 5 个氨基酸，分子量为9 70 3 6 。r i c h a r d 等”报道l o x 3 基因组d n a及c d n a 全序列，由9 个外显子和8 个内含子组成，其蛋白质包含8 5 9 个氨基酸，分子量9 66 6 3 。孙君明等口”以缺失脂肪氧化酶基因的c e n t u r y 近等基因系为材料，利用f 2 材料作为定位群体，寻找与x l 基因位点紧密连锁的r a p d 标记，为大豆脂肪氧化酶分子定位及标记辅助育种提供可靠的依据。r a p d 标记是在d n a 水平上检测特定序列的d n a 差异，其不受外界环境和不同发育时间、阶段的限制，且技术简单、方便，具有普遍性，但其可重复性和稳定性受到一定限制。j a m e sm n a r v e l ( 2 0 0 0 ) 对传统的实验程序作了重大改变，运用种子芯片大规模分析子粒样品拉“。段红梅，邱丽娟( 2 0 0 3 ) 利用s s r 标记进行遗传背景分析，探索分子标记辅助遗传背景选择时所需适宜的标记数和方式，获得进一步回交的鲁豆4 号的缺失株系，从而加速培育鲁豆4 号脂肪氧化酶缺失近等基因系l l “3 ”j 。利用分子标记作为辅助选择，尽管结果准确可靠，但是检测成本仍然很高，不能同时进行群体规模l o x 类型的大量筛选。大豆种子中的三种同工酶l o x 都是球形、水溶性蛋白质，每个l o x 的m r 为9 6 9 7 k d左右的多肽，根据免疫学研究中常用天然蛋白质的m r 约为6 0 0 0d a l 的特性，日本曾使用免疫法测定大豆贮藏蛋白的方法及多克隆技术鉴定大豆脂肪氧化酶的缺失情况”。”j ，我们设计利用植物蛋白抗原在动物体内产生抗体，并在体外建立杂交瘤细胞系，筛选具有高度专一性的单克隆抗体。单抗一旦制备成功，其杂交瘤细胞株可分装长期冻存，并且随时复苏分泌大量单抗。将单克隆抗体技术与免疫分析技术相结合，探索一种快速、简便、准确2大豆脂肪氧化同工酶( l o x l ) 单克隆抗体的制各及其检测应用的l o x l 、l o x 2 、l o x 3 存在或缺失的检测技术，为种质创新研究及开发食品资源提供投资少、见效快的鉴定方法，成本会大大减低。按照免疫应答的效果可以将抗原分为完全抗原和半抗原。完全抗原是指能够直接诱导机体产生特异性免疫应答的一类物质。l o x l 、l o x 2 、l o x 3 的分子量都远大于6 0 0 0d a l ，其化学成分为含多肽的天然蛋白质，而且酪氨酸的含量较高，免疫原性和抗原性都较强，可作为完全抗原进行免疫。但是半抗原虽能与抗体特异性结合，却不能激发机体产生抗体，必须与蛋白质( 载体) 结合后进入机体，才能产生有效的免疫应答。所有抗体都具有与抗原特异性结合的能力，其本质是抗原决定蔟与抗体结合簇的专一适配性。抗原决定簇( a n t i g e n i cd e t e r m i n a n t ) ，又称表位( e p i t o p e ) 指抗原分子上专有的化学基团，可以决定其刺激机体所产生抗体的特异性。抗原决定簇与其相对应的抗体结合簇立体构型完全相适应。抗体结合簇是在抗体分子上与对应的抗原决定簇发生特异性结合的部位。一个抗原分子可带有多个不同的决定簇。抗原分子量愈大，决定簇数量愈多。决定簇数目代表抗原分子的结合价。因此分子量大的抗原，将会产生相当丰富的杂交瘤细胞株，后期阳性筛选的工作量会很大p ”川。多克隆抗体( p o l y c l o n a la n t i b o d y ，p c a b ) ：因为进入机体的抗原往往带有若干个抗原决定簇。不同个体对同一抗原决定簇的反应并不相同，即使同一个体不同时间接受抗原刺激后产生的反应也不完全一致。由于人们无法将体内已受抗原刺激的各种不同的b 淋巴细胞克隆区分开，即使在体外能将它们分成单细胞，也无法让其继续生长增殖并分泌抗体。因此，用常规免疫方法制备的免疫血清抗体只能是数目众多的单克隆抗体的混合物，现在，一般称其为多克隆抗体( p c a b ) 。这种多克隆抗体存在特异性差、效价低、数量有限、动物问个体差异大，难以重复制备等固有缺陷，许多场合下使用时难尽人意。单克隆抗体( m o n o c l o n a la n t i b o d y ，m c a b ) ：对于体内免疫法很难获得单克隆抗体( m o n o e l o n a la n t i b o d y ，m c a b ) 。如能将所需要的抗体形成细胞选出并能在体外进行培养，即可获得已知特异的单克隆抗体。1 9 7 5 年德国学者k o h l e r 和英国学者m i l s t e i n 将小鼠骨髓瘤细胞和经绵羊红细胞( s h e e pr n eb l o o dc e l l ) ，s r b c ) 免疫的小鼠脾细胞在体外进行两种细胞融合，结果发现部分形成的杂交细胞既能继续在体外培养条件下生长繁殖又能分泌抗s r b c 抗体，称这种杂交细胞系为杂交瘤( h y b r i d o m a ) o ”。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有b 淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永生的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制各抗一种抗原决定簇的特异性强的单克隆抗体。这种用杂交瘤技术制备的单克隆抗体可视为第二代抗体。单克隆抗体由于纯度高，特异性强。可以提高各种血清学方法检测抗原的敏感性及特异性，但单克隆抗体多为取价抗体，与抗原结合不易交联为大分子集团。故不易出现沉淀反应，对其检测时需要使用酶标仪进行免疫酶标记技术一e l i s a ，迄今全世界已研制成数以千的m c a b l 3 7 3 8 3 ”。单克隆抗体与多克隆抗体的比较：与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有均质性、特异性及长期无限量供应性等特点，但杂交瘤也有不足之处：其制各方法复杂，周期长，一般需要6 1 2 个月；工作量大，细胞培养条件严格，费用高；细胞稳定性不太好，细胞株保存要求严格等( 刘秀梵，1 9 9 4 ) ，如表l 所示。根据杂交瘤技术获得单克隆抗体准确特异地检测抗原适于本实验进行i ”1 。3河北农业大学硕士学位论文表1 单克隆抗体与多克隆抗体的比较( 仿刘秀梵，1 9 9 4 )t a b l e lt h ec o m p a r i s o no f t h em a ba n dp c a b ( f r o ml i u ，1 9 9 4 )杂交瘤技术，即细胞融合，是一个随机的物理过程。杂交瘤的基本原理是，在小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合细胞悬液中，经融合后细胞将以多种形式出现，如融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、来融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。正常的脾细胞在培养基中存活仅5 7 天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去。而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。细胞的d n a 合成一般有两条途径。主途径是由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成d n a ，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶( h g p r t ) 和胸腺嘧啶核苷激酶( t k ) 的催化作用合成d n a 。细胞融合的选择培养基中有三种关键成份：次黄嘌呤( h y p o x a n t h i n e ，h ) 、氨甲喋呤( a m i n o p t e r i n ，a ) 和胸腺嘧啶核苷( t h y m i d i n e ，t ) ，所以取三者的字头称为h a t 培养基。氨甲喋岭是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成d n a 。而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的h g p r t 细胞株，所以不能在该培养基中生长。只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能，可在h a t 培养基中长期存活与繁殖”“。4大豆脂肪氧化同工酶( l o x l ) 单克隆抗体的制备及其检测应用小鼠脾淋巴细胞i | 聚乙二醇| | 骨髓瘤细胞h g p r t + 上h g p r t - 上1 l上上l 未融台雕脾细胞融合的脾细胞杂交瘤细胞融合的瘤细胞未融合的瘤细胞lh a t 选择性培养基中培养筛选h g p r t + 细胞完整h g p r t + 细胞代谢h g p r t 代谢缺陷不但不能连续培养完整能够连续培养能在h a t 中生长上上上细胞死亡细胞生长并增殖细胞死亡基因j 二程抗体( g e n e t i c a l l ye n g i n e e r i n ga n t i b o d y )自1 9 7 5 年单克隆抗体杂交瘤技术问世以来，单克隆体在医学中被广泛地应用于痢疾的诊断及治疗。但目前绝大数单克隆抗体是鼠源的临床重复给药时体内产生抗鼠抗体使临床疗效减弱或消失。因此，临床应用理想的单克隆抗体应是人源的，但人一人杂交瘤技术目前尚未突破，即使研制成功，也还存在人人杂交瘤体外传代不稳定，抗体亲合力低及产量不高等问题。目前较好的解决办法是能研制基因t 程抗体( g e n e t i c a l l ye n g i n e e r i n ga n t i b o d y ) 代替鼠源单克隆抗体用于临床。但是在脂氧酶l o x 的单克隆抗体制备用于鉴定的实验过程中，鼠源的单克隆抗体能够顺利完成。基因工程抗体兴起于8 0 年代早期。这一技术是将对j g 基因结构与功能的了解与d n a重组技术相结合，根据研究者的意图在基因水平对i g 分子进行切割、拼接或修饰，甚至是人工整合后导入受体细胞表达，产生新型抗体，也称为第三代抗体。基因工程抗体包括嵌台抗体、重构抗体、单链抗体、单区抗体及抗体库等。其中以嵌合抗体研究的较多，也较成熟。单链抗体及单区抗体虽具有结构简单、分子小等优点但其临床应用的前景尚待证实1 4 “。免疫学分析技术在生命科学研究中的重要性日益明显。它是根据免疫学的基本原理而建立的对生物体内微量物质的检测技术。近年来，这种方法研究证明，由于免疫分析技术具有高度专一性和灵敏性，使用它几乎可以检测所有的生物活性物质，诸如对蛋白质、核酸、甾类激素、多肽激素等的定性、定量和定位的分析以及对生物膜的研究等。通常生物测定或物理化学检测技术往往需要几克甚至几十克的材料，经过反复提取、分离和纯化处理后方可得到供测样品，且要有价格昂贵的仪器( 如高效气相色谱、液相色谱以及核磁共振等) 配合分析才能完成，而免疫分析技术可直接测定略经纯化的微量样品中的某一种或某几种物质。它具有灵敏、精确、迅速和简便等优点1 4 “i 。放射免疫分析( r a d i oi m m u n o a s s a y ，r i a ) 技术：1 9 6 0 年，美国学者y a l o w 和b e r s o n 创立了放射免疫分析( r a d i o i m m u n o a s s a y ，r i a ) ，它使得那些原先认为是无法测定的极微5河北农业大学硕士学位论文量而又具有重要生物学意义的物质得以精确定量”4 ”。放射免疫分析( r a d i o i m m u n o a s s a y ，r i a ) 是以放射性核素为标记物的标记免疫分析法，免疫放射分析( i r m a ) 是从放射免疫分析( r i a ) 的基础上发展起来的核素标记免疫测定，其特点为用核素标记的抗体直接与受检抗原反应并用固相免疫吸附剂作为b 或f 的分离手段。放射免疫分析r i a 虽然有灵敏度高。特异性强，应用范围广，操作简便等无法比拟的优点，特别适用于微量蛋白质、激素和多肽的定量测定。但是r 1 a 存在以f 缺点：1 只能以免疫反应测得具有免疫活性的物质，对具有生物活性而失去免疫活性的物质是测不出的。因此r i a 结果与生物测定结果可能不一致。2 由于使用了生物试剂，其稳定性受多种因素影响，需要有一整套质量控制措施米确保结果的可靠性。3 灵敏度受方法本身工作原理的限制，对体内某些含量特别低的物质尚不能测定。4 由于放射免疫分析是竞争性的反应，被测物和标准物都不能全部参与反应，测得的值是相对量而非绝对量。5 存在放射线辐射和污染等问题。并且有些放射性标记需专门部门提供，同时同位素的测定需较昂贵的仪器，从而限制了r i a 的进一步推广普及。j a m e sp g o s l i n g 根据在c l i n i e a lc h e m i s t r y ) ) 发表的文章统计，国际上在免疫分析