（发育生物学专业论文）果蝇ptip基因功能的初步研究.pdf

中文摘要 中文摘要 论文题目：果蝇p 卿基因功能的初步研究 研究生姓名：任宏艳 导师姓名：谢维( 教授) 学校名称： 东南大学 p e g 蛋白最初在果蝇中被鉴定，此蛋白家族在维持h o x 基因阻遏状态的过程中起关键 作用。t r i t b o r a x 蛋白家族与p c g 蛋白的作用是相互拮抗的，它们在发育过程中激活h o x 基 因的表达。这两大蛋白家族必须通过一类称之为p o l y c o m b 反应元件( p r e ) 的顺式作用元 件发挥作用。目前p e g 及t r x g 蛋白家族对h o x 基因的具体作j | j 机制尚不明了，且是否对 h o x 以外的基因产生效应也还不清楚。 尸刀p 基因，全称为p a x 2t r a n s a c t i v a t i o nd o m a i n i n t e r a c t i n gp r o t e i n ，实验表明其对小鼠胚 胎发育非常重要，且近期人们发现在哺乳动物中p t i p 蛋白与a l r 蛋白、m l l 蛋白( 果蝇 t r i t h o r a x 在哺乳动物中的同源物) 形成的复合物具有组蛋白甲基转移酶( h m t ) 的活性。 我们实验室已有的研究结果表明果蝇中尸死p ( c g 3 2 1 3 3 ，即d p t i p ) 对果蝇翅膀成虫盘a p p a t t e m i n g 的发育过程非常重要，并对t r i t h o r a x 依赖性的基因如u b x 的表达是必须的。冈此 我们认为d p t i p 可能在p c g t r x g 介导的基囚表达调控的过程中发挥重要作用。本文试图进 一步阐明在果蝇中p 卿基因的功能并从两个假说展开我们的研究。 1 d p t i p 是哺乳动物p t i p 基因在果蝇中的同源基因。 通过对多个生物物种的基闪组序列进行了序列比对和分析，基于序列及蛋白结构域组成 的相似性，我们发现p t i p 样蛋白编码基因仅存在于进化相对高等的真核生物，包括昆虫、 蠕虫和脊椎动物，但未发现存在于单细胞生物，如酵母。且p t 伊样蛋白编码基冈以独立 拷贝的形式存在于基因组中。为了验证d p t i p 与小鼠尸卿基因功能上的保守性，我们构 建了儿株小鼠p t i p 过表达( u a s m p 弛p ) 的转基因果蝇，并选择位于二号染色体的转基 因果蝇品系进行下一步研究。利用已获得的d p t i p 合子突变体果蝇所表现的蛹前期致死表 型，运用h s g a l 4 驱动u a s n 巾t i p 在d p t i p 突变的背景上表达时，我们发现部分d p t i p 功能缺陷的果蝇可以存活至成虫期。并且通过r t - p c r 和w e s t e r nb l o t 验证在驱动 u a s m p t i p 转基因果蝇表达的个体中，m p t i p 在转录及蛋白水平均有显著表达。这些结果 表明d p t i p 与哺乳动物p 卿在功能上是保守的，d p t i p 确实是哺乳动物p z z p 的同源基因。 因此我们在果蝇中的研究结果将有可能推广到哺乳动物。 2 d p t i p 对a l pp a t t e r n i m g 至关重要且在体介导组蛋白甲基化修饰 我们已有的研究结果显示e n g r a i l e d ( e n ) 在卯死p 合子突变体果蝇的整个翅膀成虫盘均 有表达，说明e n 在a n t e r i o r 出现了去阻遏现象。由r 丁在哺乳动物中的研究结果表明p t i p 协 同激活基因的表达，因此，我们推测d p t i p 对e n 的表达调控是间接的。通过原位杂交我们 发现勘的转录阻遏因子c u b i t u si n t e r r u p t u s ( c o 在d p t i p 合子突变体果蝇的翅膀成虫盘 a n t e r i o r 部分的分布几乎完全消失。此外，d p t i p 突变体唾液腺的免疫染色结果显示，h 3 k 4 三甲基化修饰水平明显下降，而h 3 k 2 7 的三甲基化修饰水平却显著增加。并且我们用 w e s t e r nb l o t 验证了h 3 k 4 的三甲基化水平的降低。这些结果提示我们d p t i p 通过介导组蛋 白修饰直接调控c f 的表达进而参与a p 轴形态发生。由此我们认为p t i p 通过在体介导组蛋 白修饰而在特定的发育事件中发挥重要的作用。 关键词：p o l y c o m b ；t r i t h o r a x ；p t i p ；果蝇；组蛋白修饰 英文摘要 a bs t r a c t t h e s i st i t l e ：f u n c t i o n a ls t u d yo fd r o s o p h i l ap ，丌pg e n e g r a d u a t es t u d e n tn a m e ：r e nh o n g y a n s u p e r v i s o rn a m e ：x i ew e i ( p r o f e s s o r ) s c h o o ln a m e ：s o u t h e a s tu n i v e r s i t y p o l y c o m bg r o u p ( p e g ) p r o t e i n s ，w h i c hi n i t i a l l yd i s c o v e r e di nd r o s o p h i l a , a r eb e s tk n o w nf o r t h e i rr o l e si nt h em a i n t a i n i n go fh o xg e n e ss i l e n c i n gd u r i n gd e v e l o p m e n t t r i t h o r a xg r o u p ( t r x g ) p r o t e i n sa n t a g o n i z ep c ga c t i o na n da r ee s s e n t i a lf o rt h em a i n t a i n i n go fh o xg e n ei i l t h ea c t i v e t r a n s c r i p t i o ns t a t e s a c c u m u l a t e de v i d e n c es u g g e s t st h a tt h e s et w op r o t e i ng r o u p sf u n c t i o ni n c o m p l e x e sa n dv i as p e c i a lc i s r e g u l a t o r ye l e m e n t s ，t e r m e da sp o l y c o m br e s p o n s ee l e m e n t s ( p r e s ) t h ep r e c i s ew a yo fh o wp c ga n dt r x gw o r ki nt h eb i o l o g i c a lc o n t e x ti sn o tw e l lu n d e r s t o o d i n a d d i t i o n , i ti sn o tc l e a rw h e t h e rt h ew a yt h a tt h e s ep r o t e i n sa f f e c to nh o xg e n e sc o u l db ee x t e n d e d t oo t h e rg e n e s p t i p 。o rp a x 2t r a n s a c t i v a t i o nd o m a i n - i n t e r a c t i n gp r o t e i n 。h a sb e e ns h o w nt ob ea ne s s e n f i a l g e n ef o rt h em o u s ee m b r y o n i cd e v e l o p m e n t r e c e n ts t u d i e sd e m o n s t r a t et h a tp t i pp r o t e i n c o m p l e x e sw i t ha l ra n dm l l 3 ，t h ef l yt r i t h o r a xh o m o l o g u e s ，p o s s e s s i n ga ne n z y m a t i ca c t i v i t y o fh i s t o n em e t h y l t r a n s f e r a s e ( h m t ) i nm a m m a l s p r e v i o u ss t u d yi no u rl a bh a v es h o w nt h a tt h e f l yp r e s u m p t i v ep t i pg e n e ( c g 3 2 l3 3 ，r e f e r r e dt o 卯刀_ pt h e r ea f t e r ) p l a y sa ne s s e n t i a lr o l ei nt h e a n t e r i o r - p o s t e r i o r ( a p ) p a t t e r n i n gi nt h ew i n g i nc e l lc u l t u r e i ta p p e a r st h a t 卯刀pi sr e q u i r e df o r t h ee x p r e s s i o no fh o m e o t i cg e n e s ，s u c ha su b x ，i nt r x gg e n e sd e p e n d e n tm a n n e r t h e r e f o r e ， d p 力pc o u l dp l a yr o l e si ns p e c i f i cd e v e l o p m e n t a lp r o c e s s e si nr e l a t e dt ot h ep c g t r x gc o n t r o l l i n g o fg e n ee x p r e s s i o n t h i ss t u d yi sa i m e dt of u r t h e rc h a r a c t e r i z et h eg e n ef u n c t i o no f 尸z 驴i nf l i e s a n dw ea r et e s t i n gw i t ht w os p e c i f i ch y p o t h e s e s 1 d p t i pi st h eo r t h o l o g o u sp a r t n e ro f t h em a m m a l i a np 刀pg 蚰厶 w ed i dac o m p r e h e n s i v es e q u e n c ea n a l y s i s c o m p a r i s o na c r o s sm a n ys p e c i e s ，w h o s eg e n o m e s e q u e n c e sa r ea v a i l a b l e b a s e do nt h es e q u e n c es i m i l a r i t ya n dt h eu n i q u ed o m a i ns t r u c t u r eo ft h e h u m a np t i p w ef o u n dt h a tp 配p 1 i k eg e d ee x i s t so n l yi nh i g h e re u k a r y o t i co r g a n i s m s ，i n c l u d i n g i n s e c t s ，w o r ma n dv e r t e b r a t e s ，b u tn o ti ns i m p l e rf o r m so fo r g a n i s m s ，s u c ha sy e a s t p z y p l i k e g e n ea p p e a r st ob ew i t has i n g l ec o p yi na l ls p e c i e st h a tw ee x a m i n e d t ot e s td i r e c t l yw i t ht h i s h y p o t h e s i s w ea s k e di ft h ef u n c t i o n0 td p t i pc o u l db er e p l a c e db ym p t i p 、n eu t i l i z e dt h e p r e p u p a ll e t h a lp h e n o t y p eo ft h ez y g o t i c 卯刀pm u t a n tf l i e s w ec o n s t r u c t e ds e v e r a lu a s c o n 仃o i l e dm o u s ep 死pf u a s m p t i p ) t r a n s g e n e s ，a n dt h eo n em a p p i n gt ot h es e c o n d c h r o m o s o m ew a su s e df o rf u r t h e rs t u d i e s ，l 场e nc 纠s m p t l pi sd r i v e nt oe x p r e s s i o nw i t ht h e h s g a l 4i nt h e 卯刀pm u t a n tb a c k g r o u n d w ef o u n dt h e s ef l i e ss u r v i v e dt ot h ea d u l ts t a g e i n a d d i t i o n ，m j p 死pe x p r e s s i o n sw e r er e a d i l yd e t e c t a b l e ，a se x a m i n e db yr t p c ra n dw e s t e r nb l o t t h e s er e s u l t si n d i c a t et h a t 卯刀pf u n c t i o n si nac o n s e r v e dw a ya si nt h em a m m a l sa n dt h a t 卯刀p i st r u l yt h eo r t h o l o go fm a m m a l i a n 尸觋t l l i sw i i la l l o wu st oe x t e n do u rf m d i n g si nf l i e st ot h e m a m m a l i a ns y s t e r n 2 d p t i pi se s s e n t i a lf o ra pp a t t e r n i n ga n dr e g u l a t e st h eh i s t o n em e t h y l a t i o n nv i v o o u rp r e v i o u sr e s u l t sh a v es h o w nt h a te ni se x p r e s s e db r o a d l yo v e rt h e 卯刀r 尸z y g o t i cm u t a n t w i n gd i s c s p r e s u m a b l yb yt h ed e r e p r e s s i o no fe ni nt h ea n t e r i o rc o m p a r t m e n t h o w e v e r , t h i s r e s u l ti sn o tc o n s i s t e n tw i t had i r e c tr o l eo fd p t i p s i n c ef i n d i n g si nm a m m a l i a nh a v es u g g e s t e da r o l ef o rp t i pc o n s i s t e n tw i t ht h eg e n ea c t i v a t i o n w et h e r e f o r ef a v o r e dav i e wt h a td p t l p i n d i r e c t l yr e g u l a t e st h ee ne x p r e s s i o n b yi ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，w ef o u n dt h a tt h ee x p r e s s i o no f c u b i t u si n t e r r u p t u s ( c o ac a n d i d a t ee nr e p r e s s o r , i sl o s ti nt h ea n t e r i o rp a r to ft h e 卯刀pz y g o t i c m u t a n tw i n gd i s c s i na d d i t i o n w ef o u n dt h el e v e l st r i m e t h y l a t e dh 3 k 4d e c r e a s e da n d t r i m e t h y l a t e dh 3 k 2 7i n c r e a s e di nt h ed p 孤pm u t a n ts a l i v a r yg l a n d p a r to fw h i c hi sc o n f i r m e db y w e s t e r nb l o t t h e s er e s u l t ss u g g e s tam o d e lt h a td p t i pd i r e c t l yr e g u l a t e sc ie x p r e s s i o nv i ah i s t o n e 英文摘要 m o d i f i c a t i o na n dh e l p si nt h et u pp a t t e r n i n g w et h e r e f o r ea r ea b l et od e m o n s t r a t e ，nv i v o ，t h a t p r r i pf u n c t i o n si nas p e c i f i cd e v e l o p m e n t a lp r o g r a mt h r o u g hac o o r d i n a t er e g u l a t i o no fh i s t o n e m o d i f i c a t i o n k e yw o r d s ：p o l y c o m b ；t r i t h o r a x ；p t n ? ；d r o s o p h i l a ；h i s t o n em o d i f i c a t i o n i 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：农室拉日期：碰u 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复印 件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括 刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研究生院办理。 研究生签名：溅导师签名： 绪言 绪言 分化细胞的特性在很大程度上取决于其独特的基因转录谱( t r a n s c r i p t o m e ) ，某些基因 一呈现活跃的转录活性，同时另一些基因则处于关闭的状态。这种基因转录的状态可以经多代 细胞分裂而维持不变，称之为细胞记忆( c e l l u l a rm e m o r y ) 1 1 1 细胞记忆不仅在生物个体发 育中对细胞的分化和命运决定起关键作用，而且细胞记忆失调与癌症等疾病的发生密切相 关。因此阐明这种细胞记忆的机制是生物学的基本问题之一。 维持细胞记忆的机制目前还不十分清楚，但研究表明，表观遗传控制可能是其中的覆要 组成部分，特别是通过p o l y c o m bg r o u p ( p e g ) 和t d t h o r a xg r o u p ( t r x g ) 两人类蛋白复合物 对特定组蛋白残基进行修饰，进而改变染色质的结构，从而实现对基囚转录的长时程调控是 新近研究的热点之一。 本课题将围绕新近发现的一个叫做p 弛p 的基因进行功能研究。我们有证据表明p t i p 蛋白可能是p c g t r x g 通路的重要成员。我们已经对果蝇p 卿进行了初步鉴定，并发现其 在果蝇早期胚胎发育特别是p a t t e r n i n g 起重要作用。因此本研究将以果蝇为模式动物集中对 p t i p 如何影响p c g t r x g 介导的组蛋白修饰的机制进行探讨。 东南 砸学位论立 第1 章文献综述 1 1 p c g 和t r x g 蛋白功能研究进展 p c g f p o y c o m b g r o u p ) 蛋a 最初在果蝇中被鉴定，第一个p c g 突变体蹦们s e xc o m b j ( e s c ) 导致雄性某蝇第二及第三埘足上出现多余的性梳，这也是p o l y c o m b 名称的由来。有关 3 图】i 果蝇胚胎早期发育的基因( m o l e c u l a r b i o l o g yo f t h e c e l l 4 t h e & a o n ) p o l y c o m b 在细胞记忆中作用的捕述最早可追蝴到e d w a r dl e w i s 的诺见尔奖经典n a t u r e 文 献”l e w i s 毕生致力于研究果蝇同源盒基因( h o m e o t i cg e n e s 如u b x 和a b d - b 等，又称 h o x 基嘲) 的表达调控。h o m e o t i cg e n e s 是一娄重要的胚胎牡肯调控基囡，其在果蝇胚胎不 同节段的差异衰返决定了果蝇不同体节的最终发育属性。h o m e o t i cg e n e s 的表达由早期发育 i 嚣篙嚣篇糍萎裟霈锻糍： 如图1i 所示) 所控制，其分布节段一旦确定， h o m e o t i cg e n e s 的这种表达分布是通过什么机 制柬维持的呢? 显然小可自e 通过最初控制这些基因开启或关闭的基因来实现，园为这些基因 的表达是一过性的，其基园表达产物在胚胎晚期即已不复存在。网此，人们猜想町能存在其 它机制来维持h o m e o t i cg e n e s 的开启或关闭状态。l e m s 根据他果蝇遗传学的研究结果首先 提出口o b c o m b ( p c ) 可能对h o m e o t i cg e n e s 表达具青负调柑的作用。大量研究工作肯定了 佻对h o m e o t i cg e n e s 咀遇状态的维持起关键作用”j ，并拉现多个基园具确和p c 相1 蛳佝突变 表型，即均表现h o m e o t i c 口a t l s 如衄m l 。n ，这些基因构成rp c g 基凶家族e 由于单个家族成 员的突变即足以遗成表型的产牛，因此合理的解释是多个p c g 虽a 以复合物的形式发挥作 用。同一时期迁发现另一组封h o m e o t mg e n e s 表达具有调甘作用的基囡，以t n t h o r a x ( t m ) 和a s h l 为代表”，称t r x g 基因。t r x g 基因与p c g 基因在遗传学上表现出相互拮抗的关 系。 p c g 和t g 基因酱墒存在于包括哺乳动物和植物”在内的各种多细胞生物体一其在 进化上相当保守。人类p c g 基目如胁- 1 i j ”1 12 , t o g 基因如a i i i ( m i i - i ) 均和癌症笈生关系密 切”“。因此p o g t r x g 通路是生物体控育基因表达调控的基本途径之。 弋 l， 第1 章文献综述 l i 】，p 复合物 p c g 的沉默效应是由三组多蛋白聚合体1 1 3 17 1 共同维持的，它们分别是p r c i 、p r c 2 驶 p h o r c 复合物( 表1 ) ( 图l2 ) 1 9 1 。 图l2z 果蝇p o l y c o m b 复合体。阿中各复台体的核心蛋白 用实线椭圆表示，与复合体有柙互作用 n 还不确定的蛋白 用虚线椭圆表示。a 、p r c i 的四个核心组分( p c 、p h 、p s c 、 r i n g ) ；b 、p h o r c 核心成员( p h o 、f m b t ) ，c 、果蝇胚 胎中p r c 2 报道的不同亚型其核心组分部是e f z l e s c 、 s u ( z ) 1 2 及p 5 5 ，这两种韭型之间的关系还不清楚d 、果 蝇幼虫中发现的p r c 2 还包括n a d + 依赖性的组蛋白脱乙 酰基酶s i r 2 。n a tr e vg e n e t , 2 0 0 7 1 1 1 1p r c i 复台物 从果蝇o 1 2 小时胚胎中纯化的p r c i ( p o l y c o m br e p r e s s i v ec o m p l e x l ) 复合物包括 p o l y c o m b ( p c ) 、p o s t e d o rs e xc o m b s ( p s c ) 、p o l y h o m e o t i c ( p h ) 、i l r n g 驶少量的s c m ( s e x c o m b m z d i e g ) ，同时纯化出的还有z e s t e 、t b p ( t a t a b o xb m d m gp 。k m ) 褶关因子 t a f i l 2 5 0 、t a f i l l1 0 、t a n l 8 5 和t a f i l 6 2 及一些其他因于如m 1 2s i n 3 as m r t e r l 4 。从 哺乳动物h e l a 细胞纯化的p r c l 复台物成分与果蝇中相似，包括h p c i 、2 、3 ，h p h i 、2 、 3 ，r 1 n g i a 、r i n g i b 、b m l l 及它的f 刮源物m e l l 8 “j 。目前植物中还没发现p r c l 组分 的同源物”。秀丽隐杆线虫也醯少p r c i 复合物，而生物信息学已预测到在线虫里有p c 同 源物的存在“。 东南大学硕士学位论文 瞄锻嘲e 瞄 t 嘿gc o m d 躺e s 表1 ：p e g 和t r x g 复合体的核心组分。表左侧为果蝇中个复合体的核心组分，右侧为各 组分在哺乳动物中的同源物。c e l l ，2 0 0 7 p r c l 复合物的核心蛋白p c 可以特异性地识别并结合三甲基化的h 3 k 2 7 2 2 1 。果蝇中的 r i n g 和哺乳动物中的r i n g l a 、r i n g l b 都包含r i n g 结构域，已证明其具有e 3 泛素连接 酶的功能并可以单泛素化组蛋白h 2 a 2 2 2 4 的第1 1 9 位l y s 残基【l9 1 。此外，b m l l 是果蝇p s c 的同源物，它也包含r i n g 结构域可以增强r i n g l a 的催化活性，对这一活性的功能还不 清楚，但已知当p s c 缺失时，p c g 介导的沉默效应就会被阻遏【l9 1 。 1 1 1 2 p r c 2 复合物 p r c 2 复合体包括e ( z ) ( e n h a n c e ro f z e s t e ) 、e s e ( e x t r as e xc o m b s ) 、s u ( z ) 1 2 ( s u p p r e s s o ro f z e s t el2 ) 和n u r f - 5 5 ( 在人中为e z h 2 ，e e d ，s u z12 和r b a p 4 6 4 8 ) ，该复合体具有结合并甲 基化核小体的功能。其核心蛋白是含s e t 结构域的h 3 甲基转移酶蛋白e ( z ) ( e n h a n c e ro f z e s t e ) 。单独的e ( z ) 没有甲基转移酶活性，但当它与其他组分组成复合体时，就具有组蛋白 甲基转移酶( h i s t o n em e t h y l t r a n s f e r a s e ，h m t ) 的活性，从而甲基化组蛋白h 3 第2 7 位的l y s 残 基( h 3 k 2 7 ) 2 1 。h 3 k 2 7 三甲基化是p e g 蛋白靶基冈的特征，e ( z ) 同时也可以单甲基化及双 甲基化果蝇基囚组中5 0 的h 3 k 2 7 。h 3 k 2 7 被三甲基化后可以被p r c l 中p c 的c h r o m o d o m a i n 特异性识别，h 3 k 2 7 单及双甲基化的作用目前还不清楚。体外实验中p r c 2 复合体 也可甲基化h 3 k 9 ，而在体内p c g 靶基因也发现有h 3 k 9 的三甲基化。p 5 5 是一种与染色质 装配因子c a f l 有关的一种组蛋白结合蛋白【1 9 1 。p r c 2 的组成蛋白对结合及甲基化核小体都 具有一定的作用。 现在果蝇中发现有一大约1 m d 的复合体包含p c l ( p o l y c o m b - - l i k e ) 蛋白，在哺乳动 物里的同源物是p h f ( p h d f i n g e rp r o t e i n ) 。p c l 对p o l y c o m b 沉默h o m e o t i cg e n e s 的表达是必 须的，并发现在多线染色体上p o l y c o m b 所在的位点也有p c l 的存在。这表明这个复合体存 在于p e g 靶区并且也有可能三甲基化h 3 k 2 7 1 旧 2 3 】。另外，在果蝇晚期发育阶段，发现一个 包含s i r 2 的复合体，s i r 2 是酵母s i r 2 ( n a d + 一依赖性组蛋白去乙酰化酶) 在果蝇中的 同源物，现在对它的结构及功能还知之甚少。 哺乳动物中已纯化出三种与p r c 2 相似的复合物：p r c 2 、p r c 3 、p r c 4 ，这些复合物都 具有甲基转移酶的活性，每种复合物都有特异的作用底物【l9 】。植物中也有几个p r c 2 1 i k e 复 4 第1 章文献综述 合物，与果蝇中p r c 2 亚单位组成是不同的1 2 4 j 。 1 1 l 3p h o r c 复合体 p h o 和它的同源物p h o l 是目前已知唯一直接结合于d n a 链的两个p c g 蛋白。它们在 哺乳动物中的同源物是y y i ( y i n y a n g ) 。现已知p h o 存在于两种复合体中，其中一个复合体 i n 0 8 0 与染色质重组机制有关。p h o 还存在于另一复合体p h o r c 中，即p c g 第三大家族【2 5 1 ， 该复合体还包括一个m b t 结构域 m a l i g n a n tb r a i nt u m o r ( m b t ) d o m a i n s 蛋白d s f m b t ( 哺乳动 物s f m b t 在果蝇中的同源物) 。哺乳动物中有许多m b t 结构域蛋白，在果蝇中，d s f m b t 对p c g 的沉默效应也是必须的，m b t 重复序列可以特异性的结合于单或双甲基化的h 3 k 9 和h 4 k 2 0 博，2 5 】。p h o 蛋白是目前已知唯一具有d n a 结合特异性并可以募集p r c 2 及p r c l 于靶基因上的p c g 蛋白【2 6 ，27 1 ，然而纯化的p h o 复合物并不包含p r c i 和p r c 2 1 1 4 2 5 】，这提示 我们p r c i 和p r c 2 与p h o 的相互作用可能是暂时的。也有文献报道，p h o ； 1 1p h o l 双缺失 的突变体果蝇有致死表型，但其唾液腺染色显示多线染色体上的p c g 位点都是正常的【2 引， 这提示还有其它蛋白在p h o 和p h o l 缺失时可以募集p c g 成员发挥作用，现在已知的有 g a g af a c t o r ( g a f ) 、p i p s q u e a k 、d s p l 、g r a i n y h e a d 、以及s p l k l f 家族的成员，但把这些 因子突变后都没有p c g 突变的表型1 2 9 。因此我们猜测p e g 蛋白的募集可能需要多个转录因 子和一些未知组分共同完成。 目前在哺乳动物和植物中是否有相似的复合物存在还不清楚，但已证实哺乳动物中p h o 和d s f i n b t 都有其同源物 3 0 , 3 1 ，而植物基因组中则缺少编码p h o 和d s f m b t 的基因。 i i 2 p o l y c o m b 反应元件( p r i g ) 三大p c g 家族及t r x 家族都必须结合于一类顺式作用元件，我们称为p o l y c o m b 反应 元件( p o l y c o m br e s p o n s ee l e m e n t s ) 1 1 。对p r e 的了解人部分来白果蝇中儿个特异p r e 的研 究：e n g r a i l e d p r e 3 1 、f a b 7 p r e 3 2 ，3 3 】和b x d p r e f 3 4 】其中突出的例子是围绕凡西7 ( h o m e o t i c g e n e a b d - b 的关键调控序列之一) 进行的研究1 35 。c h i p 实验的结果表明，p c 蛋白和g a g a f a c t o r ( 一种t r x g ) 在f a b 7 的分布儿乎一样；用f a b 一7 和u a s 序列双重驱动的w h i t e 报告 基冈转基囚果蝇的表现说明f a b 一7 确能传递表观遗传信息。当这种报告基因与热激活的g a l 4 表达系统同时存在时，通过观测成虫果蝇眼睛的颜色以确定w h i t e 的表达强度。1 8 c 时，眼 睛颜色很浅，说明f a b 一7 抑制了w h i t e 的表达；但如果热激1 小时，再转同1 8 培养，眼睛 将明显变红，表明w 厅抛的表达被激活。有意思的是，眼睛颜色的变化程度与热激进行的时 间( 无论是胚胎早期还是成蛹阶段) 无关，由此推断w h i t e 的表达并不依赖g a l 4 的存在。 更令人惊讶的是，热激产生的红眼效应在子代仍然存在，说明这种可能通过p c g t r x g 介导 的转录激活作用可以经减数分裂而仍得以保持。毫无疑问，f a b 一7 报告基因的转基冈果蝇提 供了一个极好的p e g t r x g 的研究模型，然而该报告基因是否在果蝇中确由p c g t r x g 介导 尚缺乏证据，而其他p c g 靶基囚的转录调：1 了是否和f a b 一7 一样，也有进一步探讨的余地。 因此，更多p r e 的鉴定是另一令人关注的研究中心。特别是最近1 - 2 年，随着c h i p - o n - c h i p 技术的商业化应用，允许在全基因组的尺度上对d n a 结合蛋白的分布进行观测。以果蝇研 究为例，运用该技术发现p e g 蛋白的d n a 结合位点与h 3 k 2 7 的甲基化谱有极好的重替( 图 1 3 ) 【3 6 j ，有力地支持了现存有关p c g t r x g 的假说【3 6 ，7 1 。p a r o 研究小组还应用生物信息学 的研究方法对p r e 的预测进行了有益的尝试，虽然成功率只有大约5 0 1 3 剐，但或许代表了 未米的必要研究手段之一。 p r e s 包含很多保守的短序列。这些短序列可被d n a 结合蛋白所识别。在果蝇中p r e s 通常包括g a g a gm o t i f s 、p h o 和p h o l 的结合位点等序列，其中g a g a gm o t i f s 可结合 g a g a 冈子( g a f ) 和p i p s q u e a k ( p s a ) 11 9 1 。r i n g r o s e 等通过p r e 组成的这些特性提供了一 个预测果蝇序列中p r e 位点的软什【3 8 1 。 对p r e 的这些组分的功能研究还不是很清楚。其中有些组分的作用可能是募集p r c l 及p r c 2 中的成员，如g a f ，它的作用可能是使结合于d n a 链上的核小体移位从而使其他 蛋白易于结合到d n a 链上。有报道称p h o 可使d n a 链弯曲以促进p r c l 复合体结合于 p r e 。p h o 与p r c l 组成复合物后结合于p r e 。然而与不同的p r e 结合时，其结合的共有 基序的数目及序列都是不同的。 目前p r e 只在果蝇中有发现，在哺乳动物及植物中都没有确定的p r e 报道。 5 东自太学碗学位论女 1 1 3 p c g 复台体的组装 。黧釜：翟冀怒锻鬻篙嚣篙裟釜茬：；i 篙鬻! 磊j i 麓 用c h i p 实验己经证明：甲基化的h 3 k 2 7 峰值的分布区域与p c ，e z ) 及p s c 的分布区域基 图13p e g 蛋白和h 3 k 2 7 三甲基化在b i t h o r a x 复合体( p c g 靶基因) 上的 分布区域图。蓝色方块代表一些已知p i l e 在基因组上的位置。n n g e n e t 2 0 0 6 本相同( 图13 ) 徘】造进一步证明了h 3 k 2 7 甲基亿对p e g 复台体技挥功能是必须的。 有种模式认为：p h o r c 结台于p r e 后，介导p r c i 厦p r c 2 结合于p k e 形成大的复 合体。随之p r c 2 特异性甲基化h 3 y , l 2 7 p r c l 识别井与甲基化的蛆蛋白结合，使p r c 2 可 图i4 ：p e g 作用机制假说p h o 、g a f 等些d n a 结台蛋白结合下p r e b 1 募集和形成复合体；c 、特异性甲基化邻近组蛋白 识别并与甲基化的组蛋白结合，持续性的甲基化相邻的组蛋白。 nr “ 6 第1 章2 献综述 蛆持续性地甲基化相邻的组蛋白，这样就形成一个环，使p e g 复台物与靶基因距离接近而 拄挥对其的抑制作用( 图i4 ) “。 1 , 1 a t r l t h o r a x 蛋白家篪 所有p c g 蛋白的靶基因都披t r i d a o r a x 及一些其他蛋白如a s h i 、a s h 2 所激活它们与 p e g 蛋白的作用是相互拈抗的。 t r x 和a s h l 都音响s e t 结构域，都具有h 3 k 4 甲基转移酶活性，而设种甲基化形式通 常存在于活跃转录基因的调控序列圳，s e t i 是酵母中t r x 的同 琢物，它可以叩基化h 3 k 4 ( 常与转录激活相关联的一种修饰方式) 。有证据表明t r x 蛋白还可募集组蛋自己酰转移 簿c b p ，囡而参与了组蛋白的乙酰化这种熟知的活化转录的尘【蛋白修饰方式的形成。 总结起来，现在的认识是p c g 与t o 通过不同的纽蛋白化学修饰方式，并进而改娈 染色质的结构，实现对基因阻遢或活跃转录状态的维持。需要指出咀上所述p c g 和t r x g 复合物组成均是基于纯化策略得到的，u r 蛆占定这些成分仅是相互作用较强的部分叫远非复 台物的全部。事实上不同研究小组纯化的复台物的结果显示，除3 叫种一致的棱心组分外 也含有不一致的其它组分。冈此对p e g 和t h g 复合物的组成和功能仍需进一步深入研究。 1 2 组蛋白修饰与基因表达调控的研究进展 在真核细胞的细胞核中，核小体是染色质的主要结构元件核小体是南核心组蛋白八聚 体( 2 个拷贝的h 2 a 、h 2 b 、h 3 、h 4 ) 及缠绕其外周长度为1 4 6 碱基对的d n a 组成一每个 组蛋白都有进化上保守的n 端末尾伸出核小体外，这些组蛋白的n 端尾部富含能被共价修 饰的氪基艘残基，从而导致许多翻译后修饰，包括磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化、a d p - 核糖基化1 4 。恻以及去磷酸化、去己酰化、去甲基化( 阁i5 ) 。这些修饰可以影响组蛋白d n a 互鞋。 ( j 三) 圜、i 匕仝：e ：书 二= 舾a 翻扣锄( h a t h p a c 二：蚺怕m a h