（预防兽医学专业论文）内蒙古传统乳制品中乳酸菌益生作用的研究.pdf

摘要 本研究以从内蒙古牧区的乳及乳制品中分离、鉴定的3 8 株植物乳杆菌和肠球菌为样品， 进行益生菌的体外筛选及其益生作用的研究。 体外筛选包括对胆盐和酸的耐受性，对常用8 类1 9 种药物的敏感陛，对结肠癌 细胞h t - 2 9 的黏附性和其发酵液对1 9 种指示菌的抑审蚱用等试验。结果如下： 各菌株经过不同浓度胆盐驯化，2 l 株乳酸菌能在胆盐中生长，包括9 株肠 球菌和1 2 株植物乳杆菌。这些菌株对胆盐都有不同程度的耐受性。植物乳杆菌耐 胆盐能力明显高于肠球菌；肠球菌在p h 3 环境中存活率都在4 5 以上：植物乳杆 菌在p h 3 环境中存活率均在6 0 以上，甚至达到1 0 0 以上；除w z 3 8 - 2 和w z 2 6 - 1 外，肠球菌对多数药物表现耐药，而植物乳杆菌只对糖肽类、喹诺酮类、青霉素g 和 多粘菌素b 有耐药性：2 1 株菌对结肠癌细胞h t - 2 9 都有一定粘附能力，植物乳杆 窗的平均黏附水平( 2 9 个细胞) 明显高于肠球菌( 1 3 个细胞) ；根据上述试验 选出较好菌株1 2 株植物乳杆菌和4 株肠球菌，植物乳杆菌的发酵液对指示菌中的 部分致病菌和部分乳酸菌都有抑制作用，肠球菌发酵液对指示菌中所有致病菌都 有不同程度的抑制作用，除w z 2 6 1 外对乳酸菌都无抑制作用。 对体外试验筛选出的1 株植物乳杆菌w z 4 7 1 进行增强机体免疫和调节肠道 菌群平衡两种益生作用的研究。结果显示，灌胃植物乳杆菌w z 4 7 - l 可显著增强 正常小鼠单核巨噬细胞的吞噬功能，对细胞免疫和体液免疫无显著影响；可使正 常小鼠肠道中的乳杆菌数显著增加肠杆菌数和产气荚膜梭菌数显著减少说明 其具有调节肠道菌群平衡的作用。 关键词：乳酸菌；益生菌；筛选；免疫：肠道菌群 s t u d yo np r o b i o t i ce f f e c t so f t h el a c t i ca c i db a c t e r i a f r o mt r a d i t i o n a ld a i r yp r o d u c t si ni n n e rm o n g o l i a a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , p r o b i o t i c sw e r es c r e e n e df r o m3 8s t r a i n so f l a c t i ca c i db a c t e r i a ( l a b ) i s o l a t e df r o md a i r ya n dd a i r yp r o d u c t sf r o me o t m t y s i d e so fi n n e rm o n g o l i a ，a n dt h e i r p r o b i o t i c f u a c t i o n sw a s s t u d i e d i nv i t r os c r e e n i n ge x p e r i m e n t so fp r o b i o t i c si n c l u d e dt o l e r a n c ei np h 3a n do 3 b i l es a l t ，s e n s i t i v i t yt o19c o m m o nd m g s ，a d h e r e n c et oh t - 2 9c e l la n di n h i b i t i o no f t h e i rf e r m e n t a t i o ns u p e r n a t a n tt ot h ei n d i c a t o r t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta f t e ra c c l i m a t e d ， 9s t r a i n so fe n t e r o c o c c u sa n d1 2s t r a i n so fl a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u mi na l ls t r a i n sh a d a c i dr e s i s t a n c ea n db i l et o l e r a n c e t h e i rs u r v i v a lr a t ei n0 3 b i l ew e r eo v e r4 5 a n d g r o w t hr a t ei np h 3w e r eo v e r6 0 ，e v e n1 0 0 e x c e p tt h a tw z 3 8 2a n dw z 2 6 - 1 ，9 s t r a i n so fe n t e r o c o c c u ss h o w e dr e s i s t a n c et om o s to ft h ed r u g s ，w h i l e1 2s t r a i n so f l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u mw e r eo n l yr e s i s t a n tt og l y c o p e p t i d e ，q u i n o l o n e s ，p e n i c i l l i n a n dp o l y m y x i nb a l lo fl a c ，t i ca c i db a c t e r i ah a dt h ed i f f e r e n ta b i l i t yo fa d h e r e n c et o h t - 2 9c e l l ，t h ea v e r a g ea d h e r s i o nl e v e lo fl a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m ( 2 9b a c t e r i a c e l l ) w e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to fe n t e r o c o c c u s ( 1 3b a c t e r i a c e l l ) a c c o r d i n gt o a b o v er e s u l t s ，16s t r a i n sw e r es e l e c t e dt on e x te x p e r i m e n t ，t h ef e r m e n t a t i o ns u p e m a t a n t o fl a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u mh a dd i f f e r e n ti n h i b i t i o ne f r e c t so ns o m ep a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s ma n ds o m el a c t i c a c i db a c t e r i ao fi n d i c a t o r , w h i l et h ef e r m e n t a t i o n s u p e r n a t a n to fe n t e r o c o e c u sc o u l di n h i b i ta l l o ft h ep a t h o g e n i cm i c r o o r g a n i s mo f i n d i c a t o r , e x c e p tt h a tw z 2 6 - lc o u l d n ti n h i b i tl a c t i ca c i db a c t e r i a a c c o r d i n gt ot h ei nv i t r os c r e e n i n ge x p e r i m e n t ，l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u mw z 4 7 一l w a ss e l e c t e dt os t u d yi t sr e g u l a t i o nf u n c t i o no fi m m u n i t ya n di n t e s t r a lm i c r o f l o r ao f m i c e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h es t r a i nc o u l de n h a n c et h ef u n c t i o no fm o n o n u c l e a r m a c r o p h a g ea n dh a dn oe f f e c to nt h es p e c i f i ci m m u n i t y 1 1 1 es t r a i nc o u l dm o d u l a t et h e b a l a n c eo fi n t e s t r a lf l o r a k e yw o r d s ：l a c a c a c i d b a c t e r i a ；p r o b i o t i c s ；s c r e e n i n g ；加撕枷磁秒；i n t e s t r a l f l o r a d r e c t e db y ：p r o fz h o uy u x ia ：w un i a p pi ic a n tf o rm a s t e rd e g r e e ：w a n gz hif e n g ( m i c r o b i o l o g ya n di m m u n o l o g y ) ( c o l l e g eo f a n i m a ls c i e n c ea n dm e d i c i n e ，i n n e rm o n g o l i a a g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y ，h u h h o t 0 1 0 0 1 8 ，c r j n a ) 插图附表清单 表。1 益生性乳酸菌所产生的健康促进作用及可能的作用机理 表2 益生性乳酸菌对机体的免疫调节作用 表3 试验用抗生素的种类、药敏酣含药量及抑菌圈直径判断标准 表4 植物乳杆菌对胆盐和酸的耐受性 表5 肠球菌对胆盐和酸的耐受性 表6 植物乳杆萤的药物敏感性试蚴果 表7肠球菌的药物敏感性试蝣果 表8 植物乳杆菌对h t 一2 9 细胞的黏附作用 表9 肠球菌对h t - 2 9 细胞的黏附作用 表1 0 乳酸菌的抑菌作用结果 表l l 溶血素测定所加试剂及用量 表1 2 植物乳杆菌w z 4 7 一l 对小鼠免疫功能的影响 表1 3 植物乳杆菌w z 4 7 一l 对小鼠免疫功能的影响 表1 4 植物乳杆菌对正常小鼠肠道乳杆菌的影响 表1 5 植物乳杆菌对正常小鼠肠道梭菌的影响 1 6 图1课题研究内容及路线流程图 1 7 图2 肠杆菌变化曲线 1 8 图3 乳杆菌变化曲线 1 9 图4 梭菌变化曲线 1 5 3 9 3 9 4 0 8 9坞n虬船弘毖船船踮l!；船蚰 l 互 豇 t 量 e l & 。； 蚰 n 挖 坞 h 坫 内蒙古农业大学硕士学位论文1 1 前言 益生菌( p r o b i o t i c s ) 一词来源于拉丁文，意思为“有利于生命( f o r1 i f e ) 。” 在2 0 世纪6 0 年代，由于抗生素的广泛使用以及畜牧业中抗生素应用引起的副作 用，人们开始注意到一些活菌制剂在改善动物健康中的作用。l i l l y 和s t i l l w e l l 最初创造该词时，是用来指一种原生动物分泌的用于刺激另种原生动物生长的 物质。p a r k e r ( 1 9 7 4 ) 则用它来描述那些能通过促进动物肠道菌群平衡从而改善 动物健康的动物饲料制剂，包括各种生物或化学物质，如抗生素等。f u l l e r ( 】9 8 9 ) 将益生菌重新定义为“一种活的微生物制剂，它可改善宿主动物肠道菌群的组成， 从而有利于动物健康”，这一定义强调益生菌必须是由活细胞组成，从而排除了 抗生素。h a v e n a a r 等( 1 9 9 2 ) 将益生菌定义为“由单一或多种微生物组成的活菌 制剂，当应用于人或动物后，能改善宿主土著菌群的组成，从而促进人或动物的 健康”，该定义从多方面发展了益生菌这一概念。首先，它不再将益生菌的作用 局限于肠道菌群，还有可能作用于其它部位的菌群组成，例如呼吸道、泌尿生殖 道和皮肤等部位；其次，它首次明确地提出了益生菌在人体中应用的概念：第三， 益生菌可以由一种以上的微生物组成。后来，为了区分普通的酸奶菌种与益生菌， s c h r e z e n m i e r 等( 2 0 0 1 ) 将u a v e n a a r 所提出的益生菌定义修订为“含有足够数量 活菌、组成明确的微生物制剂或产品，能通过定殖作用改变宿主某一部位菌群组 成、从而产生有利于宿主健康作用”。该定义的不足之处在于仍然没有区分特定的 微生物与产品的具体形式，郭本恒( 2 0 0 3 ) 建议采用以下的定义：通过定殖作用 改变宿主某一部位菌群的组成、从而产生有利于宿主健康作用的单一或组成明确 的混合微生物“，。 益生菌是大自然赋予人类的宝贵财富，它广泛存在于自然界。为了对其利用， 科研工作者进行了广泛的研究，并取得了大量的成果，其中部分成果已应用于医 药和食品领域，产生了广泛的经济和社会效益。 人类利用益生菌尤其是乳酸菌已有相当长的历史，早期人们将发酵作为食品 保藏的一种手段，如泡菜、腐乳、酸奶、千赂等的初始产品均是自然发酵的，其 真正意义上商业化产品仅有一个多世纪的历史，它们是人们在自然产品的基础上 应用现代科学主要是微生物学而生产的产品。从广泛意义上讲全部的无害乳酸菌 均可称之为益生菌，因为这些乳酸菌作用于食品基质使其成分，如蛋白、脂肪、 碳水化合物等更利于1 人体吸收。但目前我们所指的益生菌是狭义的益生菌，主要 涉及那些可以在人或其它寄主体内主要是肠道定殖，有利于人体或寄主健康的微 生物。对益生菌的认识的原动力是人们对人体或动物胃肠道菌群组成的认识，在 人胃肠道可以定殖的优势菌双歧杆菌首先受到重视，其最早在药品和食品中得到 应用；同时肠道的次优势菌嗜酸乳杆菌也被广泛研究并得到应用，二者均是嗜热 菌。近年来人们除了继续研究上述菌的功能性尤其是活菌保持性外，益生菌研究 2 内蒙古传统乳制品中乳酸菌益生作用的研究 的重点已转向适温益生菌，其中以干酪乳杆菌、植物乳杆菌等为代表，大有后来 居上之势。对益生菌的研究以其在人或其它寄主胃肠道的定殖性为基础，研究其 多种生理功能。同时科研工作者对益生菌的分类、鉴定、作用机理、耐受性、菌 的结合机制和评估模型、抑菌性、稳定性、作用噬菌体等均进行了详尽的研究， 并取得了许多新的成果。 自1 8 5 7 年l o u i s p a s t e u r 提出发酵过程是由细菌引起的理论之后，j o s e p h l i s t e r 试图证明乳酸发酵的微生物本质。他以煮沸过的牛奶为培养基，在一次偶然的机 会中，分离到历史上的第一株纯的细菌培养物，并将之命名为b s c t e r i u ml a c t i s 。 在经过几十年分离和描述新菌种的工作之后，b e i j e m i c k ( 1 9 0 1 ) 首次提出了 l a c t o b a c i l l u s ( 乳杆菌属) 这一分类名称，该名称至今仍在使用，包含有5 0 多个种。 m e t c h n i k o f f ( 1 9 0 7 ) 根据他对“保加利亚杆菌( b u l g a r i a nb a c i l l u s ) ”的研 究结果，认为经常食用发酵乳有利于人体的健康，该菌与现代酸奶生长中所用的 l a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i is u b s p b u j g a r i c u s 非常相近。至今为止，乳杆菌仍 然是应用最广泛的益生菌。目前常用作益生菌的乳杆菌有l b d e l b r u e c k i is u b s p b u l g r i c u s 、l b a c i d o p h i l u s 、l b c a s e i 、l b f e r m e n t u n 、l b r e u t e r i 、l b r h a m n o s u s 、l b p l a nt a t u m 、l b a ct i s 、l b g a s s e r i 、l b j o h n s o n i i 等。 1 1 益生菌的筛选标准 作为益生菌的乳酸菌必须是那些被公认为安全的微生物( g r a s 微生物) ，如果 使用的是不具备生物安全性有案可查的新的菌种，在实际生产以前必须进行严格 的毒理学和耐受性研究。作为筛选的第二个重要步骤是菌株的来源，主要是由益 生菌产品的用途所决定。作为人使用的益生菌通常而要满足以下的要求：人体来 源，拥有可考证的安全和耐受记录；能在胃酸和消化道胆汁存在的情况下存活； 能改善肠道功能，纠正各种肠道异常症：产生维生索、能释放有助于食物消化、 促进基本营养物质的吸收，钝化肠道内的致癌物和有毒物的各种酶；能黏附到人 肠道上皮细胞、在黏膜表面定殖并能在消化道内生长繁殖；能产生抗菌物质，并 且对各种人体致病菌具有广谱抗菌作用；具有能刺激免疫功能、增强宿主网状内 皮细胞的防御功能。 1 1 1 乳酸菌在消化道的存活 乳酸菌能否定植并存活是其发挥有益作用的关键，这种定植存活过程取决于 乳酸菌两个方面的特性，即是否具有附着于肠道的黏附能力和抵御体内不良环境 的能力，并能以活性状态到达大肠m 。通常从自然界分离得到的乳酸菌，如嗜酸乳 酸菌、双歧杆菌等抵御胃肠道低p h 值和高胆汁酸盐( 人体消化道正常p h 值范围 为2 8 ，正常胆汁酸盐质量分数为o 3 o 5 ) 环境的能力很差，是影响该类群 塑蔓直壅些查兰堕圭兰竺堡壅 ! 细菌应用效果的主要障碍“1 。 从食物或环境进人口腔的细菌随唾液一起进入胃中，绝大多数细菌在胃中会 被胃酸杀死。在胃肠消化道众多防卫机制中，胃酸是防止食物来源的致病菌侵染 机体的一种主要的手段，胃酸对保持小肠上端细菌数量较少，也发挥了重要的作 用，因为只有少数最耐酸的细菌才能在通过胃部时存活下来。而小肠则是细菌数 量稀少的胃部与细菌数量庞杂的大肠部位的中间过渡地带，小肠近端的菌群数量 与胃中的相似，约为1 0 3 1 0 4 c f u ( c o l o n yf o r m i n gu n i t ) m l 。以好气性的革兰 氏阳性菌为主，大肠菌群和厌氧菌也经常会以较低的浓度出现。 在小肠中，肠道的蠕动及胆汁的抑制作用是防止细菌过度生长的主要原因。 在远端的回肠，革兰氏阴性菌与厌氧菌的数量开始超过好氧菌，前者包括各种 b a c t e r o i d e s ，尉“d o b a c t e r i u m ，“o s t r y 以h i l l 和f u s o b a c t e r i u m ，从回盲阀开始， 细菌的浓度急剧增加。在大肠内细菌的数量可达1 0 “l o “c f u m l 。在布满各种细 菌的大肠环境中，不同细菌彼此竞争，从而调节着大肠微生物的种类与数量。例 如，某些既能在好氧又能在厌氧条件下生长的细菌将大肠中的氧气清除后，可为 某些对氧极端敏感的厌氧菌创造生存条件。 1 1 2 乳酸菌对黏膜表面的黏附 为了发挥对健康的促进作用，益生性乳酸菌在胃肠消化道中必须保持一定的 数量，以防止其因为消化道的收缩而被快速排除。乳酸菌对黏膜表面的黏附能力 可为其提供竞争优势，这一点对于维持消化道菌群平衡非常重要。否则，这些细 菌在消化道的滞留时间将非常短。显然，对粘膜的黏附能力是细菌在消化道长期 定殖并存在的必要条件。 c l e m e n t s 等在研究一种乳杆菌产品的益生效果时，发现不同批次冷冻干燥的 乳酸菌产品之间的差异非常显著，而这一差异似乎与制各过程中，使产品中乳酸 菌的黏附能力发生改变有关。因此，作为膳食补充剂的乳酸菌菌株必须性能稳定； 而且在经过冻干处理后仍能保持良好的黏附能力“，。部分研究者则对碳水化合物在 乳酸菌黏附过程中的作用进行了研究，已证明乳杆菌的细胞壁组分参与了乳酸菌 对人尿道上皮细胞的黏附作用。此外，乳杆菌细胞壁的碳水化合物组分可参与细 菌对鸡嗦囊、猪小肠鳞状上皮细胞及鸡小肠上皮细胞的黏附作用。由于影响黏附 过程的黏附因子多种多样，乳酸菌对小肠的定殖是通过细胞表面的不同结构来完 成的。由于不同动物的小肠化学组成和可利用的营养物质不尽相同，因此，黏附 作用具有宿主特异性是意料之中的事情。e l i 等报道从冻干粉或不同乳制品中获得 的l a c t o b a c i l l u sr h a m n o s u sg g ( l g g ) 对c a o o 2 细胞株具有中等至强烈的结合能 力。该菌在液体培养基中连续传代3 5 年后，对c a c o 2 黏附作用才出现降低。 不过，l g g 从人胃肠消化道的经过，并不改变其对c a e o 2 的结合作用。实验己证 4 内蒙古传统乳制品中乳酸菌益生作用的研究 明，普通的酸奶菌种l b b u l g a r i c u s 以及6 a c i d o p h i l u s n c f d l 7 4 8 不具有对c a c o 2 的黏附性，而部分b i f i d o b a c t e r i u m 菌株则表现出对真核细胞中等强度的结合作用。 与非黏附菌株不同的是，l g g 在人肠道中表现出迅速繁殖和长久滞留等特点m 。 b e m e t 等报道，b i f i d o b a c t e r i u mb r i v e 4 b i n f a n t i s 和3 株新从人体分离的双歧杆菌 对c a c o - 2 细胞及体外培养的h t 2 9 一m t x 细胞具有高度的黏附作用，且这种黏附 作用不依赖于钙离子的存在。这些细菌能与完整c a e o 2 细胞表面的微毛尖端发生 结合作用。这种黏附作用是由一种特异性的蛋白样促进因子所介导的，后者存在 于细菌完整细胞的表面及双歧杆菌培养上清液中。他们还发现，l b a c i d o p g i l u s l a l 对c a c o 一2 细胞及体外培养的h t 2 9 m t x 细胞株有类似的黏附作用m 。g r e e n e 和k l a e n h a m m e r 等阐明了参与人源工6 a c i d o p h i l u sb g 2 f 0 4 和n c f m n 2 及 l b g a s s e r ia d h 对人c a c o - 2 小肠细胞黏附过程的黏附园子。对这3 株菌而言。黏 附作用具有浓度依赖性，在低p h 值黏附作用更强。在采用蛋白酶对细菌细胞处 理后，l b a c i d o p g i l u sb g 2 f 0 4 及n c f m n 2 的黏附作用降低，而l b g a s s e r ia d h 的黏附能力不受影响，甚至有所增加。在肋，a e i d o p g i l u s b g 2 f 0 4 及n c f m n 2 中 存在细胞表面蛋白这一猜想获得了证实，但该蛋白层并不参与黏附过程。采用过 氧化物将细菌表面的碳水化合物氧化后，可显著降低6 g a s s e r i a d h 的黏附作用， 而l b a c i d o p g i l u sb g 2 f 0 4 的黏附作用被中等程度地降低，而n c f m n 2 菌株则不 受影响。以上结果表明，在乳杆菌对人肠道细胞的黏附过程中，涉及细菌与真核 细胞表面碳水化合物与蛋白质因子不同的组合。曾认为在l b a c i d o p g i l u sb g 2 f 0 4 培养上清液中存在一种作为该菌黏附作用主要介质的神秘桥蛋白，这一猜想在此 实验中未获得证实。相反，培养上清液的p h 值却对该菌株对c a e o 2 的黏附作用 有显著的影响“1 。 1 1 2 1 影响乳酸菌定殖的因素 促生长因子。a s h o o r 和m o n t e 等利用等渗高效液相色谱的方法从母乳中分离 到两种b b i f i d f t m 的促生长因子m 。p e t s e h o w 和t a l b o r t 等研究了入乳、奶牛乳以及 人乳或奶牛乳中乳清及酪蛋白组分对5 株从人婴儿粪便中分离的双歧杆菌菌株的 促生长作用。当以相同蛋白质浓度为基础进行比较时，人乳对b b i f i d u ms e r o v a r p e n n s y l v a n i c u s 及b 1 0 n g u m 促生长作用大于奶牛乳，而对于b b i f i d u m 、b i n f a n t i s 和b b r e v e 而言，两者的促生长作用相似。将人乳或母乳进行巴氏消毒处理后，其 对b b i f i d u m s e r o v a r p e n n s y l v a n 耙u s 及b b i f i d u m 的促生长作用增强，而对b i n f a n t i s 的作用下降，对b b r e v e 和b 1 0 n g u m 的作用则不受影响。人乳乳清组分对四株双 歧杆菌的促生长作用略高于人乳酪蛋白组分。当以牛乳作为底物时，b b i f i d u m s p r o y o r 口g n n s y l v a n i c u s 、b b i f i d u m 、b i n f a n t i s 及b 1 0 n g u m 完全不生长。然面，奶 牛乳乳清组分对双歧杆菌的促生长作用类似于人乳乳清“1 。 内蒙古农业大学硕士学位论文 5 r o m o n d 等检测了无菌小鼠粪便中对b b i f i d u m 有促生长作用的因子。绝大多 数促生长因子集中于经过水溶液抽提、透析后的不可透析部分。电泳和凝胶过滤 试验结果表明，多种糖基化成分具有促双歧杆菌生长作用。丑b i f i d u m 在这种无 菌小鼠体内的定殖过程涉及对这些小肠中促生长因子的利用，直至其完全消失m ，。 多种过渡金属离子和二价阳离子对占b i f i d u ms e r o v a rp e n n s y l v a n i c u s 具有抑 制生长作用。当z n 2 + 、c u 2 + 、a u ”、p t 4 + 、l a 3 + 、m n 2 + 、n i 2 + 和c d 2 + 存在时，添加 f e ”可以完全或部分逆转这种生长抑制作用：此外，c a 2 + 几乎可以完全中和由z n 2 + 、 m n 2 + 引起的双歧杆菌生长抑制作用，或部分中和c d 2 + 引起的抑制作用。钙代谢拮 抗剂异搏定( 一种冠状动脉扩张药) 、钌红、2 氯代腺嘌呤、拉沙里菌素、c 2 + 载 体a - 2 3 1 8 7 ，以及钙调节蛋白抑制剂w 5 和w 7 可抑制双歧杆菌的生长，这种抑 制作用可以完全或部分被f e ”所中和，m g ”可以中和由拉沙里菌素、c a 2 + 载体 a 一2 2 1 8 7 和v e r a p a m i l 所引起的抑制作用；而c a 2 + 则仅对由c a 2 + 离子载体a 2 3 1 8 7 所引起的抑制作用有效。因此，c a 2 + 和m 9 2 + 离子流在调节双歧杆菌的生理学方面 有重要作用，而多种金属生长抑制剂则会干扰f e 3 + 的代谢。 益生素。益生素是一类不消化性的食物成分，能选择性地刺激大肠中一种或 几种有益于宿主健康的细菌的生长繁殖和或代谢活性，从而有利于宿主健康。摄 入益生菌可通过增加大肠菌群中特定细菌的数量，从而改变大肠微生态组成。益 生素通常是一些不消化性的寡聚糖，尤其是寡聚果糖。研究表明，益生素可以刺 激肠道内源性双歧杆菌的生长，通过短时间的摄食后，使双歧杆菌成为大肠中的 优势菌群。而且，这些益生素调节脂肪代谢很可能通过发酵过程。通过益生菌与 益生索的合理搭配，可以显著地改善人消化道的菌群平衡，从而促进人体健康， 其作用机理在于抑制有害细菌的生长( 或其代谢活力) ，或选择性地刺激有利于宿 主健康的细菌的生长。 1 1 3 乳酸菌对药物的敏感性 目前，微生态制齐j 用菌株对不同抗菌药物耐药性的问题已越来越引起关注。 而市场上用于微生态制剂的菌种( 包括乳酸菌) 基本上都是野生菌株，绝大多数没 有用分子生物学方法检查其是否有抗药性因子。这些菌株中抗药性基因如果是质 粒或转座子编码，那么随着生态制剂的使用，其耐药因子将有可能在菌群中相互 传递而发生扩散，抗生素对患病者将无效。贾士芳等指出，目前生产的活菌制剂 对耐药性因子未作检测，提醒人们谨防活菌制剂携带耐药性因子对经济、社会和 生态造成的潜在危害m ，。自1 9 2 9 年f l e m i n g 发现青霉素以来，已发现9 0 0 0 余种 抗生素。抗生素的应用，使大多数细菌性疾病得以控制，也正是由于长期大量使 用抗生素，而产生不少副作用。滥用抗生素引起微生物的耐药性是一个重要的问 题，耐药性的存在不仅影响抗生素效果，而且可能产生出一批新的对人类危害更 6 内蒙古传统乳制品中乳酸菌益生作用的研究 大的致病性微生物。由此可见，选用不带抗药因子，至少是所带抗药因子甚少的 有益菌株作为微生态制剂的生产用菌株，应作为一个重要指标c ，”。耐药性因子不 是每株菌都有，但是一旦含有，如果用药不当，在有抗生素的选择压力下，该菌 就会很快扩增、横向蔓延。耐药性因子有3 类：耐药性质粒、耐药性转座子和耐 药性插入系列。质粒是一种染色体外的遗传因子，大多数是环状d n a ，存在于细 胞质中，可独立复制。转座子和插入系列可存在于染色体上，也可存在于质粒上。 它们是一段可自由移动、自由跳跃、自由插入的d n a 序列，二者在功能上和结构 上有些不同，前者必须有后者，而后者则可单独存在。这3 种耐药因子大部分可 自动或借助其它因子由一个细菌传递到另一个细菌，确定耐药因子的工作费时、 费工、费资金，难度较大。 1 1 4 乳酸菌的抑菌作用 研究表明，益生菌对肠道及食物中的致病菌具有拮抗作用，它们能阻碍特定 的肠道致病菌的黏附、定居、繁殖作用和病原菌的致病途径。益生菌可通过以下 方式之一产生对肠道病原微生物的拮抗作用：通过产生挥发性短链脂肪酸( s c f a ) 如乙酸、乳酸、丙酸等降低肠腔p h 值；营养竞争，使致病菌缺乏生长所需的某种 营养：降低肠腔的氧化还原电位；在有氧环境下产生h 2 0 2 ：产生特殊的抗菌物质， 如细菌素等。 益生菌在代谢糖时，通过乳酸脱氢酶将糖代谢过程中产生的丙酮酸转化为乳 酸。乳酸的积累以及随之而来的肠道p h 值下降可对许多g + 及g 细菌产生广泛的 抑制作用。环境p h 值、解离常数( p k 值) 和其摩尔浓度是决定乳酸或乙酸在肠道 中抑菌作用的主要因素。其中乙酸的p k 值为7 6 ，乳酸的p k 值为3 8 6 ，因此如果 肠道d h 值为5 8 的话，则肠道中8 4 的乙酸和1 1 的乳酸以未解离形式存在。 这一点非常重要，因为未解离态有机酸是产生对潜在肠道致病菌和腐败菌拮抗作 用的主要成分。未解离脂肪酸，如乙酸和乳酸可以穿过细菌细胞膜，当遇到细胞 内较高的p h 环境时，将解离出h + ，从而干扰细菌的基本代谢过程，如底物转化 和氧化磷酸化过程。 m i d o l o 等( 1 9 9 5 ) 研究了p h 值和有机酸在体外对致病菌删f c d 6 口c 研p y l o r i 的 作用，他们研究了肋a c i d o p h i l u s , 二，肋c a s e i ，工6 b u l g a r i c u s ，p e d i o c o c c u s p e n t o s a c e u s 和b i d i d o b a c t e r i u mb i f i d u m 在体外培养条件下乳酸的产生情况和生长环境p h 值变 化，以及对h p y l o r i 的抑制作用。在体外，乳酸、乙酸和盐酸对h p y l o r i 的抑制 作用与酸的浓度呈现剂量效应，而乳酸的抑制作用最强，这种抑制作用是溶液p h 值和酸浓度的综合体现。在被测试的菌株中有6 株肋a c i d o p h i l u s 、一株 肋a c i d o p h i l u s ，可抑制h p y l o r i ，而l b b u l g a r i c u s 则无此作用，上述乳酸菌产生 的乳酸浓度从5 0 m m o l l 到1 5 6 m m o l l 不等“”。将大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 与干酪乳杆 内蒙古农业大学硕士学位论文 7 菌干酪亚种、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、乳酸乳球菌和瑞士乳杆菌同时接种在培 养基中大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 的活性不受影响；将0 1 5 7 ：h 7 接种到培养了2 4 h 的乳酸 菌培养液中，大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 活性显著下降。以乳酸调整的低p h 值对大肠杆 菌0 1 5 7 ：h 7 有一定的杀灭作用“。 在有氧存在的情况下，乳酸菌在黄素酶( 辅酶q ) 的作用下，通过电子转移可产 生h 2 0 2 ，当存在h 2 0 2 时，超氧化阴离子形成破坏性氢氧游离基( o h ) ，这一过程 可引起细胞膜上脂类的氧化，从而增加细胞膜的通透性，这类超氧游离基对细菌 的杀菌作用来自矛对细菌细胞壁的强氧化作用，及对核酸及细胞内蛋白质的破坏 作用。此外，h 2 0 2 还可与其它细胞内的组分形成其它的抑制性物质。n u n e zd e k a i r u z 等( 1 9 8 8 ) 报道乳酸菌对h 2 0 2 的产生依赖于脂肪酸的存在，当l a c t o b a c i l l u s l e i c h m a n i i 在添加癸酸的复杂培养基上生长时能在培养基中积累高浓度的h 2 0 2 。 其h 2 0 2 产生系统可被c 4 c 1 6 的饱和脂肪酸及油酸中的一种所特异性的诱导。在 无细胞的抽提物内，这种诱导作用与一种依赖于脂酰一c o a 的h 2 0 2 产生菌系统有 关，这种酶系统在原核微生物中还是第一次发现“。 细菌素是由某些细菌产生的一类抑菌物质，但又不同于抗生素，其作用有一 定特异性。它们是一种庞大的不均一物质，但其化学本质都是蛋白质或蛋白与糖 和脂的复合物，它们的分子量、生化性质、抑菌谱、作用机制及遗传特性都各不 相同。随着研究的深入，发现许多细菌素不仅作用于同源的细菌，有的细菌素作 用范围很广，以往的细菌素定义已远远不够，因此k o n i s l y t ( 1 9 8 2 ) 提出了新的细菌 素定义：细菌素是由某些细菌通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌生物活性 的蛋白质，抑菌范围不仅仅局限于同源的细菌，其产生菌对其细菌素有自身免疫 性n ”。 k l a e n h a m m e r ( 1 9 9 3 ) 将细菌素分成4 大类。i 类是羊毛硫细菌素，含有一些特 殊的氨基酸( 羊毛硫氨基酸与其衍生物) ，实际应用较多的乳球菌所产生的细菌素、 包括n i s i n 在内都属于i 类细菌素；其它的类群是热稳定性肽类细菌素( 类) 、热 不稳定性蛋白类细菌素( i 类) 和由蛋自质与其它化学基团( 脂或糖) 组成的复合型 细菌素( 类) 。n i s i n 是迄今为止这些细菌素中唯一被用于食品防腐保鲜的品种， 作为一种安全无毒的生物防腐剂，目前被美国、欧盟在内的5 0 多个国家用于食品 保鲜剂。h o o v e rd g ( 1 9 9 3 ) 报道。乳杆菌所产生的细菌素其抑菌范围较窄，一般只对 亲缘关系较近的其它乳杆菌有抑制作用，与其它乳酸菌的细菌素不同，乳杆菌细 菌素的产生一般与质粒无关n ”。 1 1 5 益生性乳酸菌的生理功能 在人体消化道中定殖着种类繁多的微生物，其中一部分对人体健康有益，部 分则有害。t i s s i e r ( 1 9 0 5 ) 从母乳喂养的婴儿消化道中分离到这样一种有益细菌， 8 内蒙古传统乳制品中乳酸菌益生作用的研究 并将其命名为b a c i l l u sb i f d u s 。将双歧杆菌用作益生菌就起源于该发现，目前 作为益生菌常用的双歧杆菌有丑a d o l o s c e n t i s 、丑b i f l d u m 、且l o n g u m 、 届i n f a n t i s 、丑l a c t i s ( 显a n i m a l i s ) 和置t h e r m o p h y l u m , 其中后两种双歧杆菌 来源于人体以外的生境。将链球菌以酸奶的形式用作益生菌始于f u l l e r ( 1 9 9 3 ) ， 作为酸奶发酵剂菌种之一的t h e r m o p m l u s 也是常用的益生性乳酸菌之一。 具有益生作用的乳酸菌通常都是肠道细菌，它们被认为具有改善人体胃肠消 表1益生性乳酸菌所产生的健康促进作用厦可能的作用机理 益生菌的功能提出的作用机理 减缓乳糖不耐症 对肠道菌群的调节作用 预防肠道感染 增强免疫功能 减少炎症或过敏反应 抗大肠癌作用 、改变血脂浓度。减少心 脏病发病风险 抗血腊作用 预防和治疗泌尿生殖道 感染 调节消化道的蠕动性 通过细菌性8 一半乳糖苷酶分解乳糖 乳杆菌能抑制小肠菌群过度生长；降低或抑制其有毒代谢产物 的产生；抗菌作用 对抗体表达的增强辅助作用；能刺激系统性或分泌性免疫反 应；竞争性排除；改变肠道环境，使其不利于致病菌的生存和 治病力的产生：改变黏膜表面细菌素的结合位点，减少毒素的 结合；改变消化道菌群的组成；黏附到肠道黏膜表面，阻止病 原菌的黏附：与致病菌竞争营养物质 增强机体对感染的非特异性抵抗力；提高自血细胞的吞噬话 性；在受到减毒的s a l m o n e l l at y p h i m u r i u m 致敏时，增加血清 i g a 的表达；促进网状内皮组织淋巴细胞增值；在抗原特异性 免疫反应中发挥免疫佐剂作用；调节t h l t h 2 平衡，诱导细胞 因子的台成 使免疫系统回复到静息状态；调节细胞因子的合成：阻止抗原 在血液中转位( 或转移) ： 与突变剂结合：顿化致癌物；改变大肠菌群的活性： 免疫反应；影响次级胆盐的活性： 同化胆匾醇：改变肠道菌群胆盐水解酶活力；抗氧化作用 通过肽酶的作用，分解乳蛋白产生具有抗高血压作用的小肽 ( 例如i p p 、v p p 。均为血管紧张素转化酶抑制剂) ：细胞壁成 分对血管紧张索转化酶有抑制作用； 黏附到尿道和阴道上皮细胞表面；竞争性排除；产生抑菌物质 ( 如h 。0 2 、生物表面活性荆) ；竞争性排除：产生乳酸： 短链脂肪酸刺激肠道收缩 内蒙古农业大学硕士学位论文 9 化道微生态环境的功能。益生作用的范围可以分为营养、生理作用和抗菌作用等 三个方面。在这些方面研究及观察到的作用直接导致了各种含有乳酸菌的食品及 饲料在人和动物中的应用，乳酸菌还具有潜在免疫辅助作用，口服乳酸菌可以激 发黏膜和系统性免疫反应。益生性乳酸菌在营养及治疗方面的作用见表l 。 近一个世纪以来，乳酸菌的保健作用得到了广泛而深入的研究。现已确认能 在人体肠道内定殖并存活的乳酸菌，其生理功能与人的营养状态、细胞感染、药 物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤反应、衰老过程和应激反应等息息相关，是 人和动物肠道内必不可少的正常菌群。 1 i 5 1 乳酸菌的免疫增强作用 机体的免疫系统由多种器官和不同类型的细胞组成，这些细胞在受到抗原的 刺激后，被激括的免疫细胞会产生一系列细胞性免疫反应和由抗体所介导的体液 免疫反应，细胞性免疫反应可被黏附性分子所增强，被激活的淋巴细胞会释放多 种细胞因子，这种复杂的细胞免疫反应诱导了系统免疫反应。如果抗原是通过口 腔途径进入体内，那么机体还会产生由分泌型i g a ( s l g a ) 所介导的分泌型免疫反 应。t 细胞和b 细胞数量的多少、细胞因子的分泌量、抗体浓度以及免疫细胞功 能的变化( 例如吞噬功能) 是用来估评机体免疫状态常用的指标，益生菌，尤其是益 生性乳杆菌和双歧杆菌对系统免疫反应以及分泌型免疫反应的作用最近几年受到 广泛的研究，其对机体的免疫调节作用包括：防止肠道感染，作为口服免疫佐剂， 表2 益生性乳酸菌对机体的免疫调节作用 功能 乳酸菌 由多型核自细胞和单核细胞诱导的粒细胞肿 诱导腹腔渗出物的自然杀伤细胞活性 增强体液免疫中抗体的表达 激活t 细胞，诱导细胞毒t 细胞的产生 增强单核细胞的吞噬括性 提高网状内皮系统的吞噬功能 体液免疫延迟型超敏反应 增强小鼠对y 一干扰素的表达 有效的口服免疫佐剂 l b p l a n t a r u m 、l b b r e u i s l b p a n t a r u m l b c a s e i l b c a s e il c 9 0 1 8 l b c a s e 、l b p l a n t a u m l b a c i d o p h i l u s ，st h e r m o p h i u s l b c a s e i 、l b a c i d o p h i u s s t h e r m o p h i u s l b c a s e l c 9 0 1 8 、l b b u g a f i c u s 置t h e z 口o p h i u s 、l b a c i d o p h i u s l b c a s e 、l b b u g a h c u s l b p a n t a v m 、l b f e r m e n t u m 1 0 内蒙古传统乳制品中乳酸菌益生作用的研究 在营养不良人群中作为免疫激活剂以及预防由化学物质引起的肿瘤等，部分乳酸 菌对宿主免疫系统