（生物化学与分子生物学专业论文）几丁质酶毕赤表达系统的构建及其果蔬采后抑菌机理研究.pdf

广 。 t - 、 一一 v 4 l l l l l 洲1 1 l l l y 17 9 8 2 15 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，同意如下 各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学 位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存 论文；学校有权提供目录检索以及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务： 学校有权按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在 不以赢利为目的的前提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术 活动。 学位论文作者签名：阊鳓 u 枷增年s 月碣同 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在r 年解密后适用 本授权书。 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 内部5 年( 最长5 年，可少于5 年) 秘密1 0 年( 最长1 0 年，可少于1 0 年) 机密2 0 年( 最长2 0 年，可少于2 0 年) 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 闰澎智 砂。8 c 7 孑 摘要 摘要 果蔬采后病害导致的巨大损耗已成为全球性问题，其中微生物侵染是造成腐 烂的主要原因，由此造成的损失非常巨大。目前控制采后病害的主要手段是使用 化学杀菌剂，但其在果蔬中的残留毒性对人类健康有潜在危险，越来越受到全社 会关注。此外，杀菌剂长期在某一地区使用会导致抗药菌株的产生，从而降低防 治效果。因此，迫切需求寻找一些新的、无毒高效的防腐技术，以逐步取代化学 杀菌剂在采后果蔬上的使用。 基因工程技术的迅速发展为解决上述问题提供了一条新途径，通过基因工程 技术可改造原有基因，使之具有新的抗性，如利用构建工程菌，培育抗病品种。 然而，此过程耗时且成本高，同时又很难对新变异真菌产生完全的抗性。目前， 虽然有些生物具有良好控制活性的抗性基因已经被证明，但由于各种原因，包含 抗性基因的商业产品尚很少见。植物几丁质酶能将真菌细胞壁的主要成分几丁质 降解为几丁质单糖，破坏其细胞壁的骨架，可以使大多数病害真菌丧失侵染能力 和致病能力，所以在植物抗病性方面具有重要作用。几丁质酶的抗病性活性已在 水稻、油菜、烟草等多种作物中得到证实，但在果蔬采后贮藏保鲜领域内的研究 尚未见报道。本课题利用d n a 重组技术将几丁质酶基因整合到毕赤酵母菌基因组 中，筛选高表达的基因工程菌株，分离纯化出几丁质酶，针对果蔬贮藏中常见的 灰霉、根霉和链格孢等病原真菌，研究其作用效果及其体外作用机理，以寻求生 物制剂用于果蔬保鲜的新途径。 本研究将来源于水稻的几丁质酶基因片段成功地导入毕赤酵母工程菌株 g s l l 5 中，构建了多种g s l l 5 p p i c 9 - c h i 和g s l l 5 p p i c 9 k c h i 转化的工程菌，并 从多个工程菌株中筛选得到了一株几丁质酶表达量和酶活较高的工程菌株 ( n b 0 1 ) 。用该菌株摇瓶条件下培养，证明其诱导产酶的最佳条件为p h 6 0 ，甲醇 浓度1 ，温度3 0 ，硫酸铵浓度为0 5 ，油酸浓度为o 0 5 ，诱导时间1 0 8 h 。 在该条件下，平均蛋白表达量达1 7 1 9 9m g l ，几丁质酶酶活为4 9 5 8u m l 。 发酵罐高密度发酵结果表明，外源蛋白几丁质酶的表达量达到1 5 4 4m g l ，是 摇瓶诱导表达量的8 9 8 倍，几丁质酶酶活达2 3 0u m l ，是摇瓶诱导酶活的4 6 4 倍。高效表达几丁质酶重组毕赤酵母( n b 0 1 ) 的构建成功，为后续几丁质酶的性质、 抑菌效果及抑菌机理的研究奠定了基础。 利用中空纤维超滤膜对发酵液进行浓缩、提纯，再经过s e p h a d e xg - 1 0 0 柱层 酶活性的增加，而且诱导果皮中酚类物质含量的增加，在不同程度上延缓葡萄、 枇杷采后的发病时间，降低发病率和病斑直径。在贮藏初期，重组几丁质酶能够 有效地控制发病率和病斑直径。但随着时间的延长，这种抑制作用逐渐降低。表 明几丁质酶只能在一定时期内抑制果实组织中狄霉菌孢子的萌发和新生菌丝的生 长，但不能杀死孢子及降解已经萌发的菌丝。可能是与几丁质酶的活性保存时间 及果实组织内的反应环境有关，其详细机制还有待于今后进一步研究。 本研究为重组几丁质酶生物制剂的研发提供了实验依据和理论支持，并为果 实生物防治及重组几丁质酶复合保鲜剂在果蔬生物保鲜上的规模化应用奠定了基 础。 关键词：真菌病害，几丁质酶，毕赤酵母，抑菌，机理，果实，生物防治 i i a b s t r a c t a b s t r a c t f r u i ta n dv e g e t a b l ec r o p ss u f f e rf r o mav a s ta r r a yo ff u n g a ld i s e a s e sw h i c hc a u s e s e v e r ey i e l dl o s s e sa l lo v e rt h ew o r l d a p p l y i n gc h e m i c a lf u n g i c i d et os o m ef r u i t sa n d v e g e t a b l e sd u r i n gs t o r a g ec a nr e d u c et h es p o i l a g ea n de x t e n dt h es t o r a g ep e r i o d h o w e v e r ，c o m m e r c i a lf u n g i c i d e sc r e a t eh e a l t ha n de n v i r o n m e n t a lp r o b l e m sb e c a u s eo f c h e m i c a lr e s i d u e s ，a sw e l l 弱t h ei n c r e a s i n gr e s i s t a n c eo f m a n yf u n g it of u n g i c i d e s a l l o ft h e s eh a v es t i m u l a t e dr e s e a r c h e r st of i n da l t e r n a t i v e sf o rt h es y n t h e t i cf u n g i c i d e st o c o n t r o lp o s t h a r v e s td i s e a s e so ff r u i t sa n dv e g e t a b l e s t h eg e n e t i ca p p r o a c ho f b r e e d i n gt op r o d u c ec r o p sw h i d la r er e s i s t a n tt of u n g a l d i s e a s e sh a sb e e np r o v e ns u c c e s s f u l ；h o w e v e r , t h i st i m e - c o n s u m i n gp r o c e s si se x p e n s i v e , a n dm a k e si tt ob ed i f f i c u l tt or e a c ta d e q u a t e l yt ot h eo fn e wv i r u l e n tf u n g a lr a c e s n e w l yd e v e l o p e dt e c h n o l o g yf o rt h ei d e n t i f i c a t i o n ，i s o l a t i o na n dt r a n s f e ro fs p e c i f i c g e n e s ，c u r r e n t l yi nu s ef o rp l a n tb r e e d i n g ，h a se n a b l e dt h ei n s e r t i o no fr e s i s t a n tt r a i t s w i t h o u t i n t e r f e r i n gt ot h ei n t r i n s i cp r o p e r t i e so ft h eh o s tp l a n t p l a n tc h i t i n a s e sa r e p a t h o g e n e s i s - r e l a t e dp r o t e i n s ，w h i c ha r eb e l i e v e dt ob ea l la t t r a c t i v et a r g e tp r o t e i nf o r b e i n gu s e da sa n t i f u n g a lp r e v e n t i o nt r e a t m e n t s g r e a te f f o r t sh a v eb e e nm a d et oe x p l o i t t h e s ea n t i f u n g a lp r o t e i n st od e v e l o pd i s e a s er e s i s t a n tt r a n s g e n i cc r o pp l a n t s h o w e v e r , o n l yv e r yf e wc o m m e r c i a lp r o d u c t sh a v e b e e nd e v e l o p e ds u c c e s s f u l l y s o ，i nt h i s 咖d y w et r yt os t u d yt h er i c ec h i t i n a s ef r o mad i f f e r e n tv i e w w eu s e dp i c h i ap a s t o r i ss t r a i n g si15t oh i g h - l e v e le x p r e s sr i c ec h i t i n a s e i t si n h i b i t o r ya c t i v i t ya n dm e c h a n i s mo f b e i n gr e s i s t a n tt os o m ep a t h o g e n sw a ss t u d i e d ，s u c h 鹤b o t r y t i sc i n e m a ，r h i z o c t o n i a s o l a n i ，a l t e r n a r i aa l t e r n a t e t h ef i n a lg o a lo f t h i ss t u d yi st of i n dan o v e lw a yt oc o n t r o l p o s t h a r v e s tr o t sw i t h o u tt h eu s eo fc h e m i c a lf u n g i c i d e s a f t e rw eg o tt h ee n g i n e e r i n gp t c h i ap a s t o r i ss t r a i n ( n b o1 ) 。w h i c hc a nh i g h - l e v e l e x p r e s sr i c e c h i t i n a s e t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o no ft h er e c o m b i n a t a n ts t r a i nt o p r o d u c ec h i t i n a s ef r o mp i c h i ap a s t o r i sw a ss t u d i e di nt h i ss t u d y t h ei n f l u e n c e so f i n d u c i n gt i m e ，p h ，m e t h a n o lc o n c e n t r a t i o n ，o l e i ca c i do nt h ee x p r e s s i o no fc h i t i n a s e w e r ei n v e s t i g a t e di nt h es h a k i n gf l a s k i tw a sd i s c o v e r e dt h a tt h eh i 曲e s tp r o d u c t i v i t yo f c h i t i n a s ew a so b t a i n e dw h e ni tw a si n d u c e df o r10 8h t h ee x p r e s s i o no fc h i t i n a s ew a s a b s t r a c t - 一_ 一 r e p r e s s e dw h e np hw a sl o w e rt h a n5 5 ，a n dt h eo p t i m u np h v a l u ew a sp h5 5 6 0 t h e o p t i m u mc o n c e n t r a t i o no f m e t h a n o lw a s1 t h ep r o t e i ne x p r e s s i o nc a nb ei m p r o v e d g r e a t l vw h e na d d e d0 0 5 o fo l e i ca c i d t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r ef o u n da n dt h e b e s te x l 0 i r e s s i o nl e v e lr e a c h e d171 9 9 3 m g lo fp r o t e i np r o d u c t i o na n d 4 9 5 7 6 u m lo f c h i t i n a s ea c t i v i t yu n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s t h ec h i t i n a s ee x p r e s s i o nc o n d i t i o n so fe n g i n e e r i n gs t r a i nn b 0 1i na7lf e r m e n t o r w e r ea l s oi n v e s t i g a t e d t h em a x i m u mc h i t i n a s ea c t i v i t yc o u l dr e a c h4 8 0 7 9 5u r n la t 8 4hb ye n h a n c i n ga e r a t i o na n dc h a n g i n gt h ea g i t a t i o n r a t ef o rt h em a i n t a i n i n g d i s s o l u t i o no x y g e n ( d o ) l e v e lh i g h e rt h a n3 0 t h ep u r i f i c a t i o n o fr e c o m b i n a n t c h i t i n a s ew 嬲c o n d u c t e dw i t hh o l l o wf i b e ru fm e m b r a n ea n ds e p h a d e xg 一10 0 ，t h e s d s p a g ea n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h e r ew a sas i n g l eb a n dw i t ht h er i g h tm o l e c u l a r w e i g h tc o r r e s p o n d i n gt ot h ec h i t i n a s eo nt h eg e l p u r i f i c a t i o nm u l t i p l eo f c h i t i n a s ew a s 7 9 9 61 f u r t h e r m o r e ，t h er e c o m b i n a n te n z y m ew a s s t a b l ea t6 0 ca n dp h2 - 6 a l s o ，i t w a sr a t h e rm o r es t a b l ew h e ns t o r e da t4 cf o ral o n gt i m e t od e t e r m i n ew h yc h i t i n a s eh a sd i f f e r e n ta n t i f u n g a la c t i v i t yo nd i f f e r e n tp a t h o g e n i c f u n g i i nv i t r o ，w ep u r i f i e dr e c o m b i n a n tr i c e c h i t i n a s ef r o mp i c h i ap a s t o r i sa n d i n v e s t i g a t e di t sa n t i f u n g a la c t i v i t ya g a i n s tf o u rf u n g i 一- r h i z o p u ss t o l o n i f e r ( e h r e n b - e t f r ) v u i l l ，b o t r y t i ss q u a m o s aw a l k e r , p y t h i u ma p h a n i d e r m a t u m ( e d s ) f i t z p ，a n d a s p e r g i l l u sn i g e rv a nt i e g h s c a n n i n g e l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m )a n df o u r i e r t r a n s f o r mi n f r a r e ds p e c t r o s c o p y ( f t i r ) w e r eu s e dt oa n a l y z et h es l y f a c em i e r o s t r u c t u r e a n dp r o p o r t i o no fc h i t i n i nt h ec e l lw a l lo ft h ef o u rf u n g i ，r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t s s h o w c dt h a tt h ec h i t i n a s ee x h i b i t e dd i f f e r e n ta n t i f u n g a la c t i v i t i e sa g a i n s tt h ef o u rf u n # ， w h i c hw a sd i r e c t l yc o r r e l a t e dt ot h es u r f a c em i c r o s t r u c t u r ea n dt h ep r o p o r t i o no f c h i t i n i nn l e 觚g a lc e l lw a l l i tw i l lh e l pu n d e r s t a n d i n gt h ea n t i f u n g a lm e c h a n i s mo f t h e r e c o m b i n a n tc h i t i n a s ea n df u r t h e rd e t e r m i n i n gi t sa p p l i c a t i o ns c o p eo nc r o pp r o t e c t i o n a n dp o s t h a r v e s ts t o r a g eo ff r u i t sa n dv e g e t a b l e s m e a n w h i l e ，t h er e c o m b i n a n tc h i t i n a s ew a su t i l i z e dt ow o u n dg r a p ea n dl o q u a tt o i n v e s t i g a t ew h e t h e rt h i sc h i t i n a s ec a nb eu s e dc o n t r o lp o s t h a r v e s tr o t t h ep u r i f i e d c l l i t i n a s ew a si n o c u l a t e dt ot h ew o u n do fg r a p ea n dl o q u a tw h i c hh a da l r e a d yb e e n i n o c u l a t e dw i t hb d t r y t i sc i n e m at oi n v e s t i g a t et h em e c h a n i s mo f r e s i s t a n c eo fc h i t i n a s et o f u n g i t h er e s u l t si n d i c a t et h a tc h i t i n a s ec a ni n d u c et h er e s i s t a n c eo fg r a p et ob o t r y t i s i v c i n e m a ，i n d u c et h ei n c r e a s eo fp o d ，p p 0a n dp a l ，a n di n d u c et h ei n c r e a s eo fp h e n o l s i nt h ep e r i c a r p ，d e l a yt h ep e r i o db e f o r es t a r to fr o ti ng r a p ea n dl o q u a t ，a n di n h i b i tt h e i n c i d e n c er a t ea n dd i a m e t e ro fd i s e a s es p o t a tt h eb e g i n n i n gc h i t i n a s ec a ne f f e c t i v e l y i n h i b i tt h ei n c i d e n c er a t ea n dd i a m e t e ro fd i s e a s es p o t ，b u tt h i sf u n c t i o ni sl o w e ra n d l o w e rm o n gw i t ht h et r e a t m e n tt i m e t h e s er e s u l t sd e m o n s t r a t et h a tc h i t i n a s ec a l lo n l y i n h i b i t ，n o te l i m i n a t et h eg r a ym o l d t h i sm a yb ed u et ot h el o s so fc h i t i n a s ea c t i v i t ya l o n gw i t h e l o n g a t i o no ft h es t o r a g ed a y s m a y b et h i si sr e l a t e dt ot h ec h a n g ei nt h ef r u i t so fg r a p ea n dl o q u a t i nc o n c l u s i o n ，t h i ss t u d yp r o v i d eg o o dt h e o r e t i c a la n de x p e r i m e n t a ls u p p o r t sf o r a p p l i c a t i o no fc h i t i n a s eo nb i o l o g i c a lc o n t r o li nf r u i t sa n dp r o d u c en e wp r e s e r v a t i v e w i t hc h i t i n a s ei nl a r g es c a l e ，w h i c hc a nb eu t i l i z e di np o s t h a r v e s tp r o t e c t i o n k e yw o r d s ：f u n g a ld i s e a s e , c h i t i n a s e ，p i c h i ap a s t o r i s , r e s i s t a n c e , m e c h a n i s m ，f r u i t , b i o l o g i c a lc o n t r o l ，g r a p e ，l o q u a t v 摘 a b s 符号说明x i v 第一章引言1 第一节目的和意义1 第二节几丁质酶的研究进展2 1 2 1 几丁质酶的定义3 1 2 2 几丁质酶的分类3 1 2 2 1 微生物几丁质酶5 1 2 2 2 植物儿丁质酶6 1 2 2 3 昆虫几丁质酶6 第三节植物几丁质酶7 1 3 1 植物儿丁质酶的结构特点7 1 3 2 植物几丁质酶的分子生物学特点。9 1 3 3 植物儿丁质酶的功能1 0 1 3 3 1 抗真菌作用ll 1 3 3 2 抗细菌作用l l 1 3 3 3 参与植物的发育调控l l 1 3 3 4 抗虫作用1 l 1 3 4 植物几丁质酶的抗菌作用l l 1 3 4 1 植物几丁质酶的可诱导性1l 1 3 4 2 植物几丁质酶的抗病作用1 3 1 3 4 3 植物儿丁质酶的防卫反应1 4 1 3 4 3 儿丁质酶在体外的抑菌作用1 5 1 3 5 几丁质酶作用的机理研究进展1 7 第四节巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展1 7 1 4 1 巴斯德毕赤酵母的甲醇代谢特性1 8 v l 目录 1 4 2 巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的一般步骤 9 2 1 9 1 4 3 外源基因导入巴斯德毕赤酵母的方法及其比较1 9 1 4 4 外源蛋白的糖基化2 0 1 4 5 影响巴斯德毕赤酵母外源蛋白表达的内在因素2 l 1 4 5 1 启动子的选择2 l 1 4 5 2 蛋白酶的影响2 l 1 4 5 3 外源基因的特性2 2 1 4 5 4 基因剂量2 2 1 4 5 5 信号肽的影响2 3 1 4 5 6 甲醇利用表型的影响2 3 1 4 6 影响外源蛋白表达的培养条件2 3 1 4 6 1p h 值的影响2 3 1 4 6 2 温度的影响2 4 1 4 6 3 碳源的影响2 4 1 4 6 4 氮源的影响2 5 1 4 6 5 微量元素的影响2 5 1 4 6 6 溶氧的影响2 5 1 4 6 7 缓解外源蛋白对巴斯德毕赤酵母的毒害作用2 6 1 4 7 巴斯德毕赤酵母的发酵罐培养策略2 7 1 4 7 1 诱导阶段的混合补料2 7 1 4 7 2 发酵过程中甲醇的监测控制2 7 1 4 8 巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白展望2 8 第二章基因克隆及毕赤酵母表达载体构建2 9 第一节试验材料和方法2 9 2 1 1 实验材料一2 9 2 1 i 1 菌株。2 9 2 1 1 2 质粒2 9 2 1 1 3 试剂2 9 2 1 1 4 大肠杆菌培养基及缓冲液2 9 2 1 3 试验方法2 9 2 1 3 1 质粒提取2 9 v i i 目录 2 1 3 2e c o l i 感受态细胞制备及重组质粒转化3 0 2 1 3 3p c r 扩增目的基因3 l 2 1 3 4p c r 产物的t - a 克隆3 2 2 1 3 5 表达载体p p i c 9 - c h i 的构建及鉴定3 3 2 1 3 6 表达载体p p i c 9 k - c h i 的构建及鉴定3 3 2 1 3 7d n a 片段同收方法( 试剂盒同收) 。3 4 2 1 3 8 毕赤酵母菌株的分离纯化3 4 2 1 3 9毕赤酵母电转化感受态细胞的制备3 5 2 1 3 1 0 毕赤酵母的电转化3 5 2 1 3 ii 酵母感受态细胞制备及质粒转化( 醋酸锂转化法) 3 5 2 1 3 1 2 毕赤酵母基因组提取方法3 6 2 1 3 1 3 毕赤酵母基因组d n a 的p c r 3 7 2 1 3 1 4 菌落p c r 鉴定重组子的方法3 7 2 1 3 1 5g 4 1 8 平板筛选多拷贝重组子3 8 2 1 3 1 6s o u t h e r nd o tb l o t ti n g 3 8 2 1 3 1 7 总蛋白测定：b r a d f o r d 法 1 3 7 。4 0 2 1 3 1 8 几丁质酶酶活力测定 1 3 8 j 4 1 第二节工程菌的构建和鉴定4 2 2 2 1 质粒p b s k s - g il ( r ) 的酶切鉴定4 2 2 2 2 克隆载体p m d l 8 - c h i 的构建4 4 2 2 3 表达载体p p i c 9 - c h i 的构建4 6 2 2 4 表达载体p p i c 9 k - c h i 的构建4 7 2 2 5 毕赤酵母工程i 封株g s i1 5 p p i c 9 - c h i 的构建与鉴定4 8 2 2 6 毕赤酵母工程菌株g s i l 5 p p i c 9 k - c h i 的构建与鉴定4 9 2 2 7s o u t h e r nd o tb l o t ti n g 5 0 2 2 8 转化菌株的筛选。5 l 2 2 8 i 表达产物的电泳检测5l 2 2 8 2 不同转化菌株蛋白表达量的比较5 1 2 2 8 3 不同转化菌株表达的酶活检测5 2 2 2 9 小结5 3 第三节讨论5 3 v i i i 目录 第三章几丁质酶在毕赤酵母中的诱导表达、检测5 5 第一节几丁质酶在摇瓶中的诱导条件研究5 5 3 1 1 实验材料5 5 3 1 1 1 菌株。5 5 3 1 1 2 培养基及试剂5 5 3 1 2 试验方法5 7 3 1 2 1 诱导表达5 7 3 1 2 2 凝胶的制备5 7 3 1 2 3s d s p a g e 电泳5 8 3 1 2 4b r a d f o r d 法测定发酵上清中的蛋白浓度5 8 3 1 2 。5 不同因素对几- j 质酶表达量及酶活的影响5 8 3 1 3 结果与分析6 0 3 1 3 1 不同p h 对表达外源蚩白的影响6 0 3 1 3 2 温度对外源蛋白表达的影响6 l 3 1 3 3 诱导阶段甲醇浓度的影响6 2 3 1 。3 4 甲醇补料间隔时间的影响6 3 3 1 3 5 甲醇诱导时间的影响6 3 3 1 3 6 油酸对外源蛋白表达的影响6 4 3 1 3 7 ( n h ，) ：s o 浓度的影响6 5 第二节p p a s t o r i s 发酵罐培养的研究6 8 3 2 1 实验材料6 8 3 2 2 设备6 8 3 2 3 试验方法6 8 3 2 3 1 上罐前的准备6 8 3 2 3 2 毕赤酵母发酵罐表达) l - i 质酶的条件优化6 9 3 2 3 3 甲醇浓度测定