（法医学专业论文）mtdna+snps复合检测体系建立及法医学应用研究.pdf

j i l 丫l l l l 9 1 l f l 7 f f l l 6 i i i f 9 98 l t l l l 3 f t t l i l 2 l l g u l 硕士学位论文 m t d n a s n p s 复合检测体系建立 及法医学应用研究 硕士研究生：何琼 导师：王慧君教授 刘超主任法医师 摘要 生物性检材易受外来环境等因素干扰，一直是困扰法医生物痕迹学专家们 的难点问题，如腐败组织、陈旧骨骼等，因检材的降解，使d n a 序列的完整性 受到破坏，影响鉴定结论的得出。目前国内外法医学实验室应用最为广泛的s t r 检测系统，通常适用于常规检材，但对微量d n a 检材、降解检材、无核检材等 则常常因等位基因丢失、非特异性扩增、或扩增不出检测片段，导致检测失败， 至今法医生物痕迹学( 法医物证) 领域尚未完全解决这一难题。 人类线粒体d n a ( m i t o c h o n d r i a ld n a ，m t d n a ) 是位于细胞核以外的唯一 基因组d n a ，主要遵循母系遗传，母亲和子女、兄弟姐妹之间的m t d n a 在理 论上是一致的，个体唯一的m t d n a 不存在。m t d n a 是由一万六千多个碱基对 组成的环状闭合共价双链分子，外有被膜包围，这样的特性使其在外界环境中 不易受到核酸外切酶的影响。每个细胞核d n a 只有两个拷贝，而每个细胞的 m t d n a 有成千上万个拷贝，突变率是核d n a 的5 - - - - 1 0 倍，但在外界环境中更 易保存下来，扩增时拷贝数更高，对于考古、大型灾难调查、亲缘关系认定、 核d n a 分型失败的法医学检材等，m t d n a 遗传标记具有良好的应用前景。 单核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ，s n p s ) 是由基因组水平 上的单个核苷酸变异所引起的d n a 序列多态性，其中最少的一种在群体中的频 率不少于1 ，具有在基因组分布广泛、遗传稳定、分析易于自动化等特点。它 包括了人类基因组已知多态性的8 0 ，是最常见的遗传变异类型。从生物遗传 中文摘要 和变异的本质分析，s n p s 将是一种最能反映群体遗传结构和个体间遗传差异的 标记系统。由于具有分析片段更小( 4 5 1 5 0 b p ) 、遗传稳定，以及可实现高通量、 自动化检测等特点，s n p s 已经成为法医学解决高度腐败检材d n a 分型以及其 他领域的研究的热点。在法医学应用s n p s 的主要目的是进行大量s n p s 位点的 同步检测，累计多个s n p s 位点的分型结果，认定同一性或亲权关系，从而在个 体识别和亲权鉴定中发挥作用。 由于m t d n a 具有突变率高、母系遗传、几乎不发生重组、进化速度快等特 性，很多研究主要是集中在m t d n a 疾病、表观遗传学等方面。目前国内外对线 粒体s n p s 这一热点领域已经有了很多研究，但大多数针对人类进化、基因突变 和表达、药物代谢动力学、表观遗传学、肿瘤学和其他疾病如p a r k i n s o n sd i s e a s e 、 a l z h e i m e r sd i s e a s e 、肥胖、糖尿病等方面进行研究，进行高通量的研究比较少。 虽然也有在法医学应用方面的研究，但还没有针对中国人群已经建立的复合高 效检测遗传标记体系的研究。本课题利用复合p c r 扩增、荧光标记单碱基延伸 ( s b e ) 技术和毛细电泳检测相结合的方法，建立一个多位点的m t d n as n p s 复 合检测体系，实现对多个m t d n as n p s 位点同步快速扩增，建立的体系特异性 好、灵敏度高、操作简单、准确性高，为微量、降解检材和无核检材的高通量 分型提供了新的技术手段和方法，并通过广东地区人群的群体遗传学调查，探 讨其在法医学案件中的应用价值。 根据n c b i 的d b s n p s 数据库( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v s i t e s d b s n p ) 、核 酸数据库查找到r c r s ( 修正剑桥参考序列，r e v i s e dc a m b r i d g er e f e r e n c e s e q u e n c e ) ，从m i t o m a p 数据库( ah u m a nm i t o c h o n d f i mg e n o m ed a t a b a s e ) 、m t d b 数据库( h u m a nm i t o c h o n d r i a lg e n o m ed a t a b a s e ) 报道在亚洲人群中多态性较好、 侧翼序列稳定的m t d n as n p s 位点和部分从未用于亚洲人群检测位点，其选择 目的在于研究在中国人群是否存在多态性，其选择的位点包括8 3 9 2 、5 1 7 8 、8 4 1 4 、 1 0 2 1 l 、1 4 4 7 0 、1 3 6 2 6 、1 5 2 1 7 、7 0 9 、1 7 1 9 、1 5 6 0 7 、1 3 9 2 8 、7 0 2 8 、1 0 3 9 8 、1 0 4 0 0 、 6 3 9 2 、9 0 9 0 、5 8 4 3 、2 0 9 2 、1 6 5 1 9 、4 8 3 3 、5 2 5 0 、1 2 4 3 8 、4 5 2 9 、4 5 8 0 、】1 7 1 9 、 硕士学位论文 4 7 7 、4 7 9 3 、1 1 9 1 4 、1 2 6 3 3 、1 2 8 5 8 、1 0 8 7 3 、1 3 2 6 3 、7 2 0 2 。 根据上述位点进行普通p c r 引物设计和单个s n p s 位点的p c r 扩增，利用 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳( n p a g e ) 和银染技术对单位点p c r 扩增产物进行 检测验证。其后通过“加尾”设计不同长度的单碱基延伸引物( 单碱基引物的长 度为18 8 8 n t ，每个位点只设计一条引物) ，利用s n a p s h o t t mm u l t i p l e x 硒t 试剂盒 对每个位点进行单碱基延伸反应及毛细管电泳检测，确定各个位点的迁移距离。 通过正交法对复合p c r 体系中各组分及p c r 反应的循环参数进行调整，去除无 法进行复合p c r 扩增的位点如2 0 9 2 、6 3 9 2 、9 0 9 0 、5 8 4 3 ，引物间二聚体形成的 位点如8 3 9 2 ，无法用复合单碱基延伸方法检测的位点如1 0 4 0 0 、8 4 1 4 、5 1 7 8 、 1 0 2 1 1 ，有非特异性扩增位点如1 3 6 2 6 、1 5 2 1 7 、1 4 4 7 0 ，考虑引物间的相互作用 和扩增效率，在保证体系的高多态性的情况下，综合考虑了引物间的相互作用、- 体系稳定性和扩增检测效率，最终选定了2 1 个m t d n as n p s 位点，建立复合检 测体系。 最后使用建立的体系对2 3 6 名广东地区无关个体、3 0 个三联体家系进行调 查，并对实际检案中收集的部分微量、腐败降解检材进行检测分型，评估该体 系在法医学中的应用价值，最终获得了2 1 个m t d n a s n p s 位点的频率分布资料， 除位点1 2 4 3 8 、4 7 7 外，其余1 9 个遗传标记位点在广东地区人群中均具有遗传 多态性。去除1 2 4 3 8 、4 7 7 两个位点，最终建立1 9 个m t d n a s n p s 复合检测体 系，其基因多样性( g e n ed i v e r s i t y ) g d 范围为0 0 0 8 5 - 0 4 9 8 0 ，共检测到9 0 种单 倍型( h a p l o t y p e ) ，单倍型多样性( h a p l o t y p ed i v e r s i t y ) h d 为0 9 7 0 5 。 在建立的1 0 山p c r 复合扩增体系中，最低检测量为5 0 p g ，当模板量在0 1 1 0 n g 时，能得到较理想结果。检测1 0 种动物血样，猴、牛、猪、鹅、鼠、兔、 鸡、羊、狗、猫的d n a 样本均无特异性扩增产物。本课题研究中同一个体的肌 肉、皮肤、肝脏、脾脏、毛发、指甲、软骨、血痕和骨骼等组织基因分型没有 差异性。 本体系采用检测3 0 例家系( 外祖母母子女) 、2 0 对兄弟和姐妹、5 个同 i i i 中文摘要 一母系来源的表姐妹，未发现有突变，个体分型结果一致。 对实际检案中收集的部分微量、腐败检材进行检测分型，对于5 0 例s t r 仅 检出l 5 个基因座的检材，本体系能够成功完成1 8 个m t d n as n p s 以上位点 的分型。 结论：本课题研究建立了一个以单碱基延伸和毛细管电泳荧光检测技术为 基础的1 9 p l e xm t d n as n p s 复合检测体系，包括7 0 9 、1 7 1 9 、1 5 6 0 7 、1 3 9 2 8 、 7 0 2 8 、1 0 3 9 8 、1 6 5 1 9 、4 8 3 3 、5 2 5 0 、4 5 2 9 、4 5 8 0 、7 2 0 2 、1 1 7 1 9 、4 7 9 3 、1 1 9 1 4 、 1 2 6 3 3 、1 2 8 5 8 、1 0 8 7 3 、1 3 2 6 3 。该体系在中国广东地区汉族人群中具有多态性， 遗传稳定性好、种属特异性强。所建立的1 9 个m t d n as n p s 复合检测体系灵敏 度高、通量大、重复性好、分型准确，特别适合于微量、降解检材和母系亲缘 关系等法医学检验。对案件中遇到的毛发、骨骼、肌肉等严重腐败降解及微量 检材分型效果满意；且研究平台基于法医d n a 实验室常规仪器设备，对腐败降 解检材的分型更有效具有良好的应用前景。 关键词：单核苷酸多态性( s n p s )线粒体d n a 复合p c rs n a p s h o t 微量检材 i v a u t h o rn a m e ： q i o n gh e s u p e r v i s o r ：p r o f h u i j u nw a n g p r o f c h a ol i u a b s t r a c t b i o l o g i c a ls a m p l e ss u c h a s c o r r u p t e dt i s s u e s ，o l db o n e sw e r ev u l n e r a b l e t o e x t e r n a le n v i r o n m e n tf a c t o r sa n dh a v ea l w a y sb e e nad i f f i c u l tp r o b l e mw h i c ht h e f o r e n s i ce x p e r t sc o n f i - o n t e d t h e s e ss a m p l e sh a v eh a db e e nd e g r a d e di nt h ec o m p l e x e n v i r o n m e n ta n dt h ei n t e g r i t yo ft h ed n a s e q u e n c eh a db e e nd a m a g e do b v i o u s l y , t h e a p p r a i s a lc o n c l u s i o nw a sm f l u e n c e ds u b s e q u e n t l y s t rg e n o t y p i n gs y s t e mw a su s e d w i d e l yi nt h ef o r e n s i cl a b o r a t o r i e s i tu s u a l l ya p p l y t oc o n v e n t i o n a ls a m p l e s ，b u tt r a c e d n a s a m p l e sa n dd e g r a d e ds a m p l e s ，n o n n u c l e a rm a t e r i a l sd e t e c t i o nw e r eo f t e nl o s t b e c a u s eo fn u l la l l e l e s ，u n s p e c i f i ca m p l i f i c a t i o n , o ref a i l u r ed e t e c t i o n f o r e n s i c b i o l o g yh a sn o ty e tb e e nf u l l yt os o l v e t h i sp r o b l e m h u m a nm i t o c h o n d r i a ld n a ( h u m a nm i t o c h o n d r i a ld n a ，m t d n a ) i sl o c a t e d o u t s i d et h en u c l e u so fg e n o m i cd n a t h eg e n e t i cm a n n e rm a i n l yf o l l o wm a t e r n a l i n h e r i t a n c e ， m i t o c h o n d r i a ld n ao fm o t h e ra n dc h i l d ，b r o t h e r sa n ds i s t e r si s t h e o r e t i c a l l yc o n s i s t e n t ，ai n d i v i d u a lh a v eo n l yt h em i t o c h o n d f i a ld n a d o e sn o te x i s t m o r et h a n16 ，0 0 0m t d n ab a s e sa lec o m p o s e db yt h ec l o s e dr i n gd o u b l e s t r a n d e d c o v a l e n ts t r u c t u r e ，s u r r o u n d e db ye n v e l o p e ，s ot h a tm t d n aa l el e s ss u s c e p t i b l et ot h e i n f l u e n c eo fn u c l e i ca c i d se n z y m ei nt h ee x t e r n a le n v i r o n m e n t c o m p a r e dt ot h e n u c l e a rd n a g e n e t i cm a r k e r , e v e r yc e l lh a so n l yt w oc o p i e s ，e v e r yc e l lo fm t d n a a b s t ra c t h a st h o u s a n d so fc o p i e s ，t h em u t a t i o nr a t eo fm t d n ai sa tl e a s t5 10t i m e sm o r e t h a nn u c l e a rd n a m t d n ai sm o r ep r e s e r v e di nt h ee x t e r n a le n v i r o n m e n ta n de a s yt o b ea m p l i f i e d ，i th a sag o o da p p l i c a t i o np r o s p e c tt of o r e n s i cs c r e e n i n gf o ra r c h a e o l o g y o fi n d i v i d u a li d e n t i f i c a t i o n ，r e l a t i o n s h i pr e c o g n i z a n c ea n df a i l u r e dn u c l e a rg e n e t i c m a r k e r st y p i n gs p e c i m e n s s i n g l e - n u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ( s n p s ) w a sd e f i n e da s as i n g l en u c l e o t i d e v a r i a t i o nc a u s e db yd n as e q u e n c ep o l y m o r p h i s mi nt h eg e n o m e a tl e a s tt h e f r e q u e n c yo fs n p sw a sn o tl e s st h a n1 a n ds n p sw e r ec h a r a c t e r i s t i c o fh i g hd e n s i t y , g e n e t i cs t a b i l i t y , e a s ya u t o m a t i o n e t c i tr e g a r d e da s t h em o s tc o m m o ng e n e t i c d i v e r s i t ya n dm a k eu pa b o u t8 0 o f a l lh u m a ng e n e t i cv a r i a t i o n d u et ot h es m a l l e r f r a g m e n t sw i t ha n a l y s i s ( 4 5 15 0 b p ) ，g e n e t i cs t a b i l i t y , l o w e rm u t a t i o nr a t e ，c a p a b i l i t y o fh i g h - t h r o u g h p u tt h r o u g ht h ef l u o r e s c e n tm a r k e ri ns i n g l eb a s ee x t e n t i o n ( s b e ) 硕士学位论文 e x t e n s i o n ( s b e ) a n dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i st e c h n o l o g y t h ee a t a b l i s h e dm t d n a s n p ss y s t e mw i t hh i g hs e n s i t i v i t y , s i m p l eo p e r a t i o n ，h i g ha c c u r a c y , a n da l s of o rt h e t r a c e ，d e g r a d e d ，n u c l e a r - f r e ed n as a m p l e s t h es y s t e mp r o v i d e dan e wt y p eo f l l i g h - t h r o u g h p u tm e a n sa n dm e t h o d s w eg a i n e dt h ep o p u l a t i o ng e n e t i c sd a t ai n g u a n g d o n g a r e aa n dd i s c u s s e di t sa p p l i c a t i o ni nf o r e n s i cc a s e s a c c o r d i n gt ot h ed b s n p sd a t a b a s e ( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v s i t e s d b s n p n c b i ) a n dn u c l e i ca c i dd a t at of i n dr c r s ( r e v i s e dc a m b r i d g er e f e r e n c es e q u e n c e ) ， m i t o m a pd a t a b a s e ( ah u m a nm i t o c h o n d r i a l g e n o m ed a t a b a s e ) ，m t d bd a t a b a s e ( h u m a nm i t o c h o n d r i a lg e n o m ed a t a b a s e ) ，w ep r i m a r i l ys e l e c t e d3 3c a n d i d a t e s m t d n as n p sw i t hh i g h l yp o l y m o r p h i s m sa m o n gi na s i ap o p u l a t i o n ，d n ar e g i o n s s u r r o u n d i n gt h es u b s t i t u t i o ns i t ea n df l a n ks e q u e n c eo fs n p ss i t e sw e r es t a b l e w e c h o o s e ds o m es n p ss i t e sf o ra i m sa td e t e c t i n gw h e t h e re x i s t i n gp o l y m o r p h i s m si n c h i n ap o p u l a t i o n a l lw es e l e c t e ds n p si n c l u d i n g8 3 9 2 、5 1 7 8 、8 4 1 4 、1 0 2 1l 、1 4 4 7 0 、 1 3 6 2 6 、1 5 2 1 7 、7 0 9 、1 7 1 9 、1 5 6 0 7 、1 3 9 2 8 、7 0 2 8 、1 0 3 9 8 、1 0 4 0 0 、6 3 9 2 、9 0 9 0 、 5 8 4 3 、2 0 9 2 、1 6 5 1 9 、4 8 3 3 、5 2 5 0 、1 2 4 3 8 、4 5 2 9 、4 5 8 0 、1 1 7 1 9 、4 7 7 、4 7 9 3 、1 1 9 1 4 、 1 2 6 3 3 、1 2 8 5 8 、1 0 8 7 3 、1 3 2 6 3 、7 2 0 2 。 a c c o r d i n gt ot h ea b o v es i t e s ，p c rp r i m e r sw e r ed e s i g n e da n ds i n g l es i t eo f s n p sw a sa m p l i f i e d ，a f t e rt h a t ，w eu s e dt h en a t i v ep o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ( n p a g e ) a n ds i l v e rs t a i nt od e t e c tp r o d u c t so fs n p s t h el e n g t h so ft e m p l a t es p e c i f i c p a r t so ft h es i n g l eb a s ee x t e n s i o np r i m e r sr a n g e df r o m 18t o8 8n u c l e o t i d e s ，t h e d e s i r e dl e n g t ho fap r i m e rw a sa d j u s t e da tt h e5 e n db ya d d i t i o no fap i e c eo fa n e u t r a l s e q u e n c ea n d o r , i fn e c e s s a r y , ap o l y - c tt a i l t h em i n i s e q u e n c i n gr e a c t i o n s w e r ea n a l y s e db yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sa n dm u l t i c o l o u rf l u o r e s c e n c ed e t e c t i o n 2 0 9 2 ，6 3 9 2 ，9 0 9 0 ，5 8 4 3w e r er e m o v e db e c a u s eo fn op r o d u c t si nt h em u l t i p l ep c r r e a c t i o n ；8 3 9 2w a sr e m o v e dd u et od i m e r i z a t i o nw i t l lo t h e rp r i m e r s ；10 4 0 0 、8 414 、 517 8 、10 211w e r er e m o v e db e c a u s et h e yw e r en o td e t e c t e di nt h em u l t i p l es b e a b s t r a c t r e a c t i o n 13 6 2 6 、15 217 、14 4 7 0w e r er e m o v e db e c a u s eo fn o n s p e c i f i cp r o d u c t s t h r o u g ho r t h o g o n a lm e t h o df o rp c rc o m p o n e n t sa n dc y c l ep a r a m e t e r sa d j u s t m e n to f c o m p l e xs y s t e m ，c o n s i d e r i n gt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e np r i m e r s ，a m p l i f i c a t i o ne f f i c i e n c y a n ds t a b i l i t yo ft h em u l t i p l e xs y s t e m ，w ef i n a l l ye s t a b l i s h e das t a b l e21 一p e l xm t d n a s n p sm u l t i p l e xd e t e c t i o ns y s t e m at o t a l2 3 6s a m p l e sf r o mg u a n g d o n ga r e aw e r e t y p e dw i t h21 - p e l xs y s t e ma n da l lt h ea l l e l ef r e q u e n c i e sw e r ed e t e r m i n e d a l lo ft h e m t d n as n p sa r ep o l y m o r p h i s me x c e p tf o r4 7 7 ，12 4 38 t h eg e n e t i cd i v e r s i t y ( g d ) o f m t d n as n p sr a n g e df r o m0 0 0 8 5 - 0 4 9 8 0a n dt h eh a p l o t y p ed i v e r s i t y ( h d ) w a s e a t i m a t e dt ob eo 9 7 0 5 9 0h a p l o g r o u p sw e r ef o u n d t h ee l e c t r o p h e r o g r a m sw i t ht h eb e s tp e a kb a l a n c ew e r eo b t a i n e dw i t h0 1 - 1 0n g i n p u td n a ，b u ta c c e p t a b l er e s u l t sw e r ea l s oo b t a i n e dw i t hl e s st o 5 0p gd n a w i t h o u ts p e c i f i ca m p l i f i c a t i o np r o d u c t sw e r ed e t e c t e df r o ma n i m a lb l o o ds a m p l e s s u c ha sc a t t l e ，p i g s ，g e e s e ，r a t sa n dr a b b i t s ，c h i c k e n ，s h e e p ，d o g s ，c a t s m u s c l e sa n d s k i n ，l i v e r , s p l e e n ，h a i r , n a i l ，b o n ea n dc a r t i l a g e ，b l o o d sf r o mas a m ei n d i v i d u a lw e r e g e n o t y p e db yt h e21 一p e l xs y s t e mo b t a i n e dt h es a m er e s u l t s w eh a v et y p e d3 0f a m i l yt r i o s ( g r a n d m o t h e r f e m a l e - s o n d a u g h t e r ) ，2 0b r o t h e r - p a i r sa n ds i s t e r - p a i ra n df i v em a t e r n a lc o u s i n s n om u t a t i o ne v e n th a d b ef o u n d t r a c e ，d e g r a d e do f5 0s a m p l e sw ec o l l e c t e df r o mc r i m es c e n ew e r ea l s ot y p e d i ns o m ec a s e s ，w h e no n l y1 - 5s t rl o c ic o u l db ed e t e c t e dw i t hc o m m o ns t r m u l t i p l e xs y s t e m ，t h e r ew e r em o r et h a n18m t s n p sl o c ic o u l db ed e t e c t e d c o n c l u s i o n ：w eh a v ee s t a b l i s h e d19 - p l e xm t d n as n p sm u l t i p l es y s t e mb a s e d o ns i n g l eb a s ee x t e n s i o na n d c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s f l u o r e s c e n c ed e t e c t i o n t e c h n o l o g y t h em u l t i p l es y s t e m i s p o l y m o r p h i ci n c h i n e s eg u a n g d o n gh a n p o p u l a t i o n t h em a r k e r s i n c l u d e d7 0 9 、1 7 1 9 、1 5 6 0 7 ，1 3 9 2 8 ，7 0 2 8 ，1 0 3 9 8 ，1 6 5 1 9 ， 4 8 3 3 、5 2 5 0 、1 2 4 3 8 、4 5 2 9 、4 5 8 0 、7 2 0 2 、1 1 7 1 9 、4 7 7 、4 7 9 3 、1 1 9 1 4 、1 2 6 3 3 、 12 8 5 8 、10 8 7 3 、13 2 6 3 e s t a b l i s h e d19 - p l e xm t d n as n p sw a sh i g hs e n s i t i v i t y , h i g l l 硕士学位论文 a c c u r a c y , h i g h t h r o u g h p u t ，h i g hs p e c i e s - s p e c i f i c ，r e p r o d u c t i v i t y , g e n e t i cs t a b i l i t y a n dw a sp a r t i c u l a r l ys u i tf o rt r a c e ，d e g r a d e ds a m p l e s ，m a t e r n a l r e l a t i o n s h i p i d e n t i f i c a t i o ne t c t h er e s u l t so fh a i r , b o n e ，m u s c l e sa n dd e g r a d e ds a m p l e sd e t e c t e d b yt h es y s m nw e r es a t i s f a c t o r y t h er e s e a r c hb a s e do nf o r e n s i cd n al a b o r a t o r y p l a t f o r ma n dt h ec o n v e n t i o n a le q u i p m e n td i r e c t l y t h ep r o s p e c to fm u l t i p l es y s t e m w o u l db ev e r yw e l l k e y w o r d ：s i n g l e - n u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ( s n p s ) ；m i t o c h o n d r i a ld n a m u l t i p l ep c r ；s n a p s h o t ；t r a c es a m p l e s 目录 摘要i a b s t r a c t i 第1 章引言1 1 1 线粒体d n a 特性1 1 2 人类d n a 遗传标记的发展2 1 3s n p s 的特性及检测方法3 1 4m t - s n p s 的应用11 第2 章线粒体s n p s 复合体系的建立1 5 2 1 材料l5 2 2 主要实验方法1 7 2 3 结果2 5 2 4 讨论4 3 第3 章多态性评估5 3 3 1 材料5 3 3 3 结果5 4 3 4 讨论6 0 第4 章法医学应用及可行性评估：6 2 4 1 材料6 2 4 2 方法。6 3 4 3 结果6 6 4 4 讨论7 2 结j 吾一7 4 参考文献7 5 附录8 0 附录1 ：缩略词表8 0 附录2 ：r c r s 序列( 修正剑桥参考序列) 8 1 附录3 ：硕士期间发表和待发表的论文8 7 致谢8 8 学位论文原创性声明9 0 硕士学位论文 第1 章引言 在法医学领域，广泛应用的人类遗传标记分为两种：核基因组d n a 和线粒 体d n a ( m i t o c h o n d r i a ld n a ，m t d n a ) 。应用最为广泛的是核基因组d n a ，也是 目前绝大多数法医d n a 实验室常规采用的是荧光标记的多基因座p c r s t r 复 合扩增体系。在法医实际检案中，经常会遇到各种腐败、微量检材，如高度腐 败的土埋、水浸、焚烧、化学腐蚀、久置野外等的尸体检材，在这些检材中d n a 常常被降解成小片段，对于严重降解d n a 片段( 2 0 0 b p ) ，现有的s t r 复合 扩增体系难以分型，可表现为复合扩增时易产生非特异性带，出现优势扩增、 基因漏扩甚至无扩增产物等现象【l 铆。通过改进d n a 的提取方法，提高模板d n a 的浓度和纯度，优化p c r 扩增条件等在一定程度上提高腐败检材的s t r 分型成 功率，但仍不能从根本上解决降解d n a 的s t r 分型问题。 目前解决微量、腐败检材中降解d n a 片段的检测，主要有两个研究方向： 将s t r 引物设计在更靠近核心序列的区域，使扩增片段缩短的技术【4 】；寻找新 的能检测更短片段的d n a 遗传标记( s n p s ) i s 。由于m i n i s t r 技术仍存在复制 滑脱、突变率较高等缺点，相对于s t r 而言，作为第三代d n a 遗传标记的s n p s ， 分布更广泛，遗传更稳定，能够扩增更短片段d n a ，更易进行高通量的检测【6 】， 再加上可利用m t d n a 特有的性质，s n p s 已经成为法医物证领域新的研究热点。 1 1 线粒体d n a 特性 m t d n a 是目前人类发现的唯一存在于核外的基因组，是由1 6 5 6 9b p 组成的 共价闭合环状双链结构，包括编码区和非编码区( 控制区) ，编码3 7 个基因( 图 1 1 ) ，遵循母系遗传，遗传方式呈单倍型，由母亲直接传给子女，几乎不发生 重组，并且这种单倍型是非随机地分布在人群中，具有种族特异性、地域分布 特点。线粒体d n a 遗传标记的识别能力与常染色体遗传标记有很大不同，不能 通过个体识别率的乘积来计算，只能通过增加遗传标记提高识别力。传统上常 常采用对线粒体d n a 高变区( h y p e r v a r i a b l er e g i o n s ，h v ) 来进行分析鉴定，采 l 第1 章引言 用的技术方法如r f l p 、直接测序等方法，因技术复杂、检验周期长、成本高、 费力，致其进一步应用受到限制。 图1 - 1 人类线粒体d n a 模拟图 f i g i - im i m i cd i a g r a mo f h u m a nm i t o c h o n d r i a ld n a 1 2 人类d n a 遗传标记的发展 ；七十年代后期应用的限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 被作为第一代d n a 遗传标记；w y m a n 和w h i t e1 9 8 0 年首次用p y n h 2 4 小卫星d n a 探针【7 】揭示了小卫星可变数目串联重复序列多态 性：1 9 8 5 年j e f f r e y s 等【8 】报道用人肌红蛋白第1 内含子3 3 b p 小卫星探针，通过 s o u t h e r n 杂交技术与人基因组d n ah i n fi 酶切片段进行杂交，得到的谱带平均 达1 7 条，犹如人的指纹在群体中有高度特异性，被形象的称为d n a 指纹。d n a 指纹的应用标志着法医物证学进入d n a 水平，实现了法医