（物理化学专业论文）123三唑化合物诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究.pdf

1 ，2 ，3 - 三唑化合物诱导肿瘤细胞凋亡机制研究 1 ，2 ，3 一三唑化合物诱导肿瘤细胞凋亡机制研究 摘要 苯并三唑类化合物具有良好的生物活性，在杀菌抗病毒抗惊厥等方面有广泛 应用，且对肿瘤细胞也有抑制作用。本文借鉴国内外开展的体外肿瘤细胞药敏性 实验研究，对苯并三唑类化物进行抗肿瘤活性筛选，并探讨其作用机制。 在本文中首先选用5 种苯并三唑类化合物，通过i r 、1 h n m r ：分析表征，从 中筛选出3 一( ( 4 一( 4 一苯基) 苯基- 1 h - 1 ，2 ，3 一三唑一卜基) 一5 一苯巯基) 甲基) 一4 h 一1 ，2 ，4 一三唑- 4 - 胺( m t m o ) ，其对人肝癌细胞株b e l 7 4 0 2 增殖有明显的抑 制作用，抑制率呈浓度和时间依赖性。进一步实验证明，m t m o 可以通过引发细 胞产生自由基、线粒体膜电位下降、打断d n a ) 阻滞d n a 复制等途径诱导细胞 凋亡。膜电位下降要早于自由基的产生，可见膜电位的下降不是由自由基引发的， 但产生的自由基又可以进一步促使膜电位崩溃，加速细胞的凋亡。而自由基清除 剂v c 和s o d 可以大大减缓细胞的凋亡，说明自由基在肿瘤细胞凋亡中起着重要 作用。 m t m o 对小鼠乳腺癌细胞株4 t 1 的增殖也有显著的抑制作用，在荧光显微 镜下可以观察到凋亡，也可以引发自由基、致使线粒体膜电位下降。 可见，m t m o 对肿瘤细胞生长有很好的抑制作用，并且可以有效诱导细胞凋 亡。这为苯并三唑类化合物的抗癌潜力提供了一个有力证据。 关键词：苯并三唑肿瘤凋亡线粒体膜电位自由基 2 青岛科技大学研究生学位论文 s t u d yo nm e c h a n i s mo fa p o p t o s i s0 fc a n c e r c e l l si n d u c e db yb e n z o t r i a z o l e a b s t r a c t b e n z o t r i a z o l ec o m p o t m d sh a v e b e e nf o u n dt os h o we x t e n s i v eb i o l o g ! c a la c t i v i t i e s m a n yo ft h e mh a v eb e e nd e v e l o p e da n du s e da sf u n g i c i d e s ，p l a n tg r o w t hr e g u l a t o r s a n dm e d i c i n e ，a n da l s oh a v eb e e ns h o w nt ob ea b l et oi n d u c eg r o w t hi n h i b i t i o n i n c a n c e rc e l l s i np r e s e n ts t u d y ，w es y n t h e s i z e df i v eb i o a c t i v eb e n z o t r i a z o l ed e r i v a t i v e sa n dt h e i r s t r u c t u r e sw e r ec o n f i r m e db ym e a n so f1 h n m r ，i rd e t e r m i n a t i o n ，o fw h i c ho n e c o m p o u n d3 - ( ( 4 一( 4 一p h e n y l ) p h e n y l 一1h - 1 ，2 ，3 一t r i a z o l 一1 一y 1 ) m e t h y l ) 一5 一( p h e n y l t h i o ) 一4 搏 1 , 2 4 一t r i z a o l 一4 一a m i n e ( m t m o ) w a ss e l e c t e d i tw a sd e m o n s t r a t e d h a tm t m o c o u l d s i g n i f i c a m l yi n h i b i tp r o l i f e r a t i o no fc u l t u r e dh e p a t o c a r c i n o m ab e l 一7 4 0 2c a n c e rc e l l s i nad o s e a n dt i m e d e p e n d e n tm a n n e r t r e a t m e n tw i t hm t m or e s u l t e di ng e n e r a t i o n o fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) ，d i s r u p t i o no fm i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a l ( 甲m ) ，d n af r a g m e n t a t i o n ，a n da p o p t o s i si nb e l 一7 4 0 2c e l l s t h er e s u l t ss u g g e s t e d t h a tm t m o i n d u c e sc e l l sg r o w t hi n h i b i t i o na n da p o p t o s i so fb e l 7 4 0 2c e l l sm a yb e t h r o u g hm o d u l a t i o no fm i t o c h o n d r i a lf u n c t i o n sr e g u l a t e db yr o s i ts e e m s t h a t c o l l a p s eo fa t mp r i o rt oi n t r a c e l l u l a rr o s a r i s ed u r i n gt h ea p o p t o t i cp r o c e s si no u r e x p e r i m e n t a ls y s t e m h o w e v e r , d i s r u p t i o no fm i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a lc a r l f u r t h e ra u g m e n tr o sp r o d u c t i o na n da m p l i r f ya na p o p t o t i cs t i m u l u s v ca n dr o sc a n s l o wd o w nt h ea p o p t o s i sw h i c hd e m o n s t r a t et h a tr o si sm u c hi m p o r t a n tt oa p o p t o s i s m t m oa l s oi n d u c eo b v i o u sg r o w t hi n h i b i t i o ni nr a tb r e a s tc a n c e rc e l l s4 t - 1 t r e a t m e n tw i t hm t m or e s u l t e di ng e n e r a t i o no fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) a n d l ，2 ，3 - 三唑化合物诱导肿瘤细胞凋亡机制研究 d i s r u p t i o no fr n i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a li nt h e s ec e l l s s i g n i f i c a n t l y ，m t m oc o u l di n d u c eo b v i o u sg r o w t hi n h i b i t i o na n da p o p t o s i si n c a n c e r c e l l s ，w h i c hm a yb e af o r c e f u le v i d e n c ef o ra n t i c a n c e ro fb e n z o t r i a z o l e c o m p o u n d s k e y w o r d s ：b e n z o t r i a z o l e ；t u m o r ；a p o p t o s i s ；m i t o c h o n d r i a lm e m b r a n e p o t e n t i a l ；r e a c t i v e ；o x y g e ns p e c i e s ； 4 青岛科技大学研究生学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢中所罗列的内容以外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人已用于其他学位 申请的论文或成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中做了明确的说明并表示了谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 本人签名： 粥九 日期： 埘年占月门日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解青岛科技大学有关保留、使用学位论文的规定，有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人离校后发表或 使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为青岛科 技大学。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 本学位论文属于： 保密口，在年解密后适用于本声明。 不保密口 ( 请在以上方框内打“”) 本人签名： 导师签名： 日期：砌扩年占月f 7 曰 日期：舀沪石月夕日 红k 献一 青岛科技大学研究生学位论文 1 1 肿瘤的产生机制 第一章前言 动物体内的细胞分裂调节失控而无限增殖的细胞称为癌细胞( t u m o rc e l l ) 。 具有转移能力的肿瘤称为恶性肿瘤( m a l i g n a n c y ) ，上皮组织的恶性肿瘤称为癌。 目前癌细胞己作为恶性肿瘤的通用名称。 细胞分化的过程往往伴随细胞的分裂，虽然d n a 能精确地复制与修复，但其 基因的碱基突变率却能达n l o 南。从进化的角度看突变是选择的源泉，具有积极 的意义。但如果在人的一生中，体细胞要分裂1 0 1 6 次，那么可以推断在基因组中 每个基因都可能发生突变。基因突变的结果有可能导致某些分化细胞的生长与分 裂失控，脱离了衰老和死亡的正常途径而成为癌细胞。细胞通过分裂与分化过程， 形成不同的细胞类型，并由此构建有机体的组织和器官。而癌细胞的细胞类型与 正常细胞趋于一致，能破坏有机体的组织器官。癌细胞与正常分化细胞不同的是， 不同类型的分化细胞都具有相同的基因组；而癌细胞的细胞类型和特征与正常分 化细胞相近，但基因组却发生不同形式的突变。随着环境因素的影响i 基因突变 率提高，细胞癌变的几率也随之增加【2 】。因此，对癌细胞形成与特征的了解不仅 有助于了解细胞增殖、分化与死亡的调节机制的细节，而且也为彻底治疗癌症一 一这一维护人类健康所面临的十分严峻的问题提供线索和希望。 1 1 1 癌细胞与正常细胞的区别 癌细胞无论从形态结构、代谢特点，还是生长方式来说，都和正常细胞有较 大的差别，具体表现如下： ( 1 ) 形态结构不同。正常情况下，来自同一组织的细胞大小、形态基本一 致，癌细胞一般比相应的正常细胞大，而且癌细胞相互之间的大小形态也很不一 致，有时出现体积很大的“瘤巨细胞”。 细胞都含有细胞核和细胞浆。正常情况下，大多数细胞只有一个细胞核，细 胞核与细胞浆也有一定比例。癌细胞的细胞核体积增大，形态也不一致，并可出 现巨核、双核、多核或异形核，癌细胞细胞浆的质和量也与正常细胞有所差别。 ( 2 ) 细胞代谢不同。任何活细胞都要进行新陈代谢( 包括蛋白质、糖、酶以 l ，2 ，3 一三唑化合物诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究 及遗传物质核酸的代谢) 以维持细胞的生命。癌细胞也是一种活细胞，其代谢特 点与正常组织细胞相比，有很大差别。表现为组成细胞基本结构的物质如蛋白质、 核酸等的合成异常旺盛，相反其分解代谢则显著降低，以至合成和分解代谢的平 衡失调。 癌细胞代谢增强也是癌症对人体危害的原因之一。比如，癌组织的蛋白质代 谢旺盛，尤其是蛋白质合成大大增强，甚至夺取正常组织的蛋白质分解产物以合 成癌组织本身所需要的蛋白质，结果可使癌症病人处于严重消耗的恶病质状态。 ( 3 ) 细胞生长方式不同。与正常细胞相比，癌细胞的生长有两大特点。 首先是癌细胞生长的自主性。人工培养细胞时发现，当正常细胞在分裂繁殖 过程中与周围细胞相接触时就停止分裂，这种现象叫作细胞增生的“接触性抑 制”，它能抑制细胞的过度增生。癌细胞在不同程度上脱离了机体的控制，往往 表现为不间断的生长繁殖和分化不良，这种特征称为癌细胞的“自主性”或“自主 性成长”。在癌症发展过程中，“自主性”总是越来越大，生长越快，发展也越快。 癌细胞生长的第二个特点是浸润性和转移。这是区分良、恶性肿瘤的主要特 点，只有恶性肿瘤才有浸润性和转移。正常细胞因为彼此间存在一定的粘着力， 限制了细胞向附近和远处的扩散；而癌细胞表面可以发生一系列变化，使细胞间 粘着性降低，癌细胞容易脱落、溶解和侵入周围组织，或侵入血液、淋巴组织， 并通过血液和淋巴液的循环，播散到身体的其他部位，造成癌症的扩散和转移。 ( 4 ) 癌细胞特征的遗传。癌细胞能把它的自主性、浸润性和转移的特性遗传 给后代细胞，使新繁殖出来的癌细胞具备同样的特点，所以癌肿可以不断扩大甚 至广泛播散，并且永远保持癌细胞的恶性特征。 1 1 2 肿瘤的发生是基因突变逐渐积累的结果 根据d n a 复制过程中的基因突变率及人的一生中细胞分裂次数推测，在人的 一生中，其基因组中每个基因都可能发生突变。如果再考虑生活环境中的致癌因 素( 如辐射等物理因素，化学诱变剂等化学因素和肿瘤病毒感染生物因素) ，令 人们感到惊奇的并不是细胞为什么会癌变，而是肿瘤的发生频率为什么如此之一 低。 根据大量的病例分析，癌症的发生一般并不是单一基因的突变，而至少在一 个细胞中发生5 6 个基因突变，才能赋予癌细胞所有的特征，即癌细胞不仅增殖 速度快，而且其子代细胞能够逃脱细胞衰老的命运，取代相邻正常细胞的位置， 不断从血液中获取营养，进而穿越基膜与血管壁在新的组织部位安置、存活与生 长。 因此细胞基因组中产生与肿瘤发生相关的某一原癌基因的突变，并非马上形 2 青岛科技大学研究生学位论文 成癌，而是继续生长直至细胞群体中新的偶发突变的产生。某些在自然选择中具 有竞争优势的细胞，再经过类似的过程，聚渐形成具有癌细胞一切特征的恶性肿 瘤。如直肠癌发生的病程中开始的突变仅在肠壁形成多个良性的肿瘤( 息肉) ， 进一步突变才发展为恶性肿瘤( 癌) ，全过程至少需要1 0 2 0 年或更长时间。因此 从这一点上看，癌症是一种典型的老年性疾病，它涉及一系列的原癌基因与肿瘤 抑制的致癌突变全的积累。 在人的二倍体细胞中肿瘤抑制基因有两个拷贝，只要其中一个基因拷贝正常， 便可保证正常的调控作用。如两个基因都丢失或失活，才能引起细胞增殖的失控， 而原癌几基因的两个拷贝中只要有一个基因发生突变，便可能引起与癌基因类 似的作用。 在某些癌症病例中，其生殖细胞中原癌基因或肿瘤抑制因子发生致癌突变， 致使体内所有的体细胞的相应基因都已变异。在这种情况下，癌变发生所需要的 基因突变数的积累时间就会减少，携带这种基因突变的家族成员更易患癌症。 随着科技的发展，特别是显微技术和细胞生物学的发展，对癌症的研究日益深入， 我们有理由相信，在不久的将来，癌症的病理将完全被现代科技征服，到时将不 再会谈癌色变pj 。 1 1 3 癌基因与抑癌基因 癌症是由携带遗传信息的d n a 的病理变化而引起的疾病。与遗传病不同，癌 症主要是体细胞d n a 突变，而不是生殖细胞d n a 突变。 癌基因( o n c o g e n s e ) 是控制细胞生长和分裂的正常基因的一种形式，能引起 正常细胞癌变。癌基因最早发现于诱发肿瘤的劳氏肉瘤病毒( r o u ss a r c o m av i r e s ， 属逆转录病毒科) 。它携带s c r 基因，该基因对病毒繁殖不是必要的，但当病毒感 染鸡体后可引起细胞癌变。后来人们发现在鸡的正常细胞基因组中也有一个与病 毒s c r 基因同源性很高的基因片段。鸡体内的s c r 基因编码一种与细胞分裂调控相 关的蛋白激酶。它不具有致癌能力，但由于它的发现源于瓶毒癌基因及其与病毒 基因的高同源性，因而不恰当地称为细胞癌基因( c e l l u l a ro n c o g e n e ) 或原癌基因 ( p r o t o o n c o g e n e ) ，但也以此表明该基因基因突变可能有致癌的危险。 对多种致癌的逆转录病毒中存在的癌基因( v o n c o g e n e ) 的研究，均导致正常 细胞中原癌基因的发现，其中很多原癌基因的产物都是细胞生长分裂的调控因 子。反过来，在人的多种癌细胞中证实了这些基因发生了突变。 逆转录病毒所携带的癌基因可能是由于这类病毒特殊的增殖方式而从宿主细 胞中捕获的，由于碱基序列的突变导致所编码的蛋白产物超活化或失去控制，最 终导致肿瘤的形成。 1 ，2 ，3 - - - - r 唑化合物诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究 目前已发现近百种癌基因。癌基因编码的蛋白质主要包括生长因子( g r o w t h f a c t o r ) 、生长因子受体、信号转导通路中的分子、基因转录调节因子和细胞周期 调控蛋白等几大类型。当然，因突变而诱发癌症的基因还不只这些。信号转导是 细胞增殖与分化过程的基本方式，而信号转导通路中蛋白因子的突变是细胞癌变 的主要原因。如人类各种癌症中约3 0 的癌症是信号转导通路中的r a s 基因突变引 起的。癌基因的产物常常是正常细胞不表达、或表达量很少、或表达产物活性不 能调控的一类蛋白。然而人们注意到，在视网膜母细胞瘤( r e t i n o b l a s t o m a ) 的细胞 中，是由于一种称为r b 的基因突变失活，而导致肿瘤发生。随后又发现p 5 3 等基因 均有类似的现象。这类基因称为抑癌基因( t u m o r - s u p p r e s s o rg e n e ) 。抑癌基因实 际上是正常细胞增殖过程中的负调控因子，它编码的蛋白往往在细胞周期的检验 点上起阻止周期进程的作用。如果抑癌基因突变，丧失其细胞增殖的负调控作用， 则导致细胞周期失控而过度增殖，导致癌基因的形成【4 j 。 通过细胞增殖相关基因和抑制细胞增殖相关基因的协同作用，共同调控细胞 的正常增殖进程。肿瘤细胞的基本特征之一是细胞增殖失控，恰恰也是这两大类 基因的突变破坏了正常细胞增殖的调控机制，形成了具有无限分裂潜能的肿瘤细 胞。 1 1 4 癌症的起因 癌的起因是一个虽经长期研究但仍未得到解决的问题。不少学者进行了大 量的调查研究，提出了各种不同的假说【5 1 。有的学者强调物理因素、化学因素或 生物因素这些外因作用；有的则强调内因，认为是遗传物质d n a 的结构或调控功 能发生异常造成了正常细胞的癌变。近年来发现了癌基因，这是癌症研究史上的重 要突破。 1 1 4 1 物理因素 ， 致癌的物理因素包括长期的慢刺激、紫外线照射、各种辐射、机械刺激、创 伤及热刺激等。经常接触放射线且保护不当，则皮肤癌、血癌的发病率会加大， 如在日本长崎和广岛两地的原子弹受害者中白血病和皮肤癌的发病率就很高o ， 1 1 4 。2 化学因素 有些化学物质以莱种方式作用于机体后即可导致癌的产生，这些物质即为致 癌物。人类约9 0 的癌症与环境中化学物质的作用有关。煤焦油、沥青、葸油、 黄曲霉素、亚硝酸盐等都有一定的致癌作用。沥青中的致癌物可诱发人类膀胱癌， 3 ，4 一苯并芘可诱发皮肤癌和肺癌【6 1 。这些致癌物可分为两类，一类是“发起” 癌的形成另一类是“促进”癌的形成。 1 1 4 3 生物因素 4 青岛科技大学研究生学位论文 由于在有些动物的癌细胞中发现了病毒，因此，不少专家学者认为肿瘤的病 。因是病毒1 6 j 。研究发现，人类的恶性肿瘤约5 是由病毒引起。致癌肿瘤病毒可 分为d n a 病毒和r n a 病毒。在病毒r n a 中有一个特定片段叫病毒癌基因( 简称 v 2 0 n e ) ，能引起细胞恶性转化，它的产物是一种转化蛋白。r n a 病毒的致癌和繁 殖都要依赖其逆转录酶的存在才能产生肿瘤。 1 1 4 4 遗传因素 细胞的癌变是由许多内外因素相互作用的复杂的多阶段细胞反应过程，它同 人类的其它疾病一样是具有定的遗传基础的。但不同癌的遗传因素大小及遗传 基础可能有所不同，有些主要受环境因素影响，而有些主要是由遗传决定。在由遗 传决定的癌中有些由单基因控制，有些是由多基因控制，有些可能是由于染色体 畸变或细胞基因突变引起的口1 。 1 ) 单基因遗传决定的肿瘤。一些主要由遗传决定的肿瘤是符合孟德尔式遗 传的，目前已知的孟德尔式遗传的肿瘤有1 0 余种。由一个基因突变引起的肿瘤 的发生至少要经过两步突变，第一步是生殖细胞中的基因突变，然后再经过一些 变化最后才发生肿瘤。而简单方式是一次体细胞突变导致肿瘤的发生。如属常染 色体显性基因决定的直肠多息肉症、腺癌、毛细血管扩张症、x 伴性遗传的多细 胞基细胞癌等。 2 ) 多基因遗传决定的肿瘤。许多家族集中性的恶性肿瘤其遗传方式不是孟 德尔式，也不是染色体畸变引起，而是多基因的遗传，如乳癌、肺癌、子宫癌、淋 巴腺癌等。 3 ) 染色体畸变或胞质基因突变引起的肿瘤。实验证明，癌的发生往往与染色 体的不稳定性密切相关。在肿瘤的原发性变化中，某个细胞发生染色体畸变引起 该细胞的遗传不平衡，使它能进行无限制的细胞分裂，增殖成细胞群，最终导致 细胞恶性转化成肿瘤。如慢性粒细胞白血病患者中有一个公认的特异标记染色体 ( p h ) ，即有一个很小的近端着丝粒染色体，经研究得知该染色体是由2 2 号染色 体长臂易位到了9 号染色体上从而引起病变。这表明p h 是相互易位的产物，癌基 因可能由于位置的改变而导致表达异常，从而使细胞发生了癌变。 4 ) 体细胞突变引起的肿瘤。一些非遗传的肿瘤往往是体细胞突变引起的。 体细胞突变的频率一般为0 1 1x1 06 代。1 个细胞在其生存期中连续发生2 次体 细胞突变的机会很小，所以非遗传的癌往往是单发的，而且发病年龄较晚。相反， 遗传的肿瘤常常多发，发病年龄也较早，如视网膜母细胞瘤零者中约9 0 是4 岁 以下的幼儿。人类每天约有1 0 6 个体细胞发生突变，其中一部分将会导致恶变细 胞的产生，因此，从理论上讲，每个人都有产生肿瘤的可能性。但由于机体自身 的免疫监视机能，恶变的细胞也在不断地被消灭着，只有那些漏网的恶变细胞才 1 ，2 ，3 一三唑化合物诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究 有可能获得增殖优势而形成肿瘤。 1 2 肿瘤与凋亡的关系 肿瘤的发生是由于细胞的异常增殖，主要表现为自主性生长的生物学行为。 一般情况下，正常细胞的增殖和凋亡维持着组织中的细胞总数的动态平衡。一旦 细胞增殖异常或凋亡异常，均可导致细胞的恶性转化，因此对细胞的增殖和凋亡 的调控的研究，是生命科学研究的热点之一【8 】。长期的研究证明，肿瘤的发生是 一种多因素、多阶段、长期相互作用的过程，其机制极为复杂。越来越多的研究 表明，癌基因如a p l ，抑癌基因j z n p 5 3 是决定细胞凋亡的重要因素。因此，细胞 凋亡与肿瘤关系密切。 1 2 1 细胞凋亡的表现 细胞凋亡最早由英国研究者k e r rj f 在1 9 7 2 年提出【9 j ，用于形容一种不同于坏 死的细胞死亡，并认为是一种程序性细胞死亡( p r o g r a m m e dc e l ld e a t h ，p c d ) 的 组织学形式。严格来说，细胞程序死亡是一个功能术语，在一个多细胞生物体中， 细胞死亡是个体发育、生长直至衰老整个生命过程中的一个预定的并受到严格控 制的主动的死亡。而细胞凋亡则是一个形态学术语，描写细胞凋亡与细胞坏死不同 的形态特点。尽管许多细胞凋亡过程代表了真正的程序细胞死亡，但并不能说所 有的程序性细胞死亡都是凋亡【1 0 , 1 1 】。细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过 程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它不是病理条件下自体 损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程l l2 j 。 凋亡细胞表面皱缩，失去微绒毛和细胞间联结，细胞表面出现卷曲，内质网扩张 并出现空腔与细胞膜相融合【1 4 。印；而胞浆中的线粒体核糖体等细胞器却保持完整 1 7 , 1 8 】。而最显著的变化发生在细胞核上，染色质迅速形成致密的新月样聚集于核 膜内面，邻近的核孔消失，核膜上发生复杂的凹陷，导致核仁碎片的产生【i 圳。细 胞膜也卷曲陷入核内，整个细胞变成一簇膜包裹的片段凋亡小体【n 睨3 j ( a p o p t o t i c b o d y ) ，它经常含有形态正常的其它的细胞器。凋亡小体很快被巨噬细 胞和邻近正常细胞所吞噬瞄4 筇】，由于只有吞噬细胞的溶酶体酶具有活性，死亡细 胞的溶酶体酶无活性，因此凋亡细胞的清除不会产生炎症反应，对周围的正常细 胞无损害【2 6 2 8 1 。凋亡细胞染色质的清除是由内源性核酸内切酶将其断裂成寡聚核 小体的d n a 片段( 1 8 0 2 0 0 b p ) ，断离发生在两个核小体核心之间，这是细胞凋亡特 征性的重要生化指标【2 圳。 6 青岛科技大学研究生学位论文 1 2 2 正常细胞凋亡的意义 细胞凋亡是许多生命体生命活动中不可缺少的正常生理过程。细胞凋亡可以 清除无用的或多余的细胞，还可以清除异常、衰老甚至有害的细胞。因此凋亡对 于维持细胞增殖和细胞死亡在机体的发育和生命平衡非常重要。许多有害因素可 以破坏机体的平衡，这些因素可以分为两类，一类是破坏细胞凋亡的调控过程， 可以引起肿瘤等疾病；另一类是具有触发细胞凋亡，引起一些老化性疾病等因素。 因此，研究细胞凋亡对于控制这些外来因素对细胞增殖分化平衡的破坏，减少肿 瘤的发生，防止生命体的过早老化，提高人们的生活质量具有重要意义。 1 2 3 线粒体在凋亡中的作用 线粒体在细胞中有很多重要的功能，除了产生能量，线粒体还参与了中间 代谢、离子的动态平衡、脂类、氨基酸和核甘酸的合成、活化转运过程，细胞迁 移和细胞增殖过程【3 0 。3 2 1 。近来的研究证实线粒体是细胞凋亡的主要调节者【3 引。线 粒体的机能障碍是癌细胞的重要特征。正常与癌细胞之间的线粒体的差异己在在 显微镜下、分子水平、生物化学、代谢和基因水平等方面得以证实。显微镜下已 证实在嗜酸瘤细胞肿瘤的细胞中线粒体增生i 3 引。有报道，在乳腺良、恶性肿瘤之 间其线粒体细胞色素氧化酶i i 的表达有差异【3 4 1 。卵巢癌、甲状腺癌、肾癌、肺癌、 结肠癌、胃癌、膀胱癌、头颈部的恶性肿瘤、白血病和乳腺癌等都发现其线粒体 d n a 基因突变较常见【j 引。 越来越多的证据表明，线粒体在细胞凋亡中起最基本的作用。现在人们普遍认 为，线粒体是凋亡的执行者。体外实验发现，线粒体内膜在一定条件下能够形成一 种通道，即通透性转运孑l ( p t p ) ，它是一种有多种蛋白组成的复合体，主要允许 不大于1 5 k d 的小分子物质通过。因p t p 的开放使线粒体基质和胞浆内的离子得以 平衡流动，使原来存在的线粒体内膜跨膜电位( al v m ) 被驱散，影响呼吸链的正 常运行，ak u m 异常会严重影响线粒体功能、基因转录和蛋白质合成。ak u m 异 常还会导致氧化磷酸化脱耦联、氧自由基生成增多和a t p 衰竭，从而诱发细胞凋 亡。在凋亡过程中对线粒体功能的研究发现，细胞凋亡早期形成p t p ，对1 5 k d 的分子( 如质子、c a 2 + 、g s h 等) 通透性增加，进而促进p t p 开放，线粒体跨膜电位 l i t m 降低，继之出现不可逆细胞凋亡p6 | 。研究表明，p t ( p e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o n ) 介导线粒体膜电位下降，胞内活性氧过量产生等，是凋亡早期细胞发生的不可逆 变化，p t 是细胞凋亡的调节物，而p t 孔则可能作为细胞死亡的开关，一旦打开， 线粒体电位下降，细胞不可逆地凋亡。 w m ，即线粒体膜电位，是由于线粒体内膜两侧质子及其他离子不对称分布造 7 l ，2 ，3 一三唑化合物诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究 成的，为保持线粒体功能所必需。一些阳离子亲脂荧光素，r h o d a m i n e 3 d i o c 6 ( 3 ) ， j c l 等能扩散到线粒体基质中，其扩散量能反映v m 的变化。用细胞荧光仪测定这 些染料的扩散量，可得出一个细胞或线粒体v m 的变化。在凋亡早期，这些染料的 扩散量减少，说明at i - r m 降低。这种变化早于细胞凋亡的其他特征性变化，如核 d n a 片段的出现，磷脂酰丝氨酸( p h o s p h a t i d y l s e r i n e ，e s ) 夕b 翻。体外细胞培养过程 中，具有低av m 的细胞，即使消除凋亡诱导因素，细胞也会发生凋亡，说明低 v m 是细胞凋亡不可逆转的标志。而aw m 完全丧失只有在将要凋亡的细胞中出 现，所以aw m 的正常与否可作为凋亡的特征性标志。而av m 的改变亦与线粒 体膜通透性的改变紧密相关。 1 2 4 r o s 诱导凋亡的意义 活性氧作为细胞调控中的一种信号分子，诱导细胞凋亡，目前已经为广大生 命科学的学者所接受，并认为其可能是机体本身的种平衡调节机制，维持生命 体的正常活动和发展。r o s 在细胞凋亡过程中扮演两种角色【3 7 】：作为外界诱因， 活性氧诱导细胞凋亡，然而当其他诱因在体内激发细胞凋亡时，活性氧是这一过 程中的产物，然后作为信号分子，其有调节细胞凋亡作用，但其作用机制目前尚 无定论。许多文献报道，在病理状态下，活性氧对细胞凋亡的诱导的意义可以分 为两种情况：细胞正常的凋亡调控机制受到破坏，加入适量的活性氧使细胞从异 常的信号传导状态逆转到正常增殖分化的平衡状态：当细胞发生病理状态下的异 常凋亡时，改变活性氧的含量能可延缓凋亡的发生；通过调节外因而调控体内活 性氧的含量，进而发挥研究活性氧对细胞凋亡的调控作用。此外，还可以调节活 性氧调节的相关因子来改变其信号途径，从而实现细胞生理功能的正常化。 因此，活性氧诱导凋亡的意义主要有三方面：正常细胞凋亡，在细胞基因 的程序化控制下，实现细胞新陈代谢，处理衰老的细胞，就是由r o s 诱导完成的。 在病理条件下，r o s 诱导细胞凋亡发生是许多细胞损伤功能下降的主要机理之 一。深入探讨细胞凋亡的调控机制，尤其促进r o s 诱导肿瘤细胞凋亡，无疑对 肿瘤的治疗具有重要意义。 随着人们对活性氧的型号作用的研究，人们发现，r o s 在细胞凋亡的调控中 有着极其重要的作用，只要给予适量的r o s ，就可导致细胞凋亡【3 引，而抗氧化剂 n a c 和过氧化氢酶均可抑制凋亡，这种抑制作用从反面证实了活性氧可以介导凋 亡e 3 9 】。使用可诱发早老性痴呆( a d ) 的p 淀粉样蛋白( a p ) 作用于转染了b e l 。2 基因的 皮层神经细胞及对照细胞【4 0 】，发现转基因细胞凋亡发生大大低于对照组。因为 b c l 2 被认为是通过抗氧化而起作用，因此研究者认为a p 诱导细胞凋亡是r o s 介 导。活性氧能破坏细胞的膜结构和功能，影响细胞的核酸和蛋白质的代谢，导致 8 青岛科技大学研究生学位论文 细胞的调亡和死亡。活性氧对细胞的调亡的调控作用，目前有以下几种观点：( 1 ) 活性氧直接诱导调亡；活性氧直接与细胞膜上的脂肪酸、胆固醇，发生醋质过氧 化，导致膜上蛋白分布紊乱而致细胞调亡，还可对氨基酸修饰和与肽键反应来攻 击蛋白，甚至直接使脱氧核糖脱氢而产生自由基影响d n a 稳定性，而导致细胞调 亡。但目前也有研究认为，活性氧诱导细胞凋亡并非对d n a 的直接损伤所致【4 。 ( 2 ) 活性氧激发体内代谢变化而诱导细胞调亡：活性氧对线粒体膜的损伤导致 线粒体膜渗透性转换( p n 。p t 的发生致细胞色素c 和c a 2 + 释放。并参与天冬氨酸 特异的半胱氨酸蛋白酶( c a s p a s e ) 的激活，从而诱发调亡。活性氧造成线粒体和 内质网c a 2 + 迁移和质膜c a 2 + 。a t p a s e 失活而导致c 十升高，c e + 升高后激活非依赖 性核酸内切，还可能引起微丝解聚成球形肌动蛋白，绽细胞骨架破坏，从而导致 细胞调亡。活性氧影响信号转导和基因表达。现已发现，几科与d n a 转录有关 的因子都含有半胱氨酸残基，女h f o s 和j u n 基因家族在d n a 的结合区都有一个保守 的半跳氨酸残基，该残基极易被氧化而调亡。此外活性氧能直接或间接激活一些 酶如酪氨酸蛋白激酶、蛋白激酶c 等这些酶作为信号分子参与许多相关的信号途 径，这些途径( ! z i ：i m a p k 途径) 可进一步激活n f k b 和a p 1 而诱导调亡。 1 2 5 肿瘤细胞的永生化及肿瘤细胞凋亡的意义 肿瘤是一种永生化的细胞，特点就是永无休止的繁殖，不发生老化。肿瘤细 胞的永生化是由于正常细胞的程序性死亡的调控发生了紊乱，导致细胞发生无限 制增殖。而肿瘤细胞凋亡同正常细胞一样需要有诱发因素存在，肿瘤细胞凋亡调 控过程伴随着。一些癌基因和抑癌基因的异常表达，而这些基因在正常细胞中的表 达也是调控凋亡的重要因素，如抑癌基因p 5 3 和凋亡抑制因子b c l 2 等：在肿瘤细胞 凋亡的信号调控过程中发挥重要的作用。由此可见，肿瘤细胞凋亡过程中与正常 细胞一样，需要信号分子的调控【4 】。近年来的研究表明，诱导肿瘤细胞凋亡是目 前肿瘤研究的一个重要内容，在控制肿瘤的生长和调节肿瘤剐各种治疗如放疗和 化疗的反应中，凋亡都充当重要的角色。诱导肿瘤细胞发生细胞凋亡是肿瘤治疗 研究的新途径【4 3 1 。其基本特点在于不直接杀死肿瘤细胞，而是诱导其发生凋亡， 从而达到清除肿瘤细胞的目的。在细胞凋亡和肿瘤的研究基础上，现代医学研究 ，证明，许多药物可以通过干扰肿瘤细胞的新陈代谢、增殖等途径，最终诱导触发 肿瘤细胞分化发生凋亡。药物治疗达到一定的剂量可引起肿瘤细胞坏死，而当刺 激水平降低时，可能导致肿瘤细胞凋亡。凋亡凋控在分子水平上的发展，尤其发 现凋亡受到特定原癌基因的蛋白产物及某些抑癌基因产物等的调控，大大扩展了 其在肿瘤学研究上的意义。 综上所述，我们可以这样认为，细胞凋亡是一个复杂的信号传导过程，其在 9 l ，2 ，3 一三唑化合物诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究 细胞的分化和增殖过程中发挥重要的作用，而活性氧作为一个信号分子在细胞凋 亡过程中起重要的调控作用；一旦这一过程受到破坏，一些原癌基因过度表达， 引发肿瘤的产生，诱导肿瘤细胞凋亡是目前肿瘤研究的一个重要内容。 目前，国内外科学家对肿瘤的研究集中于通过诱发癌细胞的凋亡，抑制细胞 坏死，影响细胞的线粒体功能，在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白表达这四个 方面来进行新药的研发和对肿瘤发生发展机制的探讨。本实验研究三唑类化合物 诱导肿瘤细胞凋亡的机制以及相关的调控机制，为三唑类化合物防治肝癌提供了 更广泛的理论和实验依据。 1 3 抗肿瘤药物的研究进展 原发性肝癌( p r i m a r yc a r c i n o m ao f l i v e r ) ) 在我国属高发病率肿瘤，为实体瘤 中预后最差的恶性肿瘤之一，其生存期短，生存质量差，素有“癌中之王”之称。 我国每年大约有1 l 万人死于肝癌，居癌症死亡原因的第3 位，占全世界肝癌年死 亡数的4 5 4 4 。 经过近半个多世纪研究，有关肝癌的病因、诊断及治疗均取得了显著的进步。 近年来，分子肿瘤学、分子药理学的发展不断地阐明肿瘤本质，而且大规模快速 筛选、组合化学、基因工程等先进技术的发明和应用，加速了药物开发进程，抗肿 瘤药物的研究与开发已进入了一个崭新的时代【4 引。在病因方面，乙型和丙型肝炎 病毒、黄曲霉毒素、饮水污染、饮酒和遗传易感性等，已取代了旧的肝癌病因概 念；基础研究由整体水平、细胞水平进入到分子水平，各种癌基因和抑癌基因的 发现，使人们对肝癌的发生又有了新的理解；甲胎蛋白( a f p ) 的合理应用和医学 影像学的飞速发展，使肝癌诊断由“难”变“易”，无症状的小肝癌得以发现； 尤其在肝癌的治疗方面，亚临床肝癌的手术切除，大幅度提高了肝癌的疗效，给 人们带来了鼓舞和希望。尽管早期手术切除是目前治疗肝癌最有效的方法，但由 于肝癌起病隐匿，病情发展迅速，7 0 - - 一8 0 患者在发现时己失去手术机会，因 此多种治疗手段，如化疗、介入治疗( 如栓塞化疗) 、放疗、免疫治疗及近年发 展的生物治疗，甚至肝移植等都被用作肝癌治疗的手段。 其中，化疗是利用细胞毒性药物阻止肿瘤细胞的增殖和( 或) 诱导凋亡，其 优势在于可以通过各种途径使化疗药分布到全身各个部位，以杀灭手术和放疗难 以杀灭的亚临床灶、己形成的转移灶、淋巴和血管内己扩散的肿瘤细胞，达到治 疗肿瘤的目的。全身性化疗仍是目前肝癌常用非手术疗法之一m j ，但是化疗药在 杀伤癌细胞的同时，对正常细胞也有明显毒副作用，常常导致患者无法耐受。多 年来，人们一直在寻找高效低毒的抗癌药物或联合用药方法，希望能够克服化疗 1 0 青岛科技大学研究生学位论文 药物的毒性及耐药性，本实验试图在这方面作些尝试。 寻找有效的抗癌药物与方法，彻底攻克癌症，是世界医学界重要的研究课题。 目前国内外关注的抗肿瘤作用的新靶点和相应的新型抗肿瘤剂型或手段有多种， 本文仅就其中部分热点简述如下。目前或在相当一段时期内，传统细胞毒性药物 仍将是肿瘤药物治疗的主体。近1 0 年来，细胞毒性抗肿痛药物的研究和开发有了 显著的进展。 1 3 1 以细胞信号转导分子为靶点的抗肿瘤药物 细胞的活性受外部信号调控，外部信号转导到细胞内部引起细胞内的一系列 反应，这一过程称为信号转导。肿瘤的发生、发展与细胞增殖、凋亡等信号转导 通路中某一个环节异常密切相关，在肿瘤生长、转移过程中起重要作用的一些生 长因子及其受体都是通过m a p k 信号转导通路起作用的。细胞信号转导异常， 导致恶性肿瘤快速增值，无限制生长。针对m a p k 信号转导通路的各个环节研究 m a p k 通路特异性抑制剂，从理论上讲，可以从根本上防治恶性肿瘤，成为了抗 癌药物的研究热点之一。这类药物中最活跃、进展较快的药物如：蛋白酪罗氨酸激 酶( p t k ) 抑制剂、法尼基转氨酶( f t a s e ) 抑制剂等【4 。目前p t k 抑制剂主要有 黄酮类、肉桂酰胺类、苯乙烯类、芪和苯胺类、二底物型抑制剂、吡哆嘧啶类、 吡哆并喹唑啉和联硒双吲哚类等。f 陷e 抑制剂( f t i s ) 可分为：法尼基二磷 酸( ，f p p ) 竞争性f t a s e 抑制剂( f p p c o m p e t i t i v ef t i s ) ，c aa x c o m p e t i t i v e f t i s 。 1 3 2 新生血管生成抑制剂 原发肿瘤的生长和转移是依赖于新生血管生成的。肿瘤既可通过肿瘤血管从 宿主获得营养，又可通过血管向宿主输送转移细胞，并在机体的其他部位继续生 长和诱导血管形成，导致肿瘤转移。肿瘤的血管系统已成为一个崭新的、有希望 的抗肿瘤治疗靶点。人们正致力于开发和研究能破坏或抑制血管生成，有效地阻止 肿瘤的生长和转移的药物，这类药物称为t a 抑制剂，是当今新型抗肿瘤药物研究 最活跃的领域之一【4 8 】。t a 抑制剂治疗具有许多优势：( 1 ) 肿瘤发生时，血管形成已 被启动，故有良好的特异性；( 2 ) 血管内皮细胞暴露于血流中，药物能直接发挥作用， 故用药剂量小、疗效高、不良反应小；( 3 ) 内皮细胞基因表达相对稳定，不易产 生耐药性。目前已有2 0 余种t a 抑制剂分别进入i 至i i i 期临床试验。 1 3 3 端粒酶抑制剂 端粒酶是一种r n a 聚合酶；能以本身r n a 为模板，在染色体末端合成六聚 1 ，2 ，3 一三唑化合物诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究 脱氧核苷酸t t a g g g 的重复序列，以补偿细胞分裂时的染色体末端缩短，解决“末 端复制问题”。端粒酶存在于绝大部分正常人体细胞，但在肿瘤细胞中广泛表达， 提示它可能为恶性肿瘤细胞无限增殖所必需。抑制端粒酶的活力，将有可能阻止 肿瘤细胞恶性增殖。因此，端粒酶抑制剂有望成为一种高效低毒的新型抗肿瘤药 4 9 ，s o o 1 3 4 反义药物 反义寡核苷酸( a s o d n ) 具有特异性抑制基因表达的能力。随着快速基因 克隆、测序技术及快速自动d n a 化学合成技术的出现，a s o d n 的研究已进 入蓬勃发展时期。针对肿瘤的反义药物的研究较早，迄今为止已有十几种a s o d n 试用于临床。选择的反义靶点主要包括：癌基因类：c m y c ，c m y b ，b c l 2 ，n r a s ，k r a s ，h r a s ，c j u n ，c 1 0 s ，c d c 一2 和c m o s 等； 宿主基因类： 多药耐药基因、周期素( c y c l i n ) 、前胸腺素、t 细胞受体、表皮生长因子受体、 蛋白激酶c 等；细胞因子类：i l 2 ，i l 1q ，i