（无机化学专业论文）人cuznsod在毕赤酵母中克隆表达的研究.pdf

摘要 超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，简称s o d ) 在生物体内起着非常 重要的作用，它是一类广泛存在于生物体的各个组织中的金属酶。巴斯德毕赤 酵母( p i c h i a p a s t o r i s ) 是一种甲基营养型酵母。 本文构建表达入c u , z n s o d 的重组酵母工程菌株，在摇瓶水平探索不同外 界条件对培养上清酶活性的影响，测试目的蛋白酶的稳定性。根据酵母密码子偏 好性，化学合成人c u 洳一s o d 基因，克隆至真核表达载体p p l c g k 中，将 p p i c 9 k s o d 线性化后电转化毕赤酵母g s l l 5 。经p c r 鉴定阳性转化子，用g 4 1 8 筛选高拷贝转化子，并用甲醇诱导表达。表达产物进行s d s p a g e ( 1 2 ) 和 w e s t e r nb l o t 检测。用l o w r y 法测定蛋自含量，用改进的邻苯三酚法测定目的蛋 白酶活性，测定不同外界条件下培养液上清中的酶活性，测试粗酶液对化学试剂， 温度和p h 的稳定性。s d s - p a g e 和w e s t e r n b l o t 结果显示，表达目的蛋白质的 相对分子量为1 8 k d 左右，低糖基化，目的蛋白占外分泌蛋白总量的2 7 ，l o w r y 法测定目的蛋白最高表达量为9 1 m g l 。活性测定实验结果表明，最佳条件下培 养液上清的酶活性为3 3 4 u m l ，粗酶对氯仿和乙醇稳定，对h 2 0 2 不稳定，粗酶 对温度和p h 都较稳定。最佳发酵条件初步确定为初始p h 6 0 ，维持甲醇浓度 1 + 5 ，持续培养9 6 小时。在毕赤酵母g s l l 5 细胞内成功表达了具备酶活性的人 c u , z n - s o d 。初步确定了发酵的的最佳条件和粗酶液对化学试剂，温度和p h 的稳 定性。 关键词人c u ，z n - s o dp p i c 9 k 毕赤酵母g s i1 5 克隆表达稳定性 s u p c r o x i d ed i s m u t a s ep l a y sav e r yi m p o r t a n tr o l ei nt h eb o d y , i ti sam e t a l e n z y m ew h i c hi sw i d e l yn n e a di nt h ev a r i o u so r g a n i z a t i o n so r g a n i s m 8 p i c h i ap a s t o r i s i sa n u l r i t i o n - t y p ey e a s t i nt h i st y p e ，t os t u d yt h ee x p r e s s i o no fh u m a nc u , z n - s o di np i c h i ap a s t o r i s , e x p l o r et h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o re x p r e s s i n gh u m a nc u , z n - s o da n dd e t e r m i n et h e m b m t yo fa ( p s s e ds o dt oc h e m i c a lr e a g e n t s , t e m p e r a t u r ea n dp h s y n t h e s i s h u m a nc u , z n - s o dg e n eb yc h e m i s t r ym e t h o d ，t h eg e n ew a sh l s e r t e di n t ot h e p i c h i ap a s t o r i se x p r e s s i o nv e c t o rp p i c 9 kw h i c hc o n t a i n e d4 蚴p r o m o t e ra n d s 黜n i n gs i g n a lp e t i d e s ，t h er e c o m b i n a n te x p r e s s i o n # a s m i dp p i c 9 k s o dw a s c o n s 心u c t e da n dt r a n s f o r m e di n t og s l1 5 t h ei d e n t i f i e dr e c o m b i n a n tg s l1 5 s o d w a sf e r m e n t e di nf l a s k s f u r t h e r m o r e ，t h ee x p r e s s i o nc o n d i t i o n sw e r ee x p l o r e df o rt h e t i m eo f e x p r e s s i o n , p ha n df i n a lc o n c e n t r a t i o no f m e t h a n o lt h es t a b i l i t yo f e x p r e s s e , t s o dt oc h e m i c a lr e a g e n t s t e m p e r a t u r ea n dp hh a v eb e e nt e s t e d s d s - p a g es h o w e d t h a tt h ep r o d u c tw i t hr e l a t e dm o l e c u l a rw e i g h to f1 8k dw a ss e c r e t e di n t ot h e s u p e m a t a n ti nt h ec u l t u r e w e s t e r nb l o ta s s a yf u r t h e rp r o v e dt h a th u m a nc u , z n - s o d e i d s bi nt h ee x p r e s s e dp r o t e i n so f g s l l 5 s o d t h eh i g h e s tq u a n t i t yo fs o di nt h e s u p e r n a t a n ta c h i e v e da t9 1 m g l t h eh i g h e s ta c t i v i t yo fs u p e m a t a n tr e a c h e aa t 3 3 4 u m 1 t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sa r ea tp h 6 0a n d1 5 ( v v ) m e t h a n o l c o n c e n t r a t i o na n dc u l t i v a t i o nf o r9 6h o u r s t h ee x p r e s s i o no fs e c r e t e dh u m a n c u , z n s o dw i t hb i o l o g i c a la c t i v i t yw a ss u c c e s s f u l l ya c h i e v e di np i c h i ap a s t o r i s e x p r e s s i o ns y s t e m t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o ne o n d i t i o m 觚dt h es t a b i l i t yo fe x p r e s s e d s o dt oc h e m i c a lr e a g e n t s ，t e m p e r a t u r ea n dp hh a v eb e e nd e t e r m i n e d k e y w o r d s ：h u m a nc u ，z n - s o d p p i c 9 k p i c h i ap a s t o r i sg s l l 5c l o n e x p r e s s i o ns t a b i l i t y 中英文缩写词表 英文缩写 s d s p a g e s d s a m p h2 0 z b p o d p b s d m s o c a t m c s r p m s o d m e g f a o x h r p t e 匝d e d t a g s h p x p e g 中文全称 s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基硫酸钠 氨苄青霉素 双氧水 碱基对 光密度 磷酸盐缓冲液 二甲基亚砜 过氧氢酶 多克隆位点。 每分钟转数 超氧化物歧化酶 鼠内皮生长因子 醇氧化酶 辣根过氧化物酶 n ，n n ，n 四甲基乙二胺 乙二胺四乙酸 谷胱甘肽氧化酶 聚乙二醇 长春理工大学硕士学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的硕士学位论文，人c u ，z n - s o d 在毕赤酵母中克隆 表达的研究是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写 过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方 式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：垂：f 逗墨生窭年_ _ l n i n 长春理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“长春理工大学硕士、博士学位论文版 权使用规定”，同意长春理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的 复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权长春理工大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存和汇编学位论文。 作者签名： 塞4 逗垒塑墨年4 月且日 指导导师签名： 壹簋垫年j 月趣日 第一章绪论 1 1 活性氧与s o d 机体内自由基主要来源于细胞生化反应，此外，紫外线照射，电离辐射和 环境污染等因素也可诱发机体产生自由基。自由基对正常生命活动的许多重要 反应必不可少，它参与生物活性物质的合成，解毒反应，吞噬细胞和杀灭细菌 的过程等。但是过量的自由基也可引起广泛的损伤效应，自由基通过传递和增 殖，愈来愈多的自由基在细胞内的出现会损伤细胞，引发各种疾病。机体代 谢中不断产生自由基，种类繁多，其中以活性氧最多。在生物体内，氧分子可 以通过单电子接受反应，依次转变为0 2 ，h 2 0 2 与o h 等中间产物。由于这 些物质都是直接或间接地由分子氧转化而来，而且具有比分予氧更活泼的化学 反应性，遂统称为活性氧，其中0 2 。和o h 为氧自由基。 生命离不开氧，人们时时刻刻在与氧打交道。人类为了适应氧化性环境， 在演化过程中不仅利用氧的氧化作用进行物质代谢和能量代谢，而且还利用活 性氧消灭入侵的微生物，同时不停地建立和完善对氧化性损伤的保护机制，尽 管如此，人体对活性氧的防御系统还不完善，氧胁迫仍然危害人类健康，许多 慢性损伤性疾病( 肿瘤、心血管病、退行性病变、各种炎症和衰老) 都与氧化 性损伤有关，甚至有时活性氧的损伤会造成或大或小的病理变化，从感冒到癌。 1 9 6 9 年m c c o r d 和f r i d o v i c h 3 1 发现超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e 简写 为s o d ) 并研究了其生物学意义之后，揭示了氧效应的自由基机理。说明0 2 。的 形成是氧毒性的主要因素，提出了氧毒性的超氧自由基( 0 2 ) 学说，极大地 促进了对氧代谢深入系统的研究。氧在代谢过程中要产生活性氧，由于0 2 是 0 2 被一个电子还原生成，而其它的活性氧是通过0 2 产生的，所以0 2 是造 成氧毒性的主要物质。超氧自由基被公认为是人体细胞的“杀手”，是引起衰 老、肿瘤等严重疾病的罪魁祸首。 5 0 年代中期，美国科学家就提出将氧的损伤效应归因于氧自由基的形成。 以后的实验证明，不但在高氧条件下氧有毒性，即使在正常氧的环境中，亦存 在氧的损伤效应。很多研究表明，由于o f 自由基可使细胞质和细胞核中的核 酸链断裂，损害d n a 可导致细胞突变，引发肿瘤、炎症、衰老、血液病以及心、 肝、肺、皮肤等方面病变的产生i 羽。氧自由基可损伤蛋白质，可使蛋白质的转 换增加，作用于s h 可使某些酶的活性降低或丧失，攻击未饱和脂肪酸可引起 脂质过氧化，其氧化产物可引起s h 氧化、酶失活、膜功能受损、干扰膜的运 送功能等。 在正常情况下活性氧不会对细胞构成危害，因为生物体内有一个防御系统： 抗氧化酶体系，它们各尽其能，互相协同，及时清除多余的氧自由基，使自由 基维持在一定限度内对机体有利而无害 4 1 。氧自由基的酶防御体系包括以下三 种：超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) ，过氧氢酶( c a t a l a s e ，c a t ) ， 谷胱甘肽氧化( g t u t a t h i o n e ，p e r o x i d a s e ，g s h p x ) ， 。 人体实验表明，正常人血液中s o d 含量为9 0 m g l ，g s h - p x 为9m g l ，谷 胧甘肽氧化酶为lm g l ，可见s o d 对人体的重要性。动物实验也证实，不同个 体间s o d 活力水平差异很小，只有1 0 左右的标准误差，但不同种类间g s h p x 活力水平最大与最小差5 0 多倍，c a t 相差1 0 0 多倍，因此三种酶相比，s o d 是生物体内酶性保护系统的主要代表，它无疑是防御体系中的关键酶。 1 2s o d 的分布及种类 超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，e c i 1 5 1 1 ，s o d ) 是1 9 3 8 年m a m 等人【5 l 首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对s o d 的研 究己有六十多年的历史。1 9 6 9 年m c c o r d 等1 6 重耨发现这种蛋白，并且发现了 它们的生物活性，弄清了它催化0 2 发生歧化反应的性质，所以正式将其命名 为超氧化物歧化酶。 s o d 是生物体预防氧毒性的防线，广泛存在于各种生物体内，主要存在于 胞液和线粒体基质中，是防御生物体氧化损伤的种十分重要的酶 。它的作 用底物是超氧阴离子自由基o f ，可将其催化歧化为氧气和过氧化氢8 o l 。这 种酶在保护生物细胞免受超氧自由基和由其形成的活性氧类( 例如h 2 0 2 ，o h ) 的毒害方面起着重要作用。 超氧化物歧化酶是一种金属酶，根据这种酶活性中心金属辅基的不同，人 们往往将其分为三大类：第一类含c u 离子和z n 离子( 简称c u ，z n s o d ) ，它不 仅可以从大多数的包括哺乳动物的组织和n e u r o s s p o r ac r a s s a l 9 1 在内的真核生物 中得到，而且也存在于一些诸如c a u l o b a c t e rc r e s c e n t u s 和h a e m o p h i l u s l n f l u e n z a e t l l l 等原核生物细胞中。图l 所示为天然c u , z n s o d 活性中心结构【l l j ： n o 图1 天然c u j z n s o d 活性中心结构 f i 9 1 t h es t r u c t u r eo f n a t u r a lc u , z n - s o da c t i v ec e n t e r 第二类含f e 离子( f e s o d ) ，存在于包括e c o l i1 1 2 - 1 6 和m e t h a n o b a c t e r i u 所 b w a n # 1 刀等原核生物细胞内；第三类含有m n 离子( m n s o d ) ，存在于真核细 胞的线粒体和包括e c o l i 1 8 1 在内的原核细胞内。一般来讲，c u , z n s o d 属于真 核生物酶，而f v s o d 和m n - s o d 是原核生物酶。 1 9 9 6 l zh o n g - d u ky o u n g 等 1 9 自s t r e p t o m y c e , s p i m s n u - 1 _ 和js t r e p c o e l i c o l o r a t c c1 0 1 4 7 的细胞质中提取得到了n i s o d ，之后在s t r e p g r i s e u s 和s t r e p 1 a v e n d u l a e 中也发现了该酶，并认为这种新型的s o d 在s t r e p t o m y c e s 属中广泛 存在。此外，有人在牛肝中发现还存在一种c o ，z n s o d1 2 0 1 。由此可见，s o d 的 家族已不再是“三口之家”，而是有了新成员的加入。正是由于金属辅基的多 样性，在生命体内一旦某类s o d 的合成由于其金属辅基的缺乏而受阻时就可以 由另一类s o d 来补充，从而稳定了s o d 在预防氧毒性中的地位。 1 3s 0 1 ) 的应用 。 s o d 是超氧阴离子自由基的天然清除剂，自s o d 发现以来，在制备、性 质研究以及实际应用等方面均取得了重大进展，并有广泛的应用前景。目前在 医学、化妆品、保健食品添加剂等方面得到了广泛的应用。 1 3 1s o d 的i 临床应用 ”( 1 ) s o d 与自身免疫病 自身免疫病的病变过程与0 2 。和s o d 很有关系。m i c h e l s o n 【2 l l 认为其可能 的致病机理是：由于特殊血清断裂因子的作用或其他细胞过程中产生了大量 0 2 和o h 所至，据此，用s o d 治疗自身免疫病应是较为有效的，m i c h e l s o n l 2 2 1 进行的体外实验也恰好证实了这一点，实验表明s o d 能有效的抑制病人淋巴细 胞染色体的断裂速度，也能有效的抑制血清断裂因子的作用。同时利用脂质体 s o d 外涂法对c r o h n 氏病患者和皮肌炎病人进行治疗，均取得了明显的疗效， 并认为这种疗法还有可能推广应用于硬皮病、红斑狼疮、进行性慢性关节炎， 出血性直肠炎以及其他c r o l m 氏病和皮肌炎的治疗。 ( 2 ) s o d 与癌 到目前为止，还不能将s o d 单独应用于癌症治疗的崎床工作，但却能将 s o d 与放射疗法联合应用于癌症的治疗。放射治疗通过放射线直接或间接的杀 死癌细胞来达到其治疗目的，问接作用过程中有大量活性氧自由基的参与导致 它一方面杀死癌细胞，另一方面也会杀死正常细胞，引起严重的副反应。因此 在放疗过程中引入s o d 可以有效抑制放射线对正常组织的间接杀死作用，从而 减少副反应，而癌细胞的杀死作用又不会受到大的影响。另外，脂质体s o d 还 能用来治疗由放疗和放射事故引起的放射病，临床证明效果明显。 ( 3 ) s o d 与骨髓损伤 在癌化疗时，由于药物的毒性往往会引起骨髓损伤等副作用。通过电离辐 射的生物学效应和s o d 的辐射防护作用的研究表明，化疗后的骨髓损伤可由自 由基链式反应中产生的0 2 _ 引起。因此s o d 处理有利于损伤的恢复，提高白 血球的数量。这里s o d 的主要作用是催化对0 2 的破坏防止骨髓进一步受 0 2 的伤害，从而加速骨髓和白血球量的恢复，同时v i l l a s c n o r l 2 3 1 提出s o d 对 骨髓也有明显的刺激作用，他的许多临床实验表明s o d 处理对加快白细胞数目 的恢复的有效性。另外，s o d 对由非化疗引起的骨髓损伤也有明显疗效。 ( 4 ) s o d 与炎症 般认为局部氧量过少或某些病变引起溶酶体酶的释放，造成细胞死亡， 为处理掉细胞碎片，大盘多形核自细胞( p m n s ) 进入病变处。进入病变处的多 形核自细胞由于特殊代谢刺激物的作用其代谢被激发，产生大量的o f 。产生 的0 2 和与0 2 。有关的自由基一方面破坏其它细胞，另一方面又进攻p m n s 本身，造成p m n s 的大量死亡，结果溶酶体酶大量释放，进一步杀死细胞，造 成骨、软骨的破坏，导致炎症和关节炎。可见，发炎过程是同0 2 密切联系的。 s o d 既可以清除0 2 ，又可在清除0 2 。的过程中产生氧分子，从而改变 4 局部氧量过少的状况，因而能有效的阻止发炎的进一步发展。并且用s o d 消炎 不会损伤软骨，这一点要优于非类固醇类和类固醇类消炎药物。 ( 5 ) s o d 与心肌缺血和缺血再灌流综合症【2 4 】 心肌缺血和再灌流损伤过程中0 2 大量产生，0 2 通过膜的脂质过氧化 损伤心肌细胞膜，从而导致c a 2 + 大里进入心肌细胞内产生心律失常。同时0 2 。也 损伤血管内皮细胞和心肌细胞的线粒体膜、内质网膜及溶酶体膜，从而损伤机 体的正常代谢，构成再灌综合症。这时如果注射适量的s o d ，用来消除产生的 0 2 。，就可以有效地防治综合症的出现。 ( 6 ) s o d 与老年性自内障【2 5 1 人类随着年龄的增长，体内保护机体免受自由基侵害的酶促与非酶促机能 有所降低，在眼内可产生过量氧自由基，引起眼内蛋白质，尤其是a 和晶体 蛋白质的交联而导致白内障。所以注射s o d 消除自由基，对白内障能有较好的 疗效。 ( 7 ) s o d 与肌肉疲劳 l u n d o l e s e n l 2 6 在进行关节炎的s o d 治疗时发现s o d 注射后，特别是肌肉 注射后，立即会出现一种激励作用，在很长一段时问内病人的肌肉疲劳消失。 他们认为细胞中含有的s o d 量在一般情况下足以清除正常代谢过程中产生的 0 2 ，但当肌肉高度紧张时，产生大量的0 2 。，s o d 就不足以完全消除产生 的0 2 - ，正是由于这个原因，再加上乳酸量的增加，导致了肌肉疲劳。注射 s o d 能消除肌肉疲劳，这是通过清除0 2 而起的作用。由于机体对注射后的 表性还有待迸一步研究，这种注射现在还没有普遍推广。 1 3 2 食品和化妆品方面 抗衰老是化妆品、保健食品行业的一个宗旨。以s o d 作为添加剂的化妆品 和保健品正不断涌现。有关实验证明，日光使得皮肤变黑是由于氧自由基的损 害，因此s o d 可防止皮肤衰老、阻止脂褐质的形成以及抗皱防晒。另外，由于 s o d 的抗衰老功能，s o d 口香糖、s o d 奶粉、s o d 片剂口服液等产品即将大 量投入生产。 1 4s o d 生产方式与本课题设计 由于天然s o d 来源有限，且具有异体蛋白免疫原性，外源s o d 不易被人 体接受等缺陷，使之在应用方面有很大限制，基因工程s o d 是降低成本和获得 无抗原性的人源葛o d 的有效途径。 近年来，美、日、英、德相继开发了微生物s o d 基因工程产品，并进行了 临床试验。国内也有较多研究者进行了利用基因工程技术生产s o d 的研究。张 翊等通过抽提入肝组织总r n a , r t - p c r 扩增人s o de d n a 构建含r h s o d e d n a 的表达质粒，转化大肠杆菌j f l l 2 5 进行表达研究。克隆到的r h s o d c d n a 序列与文献报道一致，在宿主菌中获得高效表达，表达水平达6 8 以上，蛋白 复性纯化工艺高效快速，纯品纯度达9 8 以上，比活性达到2 5 2 9 u m g 。陶开 华等脚1 为获得高表达人m n - s o d 的工程菌，从肿瘤组织中提取总r n a ，利用 r t - p c r 扩增人m n - s o d 的e d n a ，将克隆的基因片段插入表达载体p e t 2 8 a ( + ) 内的n e o l e c o r l 位点，转化大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) ，用p c r 及s d s p a g e 的方法筛选高表达人m n - s o d 的工程菌。结果构建成功高表达人m n s o d 的工 程菌，表达的人m _ n - s o d 相对分子质量约为2 2 ，0 0 0 ，表达量约占菌体蛋白的 3 0 ，为大量制备人m _ n - s o d 和近一步的应用研究奠定了基础。施惠娟等f 2 9 】利 用甲醇酵母表达系统，将人c u , z n s o d 的基因克隆到酵母整合型质粒载体 p p i c 3 6 k ，经转化h i s 4 缺陷型酵母g s l l 5 ，用m d 及p c r 方法筛选阳性重组 子，并用含g 4 1 8 的y p d 培养基筛选多拷贝转化子，经甲醇诱导表达，表达量 占酵母可溶性蛋白的1 4 ，比活性为7 7 u m g 蛋白。向华等进行了人 c u z n s o d 在乳酸乳球菌中的表达，采用r t - p c r 技术从人肝总r n a 中分离扩 增了o 4 5 k b 的人c u ，z n s o d 基因的e d n a 序列，克隆至乳酸乳球菌表达载体 p m g 3 6 e ，用电穿孔法将重组质粒转化到乳酸乳球菌中，获得c u , z n s o d 组成 型表达，其表达量约占乳酸乳球菌可溶性蛋白的5 以上。 目前国内已开发的s o d 绝大多数都是c u ，z n - s o d ，它们分别来自动物血、 猪肝、野生刺梨、辣椒、种子、果实、蔬菜等。另外，选育s o d 高产菌株进行 发酵生产是一种非常有价值的方法。 本课题在参考其它研究者的研究资料的基础上，设计了根据酵母密码子偏 好性改变人c u , z n s o d 基因密码子，化学合成目的基因，并将其克隆至整合型 真核分泌表达载体p p i c g k ，转染巴斯德毕赤酵母( p i e h i ap a s t o r i s ) ，将人 c u , z n - s o d 在巴斯德毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r i s ) 中实现克隆分泌表达的实验。 6 1 5 酵母表达系统 基因工程技术离不开基因表达系统，到目前为止，己发展了多种蛋白质表 达系统，包括原核生物基因表达系统和真核生物基因表达系统。比如：大肠杼 菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞和植物细胞基因表达系统。 大肠杆菌表达系统研究已十分深入，已在该系统中表达了多种蛋白。该系 统突出优点是：遗传背景和生化特性清楚，工艺简单，易操作，培养周期短， 营养要求低，生产成本低，产量高等。但是存在的问题有；缺少真核生物的蛋 白翻译后的修饰和加工，如剪切、糖基化、形成二硫键等；表达的蛋白质多形 成不溶性包涵体，需要经过复杂的复性才能恢复构象和活性：背景蛋白多，纯 化麻烦。 为克服大肠杆菌表达系统的缺点，科研工作者发展了酵母表达系统。最先 使用的是酿酒酵母，它的优点是繁殖速度快，能高密度发酵，可进行蛋白质翻 译后加工和修饰 缺点是缺乏强有力的启动子，分泌效率差，表达菌株不够稳 定，表达质粒易于丢失等等。为克服酿酒酵母的缺陷，近年来又发展了表性优 良的第二代甲醇酵母表达系统一巴斯德毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r i s ) 表达系统。 1 5 1 巴斯德毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r i s ) 表达系统的优点 ( 1 ) 具有受甲醇诱导的醇氧化酶( a l c o h o l o x i d a s e i ，a o x l ) 启动子，这是 目前最强、调控机理最严格的启动子之一。在转录水平可严格控制外源基因的 表达。 ( 2 ) 高效表达：由于毕赤酵母生长快，能够达到很高的细胞浓度，加上强 的a o x l 基因启动子，表达外源蛋白产量一般较高。 ( 3 ) 是真核表达系统，可对表达蛋白进行类似哺乳动物细胞的加工折叠和 翻译后修饰，如磷酸化、糖基化、二硫键形成等，从而使表达的蛋白具有生物 活性。 ( 4 ) 属单细胞生物，生长快，营养要求低，培养基廉价，易于操作，适合 高密度发酵。 ( 5 ) 有多种受体菌可供选择，可以进行胞内表达和分泌表达。 ( 6 ) 高稳定性：外源基因是通过质粒整合到巴斯德毕赤酵母基因组上，随 染色体一起复制和遗传，不会发生钋源基因的丢失。 7 ( 7 ) 与酿酒酵母相比，糖基化程度低，表达蛋白抗原性低，更适于做基因 工程受体。 ( 8 ) 不存在原核表达系统的内毒素残留和哺乳动物表达系统的病毒和支原 体污染等问题。 1 5 2 巴斯德毕赤酵母的生物学特性 巴斯德毕赤酵母是种甲基营养型酵母，在缺乏抑制性碳源( 如葡萄糖、 甘油) 时，能利用甲醇作为唯一碳源。首先，甲醇在乙醇氧化酶的作用下被氧 化成甲醛和过氧化氢，这步是在过氧化酶体中发生。醇氧化酶对氧的亲和力 很弱，因此巴斯德毕赤酵母代偿性大量产生这种酶，控制转录这种酶基因的启 动子，就是强启动予( a o x 启动子) ，外源基因的表达也就得以间接调控。毕赤 酵母中有两种基因编码醇氧化酶即a o x i 和a o x 2 ，a o x i 基因的表达受甲醇严 密控制，当以甲醇为难一碳源时，a o x i 基因大量表达，a o x 氧化酶可占细胞 总蛋白的3 0 以上【3 1 l ，此时在甲醇培养基上生长较快，菌株表型为m u t + ( 甲醇 利用型) 。当a o x i 基因缺失时只存在a o x 2 时，大部分醇氧化酶活力丧失，细 胞利用甲醇能力降低，细胞在甲醇培养基上生长缓慢，菌株表型为m u t 。( 甲醇 利用缓慢型) 。 a o x l 基因表达的调控是在转录水平进行的。它的调控是一个抑制机制加上 诱导机制的过程，在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时抑制基因转录， 而在以甲醇为唯一生长碳源时诱导基因转录，a o x 氧化酶开始表达，外源蛋白 质也得以间接被诱导表达。 现在广泛应用的大多数巴斯德毕赤酵母是通过对野生型石油酵母y 1 1 4 3 0 进行突变改造而来。根据a o x 基因的不同，受体菌主要可分为三种：g s l l 5 ： 含有a o x l 和a o x 2 基因，在含有甲醇的培养基上以野生型速率生长。( 虿) k m 7 1 ： a o x l 基因被取代，只依赖a o x 2 基因合成a o x 2 蛋白酶，甲醇代谢能力低，在 含有甲醇的培养基上生长缓慢。 m c l 0 0 3 ：a o x i 和a o x 2 基因完全缺失，不 能在含有甲醇的培养基上生长。在此基础上改造的菌株有：s m d l l 6 3 、 s m d l l 6 5 、s m d l l 6 8 ，它们都缺乏编码内源蛋白酶的基因。 1 5 3 巴斯德毕赤酵母表达载体及其整合机制 巴斯德毕赤酵母表达载体包括整合型载体和自我复制的游离载体，一般使 用的是整合型载体，已经商品化的毕赤酵母表达载体特征见图2 所示。 8 图2 毕赤酵母系统表达质粒一般特征 f i 9 2 g e n e r a lf e a t u r e so f p l a s m i df o rp i c h i a p a s t o r i se x p r e s s i o ns y s t e m 毕赤酵母系统表达质粒各区段特征及作用： ( 1 ) 5 a o x l ：1 0 0 0 b p ，包含a o x l 启动予。甲醇诱导时调控外源基因赢 水平表达，介导质粒与酵母基因组在a o x l 区整合。 ( 2 ) 信号肽序列( s i g ) ：编码n 末端信号肽序列，介导目的蛋白胞外分泌。 ( 3 ) 多克隆位点( m c s ) ：允许目的基因片段插入。 ( 4 ) 终止序列( t t ) ：2 6 0 b p ，有效终止m r n a 转录，催化m r n ap o l y a 加尾修饰。 ( 5 ) 组氨酸基因( h i s 4 ) ：2 4 0 0 b p ，野生型毕赤酵母编码组氨酸基因，介导 质粒与酵母整合，可用于筛选重组酵母转化子。 ( 6 ) 3 a o x l ：6 5 0 b p ，位于t t 序列之后的a o x l 3 端基因序列。介导 质粒与酵母基因组在0 哪区整合。 ( 7 ) 氨苄抗性基因( a m p ) ：筛选标记。 ( 8 ) 单酶切位点( n o f l ，b g l l ，s a d ，s a i l ，s m l ) ：转化前线性化位点。 载体整合到酵母基因组主要有两种方式： 单交换整合：在载体标志基因( h i s 4 基因) 或a o x l 启动子片段上的单 一位点附近整合，结果外源基因在整合位点插入到染色体，机制见图3 所示。 9 图3 毕赤酵母单交换整合机制示意图 f i 移s i n g l ee x c h a n g ei n t e g r a t i o nm e c h a n m i s mo f p i c h i a p a s t o r i s 双交换整合：载体与染色体在5 a o x l 和3 7 a o x l 发生同源重组，结果将 染色体上5 a o x l 和3 a o x i 中间基因序列置换，插入外源基因片段，机制 见图4 所示。 图4 岸赤酵母双交换整合机制示意图 f i 9 4 d o u b l ee x c h a n g ei n t e g r a t i o nm e c h a n m i s mo f p i c h i a p a s t o r i s l 5 4 表达载体p p i c 9 k 简介 p i c h i a p a s t o r i s 表达载体都是穿梭质粒，先在大肠杆菌中复制扩增，然后被 导入宿主酵母细胞。需要使产物分泌胞外的，表达载体还必须带有信号肽序列， 以引导重组蛋白进入分泌途径，使蛋白在分泌到胞外之后获得准确的构型。 p i c h i a p a s t o r i s 对外源蛋白自身的信号序列识别能力差，因此多采用酵母自身的 信号肽序列。目前i n v i t r o g e n 公司已经开发出了多种p i c h i a p a s t o r i s 表达系统分 泌型表达质粒。p p i c 9 k 就是其中的一种( 见图5 ) 。 图5 p p i c 9 k 质粒图谱 f i 9 5 m 印o f p l a s m i dp p i c 9 k 该质粒有以下特点： ( 1 ) 具有强效可调控的启动子a o x i 。 ( 2 ) 在表达载体a o x i5 端启动子序列下游，有供外源基因插入的多克隆 位点( m c s ) ，多克隆位点下游有a o x l3 端终止序列。 ( 3 ) 分泌效率强的信号肽弘因子。 ( 4 ) h i s 4 基因，为筛选转化菌株提供筛选标记。 ( 5 ) a m p 抗性基因，提供在大肠杆菌中的筛选标记。 ( 6 ) n o tl ，b g li i ，s a ci ，s a li 为质粒中单一的限制性酶切位点，可进行 质粒的线性化，便于有效地整合到宿主基因组上产生m u t + ，m u t s 型重组转化子。 ( 7 ) k a n 基因，在大肠杆菌中表现为对卡那霉素的抗性，在p i c h i a p a s t o r i s 中表现为对氨基糖苷类抗生素g 4 1 8 硫酸盐抗性，g 4 1 8 的抗性水平与载体拷贝 数相关，可以通过改变g 4 1 8 的浓度来筛选多拷贝转化予。 第二章实验方法 2 1 实验材料及仪器设备 2 1 1 质粒、菌株 大肠杆菌d h - 5 a 菌株、p p i c 9 k 真核表达质粒、p i c h i a p a s t o r i sg s l1 5 菌株 由长春生物制品研究所生物技术室保存；p u c 5 7 ，s o d 由上海生工生物技术公司 构建。 2 1 2 限制性内切酶及其他酶类 ，限制性内切酶s a li 、b g li i 、s n a bi 、n o ti 购于英国b i o l a b s 公司；t 4 d n a 连接酶购于美国p r o m e g a 公司。 2 1 3 试剂盒 d n a g e l e x t m t i o n k i t 购白杭州维特洁生化技术有限公司。 2 1 4 主要试剂 m a r k e r sd l 一2 0 0 0 ，w i d er a n g ed n am a r k e r 购于宝生物工程( 大连) 有限 公司；琼脂糖购于s i g m a 公司，溴化乙锭( e b ) 购于r o c h e 公司；蛋白质m a r k e r s 购自f e r m e n t a s 公司、b b i 公司，s d s 购自s i g m a 公司；人c u , z n - s o d 标准品 由四平市科学技术研究院提供；h r p 一鼠抗兔i g g 购于北京中山生物技术有限公 司；p e g 2 0 0 0 0 购于北京鼎国生物技术公司，氨基酸、氨苄青霉素等生化试剂均 为国产分析纯。 2 1 5 培养基 胰蛋白胨、蛋白胨、酵母提取物购自o x f o r d 公司，y n b ( 酵母含氮碱基， w 0 ) 为d i f c o 公司产品。 主要培养基配方： l b 培养基：1 9 胰蛋白胨、0 5 9 酵母提取物、1 9 氯化钠、0 i m ll m o f l n a o h 加水定容到l o o m l ，高压灭菌2 0 分钟。 l b 固体培养基：于l b 液体培养基中加入1 5 9 琼脂粉，加水定容到1 0 0 m t 。 高压灭菌2 0 分钟，冷至5 0 左右倒入无菌平腿中凝固，备用。 s o c 培养基：1 9 胰蛋白胨、o 5 9 酵母提取物、0 0 5 9 氯化钠、2 m ll m o l l 1 2 g l u c o s e 、加水定容到1 0 0 m l ，高压灭菌2 0 分钟。 y p d 固体培养基：1 9 酵母提取物、2 9 蛋白胨、o 0 5 9 氯化钠、2 m li m o l l 葡萄糖、1 5 9 琼脂粉、加水定容到1 0 0m l ，高压灭菌2 0 分钟。， 1 0 x y n b i1 3 4 9 酵母含氮碱基溶于1 0 0 0 m l 水中，过滤除菌。 5 0 0 x b ：2 0 m g 生物素溶于1 0 0 m l 水中，过滤除菌。4 。c 保存，保存期为1 年。 1 0 x d ：2 0 0 9 葡萄糖溶于1 0 0 0 m l 水中，高压灭菌1 5 分钟或过滤除菌，保存 期为1 年。 1 0 m ：将5 n d 甲醇与9 5 m l 水混匀，过滤除菌。保存期为2 个月。 1 m 磷酸盐缓冲液( p h 6 o ) ：将l m o l l 的k 2 h p 0 4 溶液1 3 2 m l 与l m o l l 的k h 2 p 0 4 溶液8 6 8 m l 混匀，用磷酸和氢氧化钾调节p h 至6 0 。 1 0 x g y ( 1 0 甘油) ：将1 0 0 m l 甘油和9 0 0 m l 水混匀后，高压灭菌或过滤除 菌。保存期为1 年以上。7 b m g y 培养基：7 0 m l 双蒸水加a a g 酵母提取物、2 9 蛋白胨后高压灭菌2 0 分 钟，凉至6 0 。c 左右加入1 0 m l 的1 0 y n b 、1 0 m l 的l m 磷酸盐缓冲液( p h 6 o ) o 2 m l 的5 0 0 b 和1 0 m l1 0 x g y 母液。 ；b m m y 培养基：7 0 m l 双蒸水加入l g 酵母提取物、2 9 蛋白胨、8 m g 硫酸铜 和o 1 6 m g 硫酸锌，高压灭菌2 0 分钟，凉至6 0 0 左右加入1 0 m l 的1 0 y n b 、 1 0 m l 的1 m 磷酸盐缓冲液( p h 6 o ) 、o 2 m l 的5 0 0 b 和1 0 m l1 0 x m 母液。 m d 固体培养基：8 0 m l 双蒸水加入1 5 9 琼脂粉后，高压灭菌2 0 分钟，于 6 0 左右加入1 0 m l 的1 0 d 、1 0 r o t 的1 0 y n b 和o 2 m l 的5 0 0 b 。倒入无菌平 皿，凝固，待用。 m m 固体培养基：8 0 m l 双蒸水n a 1 5 9 琼脂粉后，高压灭菌2 0 分钟，于 6 0 左右加入1 0 m l 的1 0 m 、1 0 m l 的1 0 y n b 和0 2 m l 的5 0 0 b 。倒入无菌平 皿，凝固，待用。 r d b 固体培养基：1 8 6 9 山梨醇溶于7 0 0 m l 水中，加2 0 9 琼脂粉，高压灭菌 2 0 分钟。冷却到6 0 后分别加入4 5 0 预热的1 0 0 m l1 0 d ，1 0 0 m l1 0 y n b ，2 m 1 5 0 0 x b ，1 0 m l1 0 0 a a ，8 8 m l 灭菌水，充分混匀后，立即铺板，冷却凝固后， 置4 c 保存。 2 1 6 主要仪器与设备 p c r 扩增仪：p t c 1 1 9 6 型，美国m jr e s e a r c h 公司； 商速冷冻离心机：j - 6 b 型，美国b e c k m a n 公司： 台式微型高速离心机：t g l - 1 6 g 型，上海医用分析仪器厂； 低温恒温槽：d c 一0 5 0 6 ，上海精密科学仪器有限公司； 核酸电泳仪；d y y 一5 ( 8 b ) ，北京六一仪器厂； 棱光紫外可见分光光度计：u v 7 5 7 c r t ，上海精密科学仪器有限公