（化学工程专业论文）地衣芽孢杆菌产β甘露聚糖酶发酵和纯化工艺的响应面法优化.pdf

中文摘要 为了对中性8 甘露聚糖酶产生菌一地农芽孢杆菌t j 1 0 1 的发酵工艺和纯化 工艺进行优化，本文贯穿运用了响应面( r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y ) 优化方 法中的因素筛选实验设计法( p l a c k e t t b u r m a n ) 和中心复合设计法( c e n t r a l c o m p o s i t ed e s i g n ) 对自控发酵罐的发酵过程、絮凝纯化条件、双水相分离和膜浓 缩进行了优化实验设计，并采用喷雾干燥手段得到固体酶制剂产品。 本文采用扩试常用的6 6 b 自控发酵罐进行分批发酵实验，对影响地衣芽孢 杼蓥发酵生产圣一甘露聚糖酶过程中鼹三个重要影响因素：搅拌速度、通气量及发 酵时间进行中心组合设计，并进行响应面分析，得到最优产酶条件：搅拌速度 6 5 8 5 8 r m i n ，发酵时间4 6 3 4 h ，通气量5 0 l m i n ，在此条件下口甘露聚糖酶的 酶活力达到4 4 0 u m l 。 以聚铝为助凝剂，采用阴离子聚丙烯酰胺和阳离子聚丙烯酰胺为絮凝剂，对 粗酶液的絮凝分离条件进行了考察，采用p l a c k e t t - b u r m a n 设计法进行重要因素 的筛选，并对其采用中心组合法设计实验，透过响应蔼优仡褥到加水量 2 4 0 5 5 ( v ) ，阳离子加入量1 4 1 3 ( v ) ，阴离子加入量1 6 9 7 ( v ) 的最佳絮凝条 件，在此条件下酶活收率达到7 2 9 3 。利用喷雾干燥将纯化后的酶液制成固体 酶制剂产品，酶活高达3 0 0 0 u 缝。 考察了8 甘露聚糖酶在双水相萃取中的分配行为，并对聚乙二醇( p e g ) 与 硫酸盐和磷酸盐的不同组合进行了筛选，得至j j p e g l 0 0 0 ( n h 4 ) 2 s 0 4 的最佳组合。 经过对影响蛋白分配效果的三个因素( p e g 、( n h 4 ) 2 s 0 4 和n a c l 含量) 的多目标 响应面优化，可以得到不同级剔的酶蛋白萃取液。 利用中空纤维膜对发酵液进行浓缩处理，考察了操作过程中的进料量，操作 压力和操作时间对膜滤效果的影响，得到理想操作条件：进料量1 3 l h ，操作压 力0 0 4 m p a ，超滤对闻在2 0 - 4 5 分钟之闻进雩亍分段收集，可获得三级浓缩酶液。 关键词： 地农芽孢杆菌，p - 甘露聚糖酶，响应谣，p l a c k e t t b u r m a n ，c c d ， 絮凝，双水捆萃取，中空纤维膜，优化，发酵 a b s t r a c t p l a c k e t t - b u r m a nd e s i g n ( p b ) a n dc e n t r a lc o m p o s i t ed e s i g n ( c c d ) i nr e s p o n s e s u r f a c em e t h o d o l o g y ( r s m ) w e r ee m p l o y e df o ro p t i m i z i n gf e r m e n t a t i o na n d p u r i f i c a t i o nc o n d i t i o n so f1 3 - m a r m a n a s ep r o d u c t i o nb yb a c i l l u sl i c h e n i f o 掰2 吞t j 一1 0 1 。 f l o c c u l a t i o n ，a q u e o u st w o p h a s ee x t r a c t i o n ( a t p e ) a n dm e m b r a n es e p a r a t i o nw e r e u s e dt op u n f yt h er o u g hz y m o t i cf l u i da n da l s os p r a yd r y i n gm e t h o dw a su s e dt o p r o d u c es o l i d1 3 - m a n n a n a s ep r e p a r a t i o n 。 a6 6 la u t o c o n t r o lf e r m e n t e rb i o s t a tw a su s e dt o s t u d yp - m a n n a n a s e f e r m e n t i n gp r o c e s sf r o mb a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s t h r e e s i g n i f i c a n tk e yf a c t o r s i n c l u d i n gr o t a t es p e e d ( r m i n ) ，a i rf l o wr a t e ( l r a i n ) a n df e r m e n t i n gt i m e 鳓w e r e i n v e s t i g a t e da c c o r d i n gt oc c d 。t h eo p t i m a lv a l u e so ft h ev a r i a b l e sw e r ed e t e r m i n e d b yr s ma n a l y s i sa n dw e r el i s t e d a sf o l l o w s ：6 5 8 5 8 r m i n ，5 0 l r a i na n d4 6 3 4 h ， r e s p e c t i v e l y t h eo p t i m i z e d1 3 - m a n n a n a s ea c t i v i t yo f4 4 0 u m lw a s o b t a i n e d w i t hf l o c c u l a n to fc a t i o n i cp o l y a c r y l a m i d e ( c p a m ) a n da n i o n i cp o l y a c r y l a m i d e ( a p a m ) a n da i d f l o c c u l a n to fp o l y a l u m i n i u mc h l o r i d e ，f l o c c u l a t i o no fr o u g h z y m o t i cf l u i d ，a sa l li m p o r t a n tm e t h o di nt h ed o w n s t r e a mb i o p r o c e s s ，w a sa l s o d e s i g n e du s i n gp bm e t h o da n dt h r e ek e yf a c t o r sw e r es c r e e n e dt os i g n i f i c a n t l ye f f e c t t h ef l o c c u l a t i n g a n dt h e nc c dw a su s e df o rf u r t h e ro p t i m i z i n gt h r e ek e yv a r i a b l e s a n dr s mw a sa p p l i e dt oa n a l y z i n gt h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t s t h eo p t i m a lc o n d i t i o n s ， 2 4 0 。5 5 ( o fw a t e r , 1 4 。1 3 ( v ) o fc p a ma n d1 6 9 7 ( v ) o fa p a m ，w e r e o b t a i n e d u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，t h ee n z y m ey i e l do f7 2 9 3 w a so b t a i n e d t h e p u r i f i e de n z y m es o l u t i o nw a sc o n v e r t e di n t os o l i de n z y m ep r o d u c tb ys p r a yd r y i n g 。 t oi n v e s t i g a t et h ef r a c t i o nb e h a v i o rf o r1 3 - m a u n a n a s ei na t p e ，d i f f e r e n t c o m b i n a t i o n sb e t w e e np o l y e t h y l e n eg l y c o l ( p e g ) a n ds a l t ( s u l f a t ea n dp h o s p h a t e ) w e r et r i e da n dp e g l 0 0 0 ( n h 4 ) 2 s 0 4w a st h eb e s to n e a f t e rm u l t i g o a lo p t i m i z a t i o n o fr s mf o rt h r e ef a c t o r s ( p e g , ( n h 4 ) 2 s 0 4a n dn a c lc o n c e n t r a t i o n s ) ，d i f f e r e n tl e v e l e n z y m ee x t r a c t i o nw e r eo b t a i n e d h o l l o wf i b e rm e m b r a n ew a su s e dt oc o n d e n s et h ef e r m e n tp r o d u c t i o na n di n l e t a m o u n t , o p e r a t i n gp r e s s u r ea n do p e r a t i n gt i m e w e r er e s e a r c h e d 。t h eo p t i m a l c o n d i t i o n so f1 3 l hi n l e ta n d0 0 4 m p ao p e r a t i n gp r e s s u r ew e r ef o u n dt h eb e s ta n d f r o m2 0m i n u t e st o4 5t h r e el e v e lc o n c e n t r a t es o l u t i o n sc a nb ec o l l e c t e d k e yw o r d s ：b a c i l l u sl i c h e n i f o t r o i s ；p - m a n n a n a s e ；r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y ； p l a c k e t t - b u r m a n ；c c d ；f l o c c u l a t i o n ；a q u e o u st w o - p h a s ee x t r a c t i o n ； h o l l o wf i b e rm e m b r a n e ；o p t i m i z a t i o n ；f e r m e n t a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特襄热殴标注郄致谢之处外，论文中不包含其德入跫经发表 或撰翟过的磷究成果，也不包含为获褥墨盎走堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说锈并表示了谢意。 学位论文作者签名：韩罐 签字曩期：2 唧年多月7 犀 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解鑫鲞基堂有关保餐、使用学位论文的规定。 特授权墨注基鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向毽家有关部门藏祝构送交论文的复印 睾和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名； 黟位 翩躲圜 签字嘲期：2 擘7 年隽f 爨 签字鬻麓：2 秘7 年月2 隧 翦蠢 努l j舂 1 3 - 1 ，4 - d 甘露聚糖酶，简称昼一甘露聚糖酶( 1 ，4 1 3 d - m a n n a nm a n n o h y d r o l a s e ， e c 3 2 1 7 8 ) 是一类能够水解p 1 ，4 d 甘露糖菅键连接的甘露聚糖( m a n n a n ) 、 葡萄甘露聚糖( g l u c o m a n n a n ) 、半乳甘露聚糖( g a l a c t o m a n n a n ) 及半乳葡萄甘露 聚糖( g a l a c t o g l u c o m a n n a n ) 的内切酶，在医药、食品、造纸、纺织印染、在油 开采及生物技术等方面已得到广泛应用。尤其是p 甘露聚糖酶水解b 甘露聚糖 型植物胶( 如角豆胶、瓜几豆胶、槐豆胶、田箐胶和魔芋等) 可生成低聚甘露糖， 引起了国内外食品和医药界的极大兴趣。 在传统的发酵过程和分离过程优化中，通常采用单次单因素方法进行优化， 即维持其他因子不变，一次实验仅改变一个因素的一项水平。但是这种方法工作 量大，且忽略了变量之闯的交互作餍，己逐渐被淘汰。西前微生物发酵实验设计 中常采用正交法、均匀设计法、响应面法等。其中，响应面法( r e s p o n s es u r f a c e m e t h o d o l o g y ) 是近年来应用最为广泛的种实验设计与优化方法，该方法将多 因素实验中因素与实验结果的耜互关系用多项式形式拟合建模，因此可分析研究 因素与响应值之闻、因素与因素之闻的相互关系，从西成功地对微生物发酵过程 和分离过程进行条件优化。 生物技术下游加工过程是决定生物技术成果能否转变为具有实用价值和具 有竞争力产品的重要因素。在各静发酵液提纯方法中，絮凝蠢超滤应用较为广泛。 聚丙烯酰胺作为一种高分子絮凝剂，它在发酵液中能吸附不同带电性质的颗粒， 形成网状结构的絮状沉淀，再结合离心和过滤等手段，达到去除发酵液中的大量 蔼体帮杂蛋自豹作用。针对不弱特点的发酵液，选择适宜的絮凝帮及其加入量是 获得理想絮凝效果的关键。利用中空纤维膜对发酵液进行超滤操作，以压差为驱 动力，根据膜孔径尺寸大小，对目标产品进行浓缩纯化，超滤过程特点不用添加 任何化学药荆，无需热缝理，特别适用予热敏性物质，对不稳定产品是安全的。 超滤膜材质和孔径的选择，超滤操作参数的优化对发酵液提纯浓缩效果有重要影 响。双水相萃取是囝前发酵液提纯方法中较为流行的技术，它利用目标产物在两 种互不稽容体系中不同的溶解性质丽达到分离强的，不同成相体系的组合和成相 物质的浓度大小都影响了目标产物的分配效果。 不同的纯化方法可以得到不同纯度和用途的发酵产品，如何结合响应面法对 上述各种纯化技术的操作条件进行优化，以得到不同目标酶产品的纯化路线将成 为本文的重要内容。 第章文献综述 第一章文献综述 甘露聚糖酶( 圣1 ，4 ，d m a n n a n a s e ；e c3 2 1 7 8 ) 是一种可以随机水解由 p - 1 ，4 d 甘露糖苷键连接的线状或分支状甘露聚糖的内切水解酶，它属于半纤 维素酶类，特别适含于水解甘露聚糖型植物胶生产低聚甘露糖。其作用底物甘露 聚糖型植物胶( 如魔芋粉、胶爱胶、瓜，l 豆胶等) 在自然界中储量十分丰富，并 属于可再生资源，经酶解所得的甘露寡糖已被证实为有效的双歧增殖因子，对维 护人体肠道正常环境、促进有益菌增殖和提高机体免疫力等方面有着显著作用。 。甘露聚糖酶熬研究始于二十世纪5 0 年代末6 0 年代初。1 9 5 8 年c o u r t o i s 等 人【l 】r 首先发现了真菌的b 甘露聚糖酶，1 9 6 0 年w i l l i a m s 和d o e t s c h 2 】发现细菌也能 产生p 甘露聚糖酶，1 9 6 5 年r e e s e 和s h i b a t a 3 】给出了p 甘露聚糖酶的概念和定义标 准，之骺多。曹露聚糖酶的研究开始逐渐深入。特别是箍着近年来对宣然界半纤维 素资源的开发和甘露寡糖药用价值的发现，b 一甘露聚糖酶的研究和开发进入了一 个新高潮，已在食品、医药、造纸、纺织印染、石油开采及生物技术等多方面得 至i 了广泛应用。 b 甘露聚糖酶的研究主要包括：( 1 ) 产生蘸种( 包括细菌、真菌和放线菌等) 的优育；( 2 ) 从摇瓶培养到发酵罐发酵的产酶条件( 产酶培养基和培养条件) 优 化；( 3 ) 多种分离纯化工艺的开发；( 4 ) p 甘露聚糖酶的应用。 1 1b 一甘露聚糖酶产生菌 1 。1 。11 3 一甘露聚糖酶的来源 瑟一甘露聚糖酶广泛存在于自然界中。懿在海洋软体动物l i t t o r i n ab r e v i c u l a 、 甲壳纲动物圆口螺和爬行动物蛇的肠道分泌液中，豆类植物四棱豆、长角豆、瓜 尔豆等萌发的种子中，天南星科植物魔芋( a m o r p h o p h a l l u sb l u m e ) 萌发的球茎 中均发现有酶活性的存在】。 8 甘露聚糖酶的另一种丰富来源途径是微生物发酵。甘露聚糖是广泛存在于 植物多糖中的种半纤维素，很多微生物包括细菌、真菌和放线菌等都能分泌b 一甘露聚糖酶进丽分解曹露聚糖作为自己的碳源或能源物质。如细菌牵的芽孢杆 菌( b a c i l l u ss p ) 1 6 - 9 、假单胞蘑( p s e u d o m o n a ss p 。) p o 、弧菌( v i b r i os p p 。) 和 气单胞菌( a e r o m o n a ss p ) 【1 2 】等；放线菌中的链霉菌( s t r e p t o m y c e ss p ) 1 3 - 1 5 ； 蘩章文献综述 酵母( y e a s t ) 1 1 翻：以及真菡中的曲霉( a s p e r g i l l u ss p 。 1 7 - 1 9 、根霉( r h i z o p u ss p 。) 2 0 1 和木霉( t r i c h o d e r m 。as p 。) 2 1 - 2 2 等均可分泌b 甘露聚糖酶。值得一提的是，一 些极端环境下的微生物，如嗜碱芽孢杆菌( a l k a l o p h i l i cb a c i l l u ss p ) 2 3 - 2 5 、嗜热 菌r h o d o t h e r m u sm a r i n u s 2 6 、那不勒新栖热胞菌( t h e r m o t o g an e a p o l i t a n a5 0 6 8 ) 印1 及嗜热真菌t h e r m o m y c e sl a n u g i n o s u s 2 8 】等也可产生8 甘露聚糖酶，并鼠以其特有 的酶学性质( 如耐热性) 拓宽y p 甘露聚糖酶的应用领域。 真菌来源的b 甘露聚糖酶的作用范围偏酸，一般p h 值在4 0 5 5 之闯，最适 反应温度一般在5 5 7 5 。如1 9 9 0 年j o h n s o nk g t 2 9 】研究的里氏本霉，最适p h 为5 5 ，最适反应温度为6 5 ；李江华等【3 0 】研究的黑曲霉，最适p h 为5 5 ，最适 反应温度为3 5 。细菌和放线菌来源的最适p h 却常为中性或者偏碱性，最适反 应温度为4 5 7 0 。细菌孛，研究最多的是芽孢扦蔫，除1 9 9 1 年马怒和和疆薪 t 1 2 5 报道了嗜碱芽孢杆菌产碱性9 甘露聚糖酶外，最适反应p h 值多为5 。5 7 0 。 马建华等【3 l 】研究的枯草芽孢杆菌最佳反应p h 值为6 4 ，最适反应温度为5 0 。 1 9 9 5 年，南开大学杨文博等入【3 驾献样中分离筛选出一株产中性1 3 甘露聚糖酶 的地衣芽孢杆菌，经紫外线及亚硝基胍诱变处理后，获得一酶活高产菌株 ( n k 2 7 ) ，并考察了不同碳源及培养条件对摇瓶发酵产酶的影响，得出地衣芽 孢杆菌( n k - 2 7 ) 的p 甘露聚糖酶为诱导酶，葡萄糖、半乳糖不利于产酶，魔芋 粉、焦甄胶为最佳碳源，有机氮源豆饼粉优于其它氮源，酵母膏对产酶有促进作 用，通气量大对产酶有利等结论。 由于微生物具有种类繁多、价廉易得、易大规模培养和繁殖速度快等特点， 因此微生物来源的多甘露聚糖酶的研究深受重视，并且随着微生物发酵技术、基 因工程以及生化分离提取技术的不断发展和完善，其开发前景极为广阔。 1 。1 21 3 一甘露聚糖酶的产生条件 魔芋、莴莲等植物在其球茎或种子萌发时可检测出大量b 甘露聚糖酶，当处 予休眠状态时，酶活则很低甚至检测不至l j 3 3 。对于微生物，除极少数的b 甘露聚 糖酶为组成酶夕b 1 3 4 1 ，大部分为诱导酶，邵：在培养基中添加适量的讨露聚糖类 物质能极大地促进8 甘露聚糖酶的生物合成，否烫| j 只骞基础水平的酶产生【3 5 】。研 究还发现，诱导物除b 甘露聚糖酶的底物或底物类似物外，一些半纤维素类物质 或苯酚类化合物也能有效地增加某些微生物b 甘露聚糖酶的分泌水平。如野油菜 黄单赡落( x a n t h o m o n a sc a m p e s t r i s ) 在含有羧甲基纤维素、木聚糖的培养基中， b 一甘露聚糖酶的合成量几乎与以长角豆半乳甘露聚糖为诱导物时相同【3 6 】；在培养 基中添加微量的黎芦酸、阿魏酸及香草酸，能有效地提高株分解木质素的真菌 ( p h l e b i ar a d i a t af r i v o7 9 ) 产多营露聚糖酶 3 7 3 。这可能是由于多糖的水解一般 第一章文献综述 需多种糖基水解酶参与，它翻的表达常常楣互影响，因此不圊结构筋诱导物有时 会产生类似的效果。 此外，多数微生物的p 甘露聚糖酶为胞外酶，只有少数结合在细胞膜上或位 予胞内。如卵形假杆菌( b a c t e r o i d e so v a t u s ) 的多一甘露聚糖酶，有三个主要组份 位于细胞膜终，有两个缀份在细胞膜内或细胞质中【3 8 3 9 1 。 1 31 3 一甘露聚糖酶产生菌的诱变优育 从蜜然赛中筛选毒的菌种经过人工诱变选育之蜃可戬褥到环境适应力强、繁 殖力高的高产菌株。诱变育种不仅可以提高菌株的生产能力，丽且还可以改进产 品的质量，扩大品种，简化工艺，从方法上来说，它具有速度快、收效显著和方 法简便等优点，因此，在科学实验和生产上都得至l 了广泛的应用；但该方法缺乏 定向性，工作量大，有的诱变阂素对某一些菌种的作用并不明显，同时对高产菌 株进一步提高产量仍较困难。 菌种的诱变主要分为物理诱变和亿学诱变两种方法。根据诱变因素种类的不 同，通常的物理诱变有紫外线、x - 射线、￥一射线、快中子以及旷射线、t 3 一射线、激光和超声波、热诱发、离子注入等。其中紫外诱变是一种使用方便， 诱变效果较好的诱变。根据诱变剂对d n a 的作用方式不同化学诱交可分为：掺 入诱变潮 碱基结构类似物) ，与核酸碱基直接作爱的诱变帮，码组移动诱变裁。 常用的诱变剂有亚硝酸( 液体) 、硫酸二乙酯( 液体) 和亚硝基胍等。 本课题组已对菌种进行了紫外诱变，热诱变和微波诱变，获得了良好的诱变 效果，得到了若干高产蔫种。 1 21 3 一甘露聚糖酶从摇瓶发酵到发酵罐发酵的优化 一般一个新发酵产晶投产之前，总是先在实验室进行摇瓶试验，首先从摇瓶 中筛选良种和摸索最佳培养条件，即培养基配方、培养温度、接种量、p h 值范 围、发酵周期、耗氧程度等初步的工艺条件，然后再通过实验室小型发酵罐试验 和中型发酵罐，最后再过渡到工业生产发酵罐，实现工业化生产。 1 。2 1 摇瓶发酵的优化 优趣豹菌种在逶当的培养条传下不仅能够有较高的生物量，也会有较高单位 的目的产物产量。在实际生产中，影响指标的因素很多。对于摇瓶发酵来说，其 中培养基配方的优化尤为重要。微生物在生长过程中不仅对培养基中的碳源、氮 源和各种无枕盐种类的选择较为苛刻，两显对其浓度和p h 等条件的要求也较为 4 第一章文献综述 严格，会影响其产酶效果。为达到最佳的产酶效果，就需要对上述多种因素进彳亍 合理的试验设计，以获得最佳的发酵培养基配方。如利用正交试验设计、均匀试 验设计、回归试验设计等都能对影响指标的诸因素进行分析，建立多元二次回归 方程，优化培养基组成嗣。 朱劫( 4 l 】等人在对黑盟霉w m 2 0 1l 产酸性争甘露聚糖酶的发酵培养基组分和 培养条件单因素研究的基础上，设计了p l a c k e t t b u r m a n 实验选取三个主要因素， 并进行三因素三水平响应面分析，获得了较好的发酵工艺参数。在该条件下，菌 株产酶活性霹达1 3 3 7 i u g 。 1 2 2 从摇瓶发酵到发酵罐发酵的放大进程 就研究放大的初衷而言，是为了加快放大进程，缩短反复多次逐级放大的时 闻，直接指导放大实践。随着人们对生化工程领域的拓展，研究放大暖不仅仅是 为了加快生物产品的工业化进程，对业已成熟的工厂工业改革来说尤为重要。就 绝大多数情况来说，工艺改革的目的是为了在固定的时闻内提高产物的产量。当 工厂建成以后，发酵设备的搅拌、通气、抟质以及传热等条件都或多或少匿定了。 因此，有人认为工艺改革的方向应是缩小，即从大型发酵罐回归到中试规模和摇 瓶的问题，以保证工艺在可重复的条件下进行，在不改变固定设备的情况下提高 产物产量的方法成为所求。由于摇瓶试验难以精确描述微生物代谢过程的计量学 和动力学，以及传递因素造成的影响难以精确在线检测和调控，所以采用发酵罐 进行发酵试验仍是目前生物技术开发和实现产业化的必由之路。这有助于了解生 产菌株在适宜培养基、p h 、温度和通气搅拌等环境条件下对基质利用、细胞生长 以及产物合成的影响情况，从两探讨微生物的代谢变化规律，存利于对生产进行 控制。 发酵过程的放大除有关新产品的工艺帮工程放大以外，另外的问题是在已工 业投产的发酵过程中如何将摇瓶所待培养数据转化或放大成生产工艺参数。放大 的首要前提必须使大型设备和小型设备中的环境条件完全相同，般通过摇瓶所 得最初工艺条件，在从摇瓶转化到小型罐的过程中常见的是培养基成份的改变， 往往是摇瓶悬浮培养基不适合小型发酵罐中菌体代谢物的累积。匿前文献报道较 多的是就针对某一产品，在其特定的物理特性下对其工艺条件进行研究决定哪种 放大方法较好。 一般来说，放大成功与否来鲁两方面的因素：一是氧的供应，二是菌丝形态。 前者问题容易解决，后一个问题比较复杂，但大多数情况下矛盾主要来自前个 问题，成功的关键在于氧供应问题解决的好坏。 1 2 3 摇瓶与罐之间氧传递的差异 第一章文献综述 对大多数发酵来说，氧的不足会造成代谢异常，产量降低。发酵巾氧的供需 容易成为主要矛盾，培养液中氧浓度的变化是供需平衡的结果。氧从气泡传递到 细胞内要克服一系列的阻力，即气泡_ 气液界面_ 液体主体一细胞团_ 固液界面 _ 细胞壁_ 原生质体寸线粒体。由以上分析可知，来自细胞本身的阻力无法通过 增加机械搅拌克服，只有通过改变菌株特性来改善其氧传递。 摇瓶发酵与罐之间培养液的运动方式明显不同。摇瓶发酵是在恒温环境中在 摇瓶机上摇动，是通过提高比表面积，促进气体交换而达到深层培养的目的；而 发酵罐燹| j 依靠通入气体并用机械搅拌搅动发酵液，不断进行气液交换，利用空压 或泵将培养液在罐内循环，达到气液良好混合的目的。 在瓶与罐实验中，两者之间氧传递的共性除系统物性，即液体的粘度、液体 的密度、界面张力、扩散系数外，楣关的操作变量( 表1 - 1 ) 之闻无直接联系， 寻求两者之间的内在必然规律，是项值得长期研究的工作。 表1 1 摇瓶、发酵罐与氧传递相关的操作变量比较 t a b l e1 - 1v a r i a b l e sr e l a t e dt ot r a n s f e r r i n g0 2i ns h a k i n gf l a s ka n df e r m e n t e r 1 2 4 发酵放大的研究状况 随着1 9 4 0 年对青霉索发酵的深层培养研究，发酵工业进入个崭新的新纪 元。一开始对发酵放大的研究人们只关注溶解氧这个问题，菌株被认为是稳定的。 因此5 0 年代，一批学者开始从事发酵液中溶氧的研究，并指出：给微生物生长 的每个阶段都充分供氧是非常必要的，否则有可能引起酶含成的减少或微生物的 死亡，从而使目的产物产量下降。 6 第一章文献综述 9 0 年代，我国范代娣帮俞俊棠湖等人在摇瓶发酵参数的测定及其应魇方瑶 进行了大量研究工作。他们研制了一种特殊摇瓶，取得了摇瓶规模下的菌体摄氧 率、氧传递系数等重要工程参数，并以菌体最大摄氧率( o u r ) 一为基准进行发酵 放大，考察t o u r 与菌体产生量( x ) 之间的关系，得出在啤酒酵母、苏云金杆菌 的发酵过程中，o u r 与x 密切棚关，且成正比关系。这些摄氧率、氧传递系数等 工程参数的获得，突破了以前在摇瓶中只能对工艺参数，无法对工程参数研究的 状况。 随麓对发酵放大研究的深入，人镌发现在均一摇瓶培养基中表现稳定的菌株 在发酵罐放大培养中越来越表现出不稳定的特性。这种菌株的退化和在长时间大 规模发酵中菌株表现不健的原因被认为是由于在发酵罐中，尤其是大规模发酵罐 中各种参数的不均一所致。这些参数包括溢度、溶氧以及液体剪切等，它们在发 酵罐的不同高度及不同直径处均有差异。发酵罐越大，这种差异也就越明显。而 且，非均一状态常诱发工业上采用的突变株中营养缺陷体的表达，从而使发酵无 法正常进行。到西前为止，生化工程放大还是个瓶颈闷题，与其说它是种科学， 还不如说是一季中技巧，很难用理论分析，并不是放大阿题没解决就不能放大，反 应器的不足也可用工艺及控制手段来弥补。也芷因为发酵放大研究的复杂性，限 制了入们对发酵过程最优仡控制的研究。 目 l 巷，在对发酵工艺条件进行优化的研究中，主要是对发酵动力学的研究， 或对发酵条件采取单因索试验和正交试验等传统试验方法以期获得最优工艺参 数。但由于一般的发酵过程周期较长，每次发酵耗时费力，传统的试验设计方法 使得工艺优纯极大的耗费财力、人力帮物力。嚣蔫响应恧法在发酵工艺优化方瑟 的应用越来越多。 。3 一甘露聚糖酶的分离纯化 从微生物发酵液、动植物细胞培养液或酶反应液中分离纯化生物产品的过程 通常称为生物技术下游嬲工过程( d o w n s t r e a mp r o c e s s i n g ) ，是生物技术的一个重 要组成部分，也是决定一个生物技术成果能否转变为一个具有实用价值和具有竞 争力的产品的关键因素。其特点如下：发酵液或培养液通常是复杂的多相系统， 分散在其中的固形物具可噩缩性，密度又与液体相近，固液分离溷难。发酵液 中所含目标产物的浓度较低( 如抗生素约o 2 2 ，酶约o 5 2 ，胰岛素仅为 0 0 0 1 左右) ，且常存在与目标产物理化性质极其相似的异构体，因此提纯常需 多步操作，总收率较低。生化物质在体外逶常很不稳定，遇热、酸碱、有机溶 剂会引起失活或分解，此外酶蛋白的活力还与其它蛋白酶、一些辘因子和金属离 子的存在有关，这就加大了处理难度。生物培养通常为分批操作，变异性大， 7 第一章文献综述 要求下游加工具有定的弹性。 可见，下游加正过程将决定产品的质量和成本，是生物技术转化为生产力的 重要环节。在多数生物产品的开发研究中，下游技术的研究费用占全部费用的 5 0 以上，在产品生产过程中，分离纯化成本可占总成本的4 0 9 0 。因此，开 发新的分离纯化工艺是提高经济效益和减少投资的重要途径。 1 ，3 。1 酶分离提纯的一般步骤 和多数生物产晶一样，酶的分离提纯过程一般可分麦睡个阶段( 见图1 - 1 ) ： 鬟一茹詈早曩篓一篇了嘉耄一嘉震一箍 l 胞外产物 | 图1 i 下游加工的一般工艺流程 f i g u r el l d o w n s t r e a mp r o c e s s i n gt e c h m ca n df l o w ( 1 ) 发酵液的预处理与固液分离 预处理器在改变发酵液的性质，便于后续操作。如，对缨胞外产物，在目标 产物稳定的范围内通过加热、调p h 可使杂质( 如蛋白质) 变性沉淀，或使目标 产物尽可能转移到液相，同时也可以降低发酵液的粘度。絮凝处理则可将发酵液 中的悬浮粒子凝戒大直径粒子，剥予两楼分离。固液分离常雳离心及过滤法。如 果提取的是胞内产物，需进行细胞破碎及细胞碎片的分离，对形成包涵体的某些 基因工程产品尚需加变性剂溶解包涵体，然后去除变性剂使包涵体复性。 ( 2 ) 初步纯亿( 提取) 主要目的是浓缩及去除与目标产物性质相差较大的物质。典型的方法有沉 淀、吸附、萃取和超滤等。 ( 3 ) 高度纯化( 精制) 髫的是去除与目标产物理化性质摆近的杂质，霈采用具有高度选择性的方 法。如对大分子物质常用色谱法，对小分子物质常利用结晶技术。 ( 4 ) 成品加工 根据产品的最终用途及贮存形态，最看迸需一些处理，如无麓过滤、去热源、 加入稳定剂、浓缩和干燥等。 上述各阶段可视具体情况选择适当的单元操作。一些常用的单元操作的原理 及特点见表1 2 4 3 - 5 2 。 第一章文献综述 第章文献综述 第一章文献综述 i 。3 。2 分离纯化工艺的设计 分离提纯工艺是生化产品开发者关注的焦点，如俺设计个高质量、高产量、 低成本的提取工艺是对生化分离工程师的挑战，这不仅需要全面了解各种提纯技 术，有时还依赖于设计者的经验。 一般在工艺设计之前需明确产品的用途、纯度要求及商业价值。对工业用酶， 要求成本低廉，如其它共存物不妨碍使用则无需花很大精力精制，将发酵液( 或 固体曲抽提液) 除去菌体残渣浓缩后添加稳定剂和防腐剂制成液体酶，甚至将发 酵液略加处理直接干澡邵可；两分析或临床诊断用酶则必须精制，徽量其它酶的 存在会严重干扰分析结果；供人体注射用酶要求更高，且必须不含热源和微生物 毒素【5 引。对价格昂贵的产品( 如酶、激素、抗体及基因工程产物) 常用色谱分 离法，倦色谱法放大困难，成本较高，不适于低价格的产品分离。其次应尽可熊 弄清舅标产物的性质，利用目标产物与杂质之闻的差异选择处理手段。一些常用 的酶蛋囱的性质及其与分离提纯设计有关的意义见表1 3 【5 4 1 。实际上，目标产物 第一章文献综述 的性质往往能被确定，毽是大量杂质的特性却难以一弄清，这使工艺设计带有 一定的经验性与盲目性。此外，还篱建立一个方便灵敏的分析方法，对酶来说， 通常是测定酶活及蛋白质含量。 表l 一3 酶蛋自的性质及其与分离提纯设计有关的意义 t a b l e1 - 3 p r o p e r t i e so fe n z y m ea n dp u r p o r to fd i f f e r e n ts e p a r a t i o nd e s i g n 分子特性意义 疏水性 等电点 分子量 溶解性 聚合性 特殊反应性 生物特异性 稳定性 均一性 与琉水、反耱介质结合的程度 决定离子交换色谱的种类及操作条件 决定膜孔径或排阻色谱介质的选择 决定分离体系及蛋自质浓度 是否需要防聚合、解聚或分离去除聚合体 产物的氧化、还原及部分催化性能的抑制 决定亲和配基 决定王艺采用的温度、p h 及操佟对闻等 影响产物回收 在工艺设计过程中，通常可遵循下述淼羹| j ：操作条件温和，尽可能保持嚣 标产物的生物活性；选择最能有效利用圈标产物与杂质性质不同丽分离提纯产 物的方法；先用处理量大、造价低的手段，最后使用必需的造价高的分离技术； 尽快采用高分辨率的方法；单元操作之闻最好能自然衔接，无需对物料进行 调整处理；尽量减少处理步骤，提高产物收搴；避免周时使用机理相同的分 离方法。 此外，现代下游加工技术还有如下几个发展趋势： ( 1 ) 多种分离纯化技术程互交叉、渗透魏融合 如亲和技术与其它操作相结合，取长补短，优势互补，派生出亲和沉淀 5 5 - 5 7 】、 亲和反胶团萃取降铡、亲和膜过滤 6 0 - 6 1 】、亲和双水相分配f 6 2 3 1 等诸多高效分离技 术。 ( 2 ) 发酵与分离相耦合 此技术已用于多种产品的生产中，优点是既可解除产物的反馈抑制，提高产 率，又霹同时提取产物，缩短生产餍麓，简化操作步骤等。 ( 3 ) 改进上游技术，简化下游加工过程 设法使胞内产物变为胞外产物，减少非目标产物的分泌( 如色素、毒素、降 解酶等) ，赋予菌体或产物菜种利于分离提纯的性质等。 1 2 第一章义献综述 ( 4 ) 完善与开发薪的分离技术 如，径向色谱采用了径向流动技术，即样品和流动相从柱的圆周围流向圆心， 流速比轴向流动可增加3 4 倍，而且保持柱直径不变时只增加柱长，就可线性增 大样品处理量，这就解决了传统轴向色谱放大难的问题剐。再如，传统的色谱 多孔介质孔内为扩散传质，传质阻力大是提高分离效率的菱要制约因素，尤其是 在高流速下。灌注色谱则以对流传质为特征，传质快，高流速下仍能获得高柱效 瞄】。还有，电泳技术尽管可靠性与分辨率都可与高压液榴色谱竞争，但是容量 太小，直用于分板。无载体连续流动电泳的文现则有望馒电泳这一赢效分离技 术在工业化制备中发挥重要作用。 1 3 。31 3 一甘露聚糖酶的纯化 8 甘露聚糖酶的纯化方法很多，典型的工艺路线有： 1 ) 发酵液一过滤一滤液( n f l 4 ) 2 s 0 4 沉淀一沉淀透析一d u o l i t ea 2 脱色 一( n h 4 ) 2 s 0 4 沉淀一沉淀透析一s e 。s e p h a d e xc - 2 5 柱色谱一( n 磁) 2 s 0 4 盐析( 3 9 饱和度) 一过滤( 玉米淀粉层) 一( n i - h ) 2 s 0 4 盐析( 酏饱和度) 一离心一沉淀透析一d e a e s e p h a d e xa 5 0 柱色谱( 3 x 4 5 c m ) 一 ( n 蛾) 2 s 0 4 沉淀( 6 0 饱和度) 一s e p h a d e xg 7 5 柱色谱( 2 6 x1 4 0 c m ) 一浓 缩一结最( 蕊酸钙、嚣酮) ：酶比活2 3 8u m gp r o t e i n ( 以l 嘲毽 豆半乳 甘露聚糖为底物) ，收率7 0 ，纯化倍数2 4 0 0 倍【3 4 1 。 2 ) 发酵液一1 0 ，0 0 0 9 ，3 0 m i n 离心一上清液一( n h 4 ) 2 s 0 4 沉淀( 0 8 饱和度) 一沉淀透析一d e a e t o y o p e a r l6 5 0 m 柱色谱( 4 6 x 3 5 c m ) 一羟基磷灰 石柱色谱( 1 6 x 2 5 c m ) 一浓缩一s e p h a c r y ls - 2 0 0 凝胶柱色谱( 2 6 x 9 0 e m ) 一m i i i ，( mi + m i i ) 一p a g e 制备电泳( 3 x 1 6 0 x 2 0 0 m m ) 一mi + m i i ： ( mi + mi i ) 比活3 1 2 u m gp r o t e i n ，收率3 l ，纯化倍数1 3 6 倍；m i l l 比活 4 7 0 u m gp r o t e i n ，收率9 ，纯化倍数2 0 4 倍阏。 3 ) 发酵液一1 0 ，0 0 0 9 ，1 5 m i n 离心一收集细胞一缀胞破碎一1 7 ，0 9 始， 1 5 m i n 离心一抽提液一2 0 0 ，0 0 0 9 ，2 5 h 离心一上清液匀浆一2 0 0 ，0 0 0 9 ， 2 5 h 离心一上清液一d e a e s e p h a c e l 柱色谱( 1 5 x 1 0 c m ) 一p b e9 4 色 谱聚焦( 1 x 2 5 c m ) 一浓缩一b i o g e l a 1 5 m 柱色谱( 1 5 x 7 5 c m ) 一茸标 产物：比活7 6 u m gp r o t e i n ，收率4 ，纯化倍数1 3 8 倍【3 8 1 。 4 ) 发酵液一11 ，0 0 0 9 ，3 0 m i n 离心一上清液一f n i - h h s 0 4 盐析( 3 0 饱和 度) 一1 1 。0 0 0 9 离心一上清液一( n f h ) 2 s 0 4 盐析( 8 0 饱和度) 一沉淀 溶解透析一d e 2 3 纤维素柱色谱一 s e p h a d e xg 10 0 柱色谱一d e 2 3 纤 第章文献综述 维素柱色谱一终产物：比活7 0 。1 u r a gp r o t e i n ( 以0 5 豹角豆胶为底物) ， 收率1 8 ，纯化倍数1 0 0 4 倍f 6 7 1 。 5 ) 发酵液一6 0 0 0 r p m ，10 m i n 离心一上清液一( n i - 1 4 ) 2 s 0 4 盐析( 3 5 饱和度) 一1 0 ，0 0 0 r p m ，2 0 m i n 离心一上清液一( n h 4 ) 2 s 0 4 盐析( 6 0 饱和度) 一 1 0 ，0 0 0 r p m ，2 0 r a i n 离心一沉淀溶解一透析一9 5 乙醇分级沉淀一沉 淀溶解一透析一c m s e p h a d e x 缸5 0 柱色谱( 1