（生物化学与分子生物学专业论文）elpintein系统在抗菌肽基因工程中的应用.pdf

摘要 摘要 抗菌肽是生物体内经诱导产生的一类具有生物活性的小分子多肽，存在于多 种生物体中，是宿主免疫防御系统的一个重要组成部分。这些抗菌肽能作用于革 兰氏阴性、革兰氏阳性细菌、真菌、寄生虫、肿瘤细胞甚至是某些具有包膜的病 毒，而绝大多数抗茵肽对哺乳动物正常细胞无害，并且其杀菌机理与传统抗生素 完全不同，被学者认为是一种天然抗生素而备受青睐。 。 近年来，研究者开发了很多种技术通过重组表达的策略来获得抗菌肽。原核 表达是目前最常用也是最经济的方法。本实验利用大肠杆菌表达系统表达两种抗 菌肽，一种是天蚕素家族的家蚕抗菌肽c m 4 ，另一种是防御素家族的人b 防御素 ( h 1 3 d 4 ) ，然后用一种完全无需色谱层析的方法纯化获得目的蛋白。我们将c m 4 和h 1 3 d 4 的基因克隆入含有类弹性蛋白( e l p ) 和内含肽( i n t e i n ) 标签的载体构建 成表达载体p e t - e l c m 4 和p e t e i h p d 4 。经过诱导，抗菌肽与这两种标签形 成的融合蛋白( e i c m 4 、e l - h 1 3 d 4 ) 以完全可溶的形式表达，利用e l p 的特殊性状 纯化得到融合蛋白，再由i n t e i n 进行自我切割去除融合标签获得目的蛋白。最终 获得的重组抗菌肽表现出与化学合成和传统亲和层析方法获得的抗菌肽一样的 活性。这种低成本、方便可行的新型的纯化方式有望为抗菌肽以及其他蛋白的规 模化制备开辟新的途径。 关键词：抗菌肽，类弹性蛋白，内含肽，可逆相变，自我剪切， a b s t r a c t a b s t r a c t m o r i c i nc m 4a n dh u m a np - d e f e n s i n4 ( h 1 3 d 4 ) a r ea l lc a t i o n i ca n t i m i c r o b i a l p e p t i d ew i t ha l la m p h i p a t h i cs t r u c t u r e ，w h i c ha l l o w s 曲e mt od i s r u p tt h ec e l l m e m b r a n eo ft h ei n v a d i n gp a t h o g e n , r e s t d t i n gi nl y s i sa n dd e a t hb u ta t o x i et on o r m a l m a m m a l i a nc e l l sa n dd on o ta c q u i r ea n ym i c r o b i a lr e s i s t a n c e t h i sn e wm e c h a n i s mo f a c t i o nm a k e sa n t i m i c r o b i a lp e p t i d e st h en o v e lp o t e n t i a lp h a r m a c e u t i c a la g e n t st o s o l v et h ep r o b l e mo fi n c r e a s i n ga n t i b i o t i c - r e s i s t a n c ec a u s e db yt h ea b u s eo f a n f i b i o t i c s d i f f e r e n ts t r a t e g i e sh a v eb e e nd e v e l o p e dt op r o d u c es m a l la n t i m i c r o b i a lp c p t i d e s l l s i l l gr e c o m b i n a n tt e c h n i q u e s h e r ew er e p o r tan e wt e c h n o l o g yo fb i o s y n t h e s i so f m o r i e i nc m 4a n dh u m a n1 3 - d e f e n s i n4 m 1 3 d 4 ) i nt h ee s c h e r i c h i ac o l i t h ec m 4a n d h 1 3 d 4g e n ew e r ec l o n e di n t oa v e c t o rc o n t a i n i n gt h et a g se l a s t i n l i k ep e p t i d e ( e l p ) a n di n t e i nt oc o n s t r u c tt h ee x p r e s s i o nv e c t o rp e t - e 1 - c m 4a n dp e t - e i h 1 3 d 4 a l lt h e e p r o t e i n s ，e x p r e s s e da ss o l u b l ef u s i o n s ，w e r ei s o l a t e df r o mt h ep r o t e i nd e b i t sb yt h e m e t h o dc a l l e di n v e r s et r a n s i t i o nc y c l i n g ( i t c ) r a t h e rt h a nt r a d i t i o n a li m m o b i l i z e d m e t a la f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ( b 4 a c ) a n ds e p a r a t e df r o mt h ef u s i o nl e a d e rb ys e l f - c l e a v a g e f p , l l yr e d u c e dp e p t i d e st h a tw e r ep u r i f i e de x h i b i t e de x p e c t e da n t k m e r o b i a l a c t i v i t y t h ea p p r o a c hd e s 面b e dh e r ei sal o w c o s t , c o n v e n i e n ta n dp o t e n t i a lw a yf o r g e n e r a t i n gs m a l la n t i m i c r o b i a lp e p t i d e k e yw o r d s ：c m 4 ；h 1 3 d 4 ；e l f ；i n t e i n ；i t c ；s e l f - c l e a v a g e 引言 引言 传统抗生素的毒副作用及其耐药菌株的出现，迫使人们去寻找新型的抗微生 物制剂。而具有抗微生物等多种生物学功能的抗菌肽有着广阔的应用前景，它们 广泛存在于多种生物体内，是生物体对抗外界病原体侵染而产生的一系列免疫反 应的产物，能快速杀死病原微生物，有着独特的不同于传统抗生素的抗菌机理， 相对不具有免疫原性，而且对其有抵抗力的细菌也不多，分子量小，性能稳定， 具有较强的广谱抗茵能力，显示出广阔的应用潜力，故潜在的治疗性抗菌肽是开 发新型、理想的抗生素药物的重要途径。由于抗菌肽天然资源有限，有望廉价获 得的化学合成和基因工程手段成为热点，化学合成肽类成本高，而基因工程方法 大量表达抗菌肽使之成为新一代肽类抗菌药物的途径更为现实，并显示出良好前 景。口前在抗菌肽转基因植物、动物及微生物等方面都做了大量研究工作，进展 快、成果多。 ： 尽管抗菌肽功能显著，应用前景广阔，但天然抗菌肽产量很低，无法从动植 物体内大量提取，而化学合成肽价格昂贵。因此，利用基因工程技术生产抗菌肽 就成为必然选择。 抗菌肽基因工程研究一直是抗菌肽研究中的热门，这里我们以家蚕抗菌肽 c m 4 和人p 防御素h 1 3 d 4 为例阐述e l p i n t e i n 系统在抗菌肽表达纯化中的应用。 c m 4 和h 1 3 d 4 的基因被克隆入含有e l p 和i n t e i n 标签的载体中构建成表达载体 p e t e i - c m 4 和p e t e i h 1 3 d 4 并转入宿主大肠杆菌中进行表达。融合蛋白以完 全可溶的形式表达。以往通常是通过层析法来纯化融合蛋白，而该系统则通过 e l p 特有的可逆相变特性将融合蛋白与其他杂蛋白分开，并且融合蛋白可以自行 切割掉携带的标签蛋白从而释放出目标蛋白抗菌肽，通过此法获得的抗菌肽同样 表现出抗菌活性。应用该系统可以免去传统纯化法中成本高，重复性差，操作繁 琐，损失较大等缺点，是一种低成本，方便的方法，为抗菌肽的基因工程制备作 了迸一步的探索。 1 1 1 第一部分文献综述 第2 章e l p - i n t e i n 系统介绍 第1 章抗菌肽的研究意义及研究方向 抗生素的发现使人们对由病原微生物感染引发的各类疾病不再束手无策，但 抗生素的长期使用，导致病原微生物耐药性的广泛产生，现迫切需要寻找新一代 的抗菌剂来代替抗生素。 抗菌肽正是一个很好的替代者。抗菌肽是由生物细胞特定基因编码，经特定 外界条件诱导产生的一类小分子多肽，由于最初被发现的是其抗细菌功能，因而 被命名为抗菌肽( a n t i m i e r o b i a lp e p t i d e s ，a m p s ) ，由于其作用机制独特，是一类 很难导致微生物耐药性的新型抗感染药物多肽，因此抗菌肽是理想的抗生素替代 品。作为一种新型抗菌物质，a m p 有着广谱抗菌活性，能快速杀死细菌，且对 一些临床相关的可导致严重感染的病原体及耐药菌株有效。随着研究的不断深入， 人们还发现某些抗菌肽还对部分真菌、原虫、肿瘤细胞甚至某些带包膜病毒具有 明显的杀伤作用，某些抗菌肽还在免疫调节、激素调节及促进伤口愈合等方面有 着重要的作用。 1 1 抗菌肽的分类 最早发现的抗菌肽来自植物的硫素( t h i o n i n ) ，实验证明其能杀死多种病原菌 的活性，且对植物具有保护功甜1 1 。随后从植物、动物以及一些微生物中都发现 了抗菌肽 2 1 。因此根据抗菌肽的来源，可以将其分为：( 1 ) 哺乳动物抗菌肽，代 表物是乳铁蛋白肽；( 2 ) 昆虫抗菌肽，代表物是e e e r o p i n ；( 3 ) 细菌抗菌肽等，代 表物是乳链菌肽；( 4 ) 植物抗菌肽，如t h i o i n s 。 根据抗菌肽的结构可将其分为五类【3 】：( 1 ) a 螺旋型抗菌肽，代表物是爪蟾抗 菌肽；( 2 ) p 折叠型抗菌肽，代表物是t a e h y p l e s i n s ；( 3 ) 无规则型抗菌肽，代表 物是i n d 0 1 i c i d i n ；( 4 ) l o o p 型抗菌肽，代表物是t h a n a t i n 。 根据抗菌肽的氨基酸组成和结构特征可分为4 类，即天蚕素( e e c r o p i n s ) 、防御 素( d e f e m i n s ) 、蛙皮素( m a g a i n i n s ，富含脯氨酸的抗菌肽) 和蜂毒素( m e l i t t i n s ，富含 甘氨酸的抗菌肽) 。 1 2 抗菌肽具有的生物活性 1 2 1 抗菌肽对胞膜攻击作用 大多数抗菌肽最基本的作用机制是破坏肿瘤细胞或细菌质膜结构，引起胞内 水溶性物质大量渗出从而最终导致肿瘤细胞和细菌死亡【4 】。其中抗菌肽分子的结 ： 2 第2 章e l p - i n t e i n 系统介绍 构特征是保证上述机制发挥作用的重要基础。抗菌肽在结构上大多具有两亲性0 【 螺旋也有一部分具有两亲性p 片层或同时具有两亲性a 螺旋和两亲性b 片层结 构。昆虫天蚕素抗菌肽分子通过其两亲性a 螺旋上的正电荷与细菌细胞质膜磷脂 分子上负电荷之间的静电吸引而结合在质膜上，紧接着抗菌肽分子的疏水段借助 于分子中的连接结构的柔性，随即插入到质膜中，之后抗菌肽分子两亲性a 螺旋 也插入到质膜中。这样就打乱了质膜上蛋白质和脂质原有的排列秩序。由于抗菌 肽的q 螺旋是亲水和疏水两亲性的，所以最终通过膜内分子间的相互位移，就可 以使抗菌肽分子相互聚集成多聚体形成离子通道。因此，细菌失去了膜势，不能 保持正常的渗透压而死亡。过多的离子回导致渗透压的变化会让细菌大量吸水， 导致细菌涨破。这种物理性的杀伤作用是很难抵御的。 1 2 2 诱导细胞凋亡作用 m a i 等【5 】在研究融合抗菌肽d p i 对肿瘤细胞株m c a 2 0 凋亡的影响时发现，d p i 可迅速诱导肿瘤细胞凋亡，并使肿瘤体积缩小。c h e r t 等网以抗茵肽r g d t a c h y p l e s i n 作用于前列腺癌细胞株t s u ，以荧光免疫法和w e s t e m 印迹杂交法检 测，结果发现凋亡相关蛋白c a s p a s e9 、e a s p a s e8 、e a s p a s e3 以及f a s 配体表达均升 高，提示抗菌肽r g dt a c h y p l e s i n 可以诱导与f a s 相关的凋亡，由此推断诱导凋亡 可能是某些抗菌肽的作用机制之一【7 】。 1 2 3 线粒体攻击作用 线粒体是细胞能量代谢最重要的细胞器。f e h l b a u m - 等 8 】发现，t h a r a t i n ( 死亡 素) 在o 3 州o 6 弘m 时就对大肠杆菌表现出强烈的杀菌作用。但当其浓度提高 到7 0 斗m 时仍检测不到细胞内k + 离子的泄露，表明t h a m t j d 不是通过改变细胞膜 的通透性来杀菌的。当用4 0 州的t h a n a t i n 处理细菌1h 后，可检测到细菌的呼吸 变弱，6h 后细菌的呼吸作用就会完全停止。超微结构发现线粒体出现肿胀、空 泡化、嵴脱落和排列不规则，核膜界限不清，有的核破裂，内容物溢出。提示 t h a n a t i n 是通过抑制细胞的呼吸作用来杀菌的。b o b e k 等 9 1 以人唾液中提取的抗菌 肽m u c 7 作用于临床常见的真菌、杆菌和球菌，发现m u c 7 对真菌和细菌都有很 强的杀伤作用。在超微结构中也发现线粒体上述的变化。c h e n 等【6 】也发现抗菌肽 t a c h y p l e s i n l 拘作用机制与抑制线粒体相关的c 嬲p a s e7 和c a s p a s e6 蛋白相关。 1 2 4 对细胞核染色体的影响 g a z a l 等i lo 】对具有同源性的两种抗菌肽d e 唧函e p 缸s 4 、d e r m a s e p t i ns 4 ( 1 3 ) 进 行研究时发现两种抗菌肽未经处理之前不能与肿瘤的细胞核结合，而经过加工改 造获得的新型抗菌肽p v s 4 ( 1 3 ) 和r r s 4 ( 1 3 ) 却具有很强的穿透性，且能结合到肿瘤 的细胞核上，荧光显微镜观察发现，经改造后的抗菌肽作用后的肿瘤细胞d n a 3 第2 章e l p - i n t e i n 系统介绍 出现断裂，最终导致细胞死亡，由此可断定抗菌肽可以通过直接作用于肿瘤细胞 的染色质发挥杀伤作用，并且这种断裂作用对癌细胞和正常细胞有选择性，具体 原因有待进一步探究。 1 2 5 对肿瘤细胞骨架的断裂作用 “ 由于肿瘤细胞的细胞骨架系统发育不完善，使抗菌肽有机会插入到细胞质膜中，促使细 胞的双分子层发生溶解，微管崩解，质膜完整性被破坏。c h e n 等【1 1 】研究了天蚕素b 、b 1 和b 3 的抗肿瘤作用机制，通过作用于体外培养的肿瘤细胞发现，3 种抗菌肽都可 以使细咆的双分子层发生溶解，微管崩解，肿瘤细胞皱缩、死亡，证实了抗菌肽 不仅可以使细胞膜发生穿孔，而且还可以破坏微管的正常功能，影响细胞骨架的 完整性，阻止纺锤丝形成和有丝分裂，进而破坏细胞器，杀伤肿瘤细胞。 而真核生物细胞膜富含膜蛋白和胆固醇，特别是胆固醇的存在维持了细胞膜 的稳定性，因此对哺乳动物正常的细胞破坏作用不明显。另外，哺乳动物细胞中 微丝、微管和质膜内层存在许多结合位点，这种高度发达的细胞骨架结构可抵抗 抗菌肽的破坏作用。 1 2 6 抑制蛋白质及细胞壁合成 h a r d e r 等 1 2 发现人的抗菌p d e f e n s i n3 能够抑制细菌细胞壁的形成，使细菌不 能维持正常的细胞形态而生长受阻，并使细胞壁穿孔，最终导致细菌死亡。麻蝇 素( s a r c o t o x i n i i ) 也能够抑制细菌细胞壁的形成，使细菌不能维持正常的细胞 形态而生长受阻，并使细胞壁穿孔，但对已形成的细胞壁不起作用【1 3 】。 j 1 2 7 抑制细胞外膜蛋白的合成 c a r l s s o na 等【1 4 】研究发现家蝇攻击素( a t t a e i n s ) 能够干扰大肠埃希菌细胞外 膜蛋t 了o m p c 、o m p f 、o m p a 和l a m b 基因的转录，使这些蛋白的含量减少，导 致细胞膜的通透性增加，细菌的生长受到抑制。 1 2 8 抗菌肽的免疫调节活性 大量研究结果证明，作为宿主防御系统的重要组成成分，抗菌肽在体内除了 能以直接杀死病原菌的方式起作用外，更多的时候是作为免疫效应分子来启动、 调节宿主免疫防御体系，从而促进免疫功能来消除感染，保护宿主免受病原微生 物侵害。 抗菌肽的免疫调节活性具体表现为：( 1 ) 适应性表达提高宿主的抗感染能 力；( 2 ) 促进淋巴细胞增殖；( 3 ) 充当免疫细胞的趋化因子；( 4 ) 促进吞噬细胞的 吞噬能力；( 5 ) 调节相关免疫辅助细胞及免疫因子的活性；( 6 ) 调节炎症反应； ( 7 ) 启动和调节特异性免疫。 4 第2 章e l p - i n t e i n 系统介绍 1 3 抗菌肽药物的开发现状 表1 抗菌肽药物的开发现状 抗菌肽自发现和研究至今，已被认为是现有抗生素的最佳替代品，其研究及 应用已成为生物制药领域中的研究热点。到目前为止，多种抗菌肽正在进行临床 前及临床试验的可行性研究，一些多肽类药物在医药研究中得到了广泛的应用 【1 5 】【1 6 1 ，上表列举了一些国外著名药企正在研发的抗菌肽类药物。 1 4 抗菌肽的获得途径 抗菌肽可通过以下3 种途径获得：( 1 ) 生物体提取；( 2 ) 化学合成；( 3 ) 基因 工程法表达。 1 4 1 生物提取 ： 抗菌肽在生物体内广泛存在。因而生物提取法具有原料来源广、工艺相对简 单、产量大的特点。目前，各国学者已从各种动植物组织和器官中提取出多种抗 菌肽。刘红玉等利用有机溶剂甲醇提取法，分离制备了林蛙蛙皮抗菌肽，并 对其进行了氢基酸分析，该抗菌肽为碱性多肽，对g + ，g 。均有抑制作用【1 7 1 。从 蟾蜍皮肤中提取的m a g a i n i n 家族被证明是其重要的生理屏障。在皮肤破损情况下 起抗菌作用，从而保证机体不被进一步感染。 生物提取法包括有机溶剂提取法、水浸提法和有机酸提取法等。虽然具有众 多优点，但是其尚未进入大规模应用阶段。主要是因为提取后杂质较多、提取率 较低、成本相对较高。国内已有学者探索用加热一层析法提取蝇蛆抗菌物质。其 抗菌肽得率为0 2 6 ，虽然获得率较低，但却是海藻酸吸附法的5 2 倍【1 8 1 。生物可 第2 章e l p - i n t e i n 系统介绍 为工农业生产提供便宜、安全、可靠的抗菌肽产品。 1 4 2 化学合成 随着人们对抗菌肽结构研究的深入，通过化学方法人工合成抗菌肽已经变为 可能。而对于一些难以经生物提取的抗菌肽。通过化学合成也是一条比较好的解 决途径，且合成的产品被证明同样在相应生物基质中具有优良的抗菌性能。 p 1 9 ( 8 ) 、- p 1 9 ( 9 b ) 和l - p 1 9 ( 9 b ) 便是三种经过模板链编码、人工合成、纯 化等一系列步骤获得的抗菌肽。虽然结构相似，仅存在3 个残基差异，但是抗菌 性能却不一样，对白色念珠菌的最小抑菌浓度( m i c ) 也不一样【1 9 1 。化学合成法尽 管在生产上可行，但同样也存在合成费用高、产品纯度低和合成长链肽时效率较 低的问题。因而使用受到限制，经过改进后，现行的工艺较以往有很大发展；但 是仍不及通过基因和生物工程在体外表达的发展潜力。 1 4 3 抗菌肽的基因工程表达体系 通过转基因技术实现抗菌肽在体外的广泛表达是今后的重点研究和发展方 向，具有广泛的临床和生产应用前景。如：牛气管抗菌肽( t a p ) 是牛体内重要生 理屏障，保障气管不受感染但是其有限的活性影响了在医药和农业上的应用。 sy a r u s 通过转基因技术使得老鼠在乳汁中表达毋心，这种含有抗菌肽的乳汁对 大肠杆菌等具有良好的抗菌性能。从而实现了，i ：a p 在体外的大量生产【2 0 】。 ( 1 ) 大肠杆菌表达系统 在过去的2 0 年里，人们对大肠杆菌系统的遗传学、生物化学和分子生物学方 面有了充分的认识，使之成为表达许多外源蛋白的首选表达系统。大肠杆菌遗传 图谱明确、易培养、周期短、费用低。对许多蛋白质有较强的耐受能力，能较高 水平地表达多种蛋白。所以大肠杆菌是应用于d n a 重组技术的主要宿主细菌。 但该表达系统亦有其不足；缺少真核生物的蛋白质翻译后修饰和加工过程； 表达的蛋白质多以包含体形式存在；杂蛋白多，纯化步骤复杂【2 1 1 。因此，应 用大肠杆菌表达抗菌肽时，一是要注意目的产物对工程菌的毒性；二是要注意表 达产物的稳定性，所以目前多采用融合蛋白的表达途径。如李保存等在大肠杆菌 中表达的天蚕素家族抗菌c m 4 2 2 】，c a t a r i n aip 等也在大肠杆菌中表达了四种抗菌 肽 2 3 1 。 ( 2 ) 酵母表达系统 酵母细胞具有真核细胞的大部分特征，是一种十分理想的真核模式生物，它 易于实验操作、成本低、不致病。此外，酵母能以稳定二倍体或单倍体形式存在， 可有效转化外源基因，进行同源重组等，这使得酵母成为目前最常用的表达系统 之一。扈进冬【2 4 】等根据惜古比天蚕e e e r o p i nb 成熟肽段的氨基酸序列，将其c 端的甘氨酸用谷氨酰胺替代，选用酵母偏爱密码子人工合成e e c r o p i nb 基因，并 6 第2 章e l p - i n t e i n 系统介绍 在毕赤酵母中成功地表达了e e c r o p i nb 。张杰等【2 5 】也在毕赤酵母中成功低表达家 蚕抗菌肽c m 4 。国外学者在酵母表达体系方面也有许多研究，如p i s u ms a t i v u m 防御素l ( p s d l ) 等均在毕赤酵母中成功表达【2 6 1 。 ( 3 ) 杆状病毒表达系统 杆状病毒是一类昆虫病毒，其主细胞是昆虫细胞。该系统具有外源基因表达 产量高，具有与哺乳动物细胞相似的蛋白翻译后修饰功能，易培养、成本低等特 点。此外，昆虫病毒的宿主范围较窄，不感染脊椎动物细胞，有较高的生物安全 性，从而成为生物技术中一种重要的表达载体 2 7 1 。 吴代飞等于1 9 9 9 年将抗菌肽b 基因经p c r 定点突变后，克隆到杆状病毒转 移载体p a c g p 6 7 b 上，随后与野生a c n p v 2 d n a 共转染s f 9 细胞。表达产物的 细胞培养液经检测表明，改造过的抗菌肽b 基因在s f 9 细胞中获得了初步表达， 且表达产物对e c o l ik 1 2 d 3 1 有抑菌活性【2 8 】。 ( 4 ) 转基因动、植物表达系统 随着基因工程技术的发展，以及抗菌肽具有分子量小、广谱抗菌活性等特点， 将抗菌肽基因转入动、植物体内不仅增添了动、植物的防病抗病能力，而且有望 通过转基因动、植物大量生产抗菌肽，甚至可能会成为人类传染病防治的新思路i l e e 等【2 9 】构建猪p r - 3 9 转基n d , 鼠，并成功获得该基因的过表达，显著提高 小鼠对链球菌感染的抵抗力。抗菌肽转基因植物方面的研究在模式植物烟草及马 铃薯的研究较为成功，贾士荣等 3 0 l 将不同的抗茵肽基因转人马铃薯中，获得的 这些基因的马铃薯青枯病发病延迟，病情指数低下，植株死亡率降低。m o r a s s u t t i 等利用改良的v m ai n t e i n 表达载体将哺乳动物抗菌肽s m a p 2 2 9 与修饰的液泡膜 a t p a s ei n t e i n 以融合蛋白的形式在烟草植物中进行了表达，结果表明重组肽可在 预期的位点被i n t e i n 切割；而且切割后的肽具有抗菌活性【3 l 】。 尽管体外表达法是未来工业化生产抗菌肽的趋势，但应注意的是其仍然存在 实验和生产周期相对较长、在后期提取和纯化过程中存在费用过高的问题。且经 细菌表达体系表达时可能对宿主菌有杀伤作用、通过基因工程改造后的动植物是 否存在排异等问题仍有待研究。 7 第2 章e l p - i n t e i n 系统介绍 第2 章e l p - in t e in 系统介绍 ， ? 基因工程的应用使包括抗菌肽在内的多肽和蛋白质大量获得成为可能。重组 蛋白的纯化是基因工程中最常规也是最重要的一步。然而也恰恰是纯化这一步制 约着基因工程的大规模化发展。 为了纯化上的方便，通常将一段亲和标签与目的蛋白融合表达，通过亲和层 析即可简单地纯化蛋e t 3 2 1 。虽然这是实验室常用也是比较高效的纯化方法，但 有着不可克服的缺点，一是亲和层析中要使用昂贵的层析柱，层析柱的品质直接 关系到蛋白纯化的好坏，但往往柱子的不同批次，不同生产商生产的柱子存在着 很大的差异，并且，层析柱在几次使用后就需要更换新的柱填料，可重复行太低， 这就都增加了蛋白纯化的不确定性。二是需要加入蛋白水解酶来切除融合标签从 而获得目的蛋白。水解酶价格昂贵，有时很会造成非特异性切割，并且加入了蛋 白酶就意味着引入了新的杂质，这又需要额外的纯化。繁琐的操作步骤增加了蛋 白的损失。纯化蛋白的成本占去了蛋白质生产总成本的绝大多数，使得亲和层析 法只能停留于小规模的蛋白质制备而无法扩大化。 近年来，许多研究者在开发新型纯化系统上取得了众多成果，例如e l p i n t e i n 系统便是其一。 l 2 1 i n t e i n 介导的新型蛋白质纯化方式 ： 必须先介绍下i n t e i n 。i n t e i n 是存在于前体蛋白中的一段序列，在前体蛋白 转化为成熟蛋白质的过程中，依靠自我剪切作用从前体蛋白中释放出来，同时将 两端的蛋白质外显肽( e x t e i n ) 连接在一起，该过程即蛋白质剪接过程【3 3 1 。i n t e i n 以 其独特的蛋白质剪接功能而被广泛应用于蛋白质工程领域，比如蛋白质的纯化、 连接、环化等。其中，在蛋白质纯化方面，修饰后的i n t e i n 能介导n 端或c 端 单侧肽键断裂，与蛋白质亲和纯化技术联合应用，为重组表达的活性蛋白提供了 良好的分离纯化途径，使传统的亲和层析技术有了重大突破。随着i n t e i n 研究的 不断深入，近年来i n t e i n 介导的新型蛋白质纯化方式不断出现，许多设计巧妙、 新颖独特的亲和纯化技术进一步拓宽了i n t e i a 的应用范围。 2 1 1 自切割亲和纯化 一 自切割亲和纯化方式就是利用i n t e i n 具有的自切割特性而实现了目标蛋白与 亲和标签分离的目的。首先将编码亲和标签、i n t e i n 及目标蛋白的基因序列连接 在一起，在合适的宿主系统中表达出一个“标签i n t e i n - 目标蛋白 的三联体，再 利用固定在树脂上的配体吸附三联体的标签而截留融合蛋白，随后在某些简单的 理化因素作用下( 如p h 、温度的变化或者巯基化合物的加入) 该三联体从i n t e i n 的 8 第2 章e l p - i n t e i n 系统介绍 n 端或者c 端发生自切割释放目标蛋白，而此时标签则留在了树脂表面【3 4 】。目 前已经有了商品化的自切割亲和纯化系统，n e w e n g l a n db i o l a b s ( n e b ) 公司基于 自切割亲和纯化原理已经开发了撇c t 、嗽c t - c n 及愀c 1 n 删等系 统，并在实验室得到了应用，已经有人利用上述系统成功地表达了多种重组蛋白， 比如b 防御烈3 5 】、绿色荧光蛋白【3 6 】等。 与传统的亲和纯化方式相比，自切割亲和纯化通过引入i n t e i n 而避免了外源 蛋白酶的加入以及后期对蛋白酶的清除步骤，但是纯化中仍然使用了昂贵的亲和 树脂，对扩大化的生产应用仍然是一个较大的限制。 2 1 2 i n t e i n 介导的弹性蛋白样多肽系统 由美国普林斯顿大学w o o d 教授及其合作者开发的由h t e i n 介导的e l p 系统和 聚p 羟基丁酸酯( p h b ) 系统彻底摆脱了使用层析柱的束缚。这里就介绍下我们在 实验中采用的e l p i n t e i n 系统。 e l p 是一些人工合成的由五种氨基酸重复排列组成的蛋白聚合体【3 7 】【3 8 1 1 3 9 ， 这五种氨基酸分别为v a l 、p r o 、g l y 、x a a 和o l y ( v p o x g ) ，第四位x a a 表示除 p r o 外的任意一种氨基酸( 因为第四位如果是p r o 会破坏相变反应) 1 3 7 。这一序列 来源于哺乳动物原弹性蛋白的疏水结构域。e l p 可进行可逆相变：在低温环境下 的水溶液中，e l p 呈无序结构状，均匀可溶分布于溶液中，但当温度逐渐升高达 到一定温度时( 称为相变温度t t l 4 0 ) ，它们会变得逐渐脱去结合水，各e l p 分子 的疏水区互相接触 4 1 1 1 4 2 1 4 3 1 ，最终发生相变聚集成团。这一相变具有典型的可逆 性，降低温度至t t 以下时，e l p 又会由聚集状态恢复到单体可溶状态。这种相 变还可以在等温条件下通过向溶液中加入盐来加速启动。e l p 还可以被设计成其 他理化条件激发型，如氧化还原剂、p h 、光线等 4 4 1 1 4 5 1 4 6 1 。而且通过试验发现， 将e l p 作为融合标签与目标蛋白融合表达时，融合蛋白同样具有这种相变特性。 当携带e l p 的融合蛋白发生聚集时，其他杂蛋白不会发生聚集，因此可以通过 高速离心将密度高的聚集体融合蛋白与不发生聚集的杂蛋白分开，从而达到纯化 的目的。 “ 9 第2 章e l p - i n t e i n 系统介绍 丁 一 图1e l p 的相变示意图m 1 ( i n s o l u b l e ) i n t e i n 介导的弹性蛋白系统是充分利用e l p 的自聚集以及i n t e i n 的自切割特 性而构建一种非常独特的蛋白质纯化系统。b a n k i 等【4 7 】利用上述理论构建了表达 “e l p i n t e i n 目标蛋白”的质粒，在大肠杆菌中成功表达了1 0 种测试蛋白，分 离得到的蛋白质其纯度、活性及产量都取得了理想的结果。其分离过程如下：首 先，在室温下( i 丁7 = r p r e c i p i t a t ee l p l d i s c a r ds u p e m a t a n t ( s o l u b l ei m p u r i t i e s ) r e s u s p e n d p h 6 o ) l i n t e i ns e l f - c l e a v a g er e a c t i o n 图2e l p i n t e i n 系统在纯化蛋白时的操作流程 a1 l m 固昏m r b t h i o r e d o x i nm x eg yr a i n t e i n e l a s t i n - l i k ep o l y p e p t i d 0 x e e l p 图3i n t e i n 介导的e l p 系统用于蛋白( 以硫氧还蛋白t r x 为例) 的分离纯化b 运用e l p 系统大大降低了蛋白纯化的成本，为工业规模的应用提供了可能 性。b a n k i 等【3 4 1 对传统的亲和层析和e l p 系统做过一项粗略的成本比较，仅仅 在原料消耗上，e l p 系统比以麦芽糖结合蛋白为标签、依靠外加蛋白酶分离目 第2 章e l p - i n t e i n 系统介绍 标蛋白的传统亲和层析方式降低了1 2 5 倍，比以h i s 为标签而不再消除标签的 亲和方式降低了1 3 倍，与n e b 公司商业化的i m p a c t - c n 系统相比，e l p 技 术因为其更高的蛋白质产量和成功地避开了亲和树脂的使用而使相应的原料成 本消耗降低了1 3 倍。 从目前的研究来看，含有内含肽的蛋白质表达载体比较适合于通过大肠杆菌 ( e s c h e r i c h i ac o l o 系统表达来源于原核生物的目的蛋白，而对于来源于真核生物 及酵母的基因往往会以包涵体的形式进行表达，通过裂解细胞得到的包涵体经过 变性、复性等处理后，再对内含肽进行诱导自切割而得到目的蛋白。实验证明， 经历了变性和复性的内含肽，其自切割特性通常不会受到影响【4 8 】【4 9 】。因此，内 含肽介导的蛋白质纯化技术为表达的重组蛋白的分离、纯化提供了较传统亲和技 术更优越的方法。随着内含肽研究的不断深入，以e l p 系统为代表的新型亲和 纯化技术不断出现，虽然目前相关的研究还多限于实验室规模的测试，但该类技 术所呈现的优越性和实用性必将为蛋白质的纯化技术和工艺的发展注入强大的 推动力，并将在在工业生产上得到广泛应用。 1 2 第二部分实验研究 第3 章表达载体构建、融合蛋白表达纯化、目的蛋白获得及其活性鉴定 第3 章表达载体构建、融合蛋白表达纯化、目的蛋白获得 及其活性鉴定 3 1 实验材料 3 1 1 实验材料和试剂 e c o l id h 5 a 、e c o l ib l r ( d e 3 ) 、e c o l ik 1 2 d 3 1 、p 口p ， 删玎d 阳a t c c 2 7 8 5 3 为 本实验室保存，p e t - e i - g f p 质粒为美国普林斯顿大学w o o d 教授赠送，p e t 3 2 _ c m 4 、p s u m o h f i d 4 为本实验室保存。限制性内切酶：b s r gi 、h i n dl i i 以及 t a qd n a 聚合酶和d l 2 0 0 0d n am a r k e r 、d l l5 0 0 0d n am a r k e r 、t4d n al i g a s e 、 c o m p e n tc e l lp r e p a r a t i o nk i t 购自t a k a r ab i o t e c h 公司。t r y p t o n e 、y e a s te x t r a c t 为o x o i d 公司原装产品。p l a s m i dm i n i p r e pk i t 、d n ag e le x t r a t i o nk i t 为a x y g e n 公司产品，p c r 产物回收试剂盒为上海g e n e r a y 公司产品。其余试剂为国产分析 纯试剂或国外进口分装产品。 3 1 2 主要实验仪器 g e n ea m pp c r s y s t e m9 7 0 0 s i g m a4 k 15l a b o r a t o r yc e n t r i f u g e s e p p e n d o r fc e n t d f u g e5 4 17 r m i m is u b 水平板电泳系统 m i d t it e m p 水浴锅 d k - 8 d 型电热恒温水浴锅 a l p h a1 - 4l s c 超低温冷冻干燥机 t h e r m of o r m a7 0 0s e r i e s 7 0 c 冰箱 e l e c l r o l u xb c d 2 51e 冷藏冷冻箱 凝胶成像系统 3 1 3 主要试剂配制 a p p l i e db i o s y s t e m 公司 s i g m a 公司 e p p e n d o r f 公司 b i o r a d 公司 p h a r m a e i ab i o t c c h 公司 上海精宏实验设备有限公司 c 瑚r j s t 公司 t h e r m o 公司 伊莱克斯( 中国) 有限公司 u v p 公司 ( 1 ) l b 液体培养基 按1 0 鲁，lt r y p t o n e ( 蛋白胨) 、5g ly e a s te x t r a c t ( 酵母提取物) 、1 0g ln b c l 溶解于纯净水中，高压灭菌，4o c 保存备用； ( 2 ) l b 固体培养基 按1 0g lt r y p t o n e 、5g ly e a s te x t r a c t 、1 0 叠ln a c l 、1 5g la g a r ( 琼脂粉) 1 4 第3 章表达载体构建、融合蛋白表达纯化、目的蛋白获得及其活性鉴定 溶解于纯净水中，高压灭菌，冷却至5 0o c 左右倒平板； ( 3 ) t b 液体培养基 按1 2g l lt r y p t o n e 、2 4g ly e a s te x t r a c t 溶解于9 0 0m l 纯净水中，取2 31 g k h 2 p 0 4 、1 2 5 4gk 2 i - i p 0 4 溶解于1 0 0m l 纯净水中，分别高压灭菌后待冷却至室温 后混合在一起，4o c 保存备用； ( 4 ) m h 液体培养基 按5g l 牛肉膏、1 7 5g l 水解酪蛋白、1 5g l 淀粉溶解于纯净水中，高压灭 菌，4o c 保存备用( 使用l 2 9 e 度的m h 培养基用于敏感菌固体及液体培养) ； ( 5 ) m h 固体培养基 按5g l 牛肉膏、1 7 5g l 水解酪蛋白、1 5g l 淀粉、1 5g l 琼脂粉溶解于纯净 水中，高压灭菌，4o c 保存备用； ( 6 ) 3mn a c l 贮存液 按1 7 5 5g ln a c l 溶解于纯净水中，高压灭菌，4o c 保存备用； ( 7 ) p b s 缓冲液( p h8 5 ) + t 按8g ln a c l 、0 2g lk c i 、1 4 4g ln a 2 h p 0 4 、o 2 4g lk h 2 p 0 4 溶解于纯净 水中，p h 调节至8 。5 ，高压灭菌，4o c 保存备用； ( 8 ) 切割缓冲液 按0 5 8 5g le d t a 、8 3 6 8g lb i s t r i s 溶解于p b s 缓冲液中，调整p h 值至6 2 ， 高压灭菌，4o c 保存备用； 。 ( 9 ) 氨苄青霉素( a m p ) 母液 按1 0 0m g m l 氨苄青霉素钠盐溶解于灭菌水中，微孔滤膜过滤除菌，分装， 2 0o c 保存备用。 3 2 实验设计 e l p i n t e i n 系统为重组蛋白的纯化提供了经济、简便的途径。将携带 e l p i n t e i n 标签的表达载体被转化入表达宿主大肠杆菌b l r ( d e 3 ) 中，长时间低 温诱导融合蛋白的表达。离心收集菌体进行超声破碎，高速离心收集上清部分通 过相变反应纯化融合蛋白，在纯化操作过程中，p h 控制在8 5 以上，这样可以 减小i n t e i n 的提前切割反应。一旦融合蛋白经过两轮相变得到纯化，即调节p h 至6 5 以下诱导自我切割反应的发生。切割完毕后，通过最后一轮相变即可获得 目的蛋白。 3 3 实验步骤 3 3 1p c r 扩增c m 4 基因及h1 3d 4 基因 1 5 第3 章表达载体构建、融合蛋白表达纯化、目的蛋白获得及其活性鉴定 ( 1 ) 目的基因上下游引物设计： p e t e i - c m 4 一f ：57 g c g t g t a c a c a a c a t g g t t g g a a g a t c l 阿t a a g 3 b s r gi p e t e i - c m 4 - r 5 c c c a a g c t t t c a t t a g t t g a t a g t g g c a g c c3 耷奉 h i n dh i 终止密码子 p e t - e i - h p d 4 一f ：5 g c c t g t a c a c a a c a t g g a a t i t g a g c t g g3 ， 历，gi p e t - e i h p d 4 - f 5 c c c a a g c t t t c a t t a t g g t t t c g t g c g a t t c 3 ， 奉 h i n d i i i 终止密码子 ( 2 ) p c r 反应体系：( 模板分别为本室保存的p e t 3 2 一c m 4 和p s u m o h p d 4 ) 上游引物 下游引物 模板 1 0 x p c rb u f f e r m 叮t p m g + r t a g d d h 2 0 1 p l 1 肛l 1 斗l 5 “l 4 肛l 3 l 0 5 “l 3 4 5 l x l ( 3 ) p c r 反应条件： 9 4o c 3 0s 总体积5 0 p l 9 4o c 5 3o c ( c m 4 ) 6 0o c ( h 1 3 d 4 ) 3 0s3 0s _ 一 3 0 c y c l e s 7 2o c7 2o c 4 5s1 0r a i n 1