（应用化学专业论文）荧光探针的合成及表征.pdf

中文摘要 以罗丹明b 为原料设计合成了一系列的烷基罗丹明b 酯衍生物。优化得到了 适宜的工艺条件以s o c l ，为酰基化试剂，罗丹明b 与醇的摩尔比为1 ：1 0 。反 应温度7 0 0 c ，反应时间7 h ，罗丹明b 酯衍生物的收率可达8 0 以上。荧光性能 分析结果表明，烷基罗丹明b 酯的烷基结构对其荧光强度、最大吸收和发射波长 影响不大。甲基罗丹明b 酯最大吸收和发射波长不受浓度的影响，荧光强度随浓 度增加而增加；随着溶剂极性的增加，其最大吸收、发射波长红移，而荧光强度 降低；随着激发光照射时间的增长，其最大吸收和发射波长无变化，但荧光强度 明显降低，且在极性溶剂中降幅大于其在非极性溶剂中。 合成了硝基罗丹明b 、氨基罗丹明b 及卤代罗单明b 。硝基罗丹明b 与罗 丹明b 相比荧光强度减弱，最大吸收和发射波长红移。氨基罗丹明b 与罗丹明 b 相比，荧光强度增强，最大吸收和发射波长红移。随着溶剂极性的增加，硝基 罗丹明b 和氨基罗丹明b 的最大吸收和发射波长略向红移，而荧光强度降低。 单卤代后罗丹明b 与罗丹明b 相比，荧光强度增大，最大吸收和发射波长红移， 其荧光强度的顺序为i b r c i f ，其最大吸收和发射波长顺序为i b r c l f 。四氟罗丹明b 和四氯罗丹明两者的最大吸收和发射波长较接近，但都比相对 应的单卤代罗单明b 要有明显的红移。四氯罗丹明b 荧光强度要小于四氟罗丹明 b ，与对应的单卤代罗丹明b 棍比都有明显的降低。 建立了长链羧酸荧光素酯合成工艺路线，合成了一系列荧光素酯。对系列 荧光素酯水解性能的研究表明，碳链越长的羧酸荧光素酯其自然水解就越难发 生，稳定性能就越好。随着荧光素酯中羧基碳链的增长，脂酶检测的灵敏度有了 进一步提高。筛选得到了研究脂酶的理想荧光探针二( 十二酸) 荧光索酯，用其 可以检测0 1 微克毫升的脂酶的活性。 以氨基罗丹明b 和氨基荧光素为原料，采用草酰氯单乙酯作为连接剂，合 成了具有双发色基屡的薪化合物r h - f 。该物质在紫外可见吸收光谱上出现两个 吸收峰，分别接近于氮基荧光素及氨基罗丹明b 。将甲基罗丹明b 酯和r h b f 分别应用于测定d n a 浓度，优化了分析条件，建立了共振光散射法测定痕量d n a 的测定方法。 关键词；荧光探针罗丹明b 衍生物荧光素衍生物双色基团共振散射 a b s t r a c t as e r i e so fa l l 刚r h o d a m i n ebe s t e i 8w e r ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e df i o m r h o & m i n eb t h es y n t h e t i cp r o c e s sw a s0 p 血n i z e da n de s t a b l i s h e d t h u s ，s o c l 2w a s u s e da st h ea c y l a t i n ga g e n t , l 洼bt oa l c o h o l = l ：1 0 ( m o l er a t i o ) r e a c t i o nt e m p e r a t u r e 7 0 a n dr e a c t i o nt i m e7 h , t h ep r o d u c ty i e l d s a r co v e r8 0 t h cf l u o r e s c e n c e a n a l v l i c a lr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ea l k y is t r u c t u r e so f r hbe s t e r sh a r d l ya f f e c t e dt h e i r f l u o r e s c e n c eb e h a v i o r s 1 1 m a x i m u ma b s o r p t i o n ( x e x ) a n de m i s s i o nw a v e l e n g t h s ( h m ) o fm e t h y l r h o d a m i n ebe s t e r sa r en o ta f f e c t e db yi t sc o n c e n t r a t i o nw h i l et h e f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yc n h a n c c sa st h ec o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e s 啊1 ck xa n dk m g e n e r a t er e ds h i f tw i t ht h ee n h a n c i n go ft h es o l v e n tp o l a r i ww h i l et h ef l u o r e s c e n c e i n t e n s i t yw e a k e n s ，n ”k xa n d 钆咖d on o tc h a n g ew i t hi n c r 喇n go ft h ei r r a d i a t i o n t h n e , b u tt h ef l u o r e s c e n ti n t e n s i t yo b v i o u s l yd e c r e a s e d n 地r a t eo ff l u o r e s c e n t i n t e n s i t yt or e d u c ei np o l a rs o l v e n ti sl a r g e rt h a ni na p o l a rs o l v e n t a i i l i n o r hb n i t r o r hba n dh a l o g e n a t e dr hbd e r i v a t i v e sw o r es y n t h e s i z e d t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fn i u o - r hbw a sl o w e rt h a nt h a to fr hbw h i l et h e 地x a n d 概w e r el a r g e r t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y , x e xa n dg e mo f 锄q l i n o - r hbw e r e s t r o n g e rt h a nt h o s eo fr hb r e s p e c t i v e l y 让e 沁xa n d 概o f a n l i n o - r hbo r n i t r o r hbs h i f t e dt o w a r d st h er e dl i g h tw i t hi n c r e a s i n gt h es o l v e n tp o l a r i t yw h i l et h e f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yd e c r e a s e d 田地f l u o r e s c e n c ei n t a t s i t yo fh a l o g 锄埘r hb d e r i v a t i v e sw e r el a r g e rt h a nt h a to f 尉l bi nas e q u e n c eo f i b r c 1 rt h e 搬a n d 沁mo f h a l o g e n a t e dr hbd e r i v a t i v e sw o r el a r g e rt h a nt h a to f r h bi na no r d e ro f i b r c l et h eh xa n d 沁mo ft e t r a f l u o r o r h o d a m i n ebw e r ei nt h e $ 8 i n cl e v e lw i t h t h o s eo ft e t r a c h l o r o r h o d a m i n e b 。 w h i l et h ef l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y o f t e t r h l o r o r h o d a m i n ebw a sl o w e rt h a nl h a to ft e t r a f l u o r o r h o d a m i n eb ，1 1 1 c f l u o r e s c e n c ep r o p e r t i e so fm o n o h a l o r h o d a m i n ebw e r em u c hb e t t e rt h a nt h o s eo f t e t r a h a l o r h o d a m i n e sb an 哪r o u t ef o rs y n t h e s i so fl i p o p h i l i cf l u o r e s c e i ne s t e r sf r o ma c y lh a l i d ea n d f l u o r e s c e i nw a se s t a b l i s h e da n das e r i e so fl o n gc h a i nf l u o r e s c e i n 跚r b o x y l i ca c i d e s t e r sw e r es y n t h e s i z e d t h eh y d r o l y s i se x p e r i m e n t so ff l u o r c s c e i ne s t e r si n d i c a t e d t h a tt h el o n g e rc a r b o nc h a i nw a s ，t h eh a r d e rt h en a t u r a lh y d r o l y s i sw a s ，l e a d i n gt oa b e t t e rs t a b i l i t y a st h ec a r b o nc h a i no fa c i di sl o n g e r , t h es e n s i t i v i t yo fl i p o i d a s e d e t e c t i o ni sl i i o r oi m p r o v e d u s i n gf l u o r e s c e i nd i l a u r a t ea st h e 趴l b s 廿跑t h ea c t i v i t yo f l i p o i d a s ea t0 1 m g m lw a sd e t e c t e dw i t ha na c c u r a c yo f 9 8 5 an o v e ld i c h r o m o p h o r i cf l u o r e s c e n c ec o m p o u n d ( r h 田c o n t a i n i n gt h eg r o u p so f r hba n df l u o r e s c e i nw a ss y n t h e s i z e df r o mc i h v lo x a l y lm o n o c h l o r i d ea st h e c o n j u n c t e r r h - fs h o w e st w om a x i m a la b s o r p t i o nw a v e l e n g t h sc o r r e s p o n d i n gt o f l i i l i n o t l u o r e s c e i na n da n l i _ r i o - r hb m e t h y lr hbe s t e ra n dr h fw e r eu s e dt o d e t e r m i n ed n a c o n c e n t r a t i o n , r e s p e c t i v e l y t h ea n a l 砸c a lc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d a n dt h er e s o n a n c el i g h ts c , 船i n gt e c h n i q u eo fd e t e r m i n i n gt r a c ea m o u n to fc t d n a w a se s t a b l i s h e d k e yw o r d s ：f l u o r e s c e n tp r o b e # r h o d a m i n ebd e r i v a t i v e ；f l u o r e s c e i nd e h v a f i v e ； d i c h r o m o p h o r e l r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果， 除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得墨鲞盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者繇沟摩舒签字日期扣年月，石日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盘鲞盘鲎有关保留、使用学位论文的规定。特授权玉 鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的 复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 汪留如 签字日期：扣d 6 年月j6 日 导师签名： f 彭碜初 签字日期：哆以易年夕月形日 前言 刖看 荧光探针是一类重要的检测物质，其广泛应用在冶金、农业、考古学、矿 物学、环境化学、药理学、生理学、分子生物学、细胞生物学、分子遗传学、单 个分子检测、信息科学、荧光标记、激光染料等方面。近年来，随着生命科学的 不断发展，荧光探针已在蛋白质、核酸、细胞检测、及免疫分析等方面起着举足 轻重的作用，并具有广阔的应用市场前景 以罗丹明类、荧光素类为代表的荧光探针在生物领域中的应用占有极其重要 的位置，长期以来一直是研究的热点。目前的研究主要集中在对其骨架引入官能 团进行修饰，以改善其荧光性能。虽然国外对荧光探针合成及应用研究进行的非 常深入，但我国在该领域的研究起步较晚。由于探针技术的研究涉及到化工、生 物化工、医学、信息科学等领域，各学科的交叉比较多，因而使其研究具有一定 的难度，目前尚未形成完善的理论体系。为此，在原有的基础上开展研究工作。 克服目前存在的不足，无论是在理论上还是实际应用方面都具有重要的现实意 义。 本文以罗丹明b 和荧光素为母体，合成了一系列荧光化合物。确定出罗丹 明b 酯化衍生物随碳原子个数增加与其吸收和发射波长、荧光特性规律。对罗 丹明b 底环进行卤代修饰，考察其吸收和发射波长、荧光特性与结构之间的关 系。由于目前合成方法的限制，荧光素酯化衍生物羧端碳原子个数最高为6 个， 本文确定了羧端碳原子个数高于6 的荧光素酯合成路线，并考察荧光素衍生物羧 端碳链长度与其水解性能之间的规律性。在多色基团的研究方面，国内外的研究 及应用方面都刚起步，所连接的官能团也都比较简单，在此基础上研究开发新型 双色荧光化合物。将合成的具有代表性的荧光化合物应用到d n a 浓度测定，优化 分析条件，从而建立共振光散射法测定痕量d n a 的测定方法。 第一章文献综述 1 1 引言 第一章文献综述 荧光探针技术是利用特定物质的光物理和光化学特性，在分子量级上对研究 对象进行定性、定量及构象研究的一种方法。该方法的最大特点是具有高度的灵 敏性和极宽的动态响应范围。近几十年来荧光探针在工业、农业、医药学、考古 学、矿物学、环境检测等各个方面都有广泛的应用。在机械工业上，冶金常利用 荧光进行各种金属制件的检疵【1 1 。在农业上被用于检查农副产品的纯度以及鉴 定种子质量等【2 】。在医学上，荧光探针可以应用到肿瘤学、免疫学、血液学、 药物学、临床检测等各个方面【3 川( 如对乙型肝炎h b v , 呼吸道合胞病毒 ( s r v ) 检测和分析嘲) ，甚至在神五的发射中荧光探针也被用于研究太空中 的引力场和温度场。近年来在分子生物学研究中，荧光探针用于特定生物大分子 化合物的定性定量分析和构象研究中。它之所以被用来研究蛋白质的构象、基因 排序，主要是因为其具有特殊的光物理性质。如在不同极性介质中有着不同的光 谱特性( 即不同的峰值波长) ；不同的荧光量子产率和荧光寿命等。因此，测 定荧光探针物质和蛋白质分子结合后荧光峰波长、位移及量子产率的变化，就可 探知其所处微环境的极性及其他有关性质。二十世纪末出现的生物芯片【6 】融生 命科学、物理学、化学、微电子学和计算机科学为一体，而荧光探针是生物芯片 中不可或缺的示踪材料，在生物芯片中起到重要的作用。由于荧光探针技术在诸 多领域中的重要应用，尤其在蛋白质基因工程中的应用，使得其成为目前国内外 研究的热点。国外在这方面的研究比较深入，并已形成产业化。尽管我国在此研 究起步较晚，但在某些具体研究中已取得突破性进展，然而在总体上与发达国家 尚有一定的差距，因而在国内研究开发出具有自己知识产权的荧光探针，对于带 动相关产业的发展具有重要的意义。 2 第一章文献综述 1 2 荧光探针 1 2 1 荧光探针的发展 1 7 1 4 年，l e e u w e n h o e k 首先应用染色剂成功地研究了肌肉组织，用番红花 九浸染切片，得到了较好的结果。当时人们使用的只能是从动植物和矿物中提炼 的天然荧光染料如靛青、朱砂，胭脂红等。直到1 8 5 6 年，p e r k i n 才首先合成 了一种淡紫色合成染料一苯胺紫，从此拉开了人工合成染料的序幕。此后，一些 化学家采用p e r k i n 的方法，以氟化苯胺作原料，相继合成了很多染料。1 8 5 9 年合成了蔷薇苯胺( 品红) ，也称为复红；随后又合成了副品红、甲紫或龙胆紫、 结晶紫、甲基绿、孔雀绿、亮绿、藏红、亚甲蓝和各种偶氮染料( 如碱性棕) 。 这些染料逐渐商品化并应用于组织标本、血液标本、细菌标本的染色，新的染色 方法随之建立。 这个时期生产的具有荧光性的染料，主要包括氧杂蒽和吖啶、派若宁y 、 罗丹明b 、荧光素、曙红y 、赤藓红等，都是很有名的吖啶类染料。一些早期 的吖啶类染料，有碱性染革黄棕、吖啶黄、吖啶橙、吖啶黄素等。 早期组织学家、细胞学家和细菌学家喜欢染色能力很强的红色、蓝色和绿色 染料，而这些染料在溶液中大多没有荧光或荧光很弱。只有派若宁y 和曙红y 等红色染料是例外。吖啶类染料通常把细胞染成黄色，因而不常用。碱性品红( 含 有副品红和品红碱的混合物) 在1 8 6 3 年被w a l d e y e r 引进组织学研究以后，就成 为一种重要的细胞核染料，它对于细菌学，特别是对于用于证明结核杆菌这类耐 酸微生物体的z i e h l - n e e l s e n 法的发展起过重要影响。甲紫是w e i g e r t 和 e h r li c h 分别在1 8 8 1 年和1 8 8 2 年引入微生物中心技术中的，它在1 8 8 4 年就成 了g r a m 染色液的主要成分。 直到荧光显微镜研制成功2 0 多年后的十九世纪三十年代初期，吖啶类和其 他荧光探针才用于固定细胞和组织的荧光显微术。k r a u s e 的显微技术大全 收录了其他很多染料。这部在其他方面都很有参考价值的著作中，关于荧光显微 镜的章节，也只提到了其在观测组织切片自身荧光中的应用。可见当时的显微镜 学家还没有认识到荧光探针能提高染色组织的观察灵敏度和清晰度。 、 3 第一章文献综述 虽然荧光探针通常被应用于固定组织和细胞的染色，但在其他方面也得到了 应用。人们知道，在水溶液中荧光黄会产生很强的黄绿色荧光，即使用水稀释到 1 6 x1 旷倍，其钠盐仍可产生黄绿色的荧光。e h r l i c h 用它来显示内液体的流动。 1 9 0 6 年，荧光黄在美国成为第一个用于地下水中的荧光探针。 1 2 2 荧光探针的分类 按荧光发射波长分为紫外可见光区荧光探针( 如丹磺酰氯) 和近红外荧光探 针( 如吖啶) ，还可以分为无机类荧光探针和有机类荧光探针。目前最常用的是 有机类荧光探针，其按结构分为以下几种： ( 1 ) 吖啶类 吖啶类染料是以吖啶为母体，并在甲烷碳原子上的对位上引入氨基或取代氨 基所组成。 ( 2 ) 菁类 菁类染料是一类在两个含氮杂环之问，用一个或多个甲川基相连的染料，主 要是以吲哚环和苯丙噻唑、苯丙囔唑或苯丙吲哚为骨架，如t o t o ，y o y o 类；多甲 川类c y 3 ，c y 5 ，c y 7 ，包括次甲基菁、方酸菁、克酮酸菁，发射波长6 0 0 1 0 0 0 n m ( 3 ) 酞菁类 酞菁染料是由四个异吲哚结合而成的十六元环共轭体，在酞菁的基本结构 中，周边取代的官能团可以是氢原子、烷基、苯并基团、杂环等，中心可容纳n 。， z n 、p t 、p d 、s i 、g e 等原子，如四磺酸基铝酞菁。酞菁类染料的缺点是合成中 溶解度小、体积大，会影响生物分子其他性能。 ( 4 ) 罗丹明类 罗丹明类染料是以罗丹明为母体，经过多种官能团进行修饰的系列衍生物。 罗丹明类染料的荧光量子产率较低，而其最大吸收和发射波长较长，一般在6 0 0 h m 左右，所以受样品背景干扰相对较少，是常用的荧光探针。 ( 5 ) 荧光素类 荧光素类染料母体结构为荧光素，具有较好的荧光量子产率以及良好的水溶 性。荧光素最大激发波长在5 0 0 n m 左右，适用于氩离子激光器的4 8 8 n m 光谱线，但 4 第一章文献综述 其容易光致褪色，光猝灭率高，p h 敏感性强与发射波谱宽等。 ( 6 ) 香豆素类 香豆素的衍生物已被众多的荧光化学研究者所熟悉，在它们的分子结构中 不但含有六元杂环，而且含有羰基，二者都有产生荧光的潜能。大多数的香豆素 荧光染料为黄色，带有绿色荧光，但香豆素的母体结构是无色的，且在常温下没 有荧光。取代后的香豆素衍生物，特别是给电子基团的取代，将增加其荧光量子 产率。 综上所述，在这些探针中，以罗丹明类、荧光素类及其衍生物在生物领域 中的应用占有极其重要的位置，长期以来一直是研究的热点。 1 3 罗丹明探针研究进展 1 3 1 罗丹明探针 罗丹明( f h l ) 是一类重要的荧光探针材料，属于咕吨类碱性染料。由于苯环 间氧桥的存在，分子具有刚性共平面结构，使其分子结构稳定性增强。在激发光 的作用下能产生强烈的荧光，在红色可见光区，它们是一类非常好的激光染料【7 】。 其单体水溶液能发出很强的荧光，有很大的摩尔吸光系数，但在酸性介质中， 与阴离子结合形成离子缔合物后，便产生荧光淬灭”1 。在不同的溶剂、p h 值，温 度和浓度条件下，在溶解状态中罗丹明染料有几种存在形式；中性分子、离子形 式、内酯和二聚体或四聚体【6 】。图1 - 1 是p h 值对罗丹明存在形式的影响。 图1 - 1p h 值对罗丹明存在形式的影响 f i g 1 1e f f e c t so fp ho i lt h es t r u c t u r eo fr h o d a m i n e 在生物分析上经常用到的罗丹明衍生物主要有：罗丹明b ，罗丹明、罗丹明 6 g 、罗丹明1 1 0 。表1 - 1 列出了这四种衍生物的化学式。 第一章文献综述 表卜1 常用的四种罗丹明类衍生物化学结构式 t a b l e 卜lt h es t r u c t u r eo ff o u rk i n d so fr h o d a = i n ed e r i v a t i v e s 染料名称 r ，r zr 。凡r s 如r ， 絮 罗丹明bc 乩c 她c 地c 她h i t h 罗丹明 hhhf rhhh 罗丹明6 gg h 。hc 2 h 6 h c 池c h ，c 乩 罗丹明1 1 0 hhh h h h h 罗丹明染料具有光学性能好、对p h 值不敏感范围宽、波长范围宽等优点 l i e r 丌。但随着生物荧光分析范围的不断拓宽，以下几个方面制约了罗丹明在此领 域中的应用。( 1 ) 亲脂性差，对细胞的穿透能力差：( 2 ) 荧光量子产率较低，不 能满足某些探针检测的需要；( 3 ) 荧光发射波长较短，多数罗丹明类探针最大吸 收和发射波长在6 0 0 h m 以下，易受被标记物荧光的影响；( 4 ) 特异选择性差， 发生特异性结合的选择性差。 为了改善罗丹明探针的性能，国内外科学家则以罗丹明为母体，通过引入不 同的官能团对罗丹明的结构进行修饰，设计合成了多种罗丹明类衍生物。这些修 饰弥补了罗丹明探针的某些缺陷，使其更适用于荧光分析。 1 3 2 亲脂性罗丹明探针的合成及应用 为了提高罗丹明的亲脂性，许多学者进行了大量的研究，设计合成了许多亲 脂性好的罗丹明探针。 1 3 2 1 酯化的罗丹明探针 罗丹明结构中具有两个氨基和一个羧基，在极性溶剂中易形成氢键，水溶性 好，但亲脂性差 1 8 , 1 明。j a r o m i r 等洲发现罗丹明探针与d n a 、蛋白质和核酸等的结 合能力与其亲脂性成线性相关。大量的研究表明，酯化后的罗丹明衍生物亲脂性 能有显著提高，更容易被细胞吸收田丑】。 6 第一章文献综述 p a l 等2 4 1 合成了罗丹明1 2 3 、4 ，5 - 二溴罗丹明甲酯和4 ，5 - 一- - 溴罗丹明正丁 酯，这些探针不仅亲脂性有了一定程度增加，而且光敏感性也有了很大提高。 l o u i s 等【2 1 聋1 发现4 ，5 - - - 溴罗丹明正丁酯( 1 1 ) 不仅荧光量子产率提高了，光疗 作用也更加显著了。c o s t e l a 等巧。2 7 1 合成了罗丹明1 9 、r h - a 1 、r h b z e t 和 r h b z m a ( 1 2 ) 等，它们亲脂性有了显著提高，光稳定性也有了进一步的提高， 而荧光量子产率和最大吸收波长基本保持不变。w a r d 嘲1 等合成了丙烯酸丁二醇基 罗丹明b 酯( 1 3 ) ，可以用它对水质情况进行很好的监测。为了监测单个活细胞 中氧气的浓度，r i b o u 等【缄虮合成了( 1 一芘丁基) 一2 一罗丹明酯( 1 4 ) ，它的荧 光保留时间非常长，可以长时间对细胞中的氧气浓度进行检测。 1 3 1 3 2 2 酰化的罗丹明探针 1 4 罗丹明c 2 位的羧酸亦可以转化为酰胺，以提高其亲脂性。s n e 2 a n a 等【3 “ 3 2 】在c o s t e l a 合成的罗丹明1 9 基础上制备了其酰胺基衍生物罗丹明1 9 0 a ( 1 5 ) 。 罗丹明1 9 0 a 不仅具有罗丹明1 9 的高荧光量子产率，而且由于长链烷烃存在而使 其亲脂性也有了明显提高。y a n g 等3 3 1 合成了罗丹明b 酰肼，它不仅具有罗丹明 b 的特点，而且对过亚硝酸盐很敏感，能很好的检测生物体中的过亚硝酸盐。 7 第一章文献综述 为了合成比罗丹明b 的p h 值更宽的罗丹明衍生物，a d a m c z y k 等【1 6 3 4 合成了许多 罗丹明的酰胺衍生物，发现( 1 6 ) 的荧光量子产率很高，可达9 2 ，其中在罗 丹明分子上连接荧光素后( 1 7 ) 的测量范围很宽，但是其荧光量子产率较低。 而o d o 等【3 5 】人合成了双合体的罗丹明衍生物( 1 8 ) ，发现其比传统的罗丹明衍 生物光牢度( 1 i g h tf a s t n e s s ) 有了明显的增加，更适于与各种化合物分子相结 合。u d o 和j u t t a 3 8 1 等分别合成了一系列的罗丹明酰胺衍生物，并对其荧光特 性进行了检测，研究发现n 烷基取代对最大吸收和发射波长影响较小。 1 5 弧裂m 、鼎 w _ 分d 、 1 7 1 3 2 3 氨基取代的罗丹明探针 1 6 1 8l ：c 2 - c l o 烯烃。 r ：c i - c i o 烷烃 b 通过对罗丹明分子进行氨基取代修饰可以提高其衍生物穿透细胞膜的能力 ( 3 9 , 4 0 ，同样可以提高其亲脂性。r h l1 0 和r h l 2 3 具有很好的光疗作用，但是其穿透 细胞膜的能力比较弱，m o r l i e r e r 等 4 1 塘过a 唱( a r g i n i n a m i d o ) 将氨基酸引入到 罗丹明的氨基上，使其穿透细胞膜的能力大大增强。 l e y t u s 等 4 2 , 4 3 合成了罗丹明衍生物( c b z a r g ) z - r h ( 1 9 ) ；w a l t 昭等m 在 k 叽岫工作的基础上合成了多种氨基酸取代的罗丹明衍生物，如： 碍 第一章文献综述 ( c b z - m a - a r g ) = - r h ，( c b z g 1 u - a r g ) = - r h ，以( c b z v a 卜a r g ) 。- r h 。他们发现这些 双氨基酸取代罗丹明衍生物对某些酶很敏感，在某些酶的作用下会从没有荧光的 双取代的氨基罗丹明衍生物转变为荧光性能很好的单氨基取代物。单氨基取代的 衍生物比双取代或者没有氨基取代的罗丹明衍生物的最大吸收和发射波长以及 荧光量子产率都有了很大的提高，消光系数也变得很大。由于以上原因，s u i 等 f 5 删等人合成了n - - o c t y l o x y c a r b o n y lr h l l o ( 1 1 0 ) 和n - - a c d e v d n 一 o c t y l o x y c a r b o n y lr h l l 0 ( 1 1 1 ) ，其能有效地穿透细胞，分离和检测人类重组 细胞c a s p a s e 一3 和h l 一6 0 。a n t h o n y 4 _ 7 】等合成了大环的罗丹明1 1 0 的酶取代物 ( 1 1 2 ) ，其能很好的检测c a s p a s e - 3 的活性。 h 由一r 1 9 也一c n 2 - - 。 , 0 c hj i 1 0r ：h r ：c h 如0 0 ( c i k ) ，a 五 1 1 1r ：a c - d e v dr ：c i l ，0 0 0 ( c m ) 棚。 l f ! ! ：= ! ：= ! ：二! ! ：! ：二= ! ：! ! ：= i 。3 8 b n h + 3 1 1 2 1 3 3 高荧光量子产率的罗丹明探针的合成及应用 荧光量子产率对生物分析的灵敏度和精确度有很大影响，是衡量荧光探针性 能的一个重要的参数。结构阿8 性是影响荧光量子产率的主要因素。在罗丹明衍生 物中，结构刚性弱是非发光失效的主要原因，c l a u d i n e 等【4 8 】合成出一种新型咕吨 环上取代的罗丹明染料，它是罗丹明5 7 5 和罗丹明6 g 的异构体。其关键中间体3 乙氨- 5 甲基酚是由3 甲基5 酮_ 2 已烯甲酯与n 乙基苯甲氨制得，它与苯酐类衍 生物缩合后在顶环的c 1 和e 8 位各引入了一个甲基，减少了由于羧基苯环部分的 9 o i c棚 删 p丫。殴 h l n 第一章文献综述 自由旋转而引起的非放射过程，从而获得高的荧光产率。研究表明取代基的类别、 位置和数量对罗丹明分子荧光量子产率有很大影响。只有一个推电子取代基，且 处于空间位阻最小或无空间位阻的位置时，荧光量子产率最高。 d r e x h a g e 等【4 9 】发现罗丹明类染料末端氨基的扭转运动会使s 1 一s o 内部转换 加剧，氧杂蒽母环的刚性平面被破坏，导致它们的荧光量子产率降低，实验证明， 罗丹明b 的荧光量子产率与温度有关就是因为氨基扭动影响，若将罗丹明类染 料末端氨基固定，则荧光量子产率就与温度变化无关了，可有效地提高分子的刚 性，从而使荧光量子产率提高。所以具有特殊结构罗丹明的合成，尤其是结构刚 化及不对称合成一直是化学家颇感兴趣的课题之一【鲰n 】。 h a m m o n d 等人嘲先将喹啉上的n 烷基化，还原后再经过磺化、碱融的方法 合成一系列具有特殊结构的间氨基苯酚，代表性的间氨基酚有n 上取代的羟基 喹啉或吲哚。利用这一关键中间体可以合成具有刚性结构的罗丹明衍生物， r 和r ”可以是h 或1 1 0 个碳的烷基( 图1 - 2 ) 。 避幻一幻掣防公 图l - 2 化合物1 1 7 的合成 f i g 1 - 2s y n t h e s i so f c o m p o u n d l 1 7 h a u g l a n d ( 5 4 通过扩展兀共轭体系用以增加刚性，设计并合成出新类型的 强荧光罗丹明染料，这一系列染料在5 8 1 6 3 1 n m 处有较强吸收，量子产率在 0 6 4 o 8 9 之间，可以广泛用于生物分析领域。此类化合物是用4 - 溴3 硝基茴香 醚及五种不同的芳香硼酸为原料合成，a r 部分可以是苯环、萘、噻吩、苯并噻 吩，其合成路线如图1 3 所示： l o 第一章文献综述 0 2 n 、02n、h2n、 t 呲e r m 一心m 旦 m 篾苫蕊一苫昏m 。 虹m 虹。一 图1 3 化合物1 1 8 的合成 f i g 1 3s y i l m a i so f c o m p o u n d1 1 8 1 3 4 最大吸收和发射波长的改进及在生物分析中的应用 因为生物体内存在的背景荧光可能会对检测产生影响。所以长吸收和发射波 长的荧光染料更适用于标记生物体，如血液、尿、细胞与组裂5 5 1 。一般来说罗 丹明类染料的最大吸收波长在6 0 0 h m 以下，通过提高罗丹明染料的吸收波长可以 增强其适用性。 r l l p e 甜5 6 】合成了吸收波长在6 0 0 n m 以上的衍生物。j o e 合成了n u c l r h ( n u c 为核苷或核苷类，l 为连接基团) ，它不仅很容易和核苷酸等结合，而且 它可以用波长在6 3 0 n m 以上的廉价的红外激光激剔5 7 1 。近些年，一些学者通过增 加罗丹明母核的刚性和引入不同的官能团合成了许多罗丹明衍生物，如1 1 9 1 2 7 所示。罗丹明上n 原子成环后结构刚性增强，使其最大吸收波长有了很大地 提高。其吸收波长在6 0 0 6 7 0 n m 之间，可与廉价的通用二极管激光器匹配使用， 也更适用于以分析和诊断为目的的生物分子标记- 6 3 。 第一章文献综述 a 1 1 9 1 2 l 1 2 5 s 0 3 n - 1 2 0 1 2 2 n 氅 。菸 。冷 罐 第一章文献综述 酬翟如 1 z 71 2 8r = h 1 2 9r = c h 3 另外，r a j e w 等【删在罗丹明6 g 中加入适量罗丹明b ，加宽了罗丹明6 g 光谱范 围。通过加入罗丹明b ，罗丹明6 g 的光谱范围从5 6 4 n m 6 0 9 n m j j f l 宽到了5 6 4 n m 6 4 5 n m 。这样罗丹明6 g 既保持了高的荧光量子产率又有较宽的荧光波长范围， 其适用范围大大增加。 在底环上引入不同的取代基会引起罗丹明最大吸收波长的改变。一般引入卤 素可加深颜色，引入愈多颜色愈深，可得到黄、红、蓝色。相应化合物颜色加深 的程度取决于引到环上的卤素的原子量，原子量越大色越深。选用多卤代苯酐及 苯甲醛衍生物与间氨基酚缩合可得到底环上含卤代如2 ，3 ，4 卤代或全氯( 氟) 罗丹明衍生物，卤素被某些硫醇取代可以很便利地引入活性基团f 珏6 6 1 。l i n d a 等 【叨报道的4 ，7 二氯罗丹明染料主要是用3 ，6 二氯偏苯三酸酐与间氨基酚衍生 物在多聚磷酸( p p a ) 作用下缩合而成，特别适用于多色荧光d n a 测序及碎片分 析，其发射带宽比缺少4 ，7 - 二氯的罗丹明染料窄2 0 - - 3 0 ，最大吸收发射波长比 缺少4 ，7 二氯的罗丹明染料高1 0 3 0 n m 。 1 3 5 特异选择性的改进及在生物分析中的应用 由于罗丹明自身活性基团的特异选择性差，已不能满足不断发展的生物分析 要求，含活性基的罗丹明衍生物因能与生物分子发生某些特异反应而显示出巨大 的吸引力。如今，开发特异选择性好、具有活性基团的罗丹明衍生物已成为生物 分析领域中研究的热点。 目前含活性基的罗丹明衍生物中罗丹明b 异硫氰酸酯( r b i t c ) ( 1 2 8 ) 、四甲 基罗丹明异硫氰酸酯( 1 2 9 ) 、丽斯胺罗丹明b ( 1 3 0 ) 、德克萨斯红( 1 3 1 ) 等在生物分析中均已得到广泛应用。 1 3 第一章文献综述 1 3 01 3 l x a v i e r 等啪6 9 1 合成了罗丹明b 异硫氰酸酯和四甲基罗丹明异硫氰酸酯。利用 其亲脂性强来分析研究粘度比较大、分子量大于4 1 0 6 的蛋白质取得了很好的效 果，而其它试剂很难对其进行分析检测。另外该物质由于具有分析速度快且不会 污染蛋白多糖结构，而广泛应用于d n a 钡u 序和免疫荧光染色。丽斯胺罗丹明 b ( l i s s a m i n er h o d a m i n eb ) 为红褐色粉末，不溶于水，易溶于丙酮和乙醇，比较 稳定，可长期保存。罗丹明马来酰亚胺荧光发射波长较长，与- - s h 反应后有较 高的荧光量子产率，但它的s t o e k t ! t 移较小，荧光量子产率对p h 值敏感，在碱性 条件下荧光量子产率较低，又含有光敏感基团，很容易分解嗍。尽管如此，由 于它的发射波长较长以及吸光系数较大，故仍被广泛应用于研究蛋白质的结构、 性能j 内部的相互作用关系和标记抗体等方面r 7 “7 2 。 近年来n 一羟基琥珀酰亚胺酯( n t i s ) 罗丹明也受到越来越多的关注。它们对 脂肪胺有较高的选择性，而不与芳胺、羟基、巯基等反应，常被用作分析氨基酸 和多肽的h p l c 柱前衍生试剂。硫氰基( 一n c s ) 和氯磺酰基( - - s o i ) 在适当的条 件，它们易与抗体蛋白质氨基酸的一级氨基形成共价键，成为牢固的荧光染料一 蛋白质结合物【7 3 】。n a t a l y a 在罗丹明c 47 位引入了低聚核苷酸，使其亲脂性和 特异选择性有了很大提高，更适合检测核酸分子【7 4 】。 1 3 6 多发色团的罗丹明类荧光染料 近年来罗丹明类荧光染料研究领域里比较活跃的研究方向是在罗丹明的胺 基氮原子或底环羧酸基上接一些“天线分子”，形成双发色团或三发色团荧光染料 t 7 5 7 6 。d r e x h a g e 等【州将氨基末端刚化的罗丹明d r - 2 1 ( 1 - 3 2 ) 通过桥链与2 ， 1 4 第一章文献综述 5 一二苯基嗯唑( p p o ) 、硝基苯、蒽相连，在染料分子上用桥链连接这些接收能量 的“天线”作为染料的能量给体，目的是减少基态吸收时的共振损失。如果天线单 元的最大发射波长正处在罗丹明染料最低吸收区域( 3 1 0 - 3 5 0 n m ) 范围内，会发 生从天线单元向罗丹明母体的分子内单线态单线态能量传递现象，能够将能量 有效传递给母体染料。 r r li 缈x - 咿啪 t i m 等【7 8 7 9 】通过亚乙基和酯基把l ，8 一萘酰亚胺天线与罗丹明1 0 1 或罗丹 明b 相连，合成了另一类双发色团荧光染料( 1 3 3 ) ，它们都比罗丹明1 0 1 或罗丹 明b 的荧光辐射高。t i a n 又以两个l ，8 一萘酰亚胺衍生物作天线、以罗丹明6 g 或罗丹明d r - 2 1 作激光单元并通过亚乙基桥相连，合成了新型三元罗丹明荧光 染料( 1 3 4 ) 。从天线到罗丹明单元分子内能量传递增大了多发色团染料的荧光 量子产率。 h 蛙蛙难殴 e 二“2 i c c 。h “2 2 c h 3 r ：b r n m e 2 r 。- h b r x = c i c l 0 4 1 3 31 3 4 p e v e n a g e 等人舯1 用芘丁基磺酸盐制成的芘丁基氨取代二氯荧光素上的氯， 合成了n 上取代的4 - 0 - 芘基) 丁基罗丹明( 1 3 5 ) ，并研究了芘与罗丹明之间的能 量传递过程。这对研究生物体系的活细胞，测定各种细胞器官氧气浓度是非常重 第一章文献综述 要的阻”。r i b o u e 8 2 l 合成出了一种测定活细胞线粒体中氧浓度的新型探针：( 1 芘丁 基) - 2 - 罗丹明酯。方法是将1 芘基丁酸( p b a ) 用l i 舢地还原成1 芘基丁醇( p b ) ， 在缩合剂d c c 作用下与罗丹明1 1 0 成酯( p r e ) ( 1 3 6 ) ，实验研究了p r e 的荧光 性质，证明了p r e 在活细胞中的荧光寿命对氧浓度敏感，罗丹明与芘间的能量 传递与环境有关。 + 1 3 5 1 4 荧光素荧光探针研究进展 1 3 6 荧光素及其衍生物是重要的荧光探针材料，也属于咕吨染料。荧光素( 1 3 7 ) ( f l l l o 懈i n ) 又称荧光黄，化学名称为3 ，6 二羟基螺 异苯并呋喃1