（果树学专业论文）小金海棠Felt3gt还原酶基因MxFRO2的克隆及功能初探.pdf

摘要 机珥1 型植物在吸收和利用铁时，需将f e 3 + 还原为f e 在此过程中f e 还原酶起到丁关键 作用。苹果属小垒海棠( m a l u s x i a 。f i n e n s i s c h e n ge tj i a t l g ) 是机理i 型植物，也是铁高效基心型 植物。为了研究其抗缺铁的分子生物学机理，从小金海棠申克隆f e 3 _ 一还原酶基因m x f r 0 2 ，分析 ，孩基因的表达情况，并在酵母中初步研究该基因的功能。结果如下： ( 1 ) 根据f e 3 _ 还原酶基因家族的功能保守医序列设计简并引物，利用r t p c r 及r a c e 等方 法克隆了小金海棠f c 3 还原酶基因m x f r 0 2 。m x f r 0 2 的c d n a 序列全氏2 4 1 7 b p ，开放阅读框 为2 1 6 6 b p ，编码7 2 2 个氧基酸，分子量约为8 i k d a 。小金海棠m x f r 0 2 与豌豆p s f r o 及番茄l e f r o 蛋白具有7 7 的同源性，与拟南芥a t f r 0 2 蛋白具有7 4 的同源性，与a t f r 0 1 具有7 1 的同源 性。跨膜结构分析发现该蛋白具有9 个跨麒结构域，有f a d 结合位点和n a d p h 结合位点以厦2 对与血红索结合的h i s 残基。 ( 2 ) 半定最r t - p c p - - 结果表明。正常供铁时，在小金海棠的根和叶中均没有检测到m x f r 0 2 基因的表达；当缺铁处理2 天时，m x f r 0 2 基圜有了微弱的表达；此盾随着缺铁处理时间的延长， 基因的表达逐渐增强。说明小金海棠m x f r 0 2 基幽在根驶n i 片中均受缺铁胁迫诱导莉加强表沾。 ( 3 ) 将m x f r 0 2 转入到野生型酵母中，结果表明转基因酵母的f e 3 + 还原酶活性得到了显著 提高，足对照的2 , 8 倍，因此我们初步推测m x f r 0 2 摹网编码的蛋白具有f e + 还原酶活性。 关键词：小金海棠，缺铁胁迫，m x f r 0 2 ，半定量r t - p c r ，f e h 还原酶活性 a b s t r a c t s t r a t e g yt - t y p ep l a n t sm u s tr e d u c ef e ”t oi r e 2 + i ns o i lb yf e r r i cr e d u c t a s et oa c q u i r ei r o nm a i m , x i a o j i n e n s i sc h a n g e tb a n gb e l o n g st os t r a t e g yi - t y p ea n di r o n e f f i c i e n tg e n o t y p ep l a n t ，f r o mw h i c hw e i s o l a t e da n dc l o n e df u l l l e n g t he d n as e q u e n c eo f m x f r 0 2i na d d i t i o n ，w ea n a l y z e di t se x p r e s s i o na n d s t u d i e do l li t sf u n c t i o ni ny e a s tt h er e s u l t sa r ea sf o l l o w i n g ： ( 1 ) af r a g m e n to faf e cr e d u c t a s ec d n a 矗 mm a l u sx l a 凹f 删，盯w a si s o l a t e db y u s i n g r t - p c ra n dd e g e n e r a t ep i m d e s i g n e do nt h eb a s i so fs e q u e n c e sc o n s e r v e di nt h e s er e d u c t a s e p r o t e i n s r a c ew a st h e nu s e dt oi s o l a t eaf u l l - l e n g t he d n ac l o n ei ti s2 4 1 7 b pl o n gc o n t a i n i n ga no p e n r e a d i n gf r a m eo f 2 1 6 6 b pe n c o d i n g7 2 2a n d n oa c i dr e s i d u e st h em x f r 0 2s h o w sas i m i l a r i t yo f7 7 w i t hp s f r oa n dl e f r o ，a n dt h a to f7 4 w i t ha t f r 0 2a n d7 1 w i t ha t f r o lm x f r 0 2h a s f a d - b i n d i n gs i t e , n a d p h b i n d i n gs i t ed o m a i n sa n dh e m e b i n d i n gh i s t i d i n er e s i d u c e s ， ( 2 ) t h er e s u l t so fs e t n i q u a n t i t a t i v er t - p c rs h o w e dt h a tt h em r n al e v e lo fm x f r 0 2w r s u n d e t e c t a b l eb o t hi nr o o t sa n dl e a v e su n d e ri r o n s u f f i c i e n c yc o n d i t i o n t h em r n al e v e lw a sd e t e c t a b l e u n t i l2d a y si r o n d e f i c i e n c ys t r e s sa n di n c r e a s e dg r a d u a l l yu n d e ri r o n - d e f i d e n c ys t r e s s ，w h i c hs u g g e s t e d m x f r 0 2w a si n d u c e db yi r o n d e f i c i e n c ys t r e s sb o t hi i lr o o t sa n dl e a v e s ( 3 ) y e a s tw a st r a n s f o r m e dw i t hm x f r 0 2g e n e ，a n dt h ef e r r i cr e d u c t a s ea c f i v i t yi nt r m a s g e n i cy e a s t w a s2 8 - f o l dt h a to f c o n t r o l s i ts u g g e s t e df l l a tm x f r 0 2h a df e r r i cr e d u c t a s ea c t i v i t y k e yw o r d s ：m a t u sx i a o j i n e n s i s ，l r o n - d c f i c l e n c ys t r e s s ，m x f r 0 2 ，s e m i q u a n t i t a f i v er t - p c r f e r r i cr e d u e t a s ea e t i v i l y f i a m p b p b p d s c d n a c i c t a b d e p c e c o i l e d t a g f p 琢叮 m r n a m x f r 0 2 m s n r a m 呼 o r f p c r r a c e r t 干c r 缩略词 a m p i c i l l i ns o d i u ms a l t b a s ep a i r b a t h o p h e n a n t h r o l i n ed i s u l p h o n i v a c i d d i s o d i u ms a l t c o m p l e m e n t a r yd n a c m o f o f 缸瑚i s o a m l y a l c o h o l c e t y l t r i m e t h y ll a m m o m u mb r o m i d e d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e e s c h e r i c h i ac o i l e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a u c e t i ca c i d g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n i r o nr e g u l a t e dt r a n s p o r t e r m e s s e n g e rr n a f r 0 2g e n ei nm a i mx i a o j i n e n s i s c h e n ge tj i a n g m u r a s h i g ea n ds k o o gm e d i u m n a t u r a lr e s i s t a n c ea s s o c i a t e dm a c r o p h a g e p r o l e i n o p e nr e a d i n gf r a m e p o l y m e r e a s ec h a i nr e a c t i o n r a p i da m p l i f i c a t i o no f c d n a e n d s l e v c r s et r a n s c r i p t a s ep c r 氨卞青霉素钠盐 碱基对 f e 2 + 鳌合剂 互补d n a 氯仿异戊醇= 2 4 1 溴代十六烷基三甲胺 焦碳酸二乙酯 大肠杆菌 乙二胺四乙酸 绿色荧光蛋白 二价铁转运蛋白 信使r n a 小金海棠f r 0 2 基因 m s 培养基 与自然抗性有关的巨噬细胞蛋 白 开放阅读框 聚合酶链式反应 快速c d n a 末端扩增 反转录p c r i l l 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 百专全时间：及) 。7 年月，口日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： ：岁寻争 时问：地 年月0 曰 时间：讪9 年舌月p 臼 中国农业大学硕士论文文献综述 1 1 铁的生理功能 第一章文献综述 铁是植物生长发育所必须的营养元素之一，其参与了叶绿素的合成，在植物体的光合作用、 呼吸作用、氮的固定、蛋白质和核酸的合成等诸多生理代谢过程的电子传递链或酶促反应中发挥 着极为重要的作用( t h o i r o n 等，1 9 9 7 ) 铁虽然不是叶绿素的组成成分，但是对维持叶绿素的功能是必须的( 仝月澳和周厚基，1 9 8 2 ) 。 因为缺铁时，是不能合成叶绿素的。有人认为铁是合成叶绿素时某些酶或酶的辅基的活化剂。缺 铁会降低甘氢酸和琥珀酸辅酶a 形成卟啉前身6 氨基乙酰丙酸的速率，另外在类卟啉氧化成原 生卟啉时，铁也是必须的( m e n g d 等，1 9 8 2 ) 。然而，目前有关铁在叶绿素合成途径中是否有直接作 用仍然有争议。j a m e s 等( 1 9 8 4 ) 发现植物缺铁时，叶片黄化。叶绿体中基粒数目减少，每个基粒 类囊体折叠的片层数也大大降低，严重的时候叶绿体解体。因此j a m e s 认为铁对叶绿体结构组成 有重要的作用，而叶绿体结构又是叶绿素合成的先决条件。 植物体内许多含铁化合物都参与了光合作用。如血红素、铁氧还蛋白，细胞色素氧化酶复合 体等。植物缺铁时，这些物质的含量及活性降低，影响了植物光合作用的正常进行( a g a r w a l a ， 1 9 6 5 ) 缺铁还会导致类囊体解体，叶绿素合成受阻，甚至还会导致光合作用中电子传递链的中 断，使电子不能正常传递，影响了水的光解，从而阻断光合作用的进行。 许多含铁化合物都参与了呼吸作用，如细胞色素氧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶等。铁常 常位于这些酶的活性部位，当植物缺铁时，这些酶的活性无疑受到影响，因此使体内一系列的氧 化还原作用无法正常进行，电子不能正常传递，呼吸作用受阻，致使植物生长发育受到严重的影 响。 铁是许多酶的辅基的成分，比如细胞色素氧化酶、氧还蛋白、细胞色素等。铁还是铁硫蛋白 的重要组分，在目前所试验过的所有生命形式的氧化还原反应中均有铁硫蛋白的参与。硝酸还原 酶和亚硝酸还原酶中含有铁。固氮酶之所以能固氮，是因为它含有铁蛋白和钼铁蛋白。铁还是磷 酸蔗糖酶的活化剂，参与蔗糖的合成。铁可以发生三价铁离子和二价铁离子两种状态的可逆转变， 从而在呼吸作用中起电子传递的作用。总之，铁是许多重要酶的组成部分，而且缺铁会使氮代谢 和呼吸等方面氧化还原反应会受影响( 施卫明等，1 9 9 0 ) i 1 2 缺铁对果树的影响 缺铁会影响叶绿素的形成，从而严重影响了植物的物质和能量代谢。缺铁会对果树的呼吸作 用有严重影响，缺铁的果树叶片总呼吸强度低于正常叶片( 周厚基和仝月澳，1 9 8 8 ) 。缺铁还会对 果树叶肉细胞、栅栏细胞及主脉内薄壁细胞的形状和结构有严重影响，破坏其中的叶绿体等细胞 器的结构和功能( 周厚基和仝月澳，1 9 8 8 ：陈树彪等，1 9 9 7 ；刘成明和秦煊南，1 9 9 6 ) 。植物的茎叶、 根系的生长显然会受影响( 韩振海等，1 9 9 5 ) 苹果、梨、葡萄、桃等在受到缺铁胁迫时，轻者树 势衰弱，严重时树体生长受阻甚至死亡( 仝月澳等，1 9 8 2 ) 。但缺铁时，果树根系f e 还原酶活性却 1 中国农业大学硕十论文文献综述 大大提高了，也就是说缺铁果树根部吸收铁的含量和速率会大大提高( 薛进军等，1 9 9 9 ：韩振海 等，1 9 9 5 ) 。缺铁果树叶片的总呼吸率低于正常叶片，但对于刚失绿的植株来说，其根系的呼吸强 度高于正常植株的根( 周厚基和仝月澳，1 9 8 8 ) 。另外，据报道苹果缺铁时叶和根中苹果酸和柠檬 酸含量比对照高，这有利于酸化根际和铁的还原( 周厚基和仝月澳，1 9 8 8 ) 。 1 3 植物吸收铁机理研究 据统计，土壤中可溶性铁的浓度往往达不到l o - 1 0 m ( g u e r i n o t 和y i ，1 9 9 4 ) ，致使许多植物 表现出缺铁症状。我国很多地方都不同程度地存在着植物缺铁问题。特别是在干旱和半干旱的石 灰性土壤中，土壤的钙化导致可溶性铁含量降低，不到l o ”m ，许多植物表现出缺铁失绿症，给 农业生产造成了极大的经济损失。因此，研究植物的铁营养对提高作物的产量和品质有着重要意 义。 为了能够有效地吸收和利用土壤中的铁，满足自身生长发育的需求，植物在长期进化过程中 对缺铁胁迫形成了两种适应性机理，机理i 和机理( m a r s c h n e l 和r o m h e l d ，1 9 8 6 ) 。 1 3 1 机理i 植物吸收铁机理研究 机理i 植物包括双子叶植物和非禾本科单子叶植物，它们对缺铁的适应性反应包括形态学变 化和生理学变化。形态学变化主要指形成大量的侧根和特异的转运细胞，可以增加植株氧化还原 反应的表面积，并提高植株对铁的转运效率；生理学变化由三部分组成：f e 还原酶系统、质 子外泌泵( w - a t e a s e ) 以及有机物质的分泌系统。这三部分都位于形态上特化的根尖表皮细胞 的细胞质膜上，并有效地对缺铁胁迫发生反应。机理i 植物通过激活特异的根质膜n * - a t e a s e 向 外分泌h + 而使土壤酸化；同时分泌有机酸将土壤中的f e 3 + 以f 一+ - 螯合物的形式溶解；根表皮细 胞质膜上特异的还原酶将f e 3 + _ 整合物还原成f e ”，通过二价铁转运蛋白跨膜转运到细胞质中 ( b i e n f a i t ，1 9 8 5 ) ，之后又被氧化成f c ”( w a t e r s ，2 0 0 2 ) ，以柠檬酸铁的形式在木质部中向地上 部进行长距离的运输。地上部组织吸收利用铁时也必须先将f e 3 + 还原成f e 2 + r o b i n s o n 等( 1 9 9 9 ) 在拟南芥中首次克隆到两个f e ”还原酶基因- - a t f r 0 1 和a t f r 0 2 ，其 中a t f r 0 2 基因在拟南芥缺铁的根中特异表达，突变该基因时，植株在受缺铁胁迫时表现为失绿 黄化，甚至死亡。此外，从拟南芥中还鉴定出了其它f r o 基因，它们的产物在不同的器官或特 定的细胞类型中调控铁的吸收( r o b i n s o n 等，1 9 9 7 ) 。 另外，e i d e 等( 1 9 9 6 ) 在拟南芥中克隆分离到编码二价铁转运蛋白的基因皿刀和职踢。 c o n n o l l y 等( 2 0 0 2 ) 的研究表明i r t l 基因受缺铁胁迫调控，且在根部高水平表达。缺铁胁迫时， 上r m r n a 丰度在2 4 小时后呈稳定水平增长，到7 2 小时i r t l 蛋白含量达到最高。重新供铁1 2 小时后，则检测不到i r t l 蛋白。通过转基因发现，上r ”只在根中检测到，与e i d e 等人( 1 9 9 6 ) 结果一致。此外上r 刀的过量表达与野生型相比富集高水平的c d 和z n ，说明i r t l 同样转运这类 金属。研究表明，上r 玎是一个相对非特异性的二价阳离子转运体。c o h e n 等( 1 9 9 8 ) 研究发现上r 在酵母中表达时，不能恢复铜吸收突变体c 伊，的生长，说明皿刀不涉及铜的转运。v e r t 等人( 2 0 0 2 ) 得研究表明上r 刀是拟南芥缺铁胁迫时铁吸收所必须的，是高亲和金属离子吸收系统的主要成员。 2 中国农业大学硕士论文文献综述 运用t - d n a 插入失活的方法，筛选得到一个豫丌基因的突变体i r t l j ，该植物在缺铁胁迫下表 现出严重的失绿症和生长缺陷，甚至致死，重新供铁时该突变株可以恢复生长。通过荧光定位分 析发现腰刀基因定位在质膜上。腰刀启动子控制下的g u s 基因的表达活性分析以及原位杂交结 果显示，在缺铁胁迫时，豫 基因在植物根外表细胞层中特异表达，说明皿 基因的启动子区 具有强烈感受缺铁信号的顺式元件c o h e n 等( 1 9 9 8 ) 证明，上r ”在豌豆根中受缺铁胁迫诱导表 达，除了转运铁之外，同时还促进一些其它的重金属二价阳离子如c d 2 + ，z l l 2 + ，m n 2 + ，c o s + 的转 运。推测二价铁转运蛋白可能是一个相对非特异性的二价阳离子转运体。v e r t 等( 2 0 0 1 ) 发现z r 乃 基因也受缺铁胁迫诱导表达，被定位于质膜内侧，推测其在细胞内对f e 2 + 起转运作用。 在植物重金属转运体中还有n r a m p 基因家族，推测其可能参与植物体内铁离子平衡，在分 子水平上参与金属离子区域化。现已从拟南芥朋蝴基因家族中克隆得到4 个基因：n r a m p i ， n r a m p 2 、n r a m p 3 ，n r a m p 4 ( t h o m i n e 等，2 0 0 0 ) 。这些蛋白能够运输铁、锰、锌、铜、钴等 离子。c u r i e 等( 2 0 0 0 ) 认为n r a m p 蛋白具有1 2 个跨膜结构域和一个保守的转运基序。拟南芥 中n r a m p 3 和n r a m p 4 能够互补酵母f e t 3 f e t 4 突变体的表型，并在酵母中调节铁的吸收( t h o m i n e 等，2 0 0 0 ) 。水稻中o s n r a m p l 也能互补酵母f e t 3 f e t 4 突变体，但是互补效应要比a t n r a m p 3 低( t h o m i n e 等，2 0 0 0 ) 。o s n r a m p 2 和a t n r a m p 2 则不能使酵母f e t 3 f e t 4 突变体的表型恢复， 表明这两个蛋白可能不是铁转运蛋白( c u r i e 等，2 0 0 0 ) 。另外他们的研究还发现，o s n r a m p l 和 a t n r a m p l 主要在根中表达，o s n r a m p 3 、a t n r a m p 3 和a t n r a m p 4 在根与地上部表达，缺铁时 a t n r a m p l 、a t n r a m p 3 和彳优阴脱w 表达量增强。另外通过t - d n a 插入得到的a t n r a m p 3 突 变体在受到缺铁胁迫时并未表现出明显的黄化症状，但是该突变体对镉的抗性却比野生型强。 1 3 2 机理i i 植物吸收铁机理研究 机理植物是指禾本科植物。这类植物在缺铁胁迫下分泌和释放高铁载体，高铁载体与铁结 合形成载体复合物，并在质膜上产生一种对植物铁载体复合物具有高度亲和力的吸收转运系统， 从而可以有效地吸收和利用r r 适应缺铁胁迫。高铁载体为麦根酸类( m a s ) ，对f c r 有着强烈 的亲和能力并能形成稳定的的f e ”螯合物。目前发现6 种m a s 类载体：脱氧麦根酸、阿凡酸、 麦根酸、表羟基脱氧麦根酸、羟基麦根酸、表羟基麦根酸。关于m a s 的生物合成途径已得到明确 阐述：l 蛋氨酸是合成前体，它与a t p 形成s 腺苷甲硫氨酸( s a m ) ，在烟碱腺胺合成酶( n a s ) 的催化下，形成烟碱腺胺( n a ) ，然后在烟碱腺胺氨基转移酶( n a a t ) 等的催化下经过一系列 的步骤形成脱氧麦根酸( d m a ) ，再转化为麦根酸( m a ) 和差向异构3 羟基麦根酸( e p i - h d m a ) 等麦根酸类植物高铁载体。 与麦根酸生物合成的基因主要有：跚 n a s ，n a a t 和y s l 等。s 腺苷甲硫氨酸合成酶是 植物代谢中的一个关键酶，它催化甲硫氨酸与a t p 合成s - 腺苷甲硫氨酸( s a m ) 。尼克烟酰胺( n a ) 存在于所有植物中，研究认为其可能作为二价金属离子f j ”，c u 2 + 、z n 2 + 等内源螫合剂，在这些 金属元素的长距离运输中起转运作用( s t e p h a n 等，1 9 9 6 ) n a a t 是m a s 合成过程中有一个关键 酶。t a k a h a s h i 等( 1 9 9 7 ，1 9 9 9 ) 已经成功地从大麦根中纯化得到n a a t 蛋白，并且发现n a a t 的活性受缺铁胁迫诱导，当恢复供铁时活性则受到抑制。c u r i e 等( 2 0 0 1 ) 从玉米中分离得到z m y s l 基因。z m y s l 基因在玉米根和叶中受缺铁胁迫诱导而加强表达此外，还有其他与缺铁胁迫相关 3 中国农业大学硕十论文 文献综述 的基因：f d h 和a d h 等。s u z u k i 等( 1 9 9 8 ) 从大麦的根中分离出甲酸脱氢酶f d h 蛋白。通过 文库筛选得到f d h 基因。n o r t h e r n 杂交表明，缺铁胁迫下，f d h 在大麦根部加强表达而在叶中则 不表达，当恢复供铁时，在根和叶中都检测不到该基因。因此认为f d h 基因在根中受缺铁胁迫特 异性的表达。与f d h 相似，乙醇脱氢酶( a d h ) 也是在缺铁条件下诱导表达的基因。印莉萍等 ( 2 0 0 0 ) 构建了缺铁诱导的玉米根系e d n a 文库，并通过差异筛选得到6 个阳性克隆，在缺铁条 件下加强表达的有f d r 3 。n o r t h e r n 杂交的结果表明。f d r 3 在铁缺乏条件下加强表达。但是该基因 与已经发现的禾本科植物大麦根中麦根酸合成有关的基因没有同源性，说明此基因可能编码另外 与铁吸收有关的蛋白，使缺铁胁迫的研究又向前推进了一步。 1 4f e ”还原酶基因的研究进展 1 4 1 酵母f e 3 + - 还原酶基因 真核生物酵母( s a c c h a r o m y c e ac e r e v i s i a e ) 吸收利用铁的机制与机理i 植物相似。目前已经 克隆到两个f e ”还原酶基因：f r e l 基因和f r e 2 基因。d a n c i s 等( 1 9 9 0 ) 通过功能互补法分离克 隆到胁，基因。g e r o g a t s o u 和a l e x a n d r a k i ( 1 9 9 4 ) 发现了第二个f e ”还原酶基因f r e 2 。，k ，和 f r e 2 基因分别编码质膜上的两种f c ”还原酶，可以使f d + 还原成为f e 2 + 形式。 m ，基因开放阅读框为1 0 5 8 b p ，编码6 8 6 个氨基酸残基，分子量约为7 8 8 k d a ，f r e l 蛋白 是一种核黄索蛋白，具有f a d 和n a d p h 的结合位点。4 个主要的组氨酸被认为是细胞色素b 血 红素配基。f r e l 蛋白中含有6 个可能的n 糖基化位点和7 个疏水跨膜结构域，其n 端2 2 个氨 基酸可能为信号肽。f r e i 蛋白c 末端有4 0 2 个氨基酸与人的吞噬细胞c y t b s s 8 蛋白有1 7 9 的 一致性和6 2 2 的相似性。c y t b s s 8 是呼吸链末端成分，跨膜转移n a d p h 提供的电子给细胞外 的氧。故推测f r e i 把其得到的电子跨膜转移给f c ”。 ，力基因开放阅读框为2 1 3 3 b p ，编码7 1 1 个氨基酸残基，分子量约为3 2 i k d a ，f r e 2 蛋白 c 末端具有n a d p h 及f a d 结合位点，定位于细胞质膜的外侧，与细胞质膜的电子传递有关其 n 端2 3 个氨基酸被推测为信号肽。f r e 2 与，托j 所编码的氨基酸序列同源性很高，二者都受缺铁 胁迫诱导表达，但在表达时间上有差异，f r e l 在缺铁早期被活化表达，f r e 2 则在缺铁晚期表达。 另外将f r e l 突变时，菌株在缺铁条件下难以生长，但仍保留f e 3 + 还原酶活性；而突变f r e 2 时， 菌株在缺铁条件下却可以正常生长，说明m ，基因在酵母缺铁应答中起关键作用。 1 4 2 高等植物f e 3 + - 还原酶基因 h o l d e n 等( 1 9 9 1 ) 从番茄根部细胞质膜中纯化得到一种蛋白，研究发现在缺铁胁迫下，植物 的幼嫩侧根表皮细胞质膜上的f e 3 + _ 还原酶具有很强的活性。一种3 5 k d a 的多肽和一种7 0 k d a 的 蛋白已经从番茄根细胞膜中得到部分纯化，经证实具有f e ( h i ) 螯合物还原酶活性。 p a o l o 等( 1 9 9 5 ) 从玉米根中分离到f e ”还原酶蛋白。该蛋白被命名为n a d h f e ( i ) - e d t a 还原酶，分子量为2 1 0 k d a ，可以分解为2 8 k d a 和4 6 k d a 亚基。2 8 k d a 亚基的电子受体为高铁氰 化和物和f e ”螯合物。4 6 k d a 亚基具有高的铁氰化合物还原酶活性和相对低的f e ”一螯合物还原 4 中国农业大学硕十论文文献综述 酶活性。 r o b i n s o n 等( 1 9 9 9 ) 首次从拟南芥中分离克隆到两个f e ”还原酶基因a t f r 0 1 和a t f r 0 2 。 一职d f 基因编码1 1 0 5 个氨基酸，a t f r 0 1 蛋白具有9 个疏水结构域，含有一个f a d 结合位点和 一个n a d p h 结合位点。a t f r 0 2 基因编码7 2 5 个氨基酸，a t f r 0 2 蛋白也具有9 个疏水结构域， 同时含有一个f a d 结合位点和一个n a d p h 结合位点，定位于细胞质膜的外侧，还具有两对保 守的涉及血红素结合的h i s 残基。因此推测a t f r 0 2 的作用是：参与从细胞质n a d p h 至f a d 的 电子传递，然后电子通过两个连续的血红色素集团传递给胞外的电子受体f e 3 + 一螫合物，将 f 矿还原成r e 2 + o 半定量r t - p c r 表明：a t f r 0 1 和a t f r 0 2 在根部受缺铁胁迫诱导表达，且a t f r 0 2 转录物丰度比a t f r o i 转录物丰度要高，即a t f r 0 2 的转录水平的提高是对缺铁胁迫的反应。通 过e m s 诱变法得到拟南芥f e 3 + 还原酶突变体f r d l ，发现该突变体在缺铁胁迫时表现出严重的 黄化症状，甚至死亡。将f r 0 2 基因转k f r d l j 突变体进行功能互补实验，结果表明，f r 0 2 基 因的表达互补了f r d l j 突变体的表型，并且转基因植株中根表f e s + 还原酶活性得到恢复，确定拟 南芥根部的f r 0 2 具有f 矿还原酶活性以拟南芥基因组d n a 为模板，扩增得到a t f r 0 1 和 a t f r 0 2 基因组序列a t f r 0 1 基因组序列全长3 0 7 6 b p ，包括7 个内含子和8 个外显子。a t f r 0 2 基因组序列全长为3 6 4 7 b p ，也包括7 个内含子和8 个外显子。除了a t f r 0 1 和a t f r 0 2 之外，从 拟南芥中还鉴定出了其它f r o 基因，它们的产物在不同的器官或特定的细胞类型中调控铁的吸 收( r o b i n s o n 等，1 9 9 7 ) 。 w a t e r s 等( 2 0 0 2 ) 从豌豆( p i s u ms a t i v u m ) d p 克隆了f 矿还原酶基因胴0 1 。p s f r 0 1 基因编 码7 1 2 个氨基酸残基蛋白分子量约为8 0 5 k d a 。p s f r 0 1 与拟南芥a t f r 0 2 蛋白具有7 4 的同 源性。p s f r 0 1 蛋白具有l o 个跨膜结构域，n 一端和c - - 端都位于胞外，与拟南芥a t f r 0 2 正好 相反，具有一个f a d 和一个n a d p h 结合位点，定位于胞质，与拟南芥a t f r 0 2 一致，血红素结 合位点的两对h i s 残基定位于第v 和v 1 1 个跨膜结构上p s f r 0 1 的基因组序列全长3 0 7 5 b p ，包 含7 个内含子和8 个外显子半定量r t - p c r 结果表明：p s f r o i 基因在豌豆的根和叶片中都能 表达；正常供铁时，该基因表达量比较低，当植株受到缺铁胁迫时基因表达加强，说明脚d 基因在豌豆根和叶片中均受缺铁胁迫诱导表达。将p s f r o i 基因转入到野生型酵母中，发现转基 因酵母的f c r 还原酶活性得到了显著提高 “等( 2 0 0 4 ) 从番茄中克隆到一个耐+ 还原酶基因l e f r 0 1 。l e f r 0 1 开放阅读框有2 3 8 3 b p ， 编码7 1 9 个氨基酸，分子量约为8 1 1 k d a 。i a f r 0 1 与拟南芥a t f r 0 2 具有7 8 的同源性，与豌 豆的p s f r 0 1 具有8 l 的同源性。l e f r 0 1 蛋白具有1 0 个跨膜结构域，具有一个f a d 和一个 n a d p h 结合位点，在第v 和第v 1 1 个跨膜螺旋上具有两对与血红素相结合的h i s 残基。l e f r o 的基因组序列全长3 1 7 0 b p ，包含7 个内含子和8 个外显子，与a t f r 0 2 和p s f r 0 1 的基因组序列 有高度的相似性。s o u t h e r n 杂交表明i a f r 0 1 基因是单拷贝，但是可能存在4 6 个与其有关的 其它基因n o r t h e r n 杂交表明l e f r 0 1 在番茄根、叶，花、予叶和幼果中均有表达，在番茄根部， l e f r 0 1 随缺铁处理时间的增加而加强表达，而在番茄叶片中，l e f r o i 表达量比较高，并且不 受缺铁胁迫的诱导，表明缺铁胁迫下，l e f r 0 1 在番茄的根和叶片中存在着不同的表达调控模式 此外还从苜蓿、黄瓜、水稻中克隆得到f e 抖还原酶基因，其表达调控机制正在研究之中。 5 中国农业大学硕十论文 文献综述 1 5 小金海棠吸收铁机理研究 小金海棠( m a l u s x i a o j i n e n s i s c h e n g e tj i a n g ) 是苹果属铁高效基因型植物( h a n 等，1 9 9 4 ) 。 缺铁胁迫下，小金海棠表现出典型的机理i 植物缺铁适应性反应( 韩振海和沈隽，1 9 9 1 ：韩振海 和许雪峰，1 9 9 5 ；刘书娟1 9 9 3 ) ，根系的a r p 酶活性得到提高，根系分泌物的电导率也得到提高， 而且对铁的亲和力和吸收能力均较强( 王永章，1 9 9 4 ) r 根系对f 矿的还原能力是山定子的3 倍 ( 韩振海等，1 9 9 5 ) ；根系自由空间铁积累量大，对铁的活化能力强( 张福锁等，1 9 9 6 ) ；根系具 有较高的阳离子交换量( h a r t 等，1 9 9 8 ) 。 有关小金海棠的蛋白质方面的研究已取得了一定进展。小金海棠在缺铁胁迫2 0 天后出现一 条分子量较低的特异蛋白带，并推测与缺铁有关( 平吉成，1 9 9 4 ) 。蛋白质双向电泳分析表明， 在缺铁胁迫下有三条多肽的表达量明显提高( 于青一，2 0 0 0 ) 。鉴定了2 个缺铁胁追下下调表达 的蛋白，都属于s 。腺苷甲硫氨酸家族，具有催化a t p 和甲硫氨酸合成s 腺苷甲硫氨酸的功能( 郭 函子，2 0 0 5 ) 。 有关小金海棠的分子水平研究方面，现已构建好小金海棠缺铁胁迫下的e d n a 文库，为苹果 铁高效基因的克隆奠定了基础( 解自典，2 0 0 1 ) 。利用m r n a 差别显示的方法( m r n ad i f f e r e n t i a l d i a p l a y ，d d r t - p c 鼬已经得到7 个阳性克隆( 张勇，2 0 0 2 ) 。此后克隆了小金海棠二价铁转运蛋 白基因m x i r t l 的c d n a 全长( 戚金亮，2 0 0 3 ) 。利用异源探针筛选得到小金海棠转录因子m x m y b l 基因全长( 曹冬梅，2 0 0 3 ) 。利用r a c e 法分离得到与小金海棠抗缺铁相关的基因m x s a m s ( 郭 函子，2 0 0 5 ) 。 1 6 研究目的与意义 苹果是我国一种重要的经济作物，由于土壤的盐渍化而导致其发生缺铁黄叶病。前人采用多 种方法来缓解其黄化失绿症，但都无法从根本上解决植物缺铁状况( 韩振海，1 9 9 0 ) 。随着植物营 养分子生物学的飞速发展，筛选吸收、转运和利用铁能力强的基因型植物被公认为解决果树缺铁 失绿症的根本途径。 小金海棠是苹果属铁高效基因型植物，在缺铁情况下小金海棠对铁具有较高的吸收能力( 韩 振海和许雪峰，1 9 9 5 ) ，同时表现出典型的机理i 植物缺铁反应特征( 韩振海，1 9 9 0 ) 。 多年来，对于小金海棠铁高效机理方面分别在蛋白水平以及分子水平上进行了研究，克隆了 一系列与缺铁胁迫相关的基因，包括编码二价铁转运蛋白的基因m x l r t l ( 戚金亮，2 0 0 3 ) ，转录 因子m x m y b l ( 曹冬梅，2 0 0 3 ) 等，但是铁吸收中一个关键的因子f e t 还原酶基因还没有进行细致 的研究。 本文以小金海棠为试材，克隆f e s + 还原酶基因m x f r 0 2 ，分析了该基因的表达情况，并在酵 母中初步研究该基因的功能，试图从分子水平解释小金海棠缺铁适应性反应的机理。 6 中国农业大学硕士论文材料与方法 2 1 实验材料 第二章材料与方法 2 1 1 小金海棠f 矿还原酶基因m x f r 0 2 的克隆及序列分析 ( 1 ) 材料与处理 小金海棠( m a l u sx i a o j i n e n s i sc h e n ge tj i a n g ) 组培苗在生长培养基( m s + 0 5 m g li b a + o 2 m g l6 - b a ) 生长到茎木质化后转移至生根培养基( i 2 m s + i 0 m g li b a ) ，待长出白根后转 移到半营养液练苗1 个月，然后用完全营养液( h a s 等，1 9 9 4 ) 每周更换一次。目光灯恒定光源， 光强1 5 0 0 1 x ，光照1 4 h ，室温2 4 - 2 8 ( 2 ，相对湿度8 5 。待每株水培苗长出1 0 - 1 2 片真叶时开始进 行缺铁胁迫( e d t a - n a f c ，0 p m ) ，正常供铁( e d t a - n a f e 4 0 p m ) 为对照。分别取正常供铁及 缺铁处理2 - 6 天的白色新根及叶片，液氮速冻后置于8 0 ( 2 冰箱保存备用。 ( 2 ) 菌株和载体 大肠杆菌菌株为e e o l i d h 5 8 ；p e a s y - t i 载体购自北京全式金生物技术有限公司。 ( 3 ) 试剂 t a g 酶及d n l p 购白天根生物技术有限公司；反转录酶p o w e r s e r i p t t m r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e 自c l o n t e c h 公司；儆m l a p c r t m i nv t r o c l o n i n g k i t 月q 自t a k a r a 公司：r n a s c - f r c c d n a s e 购自l n v i t r o g c n 公司；引物合成由上海生工生物有限公司；m a r k e r 购自t a k a r a 公司；玻璃 奶回收试剂盒购自博大泰克公司；d e p c ，e d t a 、氯化锂、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、琼 脂糖、抗生素等常用生化试剂均购自本校供应科。 2 1 2 小金海棠f c 3 + 还原酶基因m x f r 0 2 的表达特异性分析 ( 1 ) 材料 所用材料为小金海棠，栽培条件及处理同2 1 1 中( 1 ) 。 ( 2 ) 试剂 r n a 提取及p c r 涉及的试剂同2 1 i 中( 3 ) 。 2 1 3 小金海棠f c 3 + 还原酶基因m x f r 0 2 酵母表达载体的构建及转化 ( 1 ) 菌株与载体 大肠杆菌菌株为e c o l i d h 5a ；酵母菌菌株为0 y 1 4 5 7 ( m a t aa d e 6u r a 3 - 5 e , l e u 2 - 3 , 1 1 e , t r p l - 1 , 打f 广以1 5 , c a n l - 1 0 0 ( o c ) ) ) 酵母表达载体为p y e s 2 0 。 7 中国农业大学硕十论文 材料与方法 ( 2 ) 培养基 参照g i e t z 和w o o d s ( 2 0 0 2 ) 配置y p d 液体、固体培养基以及s d u r a 液体、固体培养基。 2 1 4 小金海棠f e ”还原酶基因m x f r 0 2 植物表达载体的构建及转化 拟南芥野生型为c o l - o ，由本实验室保存。拟南芥突变体j 一j 由美国d a r t m o u t hc o l l e g e 的 生命科学系r o b i n s o n 教授惠赠。 拟南芥种子在7 0 的乙醇中浸泡2 r a i n ，再用1 0 次氯酸钠消毒1 0 r a i n ，用无菌水洗3 次，置 于4 c 黑暗下春化2 - 3 天，播种于m s 培养基上。日光灯恒定光源，光强1 5 0 0 1 x ，光照1 6 h ，室温 2 2 c ，相对湿度8 5 。植株长出4 片真叶时，移入土中( 营养土：蛭石= l ：1 ) 培养，待植株成 熟后收种子。 ( 2 ) 菌株与载体 大肠杆菌菌株为e c o l i d h 5 口；农杆菌菌株为g v 3 1 0 1 ；植物表达载体为p c b 3 0 2 3 。 ( 3 ) 试剂 参照分子克隆实验指南( 第三版) 配置y e b 液体、固体培养基。s i l w e t l - 7 7 由生物学院 巩志忠院长惠赠。除草剂b a s r a ( 商品名为f i n a l e ，有效成分为5 7 8 ) 由本院植保系老师倪汉文 教授惠赠。 2 2 实验方法 2 2 1 小金海棠f e ”还原酶基因m x f r 0 2 的克隆及序列分析 ( 1 ) 小金海棠总