（生物化学与分子生物学专业论文）睾丸蛋白酶体的鉴定及其功能研究.pdf

北京协和医学院博 ：研究生论文 目录 中文摘要1 a b s t r a c t 。4 前言7日u 吾7 实验材料9 实验方法1 4 实验结果4 2 第一部分蛋白酶体的纯化及活性鉴定4 2 第二部分蛋白酶体亚基的表达水平、定位、克隆及表达纯化5 7 第三部分n r d p l i n f 4 l 和b r u c e a p o l l o n 蛋白表达水平同细胞周期变化的关系7 4 讨论7 7 1 、2 6 s 蛋白酶体的纯化条件。7 7 2 、蛋白酶体的组织特异性7 9 3 、生精细胞发育过程中蛋白酶体相关亚基的定位8 4 4 、n r d p l i 矾f 4 1 和b r u c e a p o l l o n 蛋白表达水平同细胞周期的关系8 6 结论8 8 参考文献8 9 附录：英、汉名词对照9 3 综述9 4 致谢。10 5 学位论文原创性及真实性声明1 0 7 学位论文及相关实验材料使用授权书1 0 8 在读期间论文与会议摘要写作情况1 0 9 北京协和医学院博 ：研究生论文中文摘要 中文摘要 真核生物2 6 s 蛋白酶体由两部分构成，负责催化底物降解的2 0 s 催化颗粒和连接在 2 0 s 两个末端的1 9 s 调节颗粒，其中2 0 s 催化颗粒是由四个环状结构叠合在一起形成的 对称的桶状结构( q p p q ) ，由于其内表面p s m b 5 、p s m b 7 和p s m b 6 三个亚基的存在， 两个p 环具有c h y m o 时p s i n - l i k e 、缸y p s i l l - l i k e 和c a s p a s e l i k e 三种催化活性。在i f n y 的 诱导下，这三个亚基可被p s m b 8 、p s m b l o 和p s m b 9 替换，成为可增强抗原递呈作用 的免疫蛋白酶体的一部分。 本实验室前期研究结果显示家兔睾丸中除含有普通的2 6 s 蛋白酶体外，还可能存在 两种不同类型的蛋白酶体。它们包含功能未知的蛋白酶体激活因子p s m e 4 ，其2 0 s 催 化颗粒还存在着不同的亚基( 比如，尚未见报道的p s m a 7 1 i k e 亚基和存在于免疫蛋白酶 体的的亚基) 。我们在纯化牛肌肉、睾丸和脾脏中的蛋白酶体时发现，从这三种组织来 源的蛋白酶体在从阴离子交换柱上洗脱的时候所需的离子强度不同。利用短肽荧光底物 对我们从牛肌肉、睾丸和脾脏中纯化的2 6 s 蛋白酶体进行酶活性分析的时候发现，我们 初步发现，从牛睾丸中纯化出的蛋白酶体的c h y m o 时p s i nl i k e 活性要显著低于从牛肌肉 和脾脏中纯化出的蛋白酶体的活性( p o 0 5 ) ，睾丸蛋白酶体的t 帅s i nl i k e 活性显著高 于肌肉和脾脏中的蛋白酶体的活性( p 0 0 5 ) 。 在应用体外培养的生精细胞系和体细胞系进行实时定量p c r 实验和w e s t e mb l o t 实验时发现，在所选的细胞系中都存在着表达水平类似的p s m b 5 基因，但是在培养的 精原细胞株和精母细胞株( g c 1 s p g 和g c 2 s p d ) 中存在着较高水平的p s m b 8 基因的 表达，而在其他两种体细胞株( n i h3 t 3 和c 2 c 1 2 ) 中却并未发现这种基因的表达。应 用p s m e 4 的抗体在精母细胞系g c 2 s p d 中进行免疫沉淀实验来确认同p s m e 4 结合的 2 0 s 蛋白酶体类型时我们发现，蛋白酶体的催化亚基中p s m b 8 、p s m b 9 、p s m b 6 和 北京协和医学院博十研究生论文中文摘要 p s m b 7 都可以同p s m e 4 共沉淀下来，而蛋白酶体的组成亚基p s m b 5 和在i f n 吖诱导 下产生的亚基p s m b l o 都不能同p s m e 4 共沉淀，提示由这两种催化亚基参与所构成的 2 0 s 蛋白酶体可能不与p s m e 4 发生结合。而应用p s m e 4 的抗体在体细胞系n i h3 t 3 中进行免疫沉淀实验时却并未沉淀下来蛋白酶体的催化亚基，提示在体细胞中虽然也存 在着p s m e 4 的表达，但是可能并不参与组成蛋白酶体。 应用原位杂交技术观察了小鼠睾丸组织切片中p s m e 4 、p s m b 8 和p s m b 5 在生精 细胞不同发育阶段中的表达情况。发现p s m e 4 、p s m b 8 和p s m b 5 的基因表达水平随 生精细胞处于不同的发育阶段而存在着差异，以生精细胞发生周期中的v i i i 期为转折 点，在此期之前，p s m e 4 、p s m b 8 和p s m b 5 在圆形精子中的表达呈现阳性反应，而 粗线期精母细胞( p a c h y t e n es p e 肌a t o c y t e ) 中的表达为阴性反应；v i i i 期之后，这三种 基因在粗线期精母细胞中的表达转为阳性反应，而在圆形精子和细线期精母细胞 ( l e p t o t e n es p e m a t o c y t e ) 中的表达为阴性，此外这三种基因在各期的s e n o l i 细胞和长 形精子细胞中的表达呈现阴性反应。此外应用p s m b 8 和p s m b 5 的抗体进行免疫组织 化学实验时我们初步发现，p s m b 5 在一些间质细胞内存在着高水平的表达，p s m b 8 在 睾丸组织内的各种细胞中均有表达，在生精细胞的细胞核中均未发现有p s m b 5 的表达， 除了长形精子细胞的细胞核，p s m b 8 在各生精细胞核中均发现存在着表达。 这些结果提示在睾丸内精子细胞发生的不同时期及其不同的细胞器内，蛋白酶体的 亚基组成模式可能存在着差别，这可能同精子细胞在发育的不同时期所经历的细胞事件 有一定的关系。 真核细胞内即将被2 6 s 蛋白酶体降解的蛋白质底物一般都携带有一个泛素标签，这 个泛素标签是通过一系列的酶促反应泛素化反应而实现的，参与这一系列反应的酶 分别被命名为e 1 、e 2 和e 3 。e 1 是泛素激活酶( u b i q u i t i n - a c t i v a t i n ge n 巧m e ) ，可以利 用a t p 降解所产生的能量激活泛素以形成高能的硫脂键，接着激活的泛素分子可以被 转移到e 2 泛素载体蛋白( u b i q u i t i nc a 玎i e rp r o t e i n ) ，最后在e 3 泛素连接酶( u b i q u i t i n l i g a s e s ) 的协同作用下，将多聚泛素链转移到底物分子上，之后这种“标记 的蛋白质 底物分子可以为2 6 s 的蛋白酶体所识别并继而被降解。 研究表明一些参与细胞凋亡途径的蛋白质在果蝇精子细胞的发育阶段发挥着非常 重要的作用。同时具有泛素载体蛋白( e 2 ) 和泛素连接酶( e 3 ) 活性的巨型凋亡抑制 2 北京协和医学院博l 研究生论文中文摘要 蛋白( i i l l l i b i t o ro f a p o p t o s i sp r o t e i n ) b r u c e a p o l l o n 被证明可以保护精子细胞核免于过 度的浓缩和退化，因此推测其在生精过程中可能具有非常重要的功能。最新研究表明， b i m c e 还控制有丝分裂后子细胞的最终分离。由于b r u c e 蛋白是泛素连接酶 n r d p l i 矾f 4 l 的底物，我们观察了n r d p l 删f 4 l 蛋白及b r u c e 蛋白的表达水平同细 胞周期进行的关系，发现n r d p l i 斟f 4 1 蛋白的表达水平随细胞周期的变化而变化，其 表达水平在g 2 期早期( 同步化释放后3 6 小时间) 出现升高，在同步化释放后1 8 2 4 小时间升至最高。而b r u c e 蛋白的表达水平同n r d p l 蛋白的表达水平较为类似，但似 乎落后于n r d p l 蛋白水平的变化，在g 2 期( 同步化释放后6 小时) 开始出现升高，之 后表达水平一直处于升高状态，在同步化释放的早期，细胞处于s 期时表达水平最低。 这些结果表明，n r d p l 可能通过控制b r u c e 的泛素化和降解而参与细胞周期的调控。 这两种蛋白质在精子发生中的作用尚待进一步研究。 综上所述，我们在哺乳动物睾丸中发现了新型的、具有特异组成和活性的蛋白酶体。 同时，我们发现泛素连接酶n r d p l r n f 4 l 很可能参与细胞周期的调控。 3 北京协和医学院博l ：研究生论文英义摘要 a b s t r a c t t h ep r o t e a s o m ei nt h ee u k 蜀呵o t i cc e l l si sc o m p o s e do ft w o p a n s ，2 0 sc a t a l y t i cc o m p l e x ， w h i c hc l e a v e sp r o t e i ns u b s t r a t e s ，a i l dt h e19 sr e g u l a t o 巧c o m p l e x ，w h i c hb i n d so n eo rb o m e n d so f2 0 sc o m p l e xa n dr e g u l a t e st l l ea c t i v 时o ft h e2 0 sp 枷c l e t l l e2 0 sc a t a l ”i cc o m p l e x i sas y m m e t r i c a l ，c y l i n d e r - s h a p e dp a r t i c l ec o m p o s e do ff o u rr i n g s ( a p p a ) n u e ec a _ t a l 如c s u b u l l i t sp s m b 6 ，p s m b 7a n dp s m b 5w i mc h y m o n y p s i n l i k e ，仃y p s i n 1 i k ea i l dc a s p a s e l i k e a c t i v i t i e sl i e 晰t l l i nt 1 1 et 、0i n s i d ep a c k e dpr i n g s u n d e rt h ei n d u c t i o no fi f n 吖，t h e s et h r e e c a t a l y t i cs u b u l l i t sc o u l db er e p l a c e db yp s m b 9 ，p s m b l0a n dp s m b 8 ，w m c ha r eap a r to f t h ei m m u n o p r o t e a s o m ei r o l v e di na n t i g e np r e s e n t a t i o n p r e v i o u sr e s u l t sf 而mo u rg r o u ph a v es h o w nt h a t 铆ot ) r p e so fp r o t e a s o i n e sd i 仃e r e n t f 如mt l l e2 6 sp r o t e 嬲o r n ec a nb ep u r i f i e df 玷mr a _ b b i tt e s t e s t h e s ep r o t e a s o m e sc o i l t a i n p s m e 4 ( ap r o t e a s o m a la c t i t o rw i mu n l ( i l o w n 胁c t i o i l s ) ，an c wp s m a 7 一l i k es u b u i l i t ，a n da f e ws u b u l l i t su s u a l l yp r e s e mi nt 1 1 ei m m u i l o p r o t e a s o m e i nt h ep r o c e s so fp u r i f i c a t i o no ft h e b o v i n em u s c l e ，t e s t i sa n ds p l e e np r o t e 2 l s o m e s ，w ef o u n dt h a td i 虢r e l l tc o n c e n t r a t i o n so fn a c l 、e r en e e d e dt 0e l u t et l l e s ep r o t e a s o m e sf b ma na n i o ne x c h i i l g ec o l u m n b yu s i n gt h e p e p t i d ef l u o r e s c e n c es u b s t r a t e ，、ed e t e m l i n e dt h ea c t i v i t i e so ft l l ep r o t e a s o m ef 幻m l e s e t i s s u e s 弛df o u n dt l l a tt l l ec h y m o 奶，p s i n - l i k ea c t i v i 够o ft e s t i sp r o t e a s o m ew 嬲s i g i l i f i c 锄t l y l o w e rt h a l lm a t 舶mm u s c l e 觚i ds p l e e n ( p 0 0 5 ) n l et 啪s i n - l i k ea c t i v 毋o f 恤t e s t i s p r o t e a s o m ew a ss i 鲥f i c a n t l yl l i g h e rt l l 锄t h a to ft h ep r o t e 邪o i n ep u r i f i e df r o mm u s c l e 锄d s p l e e n ( p 0 0 5 ) b yu s i n gt h er e a l - t i m ep c r a i l dw e s t e mb l o te x p e r i m e n t s ，w ef o u n ds i m i l a re x p r e s s i o n l e v e l so fp s m b 5i nt h es p e 肌a t o g o n i ac e l ll i n e ( g c ls p g ) ，s p e n n a t o c y t ec e l ll i n e ( g c 一2s p d ) 4 北京协和医学院博卜研究生论文英文摘要 a r l ds o m a t i cc e l ll i n e s ( n i h3 t 3a i l dc 2 cl2 ) b u tp s m b 8w 鹤f o u n dm g h l ye x p r e s s e di nt h e s p e m l a t o g o n i ac e l ll i n ea i l dt h es p e m a t o c y t ec e l ll i i l e 锄dn o td e t e c t a b l ei nt h e 铆os o m a t i c c e nl i n e s w e 如n h e rf o u n dt h a tt h ec a t a l 如cs u b u n i t sp s m b 8 ，p s m b 9 ，p s m b 6a n dp s m b 7 ， b u tn o tp s m b 5a i l dp s m bl0 ，c o u l dc o p r e c i p i t a t ew i t hp s m e 4 h o w e v e r ，w h e nt l l es i m i l a r i m m u i l o p r e c i p i t a t i o ne x p e r i m e n tw a sp e 墒m e di n n i h3 t 3c e l l l y s a t e s ，n 0c a t a l 如c s u b u i l i t s 、e r ec o - p r e c i p i 饿d 嘶t l lp s m e 4a n t i b o d y r a i s i n gt l l ep o s s i b i l i t ) ，t h a tp s m e 4 m o s t l yd o e sn o ta s s o c i a t e 诵t 1 1t h e2 0 sp f o t e a s o m ei l ls o m a t i cc e l l s u s i n g l ei n - s i t uh y b r i d i z a t i o nt e i l i q u e s ，w ea l s oo b s e r v e dt h ee x p r e s s i o np a t t e mo f p s m e 4 ，p s m b 8 觚dp s m b 5i nm o u s et e s t i s t h ee x p r e s s i o np a t t e m so ft h et l l r e es e l e c t e d g e n e sw e r eq u i t ed i 髓r e n ti nd i 位r e ms t a g e so fs p e m a t o g e n e s i s p r i o rt ot h ev i i is t a g e so f m o u s es p e 锄a t o g e n e s i s ，p s m e 4 ，p s m b 8a i l dp s m b 5w e r eo b s e r v e di nm em 眦【ds p e m l a t i d s ， b u tn o ti np a c h y t e n es p e n n a t o c ”e s a f b rt l l ev i i is t a g e s ，t l l ee x p r e s s i o no fp s m e 4 ，p s m b 8 a 1 1 dp s m b 5 、 髑o b s e r v e di np a c h y t e n es p e m a t o c y t e s ，b u tn o ti ns p e 衄a t i d s ，l e p t o t e n e s p e n n a 幻c y t e s 锄ds e r t o l ic e l l s m o r e o v e r ， a c c o r d i n g t 0 也ei n i t i a lr e s u l t so f i r 衄u n o h i s t o c h e m i s 姆诵m 趾t i p s m b 8a n d 孤t i p s m b 5 ，w eo b s e r v e dm 曲e x p r e s s i o n l e v e lo fp s m b 5i nm el e y d i gc e l l s ，、 粗l ep s m b 8 、v 弱e x t e n s i v e l ye x p r e s s e di nt h et e s t i s t i s s u e s t h ea b o v er e s u l t ss u g g e s t e dt l l a ti nt l eg e mc e l l so fd i 丘e r e n td e v e l o p m e n t ms t a g e s ， t i l ed i a e r e n tc o m p o s t i o n so fp r o t e a s o m em i g h te x i s t i l le m o a r y o t i cc e l l s ，m ep r o t e 洫s u b s t r a t eo ft h e2 6 sp t e a s o r i l eu s u a l l yc a r r i e sa n u b i q u i t i nt a g ，、v h i c h i sa d d e dt l l i o u 曲u b i q u i t i n a t i o n 1 ke i u 了m e sm v o l v e di nt l l e u b i q u i t i n a t i o ni n c l u d eu b i q u i t i n - a c t i v a t i n ge n z y m e ( e1 ) ，u b i q u i t i nc a r r i e rp r o t e i n ( e 2 ) a 1 1 d u b i q u i t n p r o t e i nl 追a s e ( e 3 ) e 1a c t i v a t e st h eu b i q u i t i nb yp r o m o t i n g 恤f o m a t i o no f 1 1 i 曲一e n e 唱ys u l 如r - e s t e r b o n di n 也ep r e s e n c eo fa t p n l e nm ea c t i v a t e du b i q u i t i nm o l e c u l ei s t m s f e 玎e dt oa ne 2 a tl a s tt h eu b i q u i t i i li st 啪s f e 圩e dt om es u b s t r a t eb ye 3 a 船rt 胁，m e s u b s t r a t e 协g g e d 、访t hp o l ”b i q u i t i nc h a i l li s 嘲e t e df o rd e 髓l d a t i o nb yt h e2 6 sp r o t e a s o m e c e r t a i n 印o p t i ) t i cp r o t e i n sp l a y e di m p o n a u l tr o l e sd u r i n gs p e m ld e v e l o p m e m f o re x 锄p l e ， 位g i 跏i l l l l i b i t o ro fa p o p t o s i sp r o t e i n ( i a p ) b r u c e a p o l l o 玛州c ha c t sa sb o t l le 2a i l d e 3 ，c a l lp r o t e c tt l l es p e 咖n u c l e u s 舶mh i 曲d e i l s ec o n d e n s a t i o na n dd e g e n e r a t i o ni n 5 北京协和医学院博上研究生论文英文摘要 d r o s h o p h i l a i n d i c a t i n g t h a tt h i s p r o t e i nm i g h tp l a y av e r ) ri m p o m m tr o l e d l l r i n g s p e 咖a t o g e n e s i s r e c e n ts t u d i e ss h o w e dm a tb i 砌c ec o n 昀l st l l em i d b o d ym g f o n n a t i o na t t h ef i n a js t a g e so fm i t o t i cc e l lc y c l e a sb r u c ew 邪t h es u b s t r a t eo ft h ee 3u b i q u i t i nl 追a s e ， n r ( 1 p1 i 矾f 41 ，w ee x 锄i n e dt h ep r o t e i nl e v e l so fn r d pl 爪n f 4 1a n db r u c e t 1 1 r o u 曲o u tm e c e l lc y c l ep r o g r e s s i o n t h ep r o t e i nl e v e l so fn r d p1 i f 41 i n c r e a s e di nm ee a r l yg 2 m p h a s e ( 31 1 0 u r sa r e rt h er e l e a s eo fs y n c h r o n i z a t i o n ) ，r e a c h e di t sp e a ka tl8 2 4h o u r sa r e rt h er e l e a s e t h ec h a l l g eo fb r u c ep r o t e i nl e v e l s 印p e a r e dal i 砌eb e h i n dt h a to fn r d p1 i t sl e v e l s i n c r e 嬲e da t6h o u r sa r e rt l l er e l e a s e 锄dk e p ti n c r e 嬲i n gm e 删s d u r i n gt h ee 砌ys t a g e s o ft h er e l e a s eo f s ) ，i l c h r o n i z a t i o n ( ss t a g e ) ，t h el o 、e s tb i w c ep r o t e i i ll e v e l s 、e r eo b s e n ，e d o u rr e s u l t sd e m o n s t l i a t et h a tn r d p1m i g h tb ei n v o l v e di nt h er e g u l a t i o no ft h ec e uc y c l eb y p r o m o t i n gu b i q u i t i i l a t i o n 瓶dd e g r a d a t i o no fb r u c e h o w e v e r m o r ee x p e r i m e n t sw e r es t i u n e e d e dt oa d d r e s s 也er o l e so ft h e s ep r o t e i n si nm ep r 0 伊e s s i o no fm a l em e i o t i cc e l lc y c l e d u r i n gs p e m a t o g e n e s i s t 酞e nt o g e m e r ，o u rr e s u l t ss u g g e s tt h a tt l l e r ea r es p e c i a l i z e df 1 0 m so fp r o t e a s o m ei n m a i i 蚰a l i 觚t e s t i s 谢t hd i s t i n c tc o m p o s i t i o i l sa l l da c t i v i 够i i la d d i t i o n ，w ef o u l l d 廿1 a tn l e u b i q u i t i nl i g a s en r d p1 r n f 4l 、v a sp r o b a b l yi n v o l v e di nc e uc y c l er e g u l a t i o n 6 北京协和医学院博上研究生论文丽两 刖罱 1 9 7 7 年，e t l i n g e r 和g o l d b e r g 从网织红细胞中发现一种依赖a t p 的蛋白质降解系 统并为后来的研究证明为泛素蛋白酶体通路之后，人们逐渐认识到体内的蛋白质降解 过程是一个有序、高度复杂并受到严格调控的过程。目前认为，细胞内大约8 0 的蛋白 质都是通过蛋白酶体降解的。在这些被降解的蛋白质底物之中，有很多蛋白质具有重要 的功能，因此通过降解这些在细胞周期、细胞增殖以及细胞信号传导方面有着重要功能 的蛋白质，蛋白酶体也参与了细胞内很多重要的生命过程。此外，细胞内大多数发生错 误折叠、被氧化损伤后失去功能的蛋白质也是通过蛋白酶体而被降解的。 对于生物群体的繁衍而言，配子发生过程中的质量控制十分重要。而有种种迹象表 明，泛素蛋白酶体通路参与了精子发生的调控和在受精过程中发生的父源线粒体的降 解以及对异常精子的清除过程【l 2 】。例如在精子的成熟过程中，染色体中组蛋白的降解， 最后为精蛋白所替代【3 】，而在组蛋白降解之前发现有几种组蛋白的泛素化反应增强，提 示泛素介导的蛋白酶体降解在组蛋白的降解过程中有着重要的作用【4 】。此外p s m e 4 是 近年发现的一种蛋白酶体的激活因子，在动物的睾丸组织中表达水平较高【5 】，但其具体 功能目前尚不明了，有报道p s m e 4 蚰的小鼠在精子发生到减数分裂阶段的精母细胞期 存在着缺陷，这一缺陷在减数分裂后期的单倍体精子形成阶段一直存在，结果导致了 p s m e 4 蚍的小鼠的生殖能力下降，这一结果提示p s m e 4 可能在动物的精子发生过程中 起着非常重要的作用【6 】。以上研究提示泛素蛋白酶体途径在动物的精子发育过程中起着 非常重要的作用。 真核生物的2 6 s 蛋白酶体由两部分构成，负责催化底物降解的2 0 s 催化亚基和连接 在2 0 s 两个末端的1 9 s 调节亚基，其中2 0 s 催化亚基是由四个环状结构叠合在一起形 成的对称的桶状结构( 0 【p p a ) ，位于内部的两个p 环具有催化的功能，各含有三个位于 其内表面的起催化作用的亚基p s m b 6 、p s m b 7 和p s m b 5 。真核生物体内的蛋白酶体 不仅只有一种类型，在i f n 吖的诱导下细胞内可以产生“免疫蛋白酶体”，其主要功能 为促进对细胞毒性t 细胞上i 型组织相容性复合体的抗原呈递【7 ，引，免疫蛋白酶体由与 1 9 s 完全不同的1 l s 调节颗粒和变异的2 0 s 催化颗粒组成，在i f n 吖诱导下产生的免疫 蛋白酶体亚基掺入组成性蛋白酶体的程度决定了在同一种组织内存在着不同的2 0 s 蛋 白酶体亚型1 9 】，并且这些蛋白酶体的亚型不仅存在于不同的组织中，在单一的细胞中蛋 7 北京协和医学院博十研究生论文前言 白酶体的亚型也是多种多样的【1 0 1 。d 枷m 锄等人【9 1 曾经发现在小鼠的肌肉中可能存在 着六种2 0 s 蛋白酶体的亚型，包括组成型以及免疫蛋白酶体，这些蛋白酶体亚型的酶活 性存在着差异，在合成了由2 5 个氨基酸残基构成的肽段并将之作为底物测试了这些不 同的2 0 s 蛋白酶体的催化活性之后，d a l l l m 锄等人发现这些不同的蛋白酶体亚型在底 物肽段上的切割位置存在差异，因此推测这些不同的蛋白酶体亚型可能在体内所起的作 用也不尽相同。本实验室的前期研究结果显示家兔睾丸中除含有普通的2 6 s 蛋白酶体 外，可能还存在两种不同类型的蛋白酶体，分别称为大睾丸蛋白酶体( l a r g et e s t i s p r o t e a s o m e ) 和小睾丸蛋白酶体( s m a l lt e s t i sp r o t e a s o m e ) 。经质谱鉴定( 1 a b l e1 ) ，发现 从睾丸中纯化的蛋白酶体不仅包含前面提及的、功能未知的蛋白酶体激活因子p s m e 4 ， 其2 0 s 催化颗粒还存在着不同的亚基( 比如，尚未见报道的p s m a 7 1 i k e 亚基和存在于免 疫蛋白酶体的的亚基) 。一般对于蛋白质而言，往往是结构决定了该种蛋白质的功能， 那么在睾丸中存在的不同亚基组成类型的蛋白酶体其功能究竟同肌肉组织中的蛋白酶 体是否存在着差别呢? 其在精细胞的发育过程中所起的作用究竟如何? 这一系列的问 题都有待于大量设计严谨的实验加以阐明，而这些问题的明确必将使对动物精子发生机 制的认识产生质的飞跃。 t a b l e1 m a s ss p e c 仃0 m e t r i ca n a l y s i so fp r o t e 嬲o m e sp u r i f i e df 而m 瑚【b b i tm u s c l ea r l dt e s t i s 本研究从纯化的肌肉( 主要为普通的2 6 s 蛋白酶体) 、睾丸和脾脏( 主要为免疫蛋 白酶体) 蛋白酶体的酶活性方面来鉴定这些不同来源的蛋白酶体是否存在着差别；此外 利用实时定量p c r 反应以及w | e s t e mb l o t 实验鉴定2 0 s 蛋白酶体各催化亚基在睾丸和肌 肉组织中是否存在着表达水平的差异，实验中对这些亚基的选取主要依赖于对t a b l e1 的分析而确定；应用原位杂交和免疫组织化学实验来确定蛋白酶体各亚基随生精细胞发 育是否出现表达水平的变化：并且利用免疫沉淀实验来确定同p s m e 4 结合的2 0 s 蛋白 酶体的催化亚基组合模式。 北京协和医学院博l 研究生论文实验材料 实验材料 1 组织 牛睾丸组织，牛脾脏组织，牛肌肉组织，兔睾丸组织，兔肌肉组织。 2 实验动物 b a l b c 小鼠均购自中国医学科学院实验动物研究所。 3 菌株 菌株 基因型用途 e 厅d h 5 0 【f 一巾8 0 d l a c z m 1 5r e c a le n d a lg y r a 9 6t h i 1用于质粒的 h s d r l7 ( r k n 墩+ ) s u p e 4 4r e l a ld e o r 扩增与转化 ( 1 a c z y a - a r g f ) u l6 9 e c 口厅b l 2 1 ( d e 3 ) h s d sg a l ( 九c h s 8 5 7 i n d ls 锄7n i n 5 l a c u v 5 一t 7 ) 用于重组蛋 白质的表达 大肠杆菌菌株由本实验室提供 4 质粒载体 p g e m t ：用于p c r 产物的克隆。 p e t 3 0 “+ ) ：用于原核细胞中基因表达。 其中，p g e m t 购自p r o m e g a 公司，p e t 3 0 a ( + ) 由本室提供。 所用载体的结构及多克隆位点如下： & 擅 p g e m - t 载体的结构及多克隆位点 9 洲 ，e舢耵惦i；镗眙糟鸺舱弘幢筠 北京协和医学院博1 ：研究生论文实验材料 p e t - 3 0 a ( + ) 载体的结构及多克隆位点 5 工具酶及d n a 分子量标准 各种限制性内切酶、t 4d n a 连接酶和d l 2 0 0 0d n am a r k e r 购自大连宝生物有限 公司。 6 试剂盒 p g e m tv e c t o rs y s t e m 购自p r o m e g a 公司，b c a 蛋白质定量分析试剂盒购自p i e r c e 公司，h i s t o s t a i n t m p l u sk i t s 免疫组织化学试剂盒购自北京中山生物技术有限公司， e c l 化学发光显色试剂盒购自s a i l t ac r u z 公司，d n a 切胶快速纯化回收试剂盒购自博 大生物公司，s u p e r s c r i p ti i 逆转录试剂盒购自i n v i 仃o g e n 公司。 7 抗体、耗材及主要化学试剂 抗p s m e 4 、抗p s m a 7 、抗p s m b 9 、抗p s m b 7 、抗p s m b l 0 、抗p s m b 5 、抗p s m b 8 、 抗p s m e l 抗体均购自b i o m o l 公司。 抗p s m b 6 抗体购自a b n 0 v a 公司。 辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔i g g 、山羊抗鼠i g g 抗体购自中山生物工程公司。 r n a s e a 购自美国s i g m a 公司，d n a s ei 购自大连宝生物工程有限公司。d 1 v r 、a t p 购自m e r c k 公司，s u c l l v y a m c 、s u c a i 承a m c 、z l l e 。a m c 购自b i o m o l 公司， m c 标准品购自i n v i t r o g e n 公司，i p t g 、x g a l 购自德国b o e l l r i n g e r m a i l l l i l e i m 公司； 1 0 北京协和医学院博上研究生论文实验材料 丙烯酰胺、n l ，n 亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵、s d s 等均购自p r o m e g a 公司；三羟 甲基氨基甲烷( t r i s ) 购自g i b c o - b r l 公司：r n a 提取所用t r i z o l 为i n v i 昀g e n 公司 产品；p v d f ( 聚偏二氟乙烯) 膜为p l l a m a c i a 公司产品；x 光片为美国k o d a l 【公司产 品；蛋白m 撒e r 是n e b 公司产品；其它各种试剂均为进口或国产分析纯试剂。 8 细菌用培养基 l u r i a a g a l r 购自g i b c o - b i u 公司。t r y p t o n c ，y e a s te x t r a c t 购自o x o i d 公司。 9 细胞系及培养基 g g l 瞄精原躲、g c 2 s p d 精母细胞系购自a t c c ，d m e m 培养基为g i b c 0b r l 公司产品；胰蛋白酶为g i b c o b r l 公司产品，胎牛血清( f b s ) 购自h y c l o n e 公司以 及天津灏洋生物公司。 1 0 主要仪器及设备 实验所用主要仪器有：j 2 h s 冷冻高速离心机( b e c k m a l l ) 、l 7 6 5 冷冻超速离心机 ( b e