（生物化学与分子生物学专业论文）香樟果实酪氨酸酶的分离、纯化和性质分析.pdf

摘要 摘要 酪氨酸酶( e c1 1 4 1 8 1 ) 是一种含铜的氧化还原酶，它广泛存在于动植物和微生物 中，与生物体内的一些色素合成直接相关。酪氨酸酶具有重要的生理生化特征，在医药、 环境、食品、精细化工等领域具有广泛的用途。因此，研究酪氨酸酶的分离纯化、酶学 性质具有一定的理论和现实意义。 通过对几十种植物材料进行粗酶液提取、酶活力测定，确定香樟( c i n n a m o m u m c a m p h o r a 仁p r e s l ) 果实为实验材料，确定酶活测定体系为：2 0m m o l lp h7 5 瞄s - h c l 缓冲液，1 0m m o l ll d o p a 。 研究了n a a ，p e g ，h 2 0 2 处理对香樟叶片和果实中酪氨酸酶活性及同工酶的影响， 结果表明：1 0 4 m o l l 的n a a 对果实成熟以及酪氨酸酶的酶活性都有一定的促进作用； 不同的渗透压对香樟酪氨酸酶的形成和活力均呈现不同程度的影响；低浓度的 h 2 0 2 ( 1 m m o u l ) 处理可以诱导酪氨酸酶活力提高。 香樟果实经过破碎、硫酸铵分级沉淀、s u p e r d e xt m 2 0 0 凝胶过滤、d e a e 一纤维素阴 离子交换色谱分离纯化后，得到一个电泳纯的酪氨酸酶。此酶最适p h 值为7 5 ，最适温 度为5 0 ，亚基分子量为4 3 k d a 。以l d o p a 为底物时，k m 为1 2 8 3m m o l l ，v m a x 为1 8 0 6 5 u m g 蛋白。 该酶热稳定性较好，在6 0 。c 保温1 h ，仍能保持9 0 以上的酶活力；该酶在p h 4 7 的范围内稳定：添加二肽a l a - a s p 和l y s v a l 在8 0 c 保温3 0 m i n 后，两种二肽均表现出 一定程度的保护作用。 提纯的香樟果实酪氨酸酶受i r a m o l l 抗坏血酸和i r n m o l l1 3 巯基乙醇，o 0 1r e t o o l l 舢3 + 和c u 寸及乌梅提取物的强烈抑制；而o 0 0 1 m m o l lz n 2 + ，2 5 0 m m o l le d t a 和女贞 果实提取物则可激活香樟果实酪氨酸酶。 关键词：酪氨酸酶；分离；纯化；性质；香樟 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t t y r o s i n a s e ( t y r ) i sac o p p e r - c o n t a i n i n ge r l z y r 工1 e ，a sk n o w na sp o l y p h e n o lo x i d a s e ， w h i c hi sw i d e l yd i s t r i b u t e di nm i c r o o r g a n i s m s p l a n t sa n da n i m a l sa n di n v o l v e di ns o m e p i g m e n tb i o s y n t h e s i s t y r o s i n a s eh a sv e r yi m p o r t a n t b i o c h e m i c a lc h a r a c t e ra n dc a l lb eu s e di n i n d u s t r y t h ep r o c e s so fa p p l i c a t i o nr e s e a r c ho ft y r o s i n s ei nd r u g ，e n v i r o n m e n t ，f o o da n df i n e c h e m i c a li n d u s t r yw a sr e v i e w e d a ss of a r ，t h es t u d i e sf o rt y r o s i n a s ei n c l u d i n gt h es e p a r a t i o n , p u r i f i c a t i o n , c h a r a c t e r i z a t i o no ft y r o s i n a s eh a v eb e e np a i da a e n f i o nt oi nt h ew o r l d i nt h i si n v e s t i g a t i o n , s o m ek i n d so fp l a n t sw e r es e l e c t e da sc a n d i d a t ee x p e r i m e n t m a t e r i a l sa n dc i n n a m o m u mc a m p h o r a ( l ) p r e s lw a ss c r e e n e da se x p e r i m e mm a t e r i a l sd u et o i t sl l i g ha c t i v i t yo ft y ri nc r u d ee x t r a c t t h et e s t i n gc o n d i t i o n so fc r u d ee n z y m e ，2 0m m o l l ， p h 7 5t r i s h c lb u f f e r , 10m m ol ll - d o p aw a sv e r i f i e d e 丘e c to ft r e a t m e n tw i t hd i f f e r e n tn a ac o n c e n t r a t i o n so nt h ei s o z y m e sa n da c t i v i t i e so f t y rf r o ml e a fa n df r u i to fc i n n a m o m u mc a m p h o r aw e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l tr e v e a l e d t h a td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fn a ah a dt h ed i f f e r e n te f f e c to na c t i v i t yo ft y ri nb o t hl e a v e s a n df r u i t s h i g l lc o n c e n t r a t i o n so fn a a ( 10 q m o l l ) s t i m u l a t e dn o to n l yt h em a t u r i t yo ft h e f r u i t b u ta l s oi n c r e a s e dt h ea c t i v i t yo ft y rc i n n a m o m u mc a m p h o r af r u i t ；d i f f e r e n to s m o t i c p o t e n t i a lh a dt h ed i f f e r e n te f f e c to na c t i v i t yo ft y ri nf r u i t s ；l o w e rc o n c e n t r a t i o n sh 2 0 2 ( 1 m m o 彪) t r e a t m e n tc o u l da l s oi n d u c et h ea c t i v i t yo ft 豫i n f r u i t s ，豫f r o mf r u i t so fc i n n a m o m u mc a m p h o r aw a sp u r i f i e db yt h ep r o c e d u r e ：t i s s u e h o m o g e n a t i o n , a m m o n i u m s u l f a t e p r e c i p i t a t i o n , s e p h a d e x g - 10 0 g e lf i l t r a t i o n ，a n d d e a e s e p h a r o s ec h r o m a t o g r a p h y t h eo p t i m u a lp ha n dt e m p e r a t u r eo ft h ep u r i f i e d ，豫 w a s7 5a n d5 09 cr e s p e c t i v e l y t h em o l e c u l a rw e i g h to fi t ss u b u n i tw a s4 3 k d a i t sa p p a r e n t k mo fl d o p aw a s12 8 3m m o l l ，t h ev m a xw a s18 0 6 5u m gp r o t e i n t h ep u r i f i e dt y r f r o mf r u i t so fc i n n a m o m u mc a m p h o r ah a dh i g ht h e r m o s t a b l i t y t h e r e s i d u ea c t i v i t yr e m a i n e dm o r et h a n9 0 a f t e ri n c u b a t i o na t6 0 。cf o rlh t h et y rw a ss t a b l e i nt h em e d i au n d e rt h ep hv a l u ef r o m4t o7 t w ok i n d so fp e p t i d e s ，e g a l a - a s pa n dl y s v a l ， c o u l di m p r o v et h et h e r m o s t a b l i t yo ft h ep u r i f i e d 厂，rw h e nr 灭w a si n c u b a t e d 甜8 0 cf o r 3 0r a i n t h ea c t i v 时o ft h ep u r i f i e dt y rf r o mf r u i to fc i n n a m o m u mc a m p h o r ai ss t r o n g l y i n h i b i t e db y0 01m m o l la 1 3 + a n dc d + ，1m m o l lv c ，lm m o l l1 3 - m e r c a p t o e t h a n o l ，a n d e x t r a c t a n t so f a r m e n i c am u m e ( s i e b ) a n de n h a n c e db yo 0 01m m o l lz n 2 + ，2 5 0 m m o l le d t a a n de x t r a c t a n t so fl i g u s t r u ml u c i d u m 口红) k e y w o r d s ：t y r o s i n a s e ；p u r i f i c a t i o n ；c i n n a m o m u mc a m p h o r a ；c h a r a c t e r i z a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是拳人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名： 墟盗舀 日 期： 丝堕! 茎! “ 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且拳人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 导师签名： 一缘 返墨丁亟产 必亏 第一章文献综述 第一章文献综述 酪氨酸酶( t y r o s i n a s c ，t 乙e c l 1 4 1 8 1 ) ，是含有铜离子( c u 2 + ) 的一种金属酶，每个 亚基含2 个金属铜离子，2 个铜离子分别与蛋白质分子中的2 个平展的组氨酸和1 个弱的直 立组氨酸配体结合，另有1 个内源桥基将2 个铜离子联系在一起，构成酪氨酸酶催化氧化 反应活性中心，酪氨酸等底物与酶形成过渡态络合物时，主要是羟基与酶的活性中心上 的原子键合而发生作用。 h i s 气u d u ： h i s t y p e 一it t 0 2 c u ( r e 曲3 】2 f i g1 - 1 p i c t o r i a lm o d e lo ft y r o s i n a s e ( c o p p e rc e n t e r s ) 1 9 1 体黑色素的形成和外来物侵入时获得性免疫反应的产生至关重要叫。其催化反应机制 由之桫h 鼍秒一潞c o m p l e 鹳x 量土h 2 0 1 1 酪氨酸酶在不同生物中的分布 酪氨酸酶广泛存在于动物、植物和微生物体内。酪氨酸酶在生物体内存在的活性形 式有：颗粒型酪氨酸酶和可溶型酪氨酸酶。这二者的具体分布表现出不均一性 例，且在不同生物中，其分布位置也有所差异。除了少数真菌中的酪氨酸酶分泌到细胞介 质中，大多数的酪氨酸酶都位于细胞内。真菌和细菌酪氨酸酶是以一种可溶形式存在， 而不是于膜相连。植物酪氨酸酶广泛分布于各种器官组织中，如花器官、分生组织、叶 片、块茎、根中，一般在幼嫩部分含量较多，而在成熟部分较少，紧密地与膜相连。 昆 虫酪氨酸酶是十分重要的种酶，其分布与生理功能息息相关，如表皮中的颗粒型酪氨酸 酶除了与表皮的骨化和黑化有关外，还与昆虫表皮的愈伤和修复有关【4 】。 江南大学硕士学位论文 不同昆虫的酪氨酸酶在体内存在的部位不同，美洲蜚蠊存在于血红细胞内，而麻蝇则 仅存在于血浆中，并且在表皮中主要以活化形式的酪氨酸酶存在。通过免疫金染色表明， 在血淋巴中产生的酪氨酸酶原可以转移到表皮中，但是，表皮中的酪氨酸酶很少转回到血 淋巴中【4 1 。 哺乳动物酪氨酸酶常见于黑素细胞中，黑素细胞是存在于皮肤，发囊和眼睛中并产生 色素的高度特异性的细胞1 7 港j 。 1 2 酪氨酸酶的功能 酪氨酸酶是生物体内色素合成的关键酶，主要影响黑色素和多酚类物质的生成。在 高等植物中，酪氨酸酶主要与植物抗病有关，它可以诱导抗营养防御反应，在受到昆虫 等动物伤害时，由酪氨酸酶催化形成的醌不尽可以与植物蛋白质作用，降低对食草动物 的营养作用，而且对细菌也有机制作用，防止细菌扩散。在高等动物和真菌中，酪氨酸 酶的生理功能研究的还不是很彻底，推测其主要起保护作用。 1 2 1 高等植物中酪氨酸酶的生理作用 ( 1 ) 在酚类代谢中的作用 据报道，具高水平的酚类物质的组织细胞常含多酚氧化酶，而具低水平的酚类物质的 组织细胞却不含多酚氧化酶，而且多酚氧化酶能在体外将单酚转化成双酚，因而有人曾设 想多酚氧化酶参与植物体内酚类物质的合成尽管有些研究者发现了细胞或组织酚类化 合物含量与能从其中分离的多酚氧化酶活性之间的关系，但是体内大多数多酚氧化酶活 性是潜在的，要确定其在体内的实际活性几乎不可能。使用细胞化学和体外酶学方 法，v a u g h n 等人发现多酚氧化酶活性的彻底丧失对大豆幼苗的酚类物质代谢没有影响用 t e n t o x i n 处理组织导致多酚氧化酶的完全失去并不影响酚类物质在这些组织中的积累过 氧化物酶或其它酶的作用就足以满足产生那些组织中的酚类物质水平【l 4 1 。 多酚氧化酶作为一种酚氧化酶在叶绿体中是不活泼的，它仅仅是一种潜在或者缺乏 底物的酚氧化酶。这种酶的潜在形式可被各种各样的处理所激活，包括去污剂、脂肪酸和 胰蛋白酶【1 5 】。光也能激活潜在的多酚氧化酶，因为在缺乏其它激活因子的情况下，多酚可 被叶绿体膜上的光化学作用所氧化，这种依赖于光的氧化作用是由于酚类化合物替代水 作为n a d p 光还原的电子供体u 引。但也有研究表明，单酚依赖于光的氧化作用是由于光合 成的氧化，而不是多酚氧化酶的作用i l l 1 7 j 。 总之，多酚氧化酶在酚类的物质代谢中的作用主要体现在含有质体和液泡内容物的 混合液环境中，具体说来就是衰老和受伤的情况【l5 1 1 j 。在衰老方面，常用多酚氧化酶来解 释黑橄榄及其它暗褐色、黑色且常常是死的植物组织的色素的发育。因为褐变是由已存 在的底物与酶的接触引起，所以，在能分离的多酚氧化酶活性与衰老之间有时不相关联。 在衰老过程中能分离的多酚氧化酶活性的增加是由于原已合成的酶的激活所致。可见， 多酚氧化酶在此过程中的生理意义不大。然而，由于受伤而出现醌类物质的快速产生却具 有明显的生理意义，无论是机械损伤还是病虫害引起的细胞破裂，通过多酚氧化酶与酚类 物质相互作用而产生的醌类物质性质很活泼，质体的破坏导致多酚氧化酶的激活与从液 泡中释放出来的酚类物质起反应( 酶和底物的区域分布界限被打破) ，产生醌类物质，参与 2 第一章文献综述 保护植物免受进一步伤害。多酚氧化酶是一种相对较稳定的酶，尽管其反应产物对酶有一 定的抑制作用，多酚氧化酶的活性仍可维持较长时间，导致醌类物质的不断产生。 ( 2 ) 与植物光合系统之间的关系 v a u g t m 等人【4 通过研究提出多酚氧化酶可能通过植物光合系统参与介导了分子氧 的光还原过程，其理由有5 条：在植物健康组织内，还没有证据说明这种蛋白质作为多酚 氧化酶在羟基化的酚或醌的产生中起作用；多酚氧化酶只存在于那些产生高水平氧的 叶绿体，它很可能需要默勒反应的调节；醌类物质能介入默勒反应；k c n ( 一种多酚 氧化酶的强抑制剂) 可大大提高光合作用中氧的释放，而且，在分离的菠菜叶绿体中发现 其氧的释放与潜在的多酚氧化酶活性的诱导有极大关系；已发现多酚氧化酶与具有高 比率叶绿素a b 的叶绿体片段相关，虽然这些片段并没有高的光合系统i 活性。尽管如此， 要确认多酚氧化酶参与了默勒反应尚需进一步深入研究提出强有力的证据。 ( 3 ) t 乇可增加植物对病原体的抗性。如烟草对炭疽病、黄瓜对黑星病、苹果对轮纹 病、棉苗对枯萎病菌、水稻对白叶枯病菌和细菌性条斑病以及番茄对小昆虫的抗性等。 t 之的作用方式有：( 1 ) 如番茄的具腺毛状体中含有大量m r 为5 9 0 0 0 的t 乙t y r 氧化毛状 体受食草昆虫侵害而分泌出的物质，变硬能捕获小昆虫。t t 存在于表皮中、无非活化态 和可溶性的特性，在毛状体介导的抗病过程中起作用 1 8 , 1 9 ；( 2 ) 通过醌共价调节亲核氨基 酸形成抗营养机制，直接抵御昆虫和病原体【2 u j ； ( 3 ) 醌的毒性直接发挥抗病作用【2 1 】：( 4 ) 如番茄中t y r 克隆的反义表达可对基因家族的各成员进行负调节，对病原体产生超敏感 性( 感受性过敏) 皿列；( 5 ) 0 醌的次生反应所产生的黑色素的痂可阻止感染的扩散【2 引。t y r 作为一种氧化还原酶还在光合作用中发挥作用。如能调节叶绿体中有害的光氧化反应速 度。参与其中电子传递 2 4 , 2 5 1 。n 瓜还可促进伤口的愈合【1 9 1 。 1 2 2 其他生物酪氨酸酶的生理作用 昆虫酪氨酸酶是十分重要的一种酶，其分布与生理功能息息相关，如表皮中的颗粒 型酪氨酸酶除了与表皮的骨化和黑化有关外，还与昆虫表皮的愈伤和修复有关【2 6 】。昆虫 在外来微生物感染或受伤后，酪氨酸酶原级联反应被激活，酶原被活化为有活性的酪氨 酸酶，氧化昆虫体内的酚类物质如酪氨酸、多巴、多巴胺等产生黑色素，黑色素可以包 被和黑化侵入的不能被细胞吞噬的大型外来物，包括病原微生物，以抑制病原物的生长 和繁殖，减轻对寄主细胞的为害。黑化过程中形成的醌有很高的毒性，可以杀死侵入的 微生物和被感染的细胞，阻止其扩散，表皮的伤口处沉积黑色素，可阻止血淋巴的流失 1 2 7 1 。因为酪氨酸酶是黑化的重要反应酶，对醌等代谢物的形成起决定性的作用，昆虫的 酪氨酸酶常被用作评价免疫系统强弱的一个重要指标【2 卜3 0 j 。 哺乳动物酪氨酸酶催化产生的黑色素被分泌进入到表皮和毛发的角质细胞中，使体 表着色，从而起保护皮肤和眼睛、抵御紫外线的辐射和防止内部组织过热等作用。哺乳 动物酪氨酸酶常见于黑素细胞中，黑素细胞是存在于皮肤，发囊和眼睛中并产生色素的 高度特异性的细胞。酪氨酸酶功能减退或缺失时，即会影响黑色素代谢，从而发生疾病 如白癫疯和白化病。动物与人的常染色体隐性疾病也与酪氨酸酶的缺失或活性下降有 关。 江南大学硕士学位论文 在真菌中，酪氨酸酶的功能主要是与孢子形成、组织再生、致病性和提高极端环境 下的适应力有关系。酪氨酸酶的产物黑色素具有抗紫外线、清除自由基、抗病毒等重要 功能，在医药、农业、化妆业等行业具有广泛的应用前景。 1 3 酪氨酸酶的酶学特性 1 3 1 不同来源酪氨酸酶的分子特性 不同来源的酪氨酸酶有不同的分子特性，分子量和等电点都不尽相同。对从不同系 统发育阶段水平的生物中分离得到的酶的分子特性进行分析比较可以发现，酪氨酸酶由 不同的组分组成。其中，哺乳动物，原核生物，真菌的酪氨酸酶一般为单聚体，而高等 植物，昆虫，两栖类的酪氨酸酶一般为二聚体，四聚体或五聚体。两条亚基多肽链的分 子量在2 6 0 0 0 至7 0 0 0 0 之间变化，植物酪氨酸酶亚基分子量多为4 0 0 0 0 至4 8 0 0 0 之间。 不同酪氨酸酶的等电点分布在p h 3 3 至p h 9 3 5 的范围内，且大多呈酸性；最适温度一 般为3 0 ，或者2 5 。当大规模制备酪氨酸酶的技术成熟后，一系列酪氨酸酶结构与 反应机制的研究得以进行，这些实验大多以植物为材料。 表1 1 不同来源酪氨酸酶的分子量、长度、等电点 t a b 1 1t h em o l e c u l a rw e i g h t ，l e n g t ha n di s o e l e c t r i cp o i n to ft y r o s i n a s ef r o md i f f e r e n ts o u r c e 1 3 2 底物及底物特异性 尽管来自动物组织的酪氨酸酶对t y r o s i n e 和l d o p a 具有相对专一性，但真菌和高 等植物酪氨酸酶可以作用的底物很广泛。从单酚物质n - 酚都可以作为底物。在水果和 蔬菜中含有大量的酚类物质，有一部分可以作为酪氨酸酶的底物。这些酚类物质一方面 被酶催化，引起变色，影响产品的外观：另一方面对果实的口感也有影响，如多酚类物 质含量比较高，特别是儿茶酸或花青素原会有涩感。在邻二酚衍生物中，酪氨酸酶最重 要的天然底物有儿茶酚、肉桂酸酯、l d o p a 和酪氨酸，而在肉桂酸酯类物质中，绿原 酸是天然存在的最广泛的底物。 4 第一章文献综述 几茶素绿原酸 h 。洽c h n ：c h 2 h c 。h 多巴 h 。o c 警c o o h 图1 3 几种酪氨酸酶酚类底物 f i g 1 3s e v e r a lh y d r o x y b e n z e n es u b s t a n c eo nt y r 许多来自植物的酪氨酸酶只具有二酚酶活性，而缺少单酚酶活性，尽管很难确定这 种酶是否真正代表酶的活性形式。关于这种酶的不稳定性常见报道，在酶的纯化过程中， 由于结构的改变，所以单酚酶活性很容易丧失，因此m a t h e i s 发现只有大分子量的马铃 薯酪氨酸酶才具有单酚酶活性，c r a f t 发现这种膜蛋白溶解后单酚酶活性也丧失了而 v a u g h a n 发现在马铃薯老化过程中酶的活性也逐渐降低。另一方面，如果加入激素，蛋 白酶抑制剂或者尿素都会诱导增加单酚酶的活性。 尽管大多是酪氨酸酶不能氧化对苯二酚、间苯二酚、焦酚和间苯三酚，但是从某些 组织来源的酪氨酸酶可以氧化这些物质。例如茶叶来源的酪氨酸酶可以氧化对苯二酚、 间苯三酚和苯二胺。a b a k h a r m a 等报道从马铃薯块茎来源的酪氨酸酶能够氧化对苯二酚， h e i m e r 报道甜菜来源的酪氨酸酶能够氧化焦酚。 植物来源的酪氨酸酶对酚类物质的亲和性相对比较小，k m 通常为l m m o f l ，比真 菌和细菌来源的酪氨酸酶的k i n 高。但有些文章报道在棉花、香蕉中k m 比较小，在 0 0 1 m m o l l - - 0 1 m m o 儿之间。 酪氨酸酶对氧分子的亲和性也比较小，k m 值一般在o 1 m m o l l - - 0 5 m m o l l ，对氧 分子的亲和性大小依赖于酚类底物的氧化以及酶的来源。 1 3 3 同工酶 从同一种属或同一个体的不同组织或同组织，统一细胞中发现有的酶具有不同分 子形式但却催化相同的化学反应，这种酶就称为同工酶( i s o z y m e ：i s o e n z y m e ) 。根据产 生酶分子不同结构形式的原因，可将同工酶分为：基因性同工酶或原级同工酶、次生同 工酶或转译后同工酶。在生物学中，同工酶可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种 和个体发育、组织分化等。自从在酪氨酸酶的纯化研究中使用了离子交换层析、分子筛 柱层析、等电聚焦等方法，对酪氨酸酶同工酶的报道就越来越多。v a n n e s t e 在文章中把 这种酶的多重形式称为异质性，这种异质性来源于亚基不同的聚合程度。另外蘑菇酪氨 江南大学硕士学位论文 酸酶同工酶之间的结构并不同，包括他们亚基的性质也不同，在高等植物中的酪氨酸酶 其同工酶之间的结构也并不相同。 1 4 外源物质对酪氨酸酶的抑制与激活 1 4 1 酪氨酸酶抑制剂的研究进展 酪氨酸酶在黑色素的生物合成过程中起着关键性的作用，是皮肤黑素合成反应的限 速酶，参与决定了哺乳动物皮肤、头发的颜色。部分色素沉着性皮肤病，如黄褐斑、雀 斑等，就是由于过量水平的黑色素在表皮沉积形成。因此，可以选择应用酪氨酸酶抑制 剂通过抑制酪氨酸酶的活性，阻断黑色素的合成反应链，减少其在皮肤内的生成从而达 到祛斑增白的效果【4 。 酪氨酸酶抑制剂来源主要包括以下几类： ( 1 ) 植物来源的酪氨酸酶抑制剂主要包括糖苷类如熊果苷：苯丙素类肉桂酸、丁香 酚、阿魏酸等：黄酮类如山萘酚、槲皮苷、没食子酸等。现在人们已经从中草药 中提取出多种对酪氨酸酶有抑制作用的生物活性成分，开发美白产品。单味中药 和复方中药都对酪氨酸酶有一定的抑制作用。 ( 2 )昆虫来源的酪氨酸酶抑制剂例如丽蝇中分离出来的醌异构酶，烟草天蛾分离出 的多巴色素异构酶等。 ( 3 ) 微生物来源的酪氨酸酶抑制剂例如，壬二酸又命杜鹃花酸，是天然的直链饱和 c 9 二羧酸，1 9 7 8 年从糠秕马拉色菌培养液中分离出，并认为该物质是引起花斑 癣患者脱色斑的原因。曲酸，化学名5 一羟基一2 一羧甲基一4 一吡喃酮。1 9 0 7 年 s a t o 首先从溜曲霉分离出使肤色变白的物质，1 9 5 3 年从a s p e r g i l l u sa l b a p 葡萄糖 发酵液分离鉴定出其化学结构。它通过与t y r 上的铜离子嵌合而抑止t y r 。 ( 4 ) 化学合成的酪氨酸酶抑制剂例如，氢醌是皮肤科常用的和使用最久的脱色剂， 其脱色机制仍不十分清楚。再如，高血压药物卡托普利( 巯甲丙脯酸) 、q2 肾上 腺素能受体阻断药育亨宾( y o h i m b i n e ) 对黑素生物合成亦有影响，测试结果表明两 种药物均可抑制t y r 的活性。卡托普利是一个非竞争性的不可逆的t y r 抑制剂， 而育亨宾导致的t y r 活性降低是可逆的 4 2 j 。 目前，主要存在以下四种不同的抑制机理： ( 1 ) 竞争性抑制：利用底物类似物结合酶的活性中心从而抑制酶的活性，分为羧基型 或者羟基型。比如氢醌。 ( 2 ) 非竞争性抑制：抑制剂与酶活性中心以外的氨基酸残基结合及抑制剂对过氧自由 基的清除作用。比如牛磺酸。 ( 3 ) 混合型抑制：抑制剂对酶活性中心的内源桥基的影响。比如杨梅黄素。 ( 4 ) 非经典模式的抑制缓慢结合型抑制：抑制剂与酶快速形成复合物，此后经历一 个缓慢的可逆异构化过程。比如环庚三烯酚酮。 由于酪氨酸酶的抑制剂在医药、化妆品和食品工业等领域均有着广阔的应用前景， 研究可以长期实用的、安全的、有效的药物是国内外许多研究机构及药物公司开发的热 点电和方向 。 6 第一章文献综述 1 4 2 酪氨酸酶激活剂的研究进展 目前，酪氨酸酶激活剂主要是用于治疗自癜风。激活酪氨酸酶的药物目前研究较多 的是中药。近年进行的中药对蘑菇酪氨酸酶活性影响的大规模筛查，并在此基础上以鼠 黑素瘤细胞和动物模型进行的实验，肯定了一批中药对皮肤黑素代谢的调节作用【4 3 】。 ( 1 ) 酪氨酸酶的激活剂莲草在反应体系中可促进酪氨酸酶与底物的结合从而加快反 应速度。甘草、补骨脂、补骨脂素、菟丝子、苏梗、泽兰作用机理与旱莲草相似。夏枯 草对酪氨酸的非竞争作用提示夏枯草在酶促反应体系中虽不影响底物与酶的结合，然而 却能增加最大反应速度。白鲜皮、黄芩、桃仁、毛慈菇、薄荷作用机理与夏枯草相似。 鸡血藤对酪氨酸酶具有混和性激活作用，申姜、女贞子、紫荆皮、刺蒺藜、独活、潼蒺 藜作用机理与鸡血藤相似。 ( 2 ) 酪氨酸酶激活剂的激活机理 中药对酪氨酸酶的激活作用分属于三种类型：竞争性激活作用、非竞争性激活作用 和混合性激活作用。从不同类型作用的中药的激活率的中值看，混合性激活作用的效能 高于非竞争性激活型，非竞争性激活型又高于竞争性激活型。 1 5 酪氨酸酶的应用 在有机合成方面，酪氨酸酶用于合成或修饰一些有重要价值的有机化合物。其应用 主要包括：有机介质中酪氨酸酶催化酚类化合物的氧化：无溶剂体系酪氨酸酶催化单酚 类化合物与芳香胺的氧化一迈克尔加成反应；除去羧基保护基团一用于肽的合成；酪氨 酸酶磺化氧化剂制备高光学纯度的r 亚砜；酪氨酸酶催化氧化羟基吡啶类化合物的反应 等。 在环境保护方面，酪氨酸酶处理工业废水的技术已经成熟。2 0 世纪8 0 年代，酶法 处理酚类物质得到了广泛的应用，酪氨酸酶是处理酚类化合物的主要工业用酶之一m 】。 根据文献报道，目前采用酪氨酸酶出去工业废水和饮用水中的酚类等有毒物质的方法有 两种，一种是t y r 将酚和芳香胺等物质氧化为相应的自由基一醌，醌多聚化形成沉淀， 通过过滤将其与水分开；另一种是采用f 限催化废水中的酚与丙酮酸盐和氨反应合成l 一酪氨酸，因其溶解度很低，可用简单方法从废水中过滤除去，同时还可获得l 酪氨酸 【4 5 】 o 在医药和美容保健方面，人体中酪氨酸酶有催化酪氨酸合成l d o p a 或进一步合成 黑色素的作用。黑色素及其代谢中间物，有抗氧化、神经调节和增强皮肤免疫能力的作 用，因此酪氨酸酶在医药和美容保健方面具有重要的应用前景。这方面的研究和应用主要 与酪氨酸酶的激活与抑制有关。熊果苷和芦荟素都是化妆品行业常用的增白剂。1 9 8 8 年日本学者a k i u 等从杜鹃花科植物雄果的叶子中分离到一种具有脱色作用的单体物质 一熊果苷，这是氢醌的一种天然存在形式，其作用机制可能与分子结构中存在氢醌基团 有关。j i n 等研究发现以芦荟素和熊果苷共同处理，对抑制酪氨酸酶具有协同作用【4 8 】。 在食品加工与储藏过程中，经常会发生褐变等变色现象，这些现象许多都是由酶促 产生的，引起酶促褐变的酶主要就是酪氨酸酶，所以如何降低黑色素的生成已成了重要 的问题。酪氨酸酶催化黑色素合成的机制表明，蔬菜水果的变色和酪氨酸酶的活力大小 7 江南大学硕士学位论文 有着直接的联系，所以降低酶活力或者使酶失活成了解决的问题和关键。现在传统的使 用方法是采用高压灭菌，但会造成蔬菜、水果的减产和营养物质的丢失。另外也有人试 过微波法，由于微波造成的蔬菜水果水分的过度丢失和纤维破坏也使该法收到了限制。 现在，开发酪氨酸酶的抑制剂成了这一领域的重要方向。抗坏血酸、二硫化钠和一些巯 基化合物多年来作为酪氨酸酶抑制剂已经使用于食品工业。但是由于亚硫化物对人体有 毒性，这类含硫抑制剂的应用范围有限。含有抗坏血酸结构和b 一环糊精的化合物和天 然巯基蛋白酶已经开始受到人们的重视。目前，4 一己基间苯二酚被认为是较为安全又有 效的一种酪氨酸酶抑制剂【4 9 1 。 应用于农业抗虫领域，在较高等的无脊椎动物如节肢动物中，酪氨酸酶具有黑色素 形成、角质的硬化、伤口的愈合和防御反应等功能，其中由于其具有伤口愈合作用，酪 氨酸酶有可能作为害虫控制中的一个作用靶标。 采用酪氨酸酶制备生物电极将酪氨酸酶固定化在特定的电极上制成的生物电极能 够用于生物传感器中，可用于测量微量的酚类化合物且具有分析速度快、选择性高、检 测限低、操作简便等特点。目前这一领域的研究热点是通过选择不同的修饰物从而进一 步降低电极的检测下限，提高电极性能防止其他无关物质的干扰嗍。 酪氨酸酶来源广泛，不同来源的酪氨酸酶的酶学性质和功能也存在差异，需要人们 不断寻找不同来源的酪氨酸酶，并对其酶学性质和功能进行探索和开创性的研究才能更 好的将酪氨酸酶应用于工业生产的各个领域。相信随着科学技术的发展，人们将会在酪 氨酸酶的应用领域取得更加有实际意义的研究进展。 1 6 研究目的和意义 1 6 1 研究目的 本课题主要研究目的是寻找一种高效植物来源的酪氨酸酶并对其进行分离纯化和 性质研究。由于酪氨酸酶在生物体内的含量低、价格高，并且酶活力受到温度、p h 等条 件的限制。故对酪氨酸酶的性质研究，引起了人们的高度重视。本课题的主要研究内容 包括： ( 1 ) 从众多植物材料中确定具有高效酪氨酸酶酶活力的植物，初步确定实验用材料来 源。 ( 2 ) 为确保酪氨酸酶在提出过程中保持较高的酶活力，研究该实验材料粗提取条件，确 定粗提取条件。 ( 3 ) 考察外源刺激对酪氨酸酶活性的影响。 ( 4 ) 确定该植物材料中酪氨酸酶的分离纯化步骤，进行分离纯化，初步获得纯化后的酶， 为后续的实验提供材料。 ( 5 ) 进行诸如酸碱稳定性、热稳定性、酶动力学等基本酶学特性实验，在此基础上进行 添加金属离子、化合物、中药等实验，详细了解从该植物中获得的酪氨酸酶的其它性质。 1 6 2 研究意义 酪氨酸酶广泛存在于动物、植物、微生物中，在生物体内的具有极其重要的生理作 用，因此对酪氨酸酶的研究具有广泛的生物学意义。由于酪氨酸酶在有机合成、污水处 第一章文献综述 理、农业、美容保健等众多方面具有极高的应用价值，因此对酪氨酸酶的研究也具有很 高的科研和经济意义。 通过对多种植物材料进行预备实验、比较，发现在香樟果实中可以检测到酪氨酸酶 活性且酶活性较高，而有关香樟酪氨酸酶的研究目前国内外未见报道，故采用香樟作为 本实验的研究对象。 香樟树学名：c i n n a m o m u mc a m p h o r a 仁) p r e s l ，科别：樟科，别名：香樟、木樟、 乌樟、芳樟、番樟、香蕊、樟木子。樟树是属于樟科的常绿性乔木。高可达5 0 米，树 龄成百上千年，可称为参天古木，为优秀的园林绿化林木。树皮幼时绿色，平滑，老时 渐变为黄褐色或灰褐色纵裂；冬芽卵圆形。叶薄革质，卵形或椭圆状卵形，长5 1 0 厘 米，宽3 5 5 5 厘米，顶端短尖或近尾尖，基部圆形，离基3 出脉，近叶基的第一对或 第二对侧脉长而显著，背面微被白粉，脉腋有腺点。花黄绿色，春天开，圆锥花序腋出， 又小又多。球形的小果实成熟后为黑紫色直径约零点五公分；花期4 5 月，果期1 0 1 1 月。 樟树是常绿乔木，它的常绿不是不落叶，而是春天新叶长成后，去年的老叶才开始脱落， 所以一年四季都呈现绿意盎然的景象。樟树的小花非常独特，外围不易分辨出花萼或花瓣 的花被片有6 片，中心部位有9 枚雄蕊，每3 枚排成1 轮树皮有细致的深沟纵裂纹。樟树 的木材耐腐、防虫、致密、有香气。是家具、雕刻的良材；除了用来提炼樟脑，或栽培 为行道树及园景树之外，樟脑还有强心解热、杀虫之效，本种为亚热带地区( 西南地区) 重要的材用和特种经济树种，根、木材、枝、叶均可提取樟脑、樟油，油的主要成分为 樟脑、松油二环烃、樟脑烯、柠檬烃、丁香油酚等。樟脑供医药、塑料、炸药、防腐、 杀虫等用，樟油可作农药、选矿、制肥皂、假漆及香精等原料；木材质优，抗虫害、耐 水湿，供建筑、造船、家具、箱柜、板料、雕刻等用；枝叶浓密，树形美观可作绿化行 道树及防风林。 科学研究证明，樟树所散发出的松油二环烃、樟脑烯、柠檬烃、丁香油酚等化学物 质，有净化有毒空气的能力，有抗癌功效，过滤出清新干净的空气，沁人心脾。长期生 活在有樟树的环境中会避免患上很多疑难病症。因此，樟树成为南方许多城市和地区园 林绿化的首选良木，深受园林绿化行业的青睐。 香樟的果实和叶子可作为中药，具有很多药理功效。但其利用率并不高，对香樟果 实和叶子酪氨酸酶的研究，为其应用提供了很有价值的参考。 9 第二章实验材料及粗酶条件的确定 第二章实验材料及粗提条件的确定 2 1 前言 酪氨酸酶( t y r o s i n a s e ，t 巩e c l 1 4 1 8 1 ) ，是含有铜离子( c u z + ) 的一种金属酶，广 泛存在于动物、植物和微生物体内。酪氨酸酶兼有加氧酶和氧化酶的双重功能，能将单 酚加氧成二酚( 单酚酶活性) ，又可以将二酚等多元酚氧化成醌( 多酚酶活性) 【2 1 。 酪氨酸酶是生物体内色素合成的关键酶，主要影响黑色素和多酚类物质的生成。在 高等植物中，酪氨酸酶主要与植物抗病有关，它可以诱导抗营养防御反应，在受到昆虫 等动物伤害时，由酪氨酸酶催化形成的醌不尽可以与植物蛋白质作用，降低对食草动物 的营养作用，而且对细菌也有机制作用，防止细菌扩散。 在植物中，酪氨酸酶通常被称为多酚氧化酶，由于其检测方便，是被最早研究的几 类酶之一。自2 0 世纪6 0 年代以来，已从很多植物中分离出来，如梨、苹果、马铃薯、 桃、葡萄、茶叶、荔枝、小麦、甘蔗等【4 7 】_ 。由于酪氨酸酶在有机合成、污水处理、农业、 美容保健品筛选等众多方面具有极高的应用价值，因此对酪氨酸酶的研究具有很高的科 研和经济意义。 本研究旨在寻找一种新的实验材料提取酪氨酸酶，并对其酶学性质进行研究。 2 2 材料与方法 2 2 1 实验材料 植物材料为采自青山湾校区内所生长植物的叶片和果实，以及购于青山市场内的时 令水果和蔬菜。 2 2 2 试剂与耗材 石英砂( a r ) ，硫酸铵( a r ) ，盐酸( a r ) ，乙二胺四乙酸二钠e d t a ( a r ) ，三 胺基甲烷t r i s ( a r ) ，磷酸氢二钠( a r ) ，磷酸二氢钠( a r ) ，乙酸( a r ) ，乙酸钠( ， 柠檬酸，十二烷基磺酸钠( c p ) ，丙烯酰胺( c p ) ，考马斯亮蓝g 2 5 0 ，9 5 乙醇，聚乙 二醇2 0 0 0 0 ( g r ) ，甘氨酸( a r ) 等( 国药集团化学试剂有限公司) 。 l d o p a ( s i g m a 公司) 牛血清蛋白b s a ( r o c h e 公司) 2 2 3 主要仪器 d e l t a 3 2 0p h 计( 瑞士m e t t l e rt o l e d o 公司) ，d k 6 0 0 型电热恒温水浴锅( 上 海一恒科技有限公司) ，u n i c o2 1 0 0 紫外可见分光光度计( 尤尼科( 上海) 仪器有限公司) ， 日立高速冷冻离心机h i m a cc r 2 2 g ( 日本日立( h i t a c h i ) 公司) ， 多用途离心机t h e r m oi e cm u l t i r f ，家用料理机，玻璃研钵 2 2 4 实验材料的预处理 采集的花，叶子、果实，用蒸馏水洗净，擦拭干净，放入超低温冰箱中保存备用。 2 2 5 酪氨酸酶的提取 先将玻璃研钵预先放置在4 c 冰箱中预冷过夜，取出保存在超低温冰箱中的实验材 料，称取少量，剪碎，加入少量的石英砂，l m l5 0m m o l l t r i s - h c i 缓冲液( p h 7 5 ) ， 江南大学硕士学位论文 研磨。以1 0 0 0 0 x g 离心力，于4 下离心1 5r a i n ，取上清液进行酶活测定。 2 2 6 酶活测定方法的确定 采用l d o p a 法，于4 7 5 n m 下检测酪氨酸酶酶活力。反应体系的总体积为4 m l ，改 变体系中缓冲液，底物，酶液的比例，确定最佳反应体系。测定其1m i l l 内在4 7 5 n m 波 长下的光吸收值，空白为只加入4 m l2 0m m o l l 的强s h c l ( p h 7 5 ) 缓冲液。在此条件 下，以每r a i n 催化生成l g m o l 多巴醌的酶量定义为一个活力单位) 5 0 1 。 2 2 7 蛋白质测定方法 蛋白质的浓度使用b r a d f o r d 检测法来确定，以牛血清蛋白为标准蛋白，于5 9 5 n m 处测定光吸收值，做工作曲线，得到蛋白质浓度与吸收度之间的关系，样品蛋白质浓度 对照标准曲线获得。 2 3 结果与分析 2 3 1 材料的确定 先后测定了土豆、茄子、丝瓜、番茄、芋头、红薯、白薯、辣椒、苹果、香蕉、胡 萝卜、桔子、茭白、豆芽、枣、洋葱、黄瓜、香樟果实、女贞子、茶树籽等二十多种植 物材料。如图2 1 所示，从土豆、茄子、丝瓜、苹果、香蕉、红薯、香樟