（应用化学专业论文）化学发光与微纳分析方法联用研究.pdf

i - 海窆通大学博f 掌论吏 摘要 化学发光与微纳分析方法联用研究 摘要 化学发光是指某些物质( 包括产物) 在化学反应中吸收反应过程中所释放的 化学能，受激后从激发态回到基态时所产生的光辐射。由于化学发光检测系统光 路简单，无需外加光源，不存在荧光分析中由于瑞利散射和拉曼散射及溶剂荧光 杂质产生的背景信号，因而具有很高的信噪比，可获得与激光诱导荧光相媲美的 高灵敏度。常用的化学发光反应大多数属于快速动力学反应，特别适合于微体积 在线检测。然而，由于化学发光分析的选择性差，限制了它的实际应用。 本论文基于化学发光的高灵敏检测特性，微流控芯片的高效分离特点和荧光 纳米晶体( 量子点) 的量子效应，旨在发展其联用方法，建立高灵敏、高选择性 的分析新方法，用于生物分析，主要研究工作包括如下几个方面： 1 发展了玻璃芯片和硅橡胶( p d m s ) 玻璃复合芯片制备工艺。系统地研 究了化学刻蚀条件和芯片的封装工艺，利用发展的微加工技术，制备出p d m s 玻璃复合型微流控芯片和玻璃微流控芯片，同时对芯片电泳性能进行了考察。为 发展微流控芯片的联用技术奠定了基础。 2 建立了高灵敏的化学发光检测系统，成功地实现了与微流控芯片联用。 将化学发光一微流控芯片联用系统首次用于蛋白质等电点聚焦分析。建立了血色 素蛋白质的高灵敏检测分析新方法。同时对化学发光检测模式以及两种不同材质 芯片进行了比较。在优化的实验条件下细胞色素c ，肌红蛋白和过氧化物酶在 玻璃芯片上1 0 分钟内实现了很好的分离检测，其检测限( s n = 3 1 分别为1 2 1 旷7 ，1 6 x 1 旷，和1 0 1 0 - ”m o l l 。细胞色素c 的线性范围为2 5 1 0 _ 7 到3 0 l o “t o o l l , = 0 9 9 9 ) ，过氧化物酶的线性范围为3 0 1 矿”到4 o 1 旷9m a i l 僻= 0 9 9 4 ) ，细胞色素c 以及过氧化物酶的迁移时间和峰面积的相对标准偏差分 别低于5 o 和1 0 o 研= 5 】。我们初步的实验结果表明芯片等电聚焦一化学发 光检测是分离检测血色素蛋白质的有效方法。 3 发展了荧光量子点一生物标记物的纯化和表征新方法。通过实验我们发 现超滤法是纯化量子点生物标记物的简单、有效的方法。通过选择合适滤膜和多 拇交通人学博 学位论文 捕璺 次超滤步骤，碲化镉量子点一蛋白质的连接物( 牛血清自蛋白及辣根过氧化物酶) 的纯度达到9 0 以上。建立了以毛细管电泳一激光诱导荧光检测法表征量子点 一蛋白质连接物的新方法。通过优化实验条件，游离量子点与其蛋白质连接物达 到了有效分离。实验结果表明我们的方法是简单、有效的。同时我们发现量子点 一蛋白质的连接物在水溶液中是稳定的。这些工作为荧光量子点的生物应用以及 为本论文下一步的工作即化学发光检测和纳米技术联用奠定了基础。 4 基于荧光共振能量转移原理，提出了以化学发光物质为能量供体和量子 点生物标记物为能量受体的化学发光共振能量转移新方法。我们选择了辣根过氧 化物酶催化鲁米诺一过氧化氢高灵敏的化学发光反应。设计了两种共振能量转移 体系：( 1 ) 将不同尺寸的荧光量子点与辣根过氧化物酶连接，成功实现化学发光 共振能量转移；( 2 ) 将不同尺寸的荧光量子点与牛血清白蛋白连接，牛血清白蛋 白抗体与辣根过氧化物酶连接，利用抗原一抗体免疫反应实现化学发光共振能量 转移。这种新方法能够应用于生物成像和均相免疫分析中。 关键词：化学发光，微流控芯片，毛细管电泳，量子点生物连接，免 疫反应，化学发光共振能量转移 u r 海交通人学博 论空 a b s t a c t c o u p l i n g o fc h e m i l u m i n e s c e n c ew i t hm i c r oa n d n a n o - a n a l y s i sm e t h o d s a b s t r a c t c h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) i sd e f i n e da st h ee m i s s i o no fe l e c t r o m a g n e t i cr a d i a t i o n ( u s u a l l yi nt h ev i s i b l eo rn e a t i n f r a r e dr e g i o ) p r o d u c e db yac h e m i c a lr e a c t i o n c l a n a l y s i si sc h a r a c t e r i z e db yu l t r a s e n s i t i v i t y ，s i m p l i c i t ya n dl o w - c o s t ，d u et on oe x i t i n g l i g h ts o u i s ，a v o i d i n gt h ee f f e c t so fs t r a yl i g h ta n dt h ei n s t a b i l i t yo fl i g h t $ o u r c a ：c l d e t e c t i o nh a sl o wb a c k g r o u n da n ds i m p l eo p t i c a lm o d e l ，a n di su n i q u e l ys m t e dt o o n l i n em i c r o - v o l u m ed e t e c t i o n h o w e v e r , t h ep o o rs e l e c t i v i t yo fc la n a l y s i sl i m i t s i t sa p p l i c a t i o n i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，w ec o u p l e dt h em i c r o c h i pe l e t r o p h o r e s i sa n dn a n o a n a l y s i s m e t h o dw i t hu n r a s c n s i t i v cc h e m i l u m i n e 8 c 七1 1 c c a n dw eh o p et h a tt h en e wm e t h o d w h i c hc o u p l i n gh i g h p e r f o r m a n c es e p a r a t i o nt o o lw i t hah i g h - s e n s i t i v i t yd e t e c t i o n s c h e m ec o u l db eu s e df o rb i o a p p l i c a t i o n t h em a i nc o n t r i b u t i o n sa r ea sf o l l o w s ： t l lf a b r i c a t i o no f p d m s g i n s sm i e r o c h i pa n dg l a s sm i c r o e h 如 w e d e v e l o p e das i m p l ea p p r o a c hf o rf a b r i c a t i o no fp d m $ g a s sc em i c r o c h i p s t h ei r r e v e r s i b l es e a l i n go fp d m s g a l s sw a sr e a l i z e db yu vi r r a d i a t i o n f u r t h e r m o r e ， w ei m p r o v e dt h ea p p r o a c hf o rt h ef a b i r c a f i o no f # a s sc h i p si ng e r c r a l a b t h e c h e m i c a le t c h i n ga n df u s i o nb o n d i n gt e c h n i q u e sh a db e e ns y s t e m a t i c a l l yi n v e s t g a t e d t h ef a b f i c a t e dp d m s g l a s sm i c r o c m pa n d # a s sm i e r o c h i pw c r er e a d yf o r t h e f o f l o w i n gr e a r c h ( 2 c o u p l i n go f c h e m i l u m i n e s c e n c ed e t e c t i o nw i t hm i c r o c h pe l e c t r o p h o r e s i a w ep r e s e n t e dah i g h l ys e n s i t i v ec h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) d e t e c t i o no fh e m e p r o t e i n sc o u p l e dw i t hm i c r o c h i pi s o e l e c t r i ef o c u s i n g ( m i e f ) 。t h e9 1 a s sm i c r o c h i p a n dp o l y ( d i m e t h y l s i l o x a n c ) ( p d m s ) g l a s sm i c r o c h i pf o ri s o e l e c t r i cf o c u s i n gw e r e f a b r i c a t e du s i n gm i c r o - m a c h i n i n gt e c h n o l o g yi nt h el a b o r a t o r y t h em o d e so fc l d e t e c t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d ，a n dt w om i c r o c h i p s ( g l a s s ，a n dp d m s g l a s s ) w e r e i 湃交通人学博 论文 b 6 t n d c o m p a r e d c y t o c h r o m ec ，m y o g l o b i na n dh o m e r a d i s hp e r o x i d a s ew e r ew e l ls e p a r a t e d w i t h i n1 0m i no nag l a s sc h i pu n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sa n dt h ed e t e c t i o nl i m i t s w e r e1 2 1 0 - 7m ，1 6x1 0 - 7ma n d1 0 x1 0 - ”m ，r e s p e c t i v e l y t h el i n e a rr a n g eo f t h ec a l i b r a t i o nc u r v ew a sf r o m2 5 1 旷i o3 0 x1 0 - * mf r = o 9 9 9 ) 。a n dt h el i n e a r r a n g eo ft h ec a l i b r a t i o ng u r v cf o rh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s ew a sf r o m3 0 1 0 - 呻t o4 0 l 矿m ( r = 0 9 9 4 ) t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n s ( r s d s ) o fm i g r a t i o nt i m e sa n d p e a ka r e a sf o rc y t o c h r o m eca n dh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s ew e r el e s st h a n5 o ，a n d 1 0 0 ( n = 5 ) r e s p e c t i v e l y o u rp r i m a r yr e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h em i e f - c l m e t h o di se f f e c t i v ef o ra n a l y s i sh e i n ep r o t e i n s 3 t h ec o n j u g a t i o n , p u r i f i c a t i o n , a n dc h a r a c t e r i z a t i o no yq u a n t u md o t s b i o c o n j u g a t e s w ed e v e l o p e dau n i v e r s a l ，h i g h l ye f f i c i e n ta n ds e n s i t i v em e t h o df o r t h e c h a r a c t e r i z a t i o no fq u a n t u md o t sb i o c o n j u g a t a sb a s e do i lc a p i l l a r ye l e c t r o p h o t a s i s ( c e ) w i t hl a s e r - i n d u c e df l u o r e s c e n t ( l i f ) d e t e c t o r t h eq u a n t u md o t sb i o c o n j u g a t e s w e r ee f f i c i e n t l ys e p a r a t e dw i t hf r e eq u a n t u md o t su n d e rt h eo p t i m u mb u f f e rp hb y c e - l i f o u rr e s u l ti l l u s t r a t e dt h a tt h em e t h o dw a ss i m p l ea n dp o w e r f u l f u t h e r m o r e ， w ef o u n dt h a it h eq u a n t u md o t sh i o c o n j u g a t e sms t a b l ei nt h ea q u e o u ss o l u t i o n 。 f u r t h e r m o r e ，o u rr e s u l t st e s t i f i e dt h a tu l t r a - f i l t r a t i o nw a sa ne f f e c t i v ea n ds i m p l e a p p r o a c ht op u r i f yq d sb i o e o n j u g a t e s t h ep u r i t yo fq d s - b i o c o n j u g a t e sw a su pt o 9 0 b yc h o o s i n gt h er i g h tu l n a f i l t r a t i o nm e m b r a n ea n dm u l t i p l eu l t r a - f i l t r a t i o n t h e c o n j u g a t i o n p u r i f i c a t i o n , a n dc h a r a c t e r i z a t i o no fq u a n t u md o t sb i o e a n j u g a t e sw e r e p r e p a r e df o rt h ef o l l o w i n gr e s e a r c h 鲫ar e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e rb e t w e e n c h e m i l u m i n e s c e n td o n o r sa n d l u m i n e s c e n c eq u a n t u m d o t s a s , 4 c e e p t o r s ( c r e 力 w er e p o r tan e wr e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e rb e t w e e nc h e m i l u m i n e s c e n td o n o r s a n do d sa s a c e e p i n t s ( c r e t ) i no u rs y s t e m ，w ec h o s et h el u m i n o l - h y d r o g e n p e r o x i d ec lr e a c t i o nc a t a l y z e db yh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) b e c a u s et m si so n e o ft h em o s ts e n s i t i v ec lr e a c t i o n w ed e m o n s t r a t e da ne f f i c i e n tc r e tb e t w e e n i u m i n o la n dq d sb a s e do nh r p q d sc o n j u g a t e sa n dt h ei m m u n o - i n t e r a c t i o no ft h e q d s - b s aa n da n t i b s a h r pi nt h el u m i n o l h y d r o g e np e r o x i d e c lr e a c t i o n 卜泡交通大学博t 论文 a b s t r a c l f u r t h e r m o r e , w es h o w e dt h ep o t e n t i a l f o rt h e a p p l i c a t i o no fm u l t i p l eq d sa s a c c e p t o r sw i t hd i f f e r e me m i s s i o nw a v e l e n g t h st om u l t i p l e xa n a l y s i s w ea n t i c i p a t e t h a tt h ec r e tm a yb eb e c o m ea na t t r a c t i v ea h e r a t l v em e t h o df o rq u a n t i t a t i v e b i o - a n a l y s i s ，c e l la n dt i s s u ei m a g i n g k e y w o r d s ：c h e m i l u m i n e s c e n c e ，c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，m i c r o c h i p ， l u m i n o i ，c d t eq u a n t u md o t ，c h e m i l u m i n e s c e n c e r e s o n a n c e e n e r g y v 上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：熏专宦 日期：加年j 月c 7 日 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规 定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在一年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密酥 请在以上方框内打。”) 学位论文作者签名：誊蠢豇 f 以p 日期：如年7 月i ，e t 日期：如5 年7 , e j 口日 l - 海交通大学博i ：论丘 第一蟹绪论 1 1 化学发光 第一章绪论 1 1 1 化学发光研究的历史 化学发光( c h e m i l u m i n e s c e n c e 简称c l ) 是指某些化学反应中发出可见光的 现象。在几百年前人们就观察到这个化学现象。最早发现的化学发光现象发生在 生物体内即荧火虫发光，现在称之为生物发光( b i o l u m i n e s c c n c ，简称b l ) 。到 了十九世纪后期，人们发现简单的非生物有机化合物也能产生化学发光。由于大 多数化学发光强度非常傲弱且稍纵即逝，并受检测器的限制，一直到本世纪六十 年代化学发光反应才被用于分析化学，建立化学发光分析法。根据某一时刻的发 光强度或反应的发光总量来确定体系的相应组分含量的分析方法叫化学发光分 析法。国外化学发光分析方面的研究在六、七十年代得到迅速发展。国内化学发 光分析方面的研究起步于八十年初，自章竹君教授及其研究小组在鲁米诺的合 成、发光仪的研制方面取得突破性的进展以来，短短二十多年时问，国内化学发 光分析的研究得到了很大的发展。化学发光分析的研究和应用仍然是当前分析领 域的一个十分重要的研究方向。化学发光分析法在生命科学、测量科学、临床医 学和环境检测等领域具有广泛的应用前景。到目前为止，几种化合物，如鲁米诺， 过氧草酸酯，和钉0 i ) 联吡啶等，具有极好的化学发光特性，被广泛应用于化学 发光分析。 1 1 2 化学发光检测的基本原理 化学发光指在一类化学反应中，某些物质( 包括产物) 吸收反应过程中所释 放的化学能，受激后从激发态回到基态时所产生的光辐射，在固相、液帽、气相 反应中均能观察到化学发光。当放热反应的h 值介于1 7 0 3 0 0k j t o o l 之问， 才能在可见光范围内观察到化学发光现象，许多氧化还原反应所提供的能量与此 相当，故大多数化学发光反应为氧化还原反应。常用的化学发光反应可归纳成两 类，它们的化学发光步骤如图1 - 1 所示。第一种类型，反应物a 和b ，反应产生 激发态生成物c 激发态c 回到基态时产生光子；第二种类型，反应物a 和b ， 反应产生激发态生成物c ，激发态c 把能量传递给荧光素f ，激发态的f 回到基 态时产生光子l l i 。 i j 海交通人学博i 。论立第一章绪论 g r o u n ds t a t e g r o u n ds l a t eo 图1 - 1 两种不同化学发光反应类型 f i 9 1 - 1 p r i n c i p l o f t w o t y p e s o f c h e m i l u m i n e s c e n t l e a c t i o n $ ( a ) d i r e e tc lr e a c t i o n ；( b ) s e n s i t i z e dc - l l r e a c t i o n ， 化学发光信号可用标准荧光计或光电倍增管进行检测。发射光强度与化学反 应速率、激发态的产率从激发态到基态时发射光的效率以及反应物的浓度有关。 化学发光强度可用以下的公式表示： i c l 西c x ( - d c d t )( 1 - 1 ) 公式中k 表示化学发光发射强度( 光子数秒) ，中。表示化学发光量子产率， ( - d e d r ) 表示初始化学发光试剂( 反应物a ) 的消耗速率，中。的重要物理意义是 指在给定的实验条件下b ，和( - a c a o 之间的比例常数。 对于一定的化学发光反应，巾。为一定值。通常，可以用于分析化学的化学 发光系统的中，：值在0 0 1 - 0 2 0 之间“1 。化学发光测定易受化学反应条件，如p h 值、离子强度、溶液组成、温度等因素的影响。影响反应速率或任意一个量子 效率的因素都会改变发光强度。因此，在一定化学反应条件下，通过测定化学 发光强度就可以测定反应体系中某种物质的浓度。一般来说，对于任何化学发 光反应，只要反应是一级或假一级反应，都可以通过公式( 1 1 ) 进行化学发光定 量分析。例如，当反应物b 浓度保持恒定，而反应物a 的浓度变化可视为一级 或者假一级反应。则公式f 1 1 ) 。- f f f 转化为： i c l - r ，c ( t ) a t p c a “( t ) a t l a t - 中c j ( 1 2 ) 即化学发光强度如。与a 的浓度成正比。 海交通人学博 论立 第一章绪论 化学发光分析测定的物质可以分为三类f 2 l ：第一类物质是化学发光反应的反 应物：第二类物质是化学发光反应中的催化剂、增敏剂或者抑制剂；第三类物 质是偶合反应中的反应物、催化剂或者增敏剂等。通过标记的方式利用这三类 物质还可以测定人们感兴趣的其它物质，进一步扩大了化学发光分析的应用范 围。 1 1 3 化学发光反应类型 过去的二十多年以来，鲁米诺，吖啶酯。过氧草酸酯、高锰酸钾、钉0 r ) 联 毗啶和一氧化氮等化学发光体系已用于毛细管电泳和芯片毛细管电泳。 1 1 3 1 酰肼类 鲁米诺( 5 一氨基- 2 ，3 二氢一1 ，4 - 二杂氮萘二酮，也称3 一氨基邻苯二甲酰肼) 是该体系的代表。到目前为止。鲁米i 若( u m i n o ) 化学发光系统在毛细管电泳一 化学发光检测系统应用最为广泛。最早由a l b r e c h t 在1 9 2 8 年提出，鲁米诺及 鲁米诺衍生物在碱性溶液( p h = l o i i ) 中加入过氧化氢时可以观测到微弱的蓝 色发光现象。进一步加入适当的氧化刺或催化剂，如n a c i o 、f e ( n ) 、m n ( n ) 、 c w 1 配合物离子、过度金属、辣根过氧化物酶等，可以极大地提高化学发光 强度。鲁米诺的化学发光量子效率与溶液的p h 值有密切的关系，p h = 1 1 附近 时达到最大值，约为0 0 1 0 0 2 ”。发射光光强度直接与鲁米诺，催化荆和氧化 剂的浓度成比例关系。因此，这三种物质的任何一种都能进行定量计算。这类 物质的发光为氧化反应发光，它们通过辣根过氧化物酶( h r p ) 催化，被h 2 0 2 氧化成3 氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基忐时发出光子，产生 4 2 5 - 4 3 5i l l n 波长的光。鲁米诺反应已经用于毛细管电泳一化学发光检测及芯片 毛细管电泳一化学发光检测系统的金属离子、氨基酸、蛋白质、抗原抗体等物 质检测分析。 1 1 3 2 丫啶酯类 吖啶酯是一类重要的发光试剂，常用于免疫分析。吖啶酯或吖啶磺酰胺类化 合物应用于化学发光免疫分析，通常采用的体系是a c r d i n i u m e s t e r h 2 0 2 系统，即 用吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗原或抗体，用h n 0 3 ，h 2 0 2 和n a o h j i f 为发光启动试 剂。有些在发光启动试剂中加入t w e e n - 2 0 ，t r l t o n x 一1 0 0 ，g 虹c 等表面活性剂以 增强发光。根据收集到的光信号强弱来确定待测抗原或抗体的量，从而用于定性 l 海室通人学博l 论叟 第一章绪论 或者定量的分析。它以发光效率高、背景低：可以在中性或微碱性的条件下标记 多肽、抗体和抗原等；偶联物的发光量子产率及生物活性几乎不受损失：已成为 性能优良的化学发光免疫分析标记试剂。该化合物化学发光反应机理的突出特点 是参与反应的发光基团解离、发光效率均不受连接臂长短的限制，光淬灭效应较 小。通过对其结构的改造，大大增加了吖啶酯类化合物参与微量免疫分析的可能 性，在生命科学领域中应用日趋广泛。 1 1 3 3 过氧草酸酯类 过氧草酸酯化学发光反应，指芳基草酸酯、过氧化氢和某些荧光化合物之间 的化学发光反应，是己知最有效的非酶化学发光反应，量子产率高达2 5 。在化 学发光反应中，首先形成高能的双氧基中间体储能物，然后它把能量传递给荧光 素( 通常为线型稠合芳烃) ，再由激发态的荧光素回到基态时产生光子。发光光谱 与所加的荧光试剂的荧光光谱完全相同。在发生化学发光反应的条件下，荧光荆 的结构保持不变，其作用只是转移化学能量和发射荧光。除了草酸酯、过氧化氢 和荧光素外这一反应体系一般包括一种或者多种溶剂，如邻苯二甲酸二甲酯、 邻苯二甲酸二丁酯、叔丁醇等，以及一些抗氧化剂和增强发光效率的催化剂、添 加剂等。过氧草酸酯反应属于如图1 1 所示的第二种类型，其产生的光为近紫外 到近红外区域。然而，由于反应物的水溶性较差，限制了它在分析科学中的应用。 1 1 ，3 4 酸性高锰酸钾化学发光体系 应用于毛细管电泳一化学发光系统的高锰酸盐化学发光反应，是指高锰酸钾 在酸性条件下氧化有机和无机化合物。在酸性介质，由于高锰酸钾的强氧化性， 大部分有机化合物( 如酚类和氨基等) 可以与其发生氧化还原反应。其能量的转 移往往伴随化学发光现象发生。由于大量的有机物能够被高锰酸盐在酸性或碱性 条件下氧化，我们预计高锰酸盐化学发光反应将在毛细管电泳一化学发光检测中 具有越来越广泛的应用。 1 1 3 5 钌一联吡啶配台物 钌( m 联毗啶是灵敏的化学发光试剂，通过化学反应或电化学方式均能产生 化学发光。在化学发光反应中，一些化学氧化荆如浓缩的四价铈离子、硝酸、 氯气和二氧化铅等均能有效氧化r u ( b i p y ) a 2 + 至r u ( b i p y b “。由于生成物 r u ( b i p y ) 3 “不太稳定，这个反应较少应用于毛细管电泳一化学发光检测系统。 1 1 3 6 碱性磷酸酶一环1 ，2 一二氧乙烷衍生物系统 4 卜姆交通大学博b 论文 第一章绪论 由于1 9 8 9 年合成了具有稳定作用的会刚烷基一1 ，2 一二氧乙烷的磷酸盐，可 以作为碱性磷酸酶( a p ) 的作用底物，因其高度稳定性，便于应用，酶催化后发光 强度高等特点在1 9 9 1 年即建立了应用于临床的高度灵敏的增强化学发光酶免疫 分析r c u a l 。( 金刚烷) 1 ，2 二氧乙烷及其衍生物虚用于c l i a ，通常采用的体 系是i o x e t a n e a p e n l u m c e s y s t e m ，即用碱性磷酸酶( 标记抗原或抗体，用( 金 刚烷) 1 2 - 二氧乙烷或其衍生物作发光底物，在发光底物中加入增强剂。根据 收集到的光信号强弱来确定待测抗原或抗体的量，从而用于定性或定量的分析。 1 1 3 7 生物发光 生物发光( b i o l u m i n e s c e n c e ，b l ) 是化学发光中的一种类型，特指在生物体 内通过化学反应产生的发光现象，主要由酶来催化产生的。在萤火虫体内，a t p ( 三磷腺酸苷) 水解产生能量提供给荧光素而发生氧化反应，每分解一个a t p 氧化 一个荧光素就会有一个光子产生，从而发出光来。目前已知，绝大多数的生物发 光机制是这种模式。但在发光的腔肠动物那里，荧光素则换成了荧光蛋白，如常 见发光水母的绿色荧光蛋白，这些个荧光蛋白与钙或铁离子结合发生反应从而发 出光来。自从2 0 多年前，m a r l e n ed e l u c a s p i 第一个成功的获得表达萤火虫荧光 素酶基因( 1 u c 基因) 的转基因烟草以来，生物发光的应用进入了一个新时代。 b u c l 检测已经被证明是一种有效的、多功能的生物学分析工具，适用于多 种应用。现在，在很多生物技术领域，基于b l c l 原理的检测方法已经得到了 广泛的应用，如：报告基因技术，基因探针检测。当然，b l c l 技术还可以针对 各种医学、制药和环境的目标分析物进行超灵敏检测。正好与目前高通量分析仪 器的小型化，生物分析等趋势相吻合。新的b l c l 应用，例如生物发光共振能 量转移( b i o l u m i n e s e e n c er e s o n a j 】c ce n e r g yt r a n s f e r ，b r e t ) ，基因融合t 重组全细胞 生物传感器和体内全动物成像等等也变得越来越普遍。 共振能量转移是指通过分子间的电偶极相互作用，将供体( d o n o r ) 激发态能量 转移到受体( a c e e p t o r ) 激发态的一种非辐射能量跃迁过程。在该过程中，供体荧光 强度减弱，而受体可以发射强于本身的特征荧光( 敏化荧光) ，或者不发荧光( 荧 光猝灭、同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。能量传递的效率将与供体的 发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供 体与受体之间的距离等因素有关。早在2 0 世纪初p e r r i n 首先发现荧光共振能量转 移现象，1 9 4 8 年f 6 r s t e r 为荧光共振能量转移的应用奠定了理论基础1 4 j 。f o r s t e r 5 卜海交通凡学博 论堑第一章并；论 距离r 0 是指某一给定供体一受体对的临界转移距离，在这距离下，能量转移速 率等于没有受体存在的情况下供体的衰变速率。也就是说在这距离下，从供体 到受体的能量转移几率等于供体的衰变几率。共振能量转移的效率e 可用下式 表示： e 。 ! “( ，凡) 6 ( 1 3 r 为供体偶极中心到受体偶极中心的平均距离。从上式可以看出，当供体与受体 的分子间距离等子r 0 时，能量转移与供体的衰变几率相等。另外随着供体与受 体的分子问距离增加，能量转移效率以六次方速率递减。 荧光共振能量转移( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt l a n s f e r , w l 明在生物大分 子结构和功能研究、免疫分析、核酸杂交分析、蛋白酶活性研究等方面 s - r l 有很 重要的应用。目前，在荧光共振能量转移分析方法中，主要采用有机荧光染料如 荧光素，罗丹明和荧光蛋白如绿色荧光蛋白( g f p ) 为供体和受体【”。一 荧光量子点( q u a n t u md o t s ) 又称半导体纳米晶体，是一种由i i 族v i 族或i 族 v 族元素组成的无机纳米颗粒，其尺度约为1 1 0 纳米。当这些半导体纳米晶体 的直径小于其玻尔半径时，由于尺度量子效应和介电照域效应使它们表现出特殊 的光致发光性质。与有机荧光染料相比，主要表现为吸收光谱范围宽，发射光谱 范围窄，s t o c k s 位移大，量子产率高。荧光寿命长，不易化学和生物降解、光 解或漂白等特点。荧光量子点另一个重要的特性是其荧光光谱特性可阻通过控制 量子点的体积大小和表面状态进行调节，同种材料组成的不同尺寸的量子点荧光 颜色不同，而它们的吸收光谱重叠范围宽，因此，可采用单一波长的激光为激发 光源，实现多色标记适合用于活体细胞成像分析和多组分同时检测。目前，荧 光量子点已成功地应用于生命科学中的各个领域主要包括免疫分折，d n a 杂交， 活细胞和固定细胞成像等1 9 4 ”。由于荧光量子点优异的光学性能和光化学稳定 性，最近它作为能量供体l ”1 5 】和受体 1 6 - t s 已成功地应用于荧光共振能量转移。量 子点作为荧光共振能量转移的能量供体和受体主要用于分析量子点一蛋白质标 记物结构、量子点一蛋白质感应组装i 趣”、光反应变色转换【2 ，砑、光动力学 医学治疗l u l 以及d n a 复制和聚合反应的监测瞄瑚等方面。0 d 的体积较大，可以 同时将多个受体分子与同一供体分子结合形成多受体体系，提高f r e t 效率， 增加测定的灵敏度。实验瞪j 表明在许多免疫分析和糖检测中，可以利用包含o d 的f r e t 技术。w i l l a r d 等人l 以c d s e z n s 核壳量子点为供体，并将其标记到牛血 6 嗨交通 = 学博f ：论文第一章绪论 清白蛋白o b s a ) j ：，同时将作为受体的四甲基罗丹明( 1 m r ) 标记到抗生物素蛋白 ( s t e p t a v i d j n ，s a y ) 上，利用f r e t 技术研究了b b s a 与s a v 的特异结合反应。另外 m a t t o u s s i f i t j 研究4 、组p 】还以q d 与c y 3 作为供体一受体对，研究了和同一供体作 用的受体数目与f r e t 效率之间的关系。研究表明，增加与供体作用的受体数目 确实可以提高f r e t 效率。 由于荧光共振能量转移分析系统结构复杂，仪器价格昂贵，其应用受到一定 的限制。另外，生物体内自身荧光会增加背景的干扰。在一些海洋生物( 如水母 a e q u o r e a v i c t o r i a 和海参r r e n i f o r m i s ) 中自然发生一种能量转移现象生物发 光共振能量转移。生物发光共振能量转移( b i o l u m i n e s e e n c ei c $ o n a i l c ee n e r g y t r a n s f e r , b r e t ) 是基于生物发光反应，以生物发光物质为能量供体，以荧光染科 或荧光蛋白为能量受体的能量转移过程。在这个过程中，r e n i l l a 的荧光素酶( r 1 u c l 在有底物腔肠素的存在下能够发出蓝光( 4 s o n m ) ，能够转移能量到绿色荧光蛋白 ( g f p ) 的突变体【增强的黄色荧光蛋自( f r f p ) l 上，随之后者发出5 3 0 的绿光。 这两个蛋白的相互作用可以通过r l u c 融合蛋白和e y f p 融合蛋白两者的相互关 系来进行评估。它们问的能量转移只有在r l u c 和e y l 7 p 的两个融合蛋白接近到 足够近( 1 0 0a ) 的距离时才能发生。b r e t 的信号可以通过比较e y f p 发出的绿 光和r l u e 发出的蓝光的量来进行测量。因为b r e t 信号是一个比率数，不是一 个绝对量，它消除了由于细胞数、细胞类型和其它实验变量而引起的数据变量。 这个方法已成功地应用于活细胞中受体二聚体形成( 如胰岛素受体) 和受体间相 互作用以及转录激活核蛋白相互作用等研究中1 2 7 州。晟近，量子点作为能量受体 已经成功用于生物发光共振能量转移分析【”。 虽然b r e t 和f r e t 特别适合于高通量筛选，被使用于药物开发中，但是此 技术目前因为关系到供体和受体间的距离障碍，所以还是有一些缺点。 1 2 化学发光与微分离分析方法联用研究 1 2 1 毛细管电泳 毛细管电泳又称高效毛细管电泳( 脚i 1 1 a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，简称c e ) ，是一 类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术 1 3 s l 。它迅速发展于8 0 年代后期，是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重 大进展，它使分析科学得以从微升水平进入纳升水平，并使得单细胞乃至单分 7 海交通人学博l 论空 第一牵绪论 子分析成为可能。长期困扰我们的生物大分子如蛋白质的分离分析也冈此有了 新的转机。电泳用的毛细管通常为内径2 5 1 0 0 “m ，管外壁一般为弹性聚酰亚 胺外涂层的熔融石英管，毛细管电阻高，能应用高电场( 1 0 0 1 0 0 0w c m ) ，缩短 了分析时间，而大的表面积体积比又能有效扩散所产生的热量，提高了分离效 率。 1 2 1 1 毛细管电泳的分离模式 如表1 1 所列为毛细管电泳的分离模式。 袅1 - l 毛细菅电泳类型 t a b l e l - 1 研p e s o f c a p i l l a r ye l e c l r o p h o r e s i s 1 2 1 2 毛细管电泳的检测器 毛细管电泳的检测器按检测原理可分为通用型和专用型，前者如电导法、折 射指数法，其余都属于专用型，专用型只针对有所需特性的分析物，故更为灵敏。 表1 2 列出各检测器的榆铡限和相应的优缺点： 8 卜晦交通= 学博f 论止第一章绪论 表1 - 2c e 常用检测器履其特点 t a b l e1 - 2g e n e r a ld e t e c t o ra n dj l sc h a r a c t e r i s l i ci nc e 表中若避样体积l o l 则质量检测限为浓度检测隈x1 矿m o l e 1 2 2 芯片毛细管电泳 最近几年，以毛细管电泳为核心技术、以芯片为操作平台的芯片毛细管电泳 技术迅速崛起，并成为微全化学分析系统p 6