（生物化学与分子生物学专业论文）钝齿棒杆菌精氨酸生物合成关键酶分析.pdf

ab s t r a c t ab s t r a c t e i sw i d e l y a p p l i e d i n t h e f i e l d s o f f o o d a n d 日 名 an a m i n o a c i d f o r t h e h u m a n b o d y s m e t a b o li s m . 玩面 a r ti c l e , t h e f u n c t i o n o f a r g r i n w a s s t u d i e d t h r o u g h a n a l y z i n g t h e r e l a t i o n b e t w e e n t h e c a p a c i t y a n d t h e c o n d i t i o n s a m o n g t h e m u t a n t n a m e d t h e c c r e n a t u m a . s . m2 , a n d t w o e n 沈s i n s n mn 州 c. a . s . i v ,口 a r g r a . s . m2 . s p . t h e k e y w 亡r 匕 i n v e s t i g a t e d b y t h e m e t h o d o f a ff in i t y s - p age a n d t h e ma t r i x 人s s i s t e d l a s e r行 me们i s穷 绍 ( ma l d i - t o f - ms ) . t h e m a i n r e s u l t s a r e i l l u s t r a t e d ( 1 ) t h e g r o w t h c u r v e a n d t h e u t i l i t y r a t e o f o f ii i g h t a s f o l l o w i n g : c a r b o n , t h ep r u d u c 吨 c u r v e o f a n d t h e p h o f t h e c u l t u r e m e d i u m o f c c r e n a t u m w e r e d e t e r m i n e d . t h e n t a l r e s u l t s h o ws t h a t c . a . s . m2 . s p i s t h e b a c t e r i u m w h i c h h a s t h e h i g h e s t c o n c l u s i o n , 如 e l d o f a r g i n i n e . t h e y i e l d o f t h i sg e t s t o 8 5 m g / ml . i n a r g r g e n e o f c .i s a p o s i t i v e i n t h e ( 2 ) t h ew a s g a t h e r e d i n t h e h i g h e s t y i e l d p e r i o d o f p r o d u c i n g t h e w a t e r s o l u b l e p r o t e i n s o f t h e s ew e r e e x t r a c t e d a n d t h e s p e c i a l e n z y m e s a n d p r o t e i n s ( 3 ) t h e s p e c i a l w en e e n z y m e s a n d i b y t h e t p r o t e i n swi 止 a n r a ffin i 钾 a ff in i ty me t h o d s o f o r t h ea r g u n n e we r e a n a l y z e d 妙 s d s - p a g e a n d 1 0 p r o t e i n d o t s w e r e p i c k o u t a n d t h e n t o g o p e p t i d e m a s s b a s e d o na n d ncbi t h rou g h d 对， 卜 a s 已 k e y wo r d s a . s .m2 . s p ; cc r e n a t u m a. s . m2 ; cc r e n a t u m a - s . m2 m 缩略语表 缩略语表 缩略语英文名中文名 bi s ,蛇b a 劝 ( , p , l o目s e a rch too l 局部相似性检索 b o v i n e s e r u m a l b n me n 小牛血清蛋白 de o x y r i b o n u c l e i c a c 记脱氧核搪核酸 e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d乙二胺四乙酸 千道尔顿 bsadnaeutakd kb 工 a佗 mal di - t of - ms k i l o b a s e p a i r s千碱基对 la r g i n i n e艺 ， 精氨酸 m a t r i x a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n t i m e o f 基质辅助滋光解吸附电离飞行时间质 几 沙t m a s s s p e c t r o m e t ry谱 o p t i c a l d e n s i t y光密度值 bi 召 r 4 r e d二 认砚 磷酸盐缓冲液 c h a i n r e a c t i o n 聚合酶链式反应 翻d i u m山 x i e c y l s 川 伪 加十二烷墓磺酸钠 od咄心sds s ds - p a ge t e me d t h e s d s - p o l y a c ry l a m i d e g e ls d s - 聚丙烯酸胺凝胶电 泳 n, n , n , n -te t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e n, n , n , n， 一四甲基乙二胺 t h i s ( h y d ro x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e三经基氨基甲烷 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明 所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的 研究工作及取 得的 研究 成果。 据我所知，除了文中 特别加以 标注和 致谢的地方外， 论文中不包含 其 他 人 已 经 发 表 或 撰 写 过的 研究 成 果， 也 不 包 含为 获 得 j班鼓迷色或 其 他 教 育 机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的 任何 贡 献 均已 在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学 位 论 文 作 者 签 名 (、枷 签 字 日 期 : 。 7年 、 月 ，、 日 学位论文版权使用授权书 本 学 位 论文 作 者完 全了 解 -a p . 达盖 兰有 关 保留 、 使 用学 位 论 文 的 规定 ， 有 权保留并向国 家有关部门 或机构送交论文的复印 件和磁盘， 允许论文被查阅 和 借 阅 . 本人 授权 直昼去堂可以 将 学 位 论 文的 全 部 或 部 分内 容 编 入 有 关 数 据 库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学 位论文作者签名 签字 日 期 甲 年 手 ” ，:4 w f - b 月lg 日 导师签名 ( 手写): 签字 日 期:6 2年月， 考日 0 学 位论文作者毕业后去向: 工 作单位: 通讯地址 : 电话: 邮编: 第 i 章 前言 第 1 章前言 l l - 精氮酸的性质 l - 精氨酸c l - a r g in in e ， 简 称l - a r g ) 是 含有肛基的 碱性氨基酸. 其化学名为 a - 氨基- s - 肛基戊酸， 分子式为c 6 h a n 4 0 2 ， 相对分子量为1 7 4 ， 化学结构式如下: 图1 - 1 l - 精氨酸分子结构式 f i g . 1 - 1 c h e m i c a l s h u c h u e o f l - a r g n t i n e l - a r g 溶于 水， 徽溶于乙 醉， 不溶于乙 醚。 在水中 最大紫外吸收波长为2 0 5 r u n . l - a r g 从水中 析出时为含2 分子结晶水的白 色棱形结晶， 1 0 5 热脱去结晶 水， 2 3 0 色晶 体变为棕色， 2 4 4 jc l - a r g 发生分解， l - a r g 从乙 醉中析出 时为无 色单斜片状结晶。 2 l 一 精氨酸的生理作用与应用 2 . 1 l - 精氨酸的生理作用 . l - a r g 是 人 体 代 谢 的 一 种 重 要 氨 基 酸 ， 所 有 的 机 体 组 织 都 利 用l - a r g 合 成 细 胞浆蛋白和核蛋白。 它是天门冬氨酸、 谷氨酸、 脯氨酸、 经脯氨酸和聚胺 ( 腐胺、 精胺及精眯) 等转化为高能磷酸化合物磷酸肌酸的中间体， 在肝脏内与尿素 的形成有关: 在生理活性方面， 与生长激素、 胰岛素和胰高血糖素等激素诱导分 泌有关。 第 1 章 前言 2 . 2 l - 精氨酸的应用 研究 表明l - a r g 具有 提高 人 体免 疫 力的 作 用。 研究 显 示， 正 常 情 况 下， 人体 能自 身合 成 足够盘的l - a r g 以 满 足机体的 需 求， 但是 人体 在饥饿、 损伤、 疾病、 应急 状态及青少年快速生 长阶 段， 机体 对l - a r g 的 需求 超 过了自 身 合 成的 能力， 因 此 及时 补 充 外 源性l - a r g 有 利于 提 高 机体 的 免 疫 能 力 p -0 1 l - a r g 对急 性病毒性肝炎， 慢性持续性 肝炎以 及 肝硬 化等 疾病也 有较好的 治 疗效果。 动物试验表明， 大鼠 喂养缺乏精氨酸的 饲料一周 后， 其肝脏出 现明 显的 脂肪肝 病变， 因 此l - a r g 对于预防 和治 疗脂肪肝 病变， 保 肝， 护肝具有一定的 积 极 作 用 s-s1 l - a r g 具 有抗动脉粥 样硬化、 防治高 血 压 及心力衰蝎 等作 用9 - 11 l - a r g 可 刺 激 胰 脏 分 泌 胰岛 素 1 2 1 ， 刺 激 垂 体 分 泌 生 长 激 素 ， 促 进 生 长 ， 因 此 l - a r g 对儿童的 生长发育有举 足轻重的 作 用。 同 时l - a r g 对于维持男性 体荷尔蒙 的分泌具有一定的作用， 随着年龄的增长， 人体合成精氨酸的能力逐渐下降， 从 而影响 激素的分泌导致性功能衰退， 适当 补充l - a r g 对男性体内正常的 激素的分 泌 具 有 积 极 的 作 用 13 -1气 l - a r g 在食品 工业中 是常用的 调味剂. l - a r g 因 具 有抗菌 性强、 毒性低的 特 点而 作为 食品 和化妆品等的 优良 防 腐剂. l a r g 与 甘氨 酸 和 脯氨酸合 成甘氨酸一 脯氨酸一精氨酸为主要成分的聚合物是很好的表面活性剂和翁合剂， 可作为阳离 子 表 面 活 性 剂 原 料1 几 3生产现状 1 9 8 6 年， 全 球l a r g 的 需求量 为1 0 0 0 吨。 1 9 9 6 年，全世界的l a r g 的生产量为1 2 0 0 吨。 1 9 9 9 年，日 本 农林水 产省 颁布l a r g 作为 新的 饲 料添 加剂 用氨 基酸。 目 前， 主要生产国为日 本， 其生产厂家为田 边制药、 味 之素和协和发酵。 韩 国 氨基酸生 产发展也 很快， 味 元公司 年产l a r g 能 达2 0 0 吨。 日 韩欧 美等国 都 在 积极开 展重组菌株生 产l - a r g 技 术， 但目 前真正 投入生 产的 不多。 国 际 上 采用发 酵法生 产l a r g 产量能 达到5 - 6 % 提取率达到8 1 %旧 本) ， 而我国 采用发 酵法 生 产l a r g 产 量 只 能 达到2 .5 % ， 提 取 率 为75 % 118 ， 17 5 % 1 1 8 气 随着市场需求的增加， 我国也陆续建设了 精氨酸的生产装置， 但基本是加工 精品l - a r g ， 即 将外国 粗品 氨基酸提 纯精制 后 配制成复 合的 氨基酸输液原 料， 而 且产量也非常有限，主要依赖进口。 第 1 章 前言 4 l - 精氨酸的生产方法 l - a r g 的生产方法最早采用化学合成法和蛋白 质水解法， 随着利用微生物发 酵生产l - a r g 研究的 不断深 入， 发酵 法己 成为l - a r g 生 产的 主流技术。 目 前主要应用传统诱变方法获得高产l - a r g 菌株， 基因 工 程手段在l a r g 的 应用还处于研究阶段， 但随 着基因 工 程技术的日 趋完善 和 对l a r g 生物合成途 径 及其调控体系的 进一 步认识， 有望在传统手段基础上对l a n产童性状有所贡 献。 4 . 1传统诱变育种生产l - 精氮酸 该方法以 葡萄糖、 甘蔗糖蜜等廉价原料为碳源， 在代谢控制育种理论的指导 下， 通过 筛选 营养 缺陷 型 和结 构 类似 物抗 性突 变 株 选育l - a r g 生 产菌 株。 传统的 诱变育种方式之所以 能导致生物体性状的改变， 是因为引 起了 生物体的遗传信息 的 改 变， 使 遗 传 信 息 的 载 体d n a 发 生了 突 变3 11 就文献检索的情况看， 目 前研究的菌株主要是大肠杆菌和棒杆菌属的菌， 如 谷氨酸棒杆菌、 黄色短棒杆菌及我国 应用较多的钝齿棒杆菌等。 常采用的诱变剂 是能直接对核酸进行化学修饰， 不影响核酸复制的体外诱变剂-亚硝基胚。 研 究的主要进展见附录表 1 . 4 . 2 l - 精氨酸生物合成及其生物合成途径的研究 传统生 产l a r g 的 高产菌株大多 采用诱变筛选的 方 法获 得. 以 葡萄糖、 甘蔗 糖蜜等廉价原料为碳源， 在代谢控制育种理论的指导下， 通过筛选营养缺陷型和 结 构类似物 抗性 突 变 株 选育l a r g 生 产菌株。 传统的 诱 变 育 种方式之 所以 能 导 致 生物体性状的改变， 是因为引 起了生物体的遗传信息的改变， 使遗传信息的载体 d n a发生了 突变13 2 1 了 解 l a r g生 物合成及其生 物合成途径是进行基因 工 程菌株改 造的 前提。 l a r g 的生物合成是通过细胞内的代谢网 络进行的，该代谢网络由 众多的酶催化 相互关联的一系列化学反应以 及特异性的膜转移系统所构成。 其生物合成途径如 图 1 - 2 : 第 1 章 前言 乙酷谷氨酸合成醉 乙 酞谷氨酸激醛 乙耽谷氨酸半醛脱氢酶 乙酞鸟氨酸转氨酸 谷氮酸 上 谷氨酸 工 ar g a 乙阮谷氨酸 l a r g b 乙 酞谷氮酸磷酸 l a r 9 c 乙酞谷氨酸半醛 l a r g 刃 乙酞鸟氮酸 乙酞鸟氨酸转移酶 a r g j i l a r g e 乙 酞鸟 氨酸酶 鸟氨酸 氛甲 酞 磷 酸- i a r g l , f 鸟 氨 酸 转 氨甲 酞 醉 氮荃甲 酞磷酸合成酶c a r a b t瓜氨酸 c c y l a r g g 精氨 酸 玻拍 酸合 成酶 a t p鸟氨酸珑泊酸 谷氨酸l a r g h 精氨酸琉拍酸酶 精氨酸 图1 - 2精氨酸生物合成途径 f i g . 1 - 2 t h e p a t h w a y o f a r g i n i n e b i o s y n t h e s i s . 在原核 微生 物中， l - a r g 的 合 成是从 谷氨酸开始， 经历了8 种酶催化而成， 分别为: 乙酞谷氨酸合成酶， 乙 酞谷氨酸激酶，乙酞谷氨酸半醛脱氢酶， 乙酞鸟 氨酸转氨酶， 乙 酞鸟氨酸酶， 乙 酞鸟 氨酸转移酶， 精氨酸琉拍酸合成酶， 精氨酸 玻拍酸酶. 有报道表明 ， 在大肠杆菌中， 合成l - a r g 的 第一 个酶: 乙 酞谷 氨酸合 成酶 是终 产物l - a r g 反馈抑制的 靶目 标; 而 有些 微生 物 被l - a r g 反 馈抑制的 关键 酶是合成途径的乙 酞谷氨酸激酶或鸟氨酸乙 酞转移酶。 谷 氨 酸 棒 杆 菌 被l - a r g 抑 制的 关 键 酶 是乙 酞 谷 氨 酸 激 酶 ， 此 酶 不 仅 被l - a r g 反馈抑 制亦被其反 馈阻 遏;乙 酞谷 氨酸合成酶亦不 受l - a r g 抑制也 不受其阻遏。 反馈抑制降低了生物合成途径中诸多与精氨酸产量相关的酶活性和表达量， 从而 限 制了 钝齿棒杆菌a . s . 1 .5 4 2 产精氨酸水平。 钝齿棒杆菌a . s 1 . 5 4 2 是我国 研究者 分离到的一种钝齿状、 无芽抱的革兰式阳性菌， 其突变株在国内 其他氨基酸生产 中被广泛应用， 前期工作对该菌的遗传背景进行了初步 研究， 有关该菌株产l - a r g 的 研究仍处于起步阶段， 但有关在l - a r g 生 物合成途 径中 受l - a r g 反 馈抑 制的关 第 i 幸 前言 键酶研究国内外鲜见报道。 5 蛋白质组学研究 基因 研究是2 0 世纪生命科学的 主线。 2 0 世纪上半叶， 生命科学领域的 研究 主要集中在遗传学研究方面， 包括基因分离、 独立分配、 连锁及化学属性等的研 究;2 0世纪下半叶，生命科学领域的研究主要以分子生物学为代表， 生命科学 通过对基因复制、 转录、 翻译及遗传密码的分析与破译， 最终以统一生命世界各。 层次、 生命科学各分支的 “ 中心法则” 的问世而集成. 其中 人类基因组计划被誉为 2 0 世纪的三大科技工程之一。 其划时代的研究成果宜告了一个新的纪元一 后 基因 组时 代” 的到来。 其中， 功能 基因组学( f u n c ti o n a l g e n o m i c s ) 成为研究的 重心， 蛋白 质 组学 ( p r o t eo m i c s ) 则是 其 “ 中 流 砒柱 ” 。 当 基因 组 计 划 趋于 完成 之时 ， 基因 组 功能的阐明则摆在面前，生命科学的研究从此开始了 新的征程一蛋白 质组学研 究，同时预示着生命科学的研究进入了一个新纪元后基因组时代 p o s tg e n o m e e r a 3 7 , 3 1j . 5 . 1 蛋白质组研究范围 “ 蛋白 质组” 不仅其研究已 成为具有重大战略意义的科学命题， 而且其分析己 成为一种十分有效且应用广泛的研究手段。 据不完全统计，目 前至少己 涉及如下 几个方面: 蛋白 质， 如蛋白 质组作图、 蛋白 质组成分鉴定、蛋白 质组数据库构 建、 新型蛋白 质发掘、 蛋白 质差异显示、同 工体( i s o f o r m ) 比 较; 基因 ，如功 能基因组计划、荃因产物识别、基因 功能鉴定、基因调控机制分析: 重要生 命活动的 分子机制， 包括细胞周期、 细胞分化与发育、 肿瘤发生与发展、 环境反 应与调节、 物种进化等; 医药靶分子寻找与分析，靶分子类型包括新型药物 靶分子等。 由此不难看出 “ 蛋白 质组” 研究与分析己 涉及生命科学中一系列热点领 域。 5 . 2 蛋白质组学的 研究内 容 蛋白 质的分离与鉴定:可以 利用二维电泳或多维色谱同时结合生物质谱 等技术， 对蛋白 质种类及丰度进行研究。 翻译后修饰: 蛋白 质要“ 经历翻译后 修饰如磷酸化， 糖基化， 酶原激活等。 翻译后修饰是蛋白 质调节功能的重要方式， 因此对蛋白 质翻译后修饰的研究对阐明蛋白 质的功能具有重要作用。 蛋白 质 功能的确定:如分析酶活性和确定酶底物， 细胞因子的生物分析ae基一 受体结合 第 i 章 前言 分析等。 对人类而言， 蛋白 质组学的研究最终要服务于人类的 健康，主要旨 在促进分子医学的发展，如寻找药物的靶标分子等。 5 . 3 蛋白质组学研究方法 蛋白 质组学的目 的是实现对一个基因组所编码的全部蛋白质及其相互作用 的研究。以 简单的真核生物酵母为例，其基因编码蛋白 质为6 1 4 5 个。 人类基因 组约 含2 8 0 0 0 - 4 0 0 0 0 个编码基因， 其表达的蛋白 质可能 达几十万种. 如何实现对 细胞、 组织或体液所含有的 成千上万个蛋白 质的有效分离， 是蛋白 质组 研究首要 解决的问 题. 理想的蛋白 质分离方法首先要具备超高分辨率， 能够将成千上万个 蛋白 质包括它们的修饰物同时分离并与后续的鉴定技术有效连接。 这种理想的分 离方法还应当 对不同 类型的 蛋白 质， 包括酸性的、 碱性的、 疏水的、 亲水的， 相 对分子量小的、相对分子量大的均能有效分离。 5 . 3 . 1 蛋白质组分离技术 目 前， 用于“ 海量” 蛋白 质混合物的高效分离方法主要有二维凝胶电 泳、 高效 液相色谱和毛细管电 泳等方法。 其中因分离度高并具有直观图谱而被普遍采用的 方 法为 二维 凝胶电 泳( t w o - d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s ) ，即2 d e . 2 d e与质谱联用技术己 经成为蛋白 质组学研究中一个较为成熟的技术平台， 被 广泛应用于蛋白 质组学研究的 各个方面。 但该 技术缺陷 在于( 1 ) 在二维凝胶电 泳图 谱 上， 并不是每 个蛋白 点 所包含的蛋白 量都 足以 用于蛋白 鉴定;( 2 ) 存在歧视 性问 题， 如 对于低丰度蛋白 、 疏水性蛋白 、 极 碱性蛋白 ( p i 1 0 ) 、 一些极大蛋白 ( 相 对分 子 质量 2 0 0 , 0 0 0 d a ) 和极小蛋白 ( 相对分子 质量 8 , 0 0 0 d a ) ， 二维 凝胶电 泳还 不能 够 将其 很好地显示出 来， 仅仅 只有一些可溶的 蛋白 被用于研究; ( 3 ) 费时、费 力，而且不容易自 动化。 高 效液相色谱 方法( h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g p h y , h p l c ) 获得了愈 来愈多的应用， 特别是各种模式色谱联用组成多维色谱分离技术逐渐被采用， 并 与质谱联用以克服二维凝胶电泳存在的缺陷。 通常与质谱联用的多维色谱分离方 法是基于两种或两种以 上不同分离机理方法的 优化和组合， 其峰容量为最后一种 模式色 谱对前一种( 或几种 ) 模式色谱分离所得的 所有馏分进一步分离的 色谱峰 的总 和。 分离方法的 选择除了 根据分离对象和目 的的不同 考虑不同分离方法以及 组合方式 外， 还应考虑质谱鉴定的要求以 及最后从蛋白 质数据库检索的需要。 由 于蛋白 质组的庞大和复杂， 通常需要对其进行预分离以 缩小分离范围， 再进一步 进行高效分离。 第 t 章 前言 5 .3 .2 蛋白质鉴定技术 对分离的蛋白 进行鉴定是蛋白 质组学研究的核心问题。 质谱鉴定技术的引入 是蛋白 质组学发展中 最重要的技术突破， 它具有高通量、 灵敏、 准确、自 动化等 特点，已 逐步取代传统的e d m a n降 解测序和氨基酸组成分析，成为蛋白 质鉴定 的核心技术。 生物质谱通过检测离子化的被分析物的 质量数来获取信息， 生物质谱仪通常 包含3 个部分: 离子 源、 质至分析器和检测器. 基质辅助 激光解吸附离子化伽a t r i x a s s i s t a n t l a s e r d e s o r p t io n i o n i z a t i o n , m a l d i ) 和电喷雾离子化( e l e c tri c s p r a y i o n i z a t i o n , e s i ) 是蛋白 质组 研究中 最为常 用的2 种离 子化方式。 e s i 常与液相分 离工具相连，将被分析物从溶液中离子化， ma l d i 利用激光脉冲从干燥结晶的 基质中气化被分析物并使之带电. m a l d i , m s 常用于分析较简单的肤段混合物， 如二维凝胶电泳蛋白 质点或单一蛋白 质的酶切提取肤混合物， 进而获得肚质量指 纹图谱( p e p t i d e m a s s f i n g e r p r i n t , p m f ) 信息， 该方法是目 前蛋白 质组研究中 最常 用的胶上蛋白 质鉴定 技术. e s l - m s ( l c - m s ) 同时具有分离和鉴定功能， 常用于 鉴定复杂肤混合物， 如混合蛋白 溶液酶切产物。 由 于e s l - m s 常具有串 联质谱功 能，可能获得肤段序列信息，因此得到的鉴定结果更为可靠。 实现对复杂蛋白 体系的分离鉴定和定量是蛋白质组学研究要解决的首要问 题。目 前有3 种主要的蛋白 质鉴定手段: 第一种是肚指纹图谱， 将蛋白酶切， 通 过酶切的特异性位点 和各肤段质谱图 搜索数据库得出 蛋白 信息。 缺点是不能对混 合蛋白 进行鉴定， 所以常与2 d e联用。第二种是肚序列标签， 通过测定某一肤 段的 氨基酸序列并在蛋白 质数据库检索。 第三种是肤阶梯序列， 通过测定每个肚 段的二级质谱来确定蛋白。 目 前常用的有2 种主要的蛋白 质鉴定体系: 一种是基于二维凝胶电 泳和生物 质谱的鉴定手段。 其优点是可以 提供其他技术所不能得到的分辨能力， 能够有效 地呈现出蛋白 质的等电点和相对分子质量迁移等信息， 但由 于二维凝胶电 泳所固 有的局限性，如检测的线性范围窄， 难以 有效分离相对分子质量高于1 0 0 k d的 蛋白质，极酸或极碱及疏水性高的蛋白 质。虽然也有很好的2 d e前的样本预处 理和分离技术等，仍很难改善 2 d e - m s技术体系在分析上述蛋白质时存在的 缺 陷。 第二种鉴定方法是新近开发的多维液相色谱分离与串 联质谱的连接， 常用的 多维分离模式为离线或在线离子交换与反相色谱连接。 二维液相色谱一 串 联质谱技术:液相色谱是广泛应用于蛋白质组研究中的一 种重要分离技术， 利用蛋白 质带电 性和疏水性的不同， 采用强阳和反向毛细管色 谱相结合， 达到蛋白 质的分离和鉴定。 它可与电离喷雾串联质谱联用。 而电喷雾 第 i 章 前言 串联质谱是获取多肚序列信息的有效质谱方法之一。电 喷雾作为一种接口 技术， 能够连接液相色谱和质谱， 较好地分离蛋白质混合物， 此外电喷雾能够将特定的 质荷比的离子进行裂解， 产生一系列的碎片离子， 这对蛋白 质序列的测定非常重 要。 胰蛋白酶消化组织或样品获得肤， 二维色谱分离肚， 通过联机的串联质谱自 动分析肚， 然后借助计算机的联机检索， 数据库查询鉴定肤， 从而实现了高通量 筛选和鉴定蛋白质混合体系的要求。 由y a t e s 16 8 1 等 率先提出 ， 用于开展酵 母全蛋白 质表达 谱的 分析. 结合离子腾 质谱仪和s e q u e s t 算 法， 一次循环 成功鉴定出1 4 8 4 个蛋白 质， 该方法被称为多 维蛋白 质 鉴定技术( m u lt i - d i m e n s i o n a l p r o t e i n i d e n t i f i c a t i o n t e c b n o l o g y ,m u d p 助 . 6研究目的、意义、前期研究进展及研究内容 6 . 1研究目的及意义 随 着我国医 药水平的提高， 对l - 精氨酸( l - a r g i n i n e , 简 称l - a r g )的 需求 日 益增长，传统的生产方法已无法满足工业化发展的要求。 钝齿棒杆菌a . s 1 .5 4 2是我国 研究者分离到的一种钝齿状、无芽抱的革兰式 阳性菌， 其突变株在国内氨基酸生产中被广泛应用， 但对其遗传背景的研究还处 于空白 状 态。 本实验室曾 对该菌株产l - a r g 生物合 成途径的 基因 学遗传背景进行 了 研究. 钝齿棒杆菌a - s .m 2 是钝齿 棒杆菌a . s 1 . 5 4 2 ( c o ry n e b a c t e r i u m c r e n a t u m ) 经亚硝基孤诱变得到的一株诱变菌。 国 际 上 采 用 发 酵法 生 产l - a r g 产 量能 达 到5 - 6 % ， 提 取 率 达 到8 5 %旧本) ， 而我国 采 用发酵法生产l - a r g 产量只能 达到2 .5 % ， 提取率 为7 5 %。 前期研究 通 过亚硝基脏诱变钝齿棒杆菌a . s .m 2( 原菌精氨酸的 产量为2 0 m g / m l ) ，获得了 一株高 产l - a r g 的 突变菌株， 产量为4 % . 在精氨酸生物合成过程中， 生物合成途径中 诸多与精氨酸产量相关的酶活性 和表达量受精氨酸反 馈抑制调节， 从而限 制了 钝齿棒杆菌a . s .m 2 产l - a r g 水平， 由于以上关系可推断生物合成途径过程中诸多影响精氨酸产量的酶系与精氨酸 存 在 着 特 殊结 合 位点. 本课 题 拟对钝 齿棒 杆 菌a .s .m 2 l - a r g ( l - a r g in in e ， 简称 l - a r g )生物合成途径中受精氨酸反馈抑制的 关键酶进行研究:同时，通过遗传 工 程原理， 研究a r g r基因 在l - a r g 生 物合成途 径中的 功能 ， 为 我国 运用基因 工 程技术进行菌种改良生产氮基酸奠定一定的基础. 第 1 章 前言 6 . 2 前期研究进展 ( 1 ) 采用p c r 方法从c . g l u t a m c i u m a t c c 1 3 0 3 2 成功 地扩增出 长约为1 k b 的 a r g b 基因，并 将其 克隆 至 p g e m - t - e a s y 载 体中; 通过酶 切 冈e m - t - a r g b获 得 a r g b 基 因 片段， 将其插入至强 启 动子 p t a c 诱导表达g s t 编码的 融合蛋白 载体 p g e x - 4 t 1 中，实现了外源基因在大肠杆菌中的表达。 ( 2 ) 构建了 敲除 型 载体闪e m - t - r k r ， 敲除了c c r e n a t u m a .s .m 2 中的a r g r 基 因。 a r 9 r 基因的敲除， 使得a r g b 基因 编码的 关键酶乙 酞谷氨酸微酶在细胞的 含 量维持较低的 和较恒定 的 水平， 而c . c r e n a t u m a . s . m 2 中的乙 酞谷氨酸激酶在监 控的时间内 一直处 于上扬态势， 表明a r 9 b 基因 受切 ， 左 基因的调控，且a r g r 基 因 在c . c r e n a t e . 的 生 物 合 成精 氨酸 途径中 扮 演正 调控的 角 色; 当. g r 基因 敲除 后， c c r e n a t u m a .s .m 2 . s p 中的a r g b 基因 有基本的 表达 水平， 即能 维持细 胞的正 常生理功能。 ( 3 ) 构建了 一个表达型 质粒p c 2 - p - a r g r - t , 成功地电 转至c c r e n a t r a n a . s .m 2 e 6 . 3 研究内 容 本课题拟在以 下几个方面展开研究: 采用偶联有l - a r g 的s e p h a r o s e - 4 b 亲和层析柱分离生 物合成途径中 受精氨酸 反馈抑制的 关键酶: 并 通过s d s - p a g e分离纯 化各关键酶， 获得受l a r g 反馈 抑制的纯蛋白 质; 将各纯化蛋白组分进行ma l d i - t o f - ms 分析，分析结果与蛋 白 组数据库进行比 对获 得在l a r g 生物合成途径中 受l a r g 反馈抑制的 关键酶信 息，为利用基因工程技术改良 生产菌株莫定基础。 ( 1 ) 比 较c .c r e n a t u m a - s . m 2 , c .c r e n a t u m a - s .m 2 . s p 和c .c re n a t u m a . s .m 2 aa r g r 这 三株菌l - a r g 产量 及 其与 各生 长因 素 之间 的 关 系， 分 析a r g r基因 在 钝齿 棒杆 菌精氨酸生物合成途径中的可能作用: ( 2 ) 采集各菌l a r g 产量高峰期的菌体， 采用偶联有l a r g 的s e p h a r o s e - 4 b亲 和层析材料分离纯化 钝齿棒杆菌l a r g 高 产期与l - a r g 有亲和力的蛋白 : ( 3 ) 通过透析、 超滤等方法浓缩蛋白， 采用s d s - p a g e电 泳分析验证该蛋白的 真实性，并切胶回收获得不同组分的纯蛋白。 ( 4 )各纯化蛋白 组分进行 m a l d i - t o f - m s分析，分析结果与蛋白 组数据库进 行比对分析。 第2 章a r g r 墓因 对钝 齿 棒 杆菌 发 酵 过 程中 产a rg in in e 特性的 影响 第2 章 a r g r基因 对钝齿棒杆菌发酵过程中 产 ar g i n i n e特 性的影响 1前言 l - a r g 是人体 代谢的一 种重要 氨基酸， 所有的 机体 组织都利 用l - a r g 合成细 胞浆蛋白 和核蛋白。 它是天门冬氨酸、 谷氨酸、 脯氨酸、 轻脯氨酸和聚胺 ( 腐胺、 精胺及精眯) 等转化为高能 磷酸化合物 磷酸肌酸的中间体， 在肝脏内 与尿素 的 形成有关 i ; 在生 理活性方面， 与生长激素、 胰岛 素 和 胰高 血糖素 等激素诱导 分 泌 有 关 (6 1 。 因 此 早 在 二 十 世 纪 七 十 年 代国 外 就 开 始 研 究 发 酵 法 生 产l - a r g (4 0 ,4 1 1 . l - a r g 的生产方法最早采用化学合成以 及蛋白 质水解法， 但是采用传统的提取法 生产吞精氨酸远不能满足市场日 益增长的需 要， 因此国内 外许多学者致力于l - 精 氨酸生产菌的选育、 工程菌的构建以 及生产工艺等方面的 研究。 随着利用微生物 发酵生产l - a r g 研究的不断 深入， 发酵法已 成为l - a r g 生 产的主流技术. 但是随 着基因工程技术的日 趋完善和以 及人们对 l - a r g生物合成途径及其调控体系的 进一步 认识， 通过利用基因 工程手段提高微生 物发酵过 程中l - a r g 产量性状的 文 献报道逐渐增多。 钝齿棒杆菌是我国 氨基酸生产中 应用较多的 一类菌， 采用常规诱变的方法虽 然对l - a r g 产量提高 有所改 普， 但离国际上报 道的高 产能 力仍有一 定的差距。 a r g r基因 是l - a r g 生 物合成途径中 普遍 存在的 一 个调控基因， 但是不同的 细菌a r 9 r 基因 有其 特殊性. 本实 验以a r 9 r 基因 在 细胞中 的 不同 表达 情况为基础， 比 较三株菌发酵过 程中 各个参数的 变化， 希望 获 得一 些 信息， 为研究a g r基因 在l - a r g 生产中的 作用提供一些参考， 同时 也希 望能为 钝齿棒杆菌l - a r g 发酵途 径研究提供一些有用资料。 2 材料和方法 2 . 1仪器及试剂 2 . 1 . 1仪器 紫外分光光度计 ( u l t r o s p e e 4 3 0 0 p r o 型， t o p h a r ma c i a b i o t e c h公司) 第2 章a r g r 荃因 对钝齿棒杆菌发酵过程中 产a r g i n i n e 特性的影响 m i li p o r e 超纯水生 成器( 美国 ) t g l 1 6 台 式冷冻离 心机( 中国 科学院 武汉科学仪 器厂) 2 k -1 5 低温离心机 ( s i g m a 公司 ) g s - 1 5 型台式高速离心机 ( 德国b e c k m a n 公司) 隔水式电热恒温培养箱 ( p h a m a r c i a b i o t e c h 公司产品) 恒温水浴锅 ( p h a m a r c i a b i o t e c h 公司产品) 超净工作台 ( 北京半导体一厂) ml s - 3 7 5 0 型全自 动灭菌锅 ( 日本s a n y o 公司) 电热手提压力蒸汽消毒器 ( 北京) e k - 1 2 0 g电 子秤( a - d c o l t o ) s a r t o r i u s电子天平 ( s a r t o r i u s 公司) 3 2 0 - s 型 p h 计 ( m e t t l e r t o l e d o 公司) l a b o r l u x s显微镜 ( l e i t z ) w p 7 0 o p 1 7微 波 炉犷东 顺德 格兰 仕电 器有限 公 司 ) 5 k c p 3 2 g n 1 0 7 g s 高 温烘箱( m e x i c o ) m v s - 1祸旋混 合器( 北京北德科学仪器有限 公司 ) c d - 1 9 6 / h c超低温冰箱 f i n l a n d l a b s y s t e m微量吸液器 2 . 1 . 2试剂 化学试剂 ( 分析纯) : 氢氧化钠， 硫酸铜， 次甲 基蓝， 酒石酸钾钠， 亚铁佩 化钾，葡萄糖，双乙酞，甲 蔡酚，正丙醉，盐酸，硫酸氨， 磷酸二氢钾，硫酸 镁，碳酸钙，尿素。 生物试剂:琼 脂粉， l - a r g , l - 组氨酸， 生物素， 甘油， 玉米浆. 2 . 1 .3 溶液 显色剂甲: 取9 0 匹 双乙 酞， 用正丙醇 溶解至1 0 0 i n l . 显色剂乙 : 称取l o g 甲蔡酚，用正丙醇溶解至1 0 0 m l . 4 5 g i l n a 0 h溶 液: 称取4 . 5 g n a o h ， 用蒸馏水溶 解，再定溶至1 0 0 m l . 0 . 2 5 m o l / l盐酸溶液:取2 . 1 5 m l , 浓盐酸稀释至1 0 0 n2 l . 斐林试剂甲 液:3 5 g 硫酸铜，0 . 0 5 g 次甲 荃蓝，用超纯水溶解后稀释至 第2 章a r g r基因 对钝齿棒杆菌发酵过程中 产a r g in in 。 特性的 影响 1 0 0 0 ml . 斐林试剂乙 液;1 1 7 g 酒石酸钾钠，1 2 6 .4 g 氢氧 化 钠， 9 .4 g 亚 铁氛化钾， 用超纯水溶解并稀释至1 0 0 0 m l . 0 : 1 % 标准葡萄糖液:准确称取1 g 无水葡萄糖，1 0 5 1c 烘干2 h 用水溶解， 加5 m l浓盐酸，用超纯水定容至1 0 0 0 m l . 2 .2苗株和培养基 2 .2 . 1质粒和菌株 2 .2 . 1 . 1 cc r e n a t u m a s .m2( 经亚硝基脏诱变 cc r e n a t u m a .s 1 .5 4 2获得的高产 a r g i n i n e 菌) ，江南大学陶文沂教授馈赠; 2 .2 .1 .2 c c r e n a tu m a .s .m 2 .s p :内 含由卯2 改 造表达a r g r 基因 的丙2 - p - a r g r - t 表达质粒， 具有卡那霉素 抗性基因。 ( 原穿 梭质粒p c 2 由日 本东 京技术学院生 物 工程系m a s a a k i wa c h i 教授馈赠，该菌株由 江西师范大学陈雪岚博士馈赠) ; 2 . 2 . 1 .3 c c r e n a t u m a . s .m 2 0 a r g r r 敲除了c c r e n a t u m a .s .m 2 中的a r g r 基因， 该菌株以卡那霉素抗性基因作为遗传选择性标记， 由 江西师范大学陈雪岚博士馈 赠。 2 . 3培养基及培养条件 2 .3 . 1 固体培养基 葡萄 搪3 0 g / l ， 玉米 浆2 0 g / l , ( n h 4 ) 2 s o 4 2 0 g / l , k h 2 p o 4 1 g / l , m g s o 4 .7 h 2 o 0 . 5 叭 ， 尿素1 .5 g / l , 5 % 琼脂粉， p h 7 .2 - - 7 .4 。 其中 ， c c r e n a t u m a . s .m 2 .s p 和c c r e n a t u m a . s .m 2 a a r g r的 培养 基中 加 入5 、卡那霉素。 2 3 . 2种子培养墓 葡 萄 搪3 0 g / l ， 玉 米 浆2 0 g / l , ( n h 4 ) 2 s o 4 2 0 g / l , k h 2 p o 4 1 妙， m g s o 4 .7 h 2 o 0 .5 叭， 尿素1 .5 叭， 州7 .2 - 7 .4 。 其中 ， c c r e n a t u m a . s .m 2 .s p 和c c r e n a t u m n a . s .m 2 0 a r g r的培养基中 加入5 % o 卡那霉素。 2 . 3 . 3 发醉培养基 葡萄糖1 2 0 g / l ， 玉米浆1 0 g / l , ( n i 1 4