（发育生物学专业论文）拟南芥自体吞噬家族atatg8转基因苗的筛选及分子鉴定.pdf

山东师范大学硕士学位论文 拟南芥自体吞噬家族a 纠彻转基因苗的筛选及分子鉴定 ( 山东师范大学生命科学学院，济南，2 5 0 0 1 4 ) 摘要 植物在逆境胁迫下常常会因吸收不到足够的营养物质而不能维持正常的生理功 能。低温、干旱、a b a 、高盐等非生物胁迫是广泛影响作物生产和植物生长的不利生 境。当植物处于某一胁迫环境中时，植物会调控自身含有的与胁迫相关的基因的表达， 产生相应的适应性。目前已经克隆了许多胁迫相关基因，用于植物抗逆基因工程中， 并得到了一些有一定抗逆性的转基因植株，展示了广阔的前景。 程序性细胞死亡是指为维持内环境的稳定，由基因控制的细胞自主且有序性的死 亡，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等，在真核生物发育、免疫调控和细胞稳 态平衡方面发挥了重要作用，因而是具有生理性和选择性的。通常情况下，细胞死亡被 分为细胞坏死和凋亡( p c d ) 。前者是因病理而产生的被动死亡，如由化学性或物理性的 损害因子、缺氧或营养不良等条件引起的细胞坏死。后者是一种程序化的主动性细胞死 亡，是通过依赖于c a s p a s e s 的蛋白家族定义的。但是大量研究结果表明还存在e a s p a s e 非 依赖性的细胞程序性死亡，已被人们初步认识的有自体吞噬作用等途径。 自体吞噬是广泛存在于真核细胞中的一种溶酶体依赖性的降解途径，它能引起细胞 中长寿命蛋白的降解，参与细胞的正常生长发育过程和维持代谢平衡。在某些压力条件 下，如在损伤、营养匮乏、饥饿状态等情况下，可以循环利用细胞组分最终使细胞得以 生存，甚至在某些组织的癌变过程中也扮演重要角色。自体吞噬作为广泛存在于真核细 胞中的生命现象，贯穿于正常细胞生长发育和生理病理过程，对防止如神经退行性病变、 肿瘤、心肌病、病原微生物侵入感染等疾病以及对防止老化、延长寿命有积极作用。因 此对细胞自噬作用和自噬型细胞死亡的研究不仅具有理论意义，而且也具有非常重要的 应用价值。自噬基因的发现使我们从分子水平认识了自噬，但对自噬起源、信号转导及 其对细胞生存影响的了解尚不全面。随着对自噬作用机制的深入研究，我们期望可以通 过调控细胞的自噬水平，控制癌症及神经退行性疾病的发展，延缓衰老，提高生存质量。 近年来由于分子生物学、基因组学等实验手段的日臻完善，尤其是酵母自噬突变 株的产生，使得对自噬分子基础的研究有了很大的进展。a t g 8 编码的蛋白是自噬降解 途径中的核心蛋白。通过化学合成或剔除彳几粥能抑制自体吞喇1 1 ，从而阻止r o s 积累和 细胞死亡。这揭示了自体吞噬在细胞死亡中有很重要的作用机制【啦】。 山东师范大学硕士学位论文 本实验采用r t - p c r 方法，扩增得到a t g 8 e 、a t g 8 f , a t g 8 h ，利用植物表达载体 p c a m b i a 3 3 0 1 ( 分别携带c a m v 3 5 s ，r d 2 9 a ，s e n l 启动子) 和农杆菌g v 3 1 0 1 将其在拟南 芥中过量表达。用除草剂筛选获得抗性苗，并进一步得到纯合系，然后对其进行了分子 生物学的验证并在胁迫条件下观察表型。 转基因植株的分子生物学检测如下： 1 转基因植株均能通过p c r 扩增出约5 0 0 b p 的b a r 基因的特异性条带，表明所构 建的载体已经整合到拟南芥基因组中。 2 在所筛选到的r d 2 9 a 8 f 的纯合株系中，随机挑选三株( 3 3 6 ，4 3 5 ，6 - 6 3 ) 与 野生型对照同时进行不同的胁迫处理( a b a 、低温、高盐等) ，2 4 h 后取材，提取植株 的r n a 并进行r t - p c r 。结果显示：从整体上看，处理后的转基因纯合系a t g 8 f 的表 达量与处理前相比有不同程度上升，而野生型处理前后a t g s f 含量差别不大。说明了 在这些胁迫条件下，r d 2 9 a 启动子启动彳粥基因的表达。 同时，将纯合系与野生型植株同时置于不同的胁迫条件下，如：干旱、低温、a b a 、 n a c l ，观察各种植株在不同处理条件下的表型。结果发现：( 1 ) 干旱、低温等胁迫条件 下，自体吞噬发挥抗细胞死亡的作用，纯合系比野生型生长良好；( 2 ) 当它们用高盐处 理时，自体吞噬发挥促细胞死亡的作用，纯合系不如野生型生长的好。这进一步说明了， 自体吞噬与细胞程序性死亡之间的关系密切。 关键词：a t g 8 ，细胞程序性死亡，自体吞噬，纯合系，转基因 中图分类号：q 7 8 2 山东师范大学硕士学位论文 s i e v ea n dm o l e c u l a ri d e n t i f yo f a r a b i d o p s i sa u t o p h a g yf a m i l ye i g h t t r a n s g p l a n t s lr a n s g e n l c1 1 a n t s ( s h a n d o n gn o r m a lu n i v e r s i t yl i f es c i e n c ed e p a r t m e n t ，j i n a n ，2 5 0 0 14 ) a b s t r a c t i ng e n e r a l ，p l a n tc a nn o tm a i n t a i nt h en o r m a lp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o nb e c a u s eo fl a c k i n g n u t r i t i o ni ne n v i r o n m e n t a ls t r e s s t h en o n b i o l o g i cs t r e s ss u c ha sl o wt e m p e r a t u r e ，d r o u g h t ， a b a ，h i g hs a l i n i t yi s t h ed i s a d v a n t a g e o u se n v i r o n m e n tw h i c hc a nw i d e l ya f f e c tc r o p p r o d u c t i o na n dp l a n tg r o w t h w h e nt h ep l a n t s a r eu n d e re n v i r o n m e n t a ls t r e s s ，t h e yt a i l r e g u l a t e t h e e x p r e s s i o no ft h e i r s t r e s s r e l a t e d g e n e sb yt h e i r s e l v e s a n db r i n gf o m l r e l a t e d t o l e r a n c e a tt h ep r e s e n t ，al o to fs t r e s s - r e l a t e dg e n e sh a db e e nc l o n e d ，a n dw e r eu s e d i na n t i - s t r e s sg e n ee n g i n e e r i n g a tt h es a m et i m e ，w ea g a i n e ds o m et r a n s g a n i cp l a n t sw h i c h c a ng r o wn o r m a l l yi ns o m ee n v i r o n m e n t a ls t r e s s a l le x h i b i te x t e n tp r o s p e c t s p r o g r a m e dc e l ld e a t h ( p c d ) i sak i n do fd e a t hw h i c hi so r d e r l ya n di n d e p e n d e n ta n di s c o n t r o l e db yg e n e t h ea i mi st ok e e pt h es t e a d yo ft h ei n s i d ee n v i r o n m e n t i ti n v o l v e sas e r i e s o fe f f e c t sw h i c hi st h ea c t i v a t i o n ，e x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o no fg e n e p r o g r a m e dc e l ld e a t h p l a y sa ni m p o r t a n tr o l e i np l a n t sd e v e l o p m e n t ，i m m u n er e g u l a t i o n ，a n dg e n e r a lc e l l u l a r h o m e o s t a s i so fe m b r y o n i c s oi ti sp h y s i o l o g i c a la n ds e l e c t i v e i ng e n e r a l ，c e l ld e a t hh a sb e e n d i v i d e di n t on e c r o s i sa n dp r o g r a m e dc e l ld e a t h ( p c d ) t h ef o r m e ri sap a s s i v ed e a t hb e c a u s e o fp a t h o l o g y c h e m i co rp h y s i c a li n j u r ef a c t o r sa n dl a c ko x y g e no ru n d e m o u r i s h m e n da l lc a n c a u s et h i st y p ec e l ld e a t h a n dt h el a t e ri sap r o g r a m m e da n da na c t i v ec e l ld e a t hp r o c e s s w h i c hi sd e f i n i t e db yd e p e n d i n go nt h ec a s p a s ep r o t e i nf a m i l y b u tal o to fr e s e a r c h e s i n d i c a t e dt h a tt h e r ew a sak i n do fc e l ld e a t hw h i c hw a sn o n d e p e n d e n tc a s p a s e w e p r e l i m i n a r yk n e ws u c hw a y s u c ha sa u t o p h a g y a u t o p h a g ye x i s t sw i d e l yi ne u k a r y o t i cc e l la n di t i sad e g r a d a b l ew a yw h i c hi sd e p e n d o nl y s o s o m e i tc a nc a u s el o n g l i v ep r o t e i n so fc e l l sd e g r a d i n g ，a n di tt a k e sp a r ti nt h en o r m a l g r o w t h ，d e v e l o p m e n ta n dm e t a b o l i s mh o m e o s t a s i s i nc e l l s u n d e rs o m es t r e s s ，s u c ha s d a m a g e ，n u t r i t i v ed e f i c i e n c y ，h u n g e ra n ds oo n , a u t o p h a g yi n d u c e sp l a n t su s ec e l l s c o m p o n e n tb yc y c l i n gt h a tc a l lh e l pc e l ll i v eb e t t e ra n d i te v e np l a y si m p o r t a n tr o l e si ns o m e c a n c e rc e l l s 3 山东师范大学硕士学位论文 a u t o p h a g yi s al i f ep h e n o m e n o nw h i c hi sw i d e l yi ne u k a r y o t i cc e l l ，i tr r n st h r o u g h g r o w t h ，d e v e l o p m e n ta n dp a t h o p h y s i o l o g yo fn o r m a lc e l l i t c a l lp r e v e n td e c l i n ea n ds o m e i l l n e s s ( s u c ha sn e u r o d eg e n e r a t i o n ，t u m o r ，m y o c a r d o s i sa n ds oo n ) a n di t a l s oc a l lp r o l o n g l i f e s ot h er e s e a r c ho fa u t o p h a g ya n da u t o p h a g y - d e a t hi sv e r yu s e f u lt on o to n l yt h et h e o r y s i g n i f i c a n c eb u ta l s oa p p l i c a t i o nm e a n i n g t h ef m do fa u t o p h a g yg e n eh e l p su sk n o wt h e m o l e c u l a rl e v e lo fa u t o p h a g y ，b u tt h eo r i g i na n ds i g n a lt r a n s d u c t i o no fa u t o p h a g ya n di t s a f f e c tt ot h ec e l ls u r v i v a lh a v en o tb e e nf u l l yk n o w n w i t ht h em e c h a n i s mo fa u t o p h a g y i n d e p t hs t u d y ，w ee x p e c t t h a tw ec a l lc o n t r o lo fc a n c e ra n dt h e d e v e l o p m e n t o f n e u r o d e g e n e r a t i v ed i s e a s e ，p r o l o n gl i f ea n di m p r o v et h eq u a l i t yo fl i f eb yr e g u l a t i n gt h el e v e l o fa u t o p h a g yi nc e l l s i nr e c e n ty e a r s ，b e c a u s eo fm o l e c u l a rb i o l o g y , g e n o m i c sa n do t h e re x p e r i m e n t a lm e a n s i m p r o v i n g ，e s p e c i a l l ym u t a n ts t r a i n s o fa u t o p h a g yi ny e a s t ，t h er e s e a r c ho fa u t o p h a g y m o l e c u l a rb a s i sw a sm a d eag r e a t p r o g r e s s at g 8i st h em o s ti m p o r t a n tc o m p o n e n to f a u t o p h a g i cl y s o s o m a ld e g r a d a t i o np a t h w a y i n h i b i t i o no fa u t o p h a g yb yc h e m i c a lc o m p o u n d s o rk n o c k i n gd o w nt h ee x p r e s s i o no fk e ya u t o p h a g yw h i c hi sc a l l e dat g 8c a ni n h i b i t a u t o p h a g y ，a n dp r e v e n tr o s a c c u m u l a t i o na n dc e l ld e a t h t h e s ef i n d i n g su n v e i lam o l e c u l a r m e c h a n i s mf o rt h er o l eo fa u t o p h a g yi nc e l ld e a t h t h i se x p e r i m e n tu s i n gr t - p c rm e t h o da m p l i f i e da t g 8 e ，a t g 8 f , a t g 8 h u s i n go fp l a n t e x p r e s s i o nv e c t o rp c a m b i a 3 3 0 1 ( w h i c hc a r r i e ds e p a r a t l yp r o m o t o r so fc a m v 3 5 s ，r c l 2 9 a ， s e n1 ) a n da g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sg v 3 101a n di n t r o d u c e di n t oa r a b i d o p s i st h a l i a n ab y i np l a n t at r a n s f o r m a t i o nm e t h o d b e c a u s et r a n s f o r m a n t sh a v et h ea b i l i t yo fr e s i s t i n gb a s t a ， w ec a na c q u i r et r a n s f o r m a n t sb ys p r a y i n gb a s t ae v e no b t a i nt h e i rh o m o z y g o t e s a n dt h e nw e v a l i d a t e dt h e i rm o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o na n do b s e r v e dt h e i rp h e n o t y p ew h e nt h e yw e r eu n d e r e n v i r o n m e n t a ls t r e s s t h em o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o n so ft h e s eh o m o z y g o t e sa r ea sb e l o w ： 1p c rr e s u l ts h o w e dt h a ta l lh o m o z y g o t e sp l a n t sh a ds t r o n gp o s i t i v es i g n a l s ，w h i c hi st h e g e n eo fb a ra n dn e a r l y5 0 0 b ps p e c i f i cb a n d s ，a n dn os i g n a lw a ss h o w n i nw i l d t y p ep l a n t s 2t h er n ao fh o m o z y g o t e sp l a n t sa n dw i l dt y p ep l a n t sw e r ee x t r a c t e da n dr e v e r s e t r a n s c r i p t i o n ，t h e nt h ee d n a w e r em a d et or t - p c r t h er e s u l t ss h o w e dt h a tc o m p a r i n gw i t h t h ew i l dt y p ep l a n t st h ea t gr n ar i s e di nh o m o z y g o t e sp l a n t sw h e nt h e yw e r ed e a l e dw i t h 4 山东师范大学硕士学位论文 s t r e s sc o n d i t i o n ( e g n a c l ，l o wt e m p e r a t u r e ，a b a ) t h i sf u r t h e re x p l a i n e da t g g e n eh a sb e e n i n t e g r a t e di na r a b i d o p s b sg e n o m ea n dt r a n s c r i p e dn o r m m l y a n dt h i sc a u s e dm u l t i p l i c a t i o no f 彳粥r n a a tt h es a m et i m e ，t h eh o m o z y g o t e sp l a n t sa n dt h ew i l dt y p ep l a n t sw e r ea l lu n d e r e n v i r o n m e n t a ls t r e s s ，s u c ha s ：d r o u g h t ，l o wt e m p e r a t u r e ，a b aa n dn a c l ，a n do b s e r v e dt h e p h e n o t y p eo fa l lp l a n t sw h e nt h e yw e r eu n d e rd i f f e r e n te n v i r o n m e n t a l s t r e s s w h e n h o m o z y g o t e s a n dt h ew i l d t y p ep l a n t sg r o w e d u n d e r d r o u g h t ，l o wt e m p e r a t u r e c o n d i t i o n ，a u t o p h a g yp l a y e dt h er o l eo fa n t i c e l ld e a t h s oh o m o z y g o t e sg r o w e db e t t e rt h a nt h e w i l dt y p ep l a n t s w h e nt h e yg r o w e du n d e rt h ec o n d i t i o no fh i g h ts a l t ，a u t o p h a g yp l a y e dt h e r o l eo fp r o - c e l ld e a t h s oh o m o z y g o t e sg r o w e dw o r s et h a nt h ew i l dt y p ep l a n t s a l lt h e s e i l l u s t r a t e dt h a ta u t o p h a g ya n d p r o g r a m e dc e l ld e a t hh a dc l o s er e l a t i o n s h i p k e y w o r d ：a t g 8 p c d a u t o p h a g yh o m o z y g o t et r a n s g e n i c c a t e g o r yn o ：q 7 8 5 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其他需要特别声 明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：江茹炙导师签字群窆 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权堂 拉可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：导师签字 彬孑 签字日期：2 0 0 9 年石月徊 日 签字日期：2 0 0 9 年石月徊 日 山东师范大学硕士学位论文 第一部分文献综述 在特定生长环境条件下，植物不可避免的要受到各种胁迫的影响，如紫外线照射 【3 1 、干旱【4 】、臭氧【5 1 、不适的温度【6 、病毒侵染和高盐等，在这些胁迫条件下，常会产 生r o s 并发生次生氧化胁迫和f 4 。次生氧化胁迫改变细胞内的氧化还原平衡，并且会 诱发一系列应答氧化胁迫的应急反应。r o s 是氧的一种高激活存在形式，含有未配对 电子i s ，是正常健康细胞线粒体有氧呼吸链中的次级产物。它具有潜在的致死效应，能 氧化如：脂质、蛋白质、d n a 细胞组分，还能损坏细胞结构、削弱细胞功能【9 】。而细 胞通过自身的氧化还原系统、s o d 、c a t a l a s e 等抗氧化物将r o s 水平控制在可以忍受的 范围内【1 0 1 。如果细胞内产生的r o s 超过上述超氧化物的抵抗能力时就产生氧化胁迫， 它是植物在应答各种胁迫因子时普遍发生的现剩1 1 】。另外，营养物质的缺乏和生存环境 的恶化，也会导致细胞的死亡【1 2 ，1 3 1 。为对抗逆境胁迫，迅速清除受损的蛋白，在长期的 进化过程中植物细胞形成了一套及时的机制。 一细胞程序性死亡( p c d ) 早在1 5 0 年前人们就了解到细胞死亡是多细胞生物中的一种正常的生理现象【1 4 】。现 在广泛接受的关于细胞死亡的类型主要分为两类，即“细胞坏死”( n e c r o s i s ) 和“细胞程序性 死亡”( p r o g r a m m e dc e l ld e a t h ，p c d ) 15 1 。 细胞坏死( n e c r o s i s ) 是一个是因病理而产生的被动死亡，如物理性或化学性的损害因 子及缺氧与营养不良等条件下所导致的细胞死亡。坏死细胞的膜通透性增高，致使细胞 肿胀，细胞器变形或肿大，早期核无明显的形态学变化，最后细胞破裂。另外坏死的细 胞裂解要释放出内含物，并常引起炎症反应；在愈合过程中常伴随组织器官的纤维化， 形成瘢痕。坏死代表了活体内局部组织、细胞死亡后所发生的最终变化的总和，并不管 其死亡前过程如何，是一形态学诊断。当今很多文献所提及的“坏死性细胞死亡”并非真 正的坏死【1 4 】，实际上是另一种不同于凋亡的细胞死亡方式。在观察胚胎发育过程中，发 现清除多余细胞存在类似坏死样方式对趾( 指) 间细胞清除的细胞死亡【1 8 】。有人认为 “坏死样死亡可促使大规模清除过渡形式的组织结构，维持正常胚胎的发育【1 7 1 9 1 。 已有报道在同一病灶中往往存在着两种不同形式的细胞死亡( 固缩或肿胀) 【2 m 2 。为 此，1 9 9 5 年m a j n o 和j o r i s 【2 2 】将这种不同于凋亡的细胞死亡称为胀亡( o n c o s i s ) 。表现为胞质 肿胀和核溶解的细胞损伤过程。越来越多的学者认为：凋亡和胀亡分别代表了两种不同 的细胞死亡方式，坏死可继发于凋亡和胀亡，但在形态上，很难区别这两种方式。1 9 9 7 6 山东师范大学硕士学位论文 年美国毒理病理学家学会细胞死亡命名委员会建谢2 2 ，2 3 1 ，将坏死作为一种诊断，包括凋 亡和胀亡【2 2 2 3 1 。若坏死细胞表现为凋亡特征时，诊断为“凋亡样坏死”( a p o p t o t i cn e c r o s i s ) ； 同样，若出现了胀亡特点，则命名为肿胀样坏死( o n c o t i cn e c r o s i s ) ，当坏死细胞特征无法 确定或可能因未知的过程产生，则称为坏死( n e c r o s i s ) ，这常见于中枢神经系统的神经元 死亡后所表现出的典型嗜酸性细胞萎缩，因此，坏死至少可由胀亡和凋亡这两种不同方 式的细胞死亡继发而来【2 叫( 图1 1 1 ) 。 a _ 瞰o $ l 毒( i k l = ) 埘p 耗尽，被动约纲雏罗巴亡 毒 囊予聚箍性羲失腠避璇性增加 王， 童| 暖霸援胂鬈 l 睫意的i l i a 整解鳕腿溶解 。件管牌胀的缀齄死1 1 = 上 臼藩鲴艉积秉伟有炙箍反应 j 申l 【细鹰l 死 毒 翻亡挈辫骱段获得 什 主砝高f 远麓 工 1 l 蟹髓惫的d 瓿裂麓 。俸钉瞄耀的壤鹰死亡。 j 犬雹耱r 和无瞧力约释肆作用 弼亡细舱和掏亡小俺职囊 骥亡鳃蠢死亡 矗e c r 0 9 1 暑 ( 环死) 图1 1 1 细胞死亡模式【2 0 】 f i g 1 一l 1t h em o d l eo f c e l ld e a t h 细胞程序性死亡( p r o g r a m m e d c e l ld e a t h ，p c d ) 是一种受基因控制的程序化的主动性 细胞死亡。它像秋天树叶凋谢一样，是由基因控制的细胞自主有序的死亡，它不仅在生 理情况下发生，而且能被一些细胞因子和化学药物诱导产生【2 4 】。这种主动性的细胞死亡 存在于生理、病理及发育过程中，尤其对于维持机体内环境的稳定，控制机体细胞的数 量起着非常重要的作用【2 5 1 。细胞程序性死亡( p c d ) 又分为两型：i 型p c d 又称细胞凋 亡( a p o p t o s i s ) ；i i 型p c d 又称自体吞噬型细胞死亡( 制t o p h a g y ) 【2 6 1 。 细胞凋亡或程序性细胞死亡可被多种内源性( 细胞所属整体的其他细胞的信号) 或环境源性( 化学、物理及生物学) 因素所诱剔2 4 】。大部分细胞凋亡与程序性细胞死亡 的诱导物，其浓度过高时亦可导致坏死，迅速分化中的细胞特别容易被诱导凋亡。细胞 凋亡或程序化死亡的诱导不是简单的线性改变过程，而是一种受高度调控的反应。细胞 7 山东师范大学硕士学位论文 通过跨膜或表面受体被刺激，而诱发启动执行正常功能或程序死亡的通道。现在的研究 表明，从线虫到哺乳动物( 包括人) 均发现有细胞死亡基因。线虫的主要死亡基因为c e d - 3 和c e d - 4 ，c e d - 3 编码的c e d 3 蛋白酶序列与哺乳动物的白细胞介素( i m e r l e u k i n 1 p c o n v e r t i n ge n z y m e i c e ) 同源。 c a s p a s e 是细胞凋亡中起关键作用的一类半胱氨酸蛋白酶，研究细胞凋亡引起的p c d 最好的方法是通过依赖于c 唧a l s e s 的蛋白家族定义的【1 1 。c 唧a s e s 的激活导致细胞不同的 形态学特征，如：核浓缩、膜泡形成、细胞收缩【2 7 捌。但凋亡并不是细胞程序性死亡的 唯一形式。近年来大量研究结果表明，还存在c 邪p a s e s 非依赖性的细胞程序性死亡。 各种类型的p c d 都是细胞主动参与的死亡过程，由激活的细胞信号传导途径来执 行，终止信号传导途径可以抑制细胞死亡。这正是p c d 与细胞坏死的本质区别所在。大 量实验已表明，c a s p 髂e 抑制剂并不能有效抑制死亡刺激所诱导的细胞死亡。c a u w e l s 等【2 9 】 甚至发现c a s p a s e 抑制剂加重了t n f 诱导的细胞死亡。所以，p c d q 了还有c a s p a s e s 依赖性 的途径存在。c a s p a s e 非依赖性的细胞死亡即为不需要c a s p a s e 的细胞死亡。这包括两方面 的含义：一是c a s p a u s e 抑制剂不能抑$ 1 j p c d ；二是细胞死亡过程中c a s p a s e 未被激活。 c a s p a s e 非依赖性的p c d 包括p a r a p t o s i s 和a u t o p h a g y 。前者在形态学上表现为胞质空泡形 成和线粒体、内质网的肿胀，但无凋亡形态学表现，c a s p a s e 9 虽在此过程中被激活，但 是却没有细胞色素c 的释放及凋亡小体的形成【3 0 1 ，刎嗽族成员在p a r a p t o s i s 的信号级 联反应中发挥着重要作用【3 l 】。同时研究者还发现4 l g - 2 作用蛋白a p 1 a l i x 可以特异性 抑$ 1 j p a r a p t o s i s 的效应，但是对凋亡却无抑制作用；后者是细胞对内外界环境压力变化的 一种反应，在某些情况下自体吞噬还可导致细胞死亡，它引起细胞中长寿命蛋白的降解， 并在饥饿状态下循环利用细胞组分最终使细胞得以生存。在自体吞噬过程中，细胞展现 了广泛的内源膜的重建，并在大的两层膜的细胞器中吞没一部分细胞质。这些自体吞噬 体与溶酶体靠近、融合，融合组分基本上被降解。 二自体吞噬 2 1 自体吞噬的简介 a u t o p h a g y - - 诟- j 来源于希腊语，a u t o 指自身、p h a g y 是吃的意思，所以a u t o p h a g y 意为 自体吞噬【3 2 】，简称自噬。从酵母到人类中高度保守的a t g 基因家族调控自体吞噬。酵母 中的遗传分析以及最近高等真核生物研究表明在营养匮乏时期，自体吞噬在细胞如何生 存方面起重要的调节作用。此外，自体吞噬在肿瘤抑制、病原体控制、抗原表达、有机 8 山东师范大学硕士学位论文 体寿命的调控方面也发挥重要作用。 早在2 0 世纪7 0 年代，诺贝尔生理医学奖得主c h r i s t i a nd ed u v e 就预告了细胞自噬对动 物生理的重要性。从最初自噬的发现到现在虽然已经有将近5 0 年的历史，但自噬相关领 域的很多研究才刚刚开始，有关自噬的很多问题都没有得到很好的解释和解决【3 3 1 ，如： 自噬体膜的来源、自噬的具体调节机制【蚓等等。自体吞噬的研究最初在动物细胞中发现， 后来利用酵母模式系统获得极大的成功，初步探明了自噬的分子机制。 自体吞噬在生物进化中很保守，首先在酵母中分离到自噬相关的基因，随后在线虫、 果蝇及哺乳动物细胞中也发现了有相似功能的同源基因。2 0 0 3 年以酵母的自噬相关基因 为标准进行了统一命名，以“a u t o p h a g y 中的字母a t g 命名，后面加数字以区分不同的基 斟3 5 】。其他物种的同源基因依此命名，线虫的同源基因命名为c e a t g ，哺乳动物中的同 源基因就被命名为m a t g 。自体吞噬能清除不正常构型的胞质蛋白质，并消化受损和多 余的细胞器。当自体吞噬被干扰后，将导致那些异常蛋白质和细胞器的积累，可能使正 常的细胞生长机制产生紊乱，发生许多急慢性疾病以及病原微生物的入侵等相关。 自体吞噬过程是一个吞噬自身细胞质蛋白并使其包被进入囊泡的过程。主要分为三 种类型：巨型自体吞噬( m a c r o a u t o p h a g y ) ，微型自体吞噬( m i c r o a u t o p h a g y ) 和分子伴侣介 导的自体吞噬( c h a p e r o nm e d i a t e da u t o p h a g y ) ”】。双层膜结构的自体吞噬体穿越组织层吞 没细胞质组分，然后到达液泡或溶酶体进行降解【3 6 1 。酵母的遗传筛选已经鉴定了许多 a t g 基因，这些基因是当前自体吞噬活性所必需的【了7 1 。尽管过去的几十年在大量的植物 形态学中观察到了类似自体吞噬的活性，但是只是在最近才开始研究自体吞噬的重要过 程【3 8 , 3 9 。植物中存在大多数酵锄粥的同源基因，有两种途径可以获得这些基因的功能： 酵母a t g 突变体的互补实验；r n a i 或基因剔刚加】。拟南张粥基因a t a t g 4 a b 、 a t a t g 6 b e c l i n l 和a t a t g 8 是与各自的酵母缺失株系互补的【4 1 4 2 】，在形成自体吞噬体或执 行自体吞噬活性时，通过回复这些基因的功能可以使a t 9 7 突变体( 剔除么粥7 基因) 具有 衰老缺陷并且对n 、c 缺乏超敏感，这与酵母或其它高等真核生物中由于营养缺乏而导 致的自体吞噬相一致【4 3 1 。自体吞噬可能也在正常的植物发育过程中发挥作用，因为 a 缸辔彳口组细彬6 双突变体【4 1 】甚至在营养充足的情况下也加速衰老。拟南芥口吻够，a t 9 5 ， a t 9 9 ，a t g l 3 突变体具有可鉴别的发育表型：加速衰老、加速抽薹以及种子减少3 8 , 3 9 。 自噬是广泛存在于真核细胞中的生命现象，贯穿于正常细胞生长发育和生理病理过 程，对防止如神经退行性病变、肿瘤、心肌病、病原微生物侵入感染等疾病以及对防止 老化、延长寿命有积极作用。因此对细胞自噬作用和自噬型细胞死亡的研究不仅具有理 9 末师范大学硕学位论文 论意义，而且也具有非常重要的应用价值。自噬基因的发现使我们从分子水平认识了自 噬，但对自噬起源、信号转导及其对细胞生存影响的了解尚不全面。随着对自噬作用机 制的深入研究，我们期望可以通过调控细胞的自噬水平，控制癌症及神经退行性疾病的 发展，延缓衰老，提高生存质量。 2 2自体吞噬体的形成 自噬起始于具有多层膜结构的自噬泡的形成。自噬的发生过程以巨型自噬为例可人 为的将它分为4 个阶段i 。( 如图1 - 2 1 ) 分隔膜的形成：在饥饿、某些激素等因素刺激 下，有双层膜的杯状分隔膜开始在被降解物的周围形成。自噬体的形成：随着分隔膜 逐渐延伸，将要被降解的胞浆成分完全包绕隔离开形成自噬体。自噬体的运输、融合： 自噬体形成后将其包裹物运输至溶酶体内与溶酶体融合形成自噬溶酶体，这一过程并非 简单的扩散，而是通过细胞骨架微管网络系统的传输实现的】。自噬体的裂解：自噬 体融合后最终被溶酶体中的水解酶溶解，它首先经过囊泡酸化，达到所需p h 值后经多种 蛋白酶作用使囊内容物降解，降解产物在细胞内再循环利用。 ：j 爹一誊，一泛? ? 一毋 2 3 自体吞噬的分子机制 b e r t z y l o x y c a r b o n y l - v a l y l a l a n y l - a s p a r t i c - a c i d ( o m e t h y l ) - f l u o r o m e t h yl k e t o n e ( z v a d ) 】或特 异性的c a 印船e8 r n a l 可阻止自体吞噬和细胞死亡。自体吞噬的化学抑制剂或其关键 基因的蛋白产物的剔除将阻止z 、帅诱导的死亡。这将为信号通路导致自体吞噬性细胞 死亡提供精确的论据。r o s 可以引起细胞损坏或死亡 4 7 a 8 。为了检测r o s 在自体吞噬细 r o s f l 懈, , 累情况。结果发现，z 、如处理引起r o s 的急剧增加。然而若用一定量的r o s 抑制剂( p g ：没食子酸：o g ；n d g a ：去甲二氢愈创木酸；t b h q ：叔丁二氢奎宁： 山东师范大学硕士学位论文 b h a ：丁化羟基苯二甲醛) 处理细胞则能抑制z m 诱导的细胞死亡【4 9 1 。z v a d 处理选择 性降解细胞内主要的抗氧化组分c a t a l a s e 。c a t a l a s e 的耗尽使r o s 的新陈代谢严重的不平 衡，导致r o s 的急剧积累、脂质的超氧化、最终导致细胞凋亡。 以前的研究表明，r o s 积累可引起细胞膜损坏和渗透性的改变【5 0 】。z v a d 处理l 9 2 9 ( 一个研究t n f 0 【诱导的细胞死亡的模型) 并检测其内的t e m 发现细胞首先液泡化形成 自体吞噬体，然后大量的质膜损伤坏死。在z v a d 分别处理o 、6 、1 2 、1 8 t j , 时之后，比 较了r o s 积累、脂膜的过氧化作用、膜渗透性的改变和细胞缺失【4 9 】( 图1 2 2 ) 。对照组 细胞在用z v a d 处理1 8 h 过程中同时用1 0 0i i m r o s 抑制剂b h a 处理。用z v a d 处理6 h 就可 以检测到r o s 积累，1 2 h 和1 8 胀o