（分析化学专业论文）基于催化金属沉积的信号放大生物分析方法研究.pdf

硕l j 学位论文 摘要 免疫分析信号的放大技术一直以来是免疫分析领域研究的一个重要方面，它 对于提高分析的灵敏度，实现一些重要疾病标志物的检测有着至关重要的意义。 酶和纳米颗粒标记的生物分子由于其自身的特点和优势，在电化学与表面增强拉 曼散射免疫分析方面具有广泛的应用前景，对它们进行研究无疑可以进一步推动 免疫分析的发展。此外，开发一些简便、价廉、精确且易于临床推广的有关d n a 的检测方法是一件很有价值的工作。为此，本文主要在免疫分析信号放大技术方 面以及电化学d n a 检测技术方面做了一些工作： 1 基于酶催化金属银沉积放大的免疫分析 在第二章中，我们将酶催化金属银沉积的放大技术与电化学、拉曼检测方法 相结合，设计出的分析方法具有简便、快速、灵敏等优点，可见酶催化金属沉积 法在免疫分析信号放大领域具有很大的潜力。 ( 1 ) 提出了一种新型的在均匀分散介质中耦合了琼脂糖微球特有的性质和 酶催化金属沉积的放大作用的非竞争性电化学定量检测人i g g 的方法。采用人 i g g 作为模版蛋白质来对此方法性能进行研究。首先，亲和素化的琼脂糖微球与 生物素化的羊抗人i g g 抗体反应形成免疫微球。在静置之后，琼脂糖免疫微球 很容易就被分离出来，在本实验中，琼脂糖免疫微球可作为探针分子的固定相， 故可同时加入人i g g 和a l p a b 进行反应以简化电化学免疫检测流程，待免疫夹 心复合物形成后，加入酶催化银沉积液避光反应。在a l p 酶催化作用下，a a p 水解生成具有还原性质的抗坏血酸，生成的抗坏血酸将银离子还原，在蛋白质和 琼脂糖表面上生成银纳米颗粒，接着用浓硝酸将银纳米颗粒完全溶解，最后采用 a s v 在c p e 上对银离子进行定量检测。该方法的线性范围为1 1 0 0 0n g m l ， 检测下限为o 5n g m l 。在同样的条件下8 次检测10n g m l 人i g g ，相对标准偏 差为9 6 5 。另外，我们通过比较采用琼脂糖微球和采用磁性粒子的免疫检测方 法的性能，发现琼脂糖微球由于具有非磁性、很好的生物相容性和很小的非特异 性吸附等优点，作为反应固定相可获得灵敏度更高和选择性更强的免疫传感器。 ( 2 ) 我们同样结合了酶催化金属银沉积的放大技术提出了一种新的基于酶 催化金属沉积可增强拉曼信号的银纳米颗粒的定量检测蛋白质的表面增强拉曼 散射( s e r s ) 免疫检测方法。首先，通过一个典型的免疫夹心反应将碱性磷酸 脂酶固定在微孔板上，接着加入磷酸抗坏血酸脂与碱性磷酸脂酶反应得到具有还 原性的抗坏血酸，然后再加入银离子还原得到银纳米颗粒，最后加入拉曼染料与 银纳米颗粒作用即可得到s e r s 信号。以人i g g 作为模版分子，在己优化的检测 i i 基于催化金属沉积的信廿放人生物分析方法研究 条件下，该方法可获得一个宽的线性范围( 1 10 0n g m l ) 和一个低的检测下限 ( 0 0 2n g m l ) 。另一方面，此方法是利用产生拉曼增强基底银纳米颗粒来增强 s e r s 信号，而不是通过传统的增加拉曼染料的量来增强s e r s 信号，这是一种 全新的基于s e r s 的定量检测方法。 2 基于纳米金催化金属铜沉积放大的电化学免疫分析及传感器的设计 在第三章中，我们利用纳米金的晶核催化作用催化金属铜沉积，使信号得以 放大，设计出了一种新型的电化学免疫分析方法，并在此分析方法的基础上设计 了一种简便的电化学免疫传感器。 ( 1 ) 提出了一种基于纳米金催化金属铜沉积的电化学免疫分析方法。在这 种方法中，抗体首先通过物理方法固定到酶标孔内壁，夹心免疫反应后，纳米金 标记的抗体被捕获到生物界面。再加入铜沉积增强试剂，由于纳米金的晶核催化 效应，在还原剂存在的条件下，铜离子在纳米金的表面得以还原，沉积形成厚厚 的铜壳。然后通过化学法将铜溶解后用溶出伏安法检测溶出的铜离子。检测下限 为o 5n g m l 。将本方法应用于实际血样的分析，取得了满意的结果。据我们所 知，这是首例将铜增强引入到免疫分析中来的报道。 ( 2 ) 在前面工作的基础上我们提出了一种基于纳米金催化金属铜沉积增强 的电化学免疫传感器的制备方法。在这种方法中，抗体首先通过化学方法修饰到 玻碳电极表面，夹心免疫反应后，纳米金标记的抗体被捕获到电极表面。再加入 铜沉积增强试剂，由于纳米金的晶核催化效应，在还原剂存在的条件下，铜离子 在纳米金的表面得以还原，沉积形成厚厚的铜壳。然后将传感器转移到电解池中 施加线性扫描，就可以通过检测铜的阳极峰电流的大小来实现抗原分子的定量分 析。检测下限为0 0 7 5n g m l 。与传统的金沉积增强和银沉积增强比较，本部分 提出的铜沉积增强传感器具有一定的优势。如避免了溶出伏安分析的繁琐步骤， 采用的铜沉积增强试剂也比较容易配制和保存，同时还保持了较高的灵敏度。 3 基于酶催化放大及分子信标的新型电化学d n a 传感器的设计 在第四章中，我们将辣根过氧化物酶的催化放大反应与分子信标相结合，设 计了一种新型电化学d n a 传感器。我们先将5 端标记有巯基，3 端标记有生物 素的分子信标通过与巯基丙酸混合自组装的形式固定到金电极表面。当与完全匹 配的目标链杂交后，分子信标3 端的生物素分子暴露出来再与链酶亲和素标记的 辣根过氧化物酶结合，最后通过检测酶催化电流的大小就可以实现d n a 的定量 分析。我们设计的这个实验对单碱基错配也具备较强的识别能力。 关键词：免疫传感器；免疫分析；催化金属沉积；酶；纳米粒子；分子信标 i i i a b s t r a c t t h ee n h a n c e m e n to fi m m u n o a s s a ys i g n a li s a l w a y si m p o r t a n ti ni m m u n o a s s a v s t u d y , w h i c hi sc r u c i a lf o ri m p r o v i n gt h ea s s a ys e n s i t i v i t ya n dr e a l i z i n gt h ed e t e c t i o n o fs o m ev i t a ld i s e a s e s e n z y m ea n d n a n o p a r t i c l e s ，b e c a u s eo ft h e i rs p e c i a lp r o p e r t i e s ， h a v e p r o m i s i n gp o t e n t i a lc l i n i c a la p p l i c a t i o n m o r e o v e r ，e x p l o r i n gs o m e s i m p l e c o s t 。e f f e c t i v e ，a c c u r a t ea n de a s yt ob ec l i n i c a l l yp o p u l a r i z e dd e t e c t i o nm e t h o d sf o r d n ai s s t i l lo fc o n s i d e r a b l e i n t e r e s t t h e r e f o r e ，t h i sr e s e a r c hf o c u s e so nt h e e n h a n c e m e n to fi m m u n o a s s a ys i g n a la n dt h ed e v e l o p m e n to fe l e c t r o c h e m i c a ld n a q u a n t i f i c a t i o n t h ed e t a i lc o n t e n t sa r ea sf o l l o w s ： 1 s i g n a le n h a n c i n gi m m u n o a s s a yb a s e do nb i o m e t a l l i z a t i o n ( e n z y m a t i cs i l v e r d e p o s i t i o n ) i nc h a p t e r2 ，w eh a v ed e v e l o p e dt w os i m p l e ，r a p i da n ds e n s i t i v ei m m u n o a s s a v p r o t o c o l s ，w h i c hc o u p l e dt h es p e c i a la m p l i f i e dp r o p e r t i e so fb i o m e t a l l i z a t i o nw i t h t h ee l e c t r o c h e m i c a lo rs e r s b a s e dd e t e c t i o nf o rq u a n t i f i c a t i o no fh u m a ni g g t h e b i o m e t a l l i z a t i o nh o l d sg r e a tp r o m i s ef o rt h ee n h a n c e m e n to fi m m u n o a s s a vs i g n a li n b i o s e n s i n g ( 1 ) an o v e l ，s e n s i t i v ee l e c t r o c h e m i c a l i m m u n o a s s a yi n ah o m o g e n e o u s l v d i s p e r s e dm e d i u mi sd e s c r i b e dh e r e i nb a s e do nt h eu n i q u ef e a t u r e so fa g a r o s eb e a d s a n dt h es p e c i a l a m p l i f i e dp r o p e r t i e so fb i o m e t a l l i z a t i o n t h ei m m u n o c h e m i c a l r e c o g n i t i o ne v e n tb e t w e e nh u m a ni m m u n o g l o b u l i ng ( 1 9 g ) a n dg o a ta n t i h u m a ni g g a n t i b o d yi sc h o s e na st h em o d e ls y s t e mt od e m o n s t r a t et h ep r o p o s e di m m u n o a s s a v a p p r o a c h a v i d i n a g a r o s eb e a d sr a p i d l yr e a c tw i t ht h eb i o t i n y l a t e dg o a ta n t i h u m a n i g ga n t i b o d yt of o r ma g a r o s eb e a d s - g o a ta n t i h u m a n i g gc o n ju g a t e ( a g a r o s e b e a d - a b ) a g a r o s eb e a d a b ，a l k a l i n ep h o s p h a t a s ec o n j u g a t e dg o a ta n t i h u m a ni g g a n t i b o d y ( a l p a b ) a n dt h eh u m a ni g ga n a l y t ea r em i x e dt of o r ms a n d w i c h t y p e i m m u n o c o m p l e xf o l l o w e db yt h ea d d i t i o no ft h ee n z y m a t i cs i l v e rd e p o s i t i o ns o l u t i o n t od e p o s i ts i l v e ro n t ot h es u r f a c eo f p r o t e i n sa n da g a r o s eb e a d s t h es i l v e rd e p o s i t e d a r ed i s s o l v e da n dq u a n t i f i e db ya n o d i cs t r i p p i n gv o l t a m m e t r y t h el o g a r i t h mo f t h e a n o d i c s t r i p p i n gp e a kc u r r e n td e p e n d e d l i n e a r l y o nt h e l o g a r i t h m o ft h e c o n c e n t r a t i o no fh u m a ni g gi nt h er a n g ef r o m1t o10 0 0 n g m l ad e t e c t i o nl i m i ta s l o wa s0 5n g m lh u m a ni g gw a sa t t a i n e db y3 a r u l e t h er s d o ft h ea p p r o a c hi s 9 6 5 f o re i g h tt i m e sd e t e r m i n a t i o no f10n g m lh u m a ni g g u n d e rs a m ec o n d i t i o n s i v o p t i c a lm i c r o s c o p ea n dt e mg r a p h sw e r ea l s ou t i l i z e dt oc h a r a c t e r i z ea g a r o s eb e a d s a n ds i l v e rn a n o p a r t i c l e sf o r m e d ( 2 ) w eh a v er e p o r t e do nan o v e le n z y m ei m m u n o a s s a ym e t h o df o rt h ed e t e c t i o n o fp r o t e i nu s i n gb i o c a t a l y t i cs i l v e rn a n o p a r t i c l e sa sa ne n h a n c e ds u b s t r a t eb a s e do n s u r f a c e e n h a n c e dr a m a n s c a t t e r i n g ( s e r s ) f i r s t ，a s c o r b i ea c i dw a sc o n v e r t e df r o m a s c o r b i ca c i d 2 - p h o s p h a t eb ya l k a l i n ep h o s p h a t a s ei m m o b i l i z e do np o l y s t v r e n e m i c r o w e l l sa f t e rat y p i c a ls a n d w i c hi m m u n o r e a c t i o n ，t h e na g ( i ) i o n sw e r er e d u c e d t os i l v e rn a n o p a r t i c l e sb yt h eo b t a i n e da s c o r b i ca c i d ，w h i c hw o u l dr e s u i ti nas e r s s i g n a lw h e nr a m a nd y e sw e r ea b s o r b e d u s i n gh u m a ni g ga sam o d e lp r o t e i n a w i d el i n e a rd y n a m i cr a n g e ( 1t o10 0n g m l ) w a sr e a c h e dw i t hal o wd e t e c t i o nl i m i t ( 0 0 2n g m l ) u n d e rt h eo p t i m i z e da s s a yc o n d i t i o n s m o r e o v e r ，t h ep r o d u c t i o no fa n e n h a n c e ds u b s t r a t ew a sc h o s e na st h es i g n a l i n ge l e m e n ti n t h i s m e t h o d ，w h i c h d e m o n s t r a t e san e w w a yf o rse r s b a s e dq u a n t i t a t i v ed e t e c t i o n 2 e l e c t r o c h e m i c a lp r o t o c o la n di m m u n o s e n s o rb a s e do nt h ed r e c i p i t a t i o no f c o p p e ro ng o l dn a n o p a r t i c l et a g s i nc h a p t e r3 ，an o v e le l e c t r o c h e m i c a lp r o t o c o lf o rq u a n t i f i c a t i o no fh u m a ni g g 1 8d e m o n s t r a t e dh e r e i nb a s e do nt h ep r e c i p i t a t i o no f c o p p e ro ng o l dn a n o p a r t i c l et a g s ， a n das i m p l ee l e c t r o c h e m i c a l i m m u n o s e n s o rf o rq u a n t i f i c a t i o no fh u m a ni g gi s d e v e l o p e db a s e do np r e c i p i t a t i o no fc o p p e ro ng o l dn a n o p a r t i c l et a g sl a t e r ( 1 ) w ed e m o n s t r a t eh e r e i nan o v e le l e c t r o c h e m i c a lp r o t o c o lf o rq u a n t i f i c a r l o n o fh u m a ni g gb a s e do nt h ep r e c i p i t a t i o no f c o p p e ro ng o l dn a n o p a r t i c l et a g sa n da s u b s e q u e n t e l e c t r o c h e m i c a l s t r i p p i n gd e t e c t i o no ft h ed i s s o l v e d c o p p e r t h e l m m u n o a s s a yw a sc o n d u c t e db yf o l l o w i n gt h et y p i c a lp r o c e d u r ef o rs a n d w i c h t y p e i m m u n o r e a c t i o n g o a ta n t i - h u m a ni g gw a si m m o b i l i z e do nt h ew e l l so fm i c r o t i t e r p l a t e s t h eh u m a ni g ga n a l y t ew a sf i r s tc a p t u r e db yt h ep r i m a r ya n t i b o d ya n dt h e n s a n d w i c h e db ys e c o n d a r ya n t i b o d yl a b e l e dw i t hg o l d n a n o p a r t i c l e s t h ec o p p l e r e n h a n c e rs o l u t i o nw a st h e na d d e dt od e p o s i t ec o p p e ro nt h eg o l dn a n o p a r t i c l et a g s a f t e rd i s s o l v e dw i t hh n 0 3 ，t h er e l e a s e dc o p p e ri o n sw e r et h e nq u a n t i f i e db ya s v t h ed e t e c t i o nl i m i ti s o 5 n g m lb y3 0r u l e i no r d e rt oi n v e s t i g a t et h ef e a s i b i l i t vo f t h en e w l yd e v e l o p e dt e c h n i q u et ob ea p p l i e df o rc l i n i c a l a n a l y s i s s e v e r a is t a n d a r d h u m a ni g gs e r u ms p e c i m e n sw e r ea l s oe x a m i n e db yt h em e t h o d ( 2 ) w e d e v e l o p e d h e r e i n an o v e le l e c t r o c h e m i c a l i m m u n o s e n s o rf b r q u a n t i f i c a t i o no fh u m a ni g gb a s e do np r e c i p i t a t i o no fc o p p e ro ng o l dn a n o p a r t i c l e t a g sw i t hs u b s e q u e n te l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o no f c o p p e r f i r s t ，g o a ta n t i h u m a ni g g w a si m m o b i l i z e do nag l a s sc a r b o ne l e c t r o d e t h e nt h eh u m a ni g ga n a l y t ew a s v 硕 ：学位论文 c a p t u r e db yt h ep r i m a r ya n t i b o d ya n ds a n d w i c h e db ys e c o n d a r ya n t i b o d yl a b e l e d w i t hg o l dn a n o p a r t i c l e s t h ec o p p e re n h a n c e rs o l u t i o nw a st h e na d d e dt od e p o s i t e c o p p e ro nt h eg o l dn a n o p a r t i c l et a g s t h eq u a n t i f i c a t i o no fc o p p e rw a sp e r f o r m e di n d i l u t e dh n 0 3b yu s i n gc y c l i cv o l t a m m e t r y t h ee l i m i n a t i o no ft h ea c i dd i s s o l u t i o n a n dm e t a la c c u m u l a t i o n s t e p sg r e a t l ys i m p l i f i e s a n ds h o r t e n sp a r t i c l e - b a s e d e l e c t r o c h e m i c a l b i o a s s a y s ， a n d e l i m i n a t e s b a c k g r o u n d c o n t r i b u t i o n sf r o m e l e c t r o s t a t i c a l l yb o u n dm e t a li o n sw h i c hw o u l do t h e r w i s eb er e l e a s e dt h r o u g ht h e a c i dd i s s o l u t i o n t h ed e t e c t i o nl i m i ti so 0 7 5n g m lb y3 0r u l e i no r d e rt o i n v e s t i g a t et h ef e a s i b i l i t yo ft h en e w l yd e v e l o p e dt e c h n i q u et ob ea p p l i e df o rc l i n i c a l a n a l y s i s ，s e v e r a ls t a n d a r dh u m a ni g gs e r u ms p e c i m e n sw e r ea n a l y z e db yt h em e t h o d t oo u rk n o w l e d g e ，t h ec o p p e re n h a n c i n gp r o c e d u r ei st h ef i r s tt i m et ob ed e v e l o p e d f o ri m m u n s e n s o r s 3 e n z y m a t i ca m p l i f i c a t i o nd e t e c t i o no fd n ab a s e do n “m o l e c u l a rb e a c o n b i o s e n s o r s i nc h a p t e r4 ，w eh a v ed e s c r i b e daa o v e le l e c t r o c h e m i c a ld n ab i o s e n s o rb a s e d o ne n z y m a t i ca m p l i f i c a t i o np r o t o c o la n dm o l e c u l a rb e a c o n ( m b ) p r o b e m 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c t i o n t h ed e t e c t i o nl i m i ta sd e f i n e db y3 0r u l ei s0 1n m i no r d e rt oi n v e s t i g a t e t h e f e a s i b i l i t yo ft h en e w l yd e v e l o p e dt e c h n i q u e t ob e a p p l i e df o rm i s m a t c h d i s c r i m i n a t i o n ， a no l i g o n u c l e o t i d ew i t ho n eg gm i s m a t c hc o m p a r e dw i t ht h e c o m p l e m e n t a r ys e q u e n c ew e r ee m p l o y e d r e s u l t si n d i c a t e dt h i s n o v e lp r o t o c o lw e a d v a n c e dc o u l dd i s c r i m i n a t es i n g l em i s m a t c he f f i c i e n t l y k e y w o r d s ：i m m u n o s e n s o r ；i m m u n o a s s a y ；c a t a l y t i cm e t a ld e p o s i t i o n ；e n z y m e ； n a n o p a r t i c i e s ；m o l e c u l a rb e a c o n v i 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研 究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 罗薮日期：弦少年 占月，日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文 的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密回。 ( 请在以上相应方框内打“”) 躐嘞昌篓：雩肚昌 硕 学位论文 1 1 免疫分析方法概述 第1 章绪论 免疫分析方法( i m m u n o a s s a y ，i a ) 是基于抗原和抗体特征性反应的一种技 术，即利用抗原( a n t i g e n ，a g ) 与抗体( a n t i b o d y ，a b ) 之间高特异性的反应( 即 免疫反应) 实现对抗体、抗原或相关物质进行检测的分析方法。免疫分析方法起 始于2 0 世纪5 0 年代，首先应用于体液大分子物质的分析，1 9 6 0 年，美国学者 y a l o w 和b e r s o n 等将放射性同位素示踪技术和免疫反应结合起来测定糖尿病人 血浆中的胰岛素浓度，开创了放射免疫分析方法的先河。19 6 8 年，o l i v e r 将地 高辛同牛血清白蛋白结合，使之成为人工抗原，免疫动物后成功获得了抗地高辛 抗体，从而开辟了用免疫分析法测定小分子药物的新领域。在放射免疫分析方法 ( r i a ) 的基础上，随：昔新的标记物质的发现及新的标记方法的使用，以及电子 计算机、自动控制技术的广泛应用，派生出许多新的检测技术，使免疫分析法逐 渐发展成为一门新型的独立学科f l j 。由于其独特的选择性、极低的检测限和易操 作性，免疫分析手段在临床、生物制药和环境化学等领域得到广泛应用【2 】。 1 1 1 抗原 能引起动物机体特异性免疫应答的化学物质叫抗原。抗原具有免疫原性 ( i m m u n o g e n i c i t y ) 和抗原性( a n t i g e n i c i t y ) 两种特性。免疫原性是指抗原引起 免疫应答、产生抗体的能力；抗原性又称免疫特异性，是指抗原与免疫应答的产 物( 抗体) 相互起反应的能力，两者并不一致。具有免疫原性必然具有抗原性，反 之则不一定成立，如半抗原( h a p t e n ) ，它具有抗原性，但不具备免疫原性。一 般来说，抗原并没有明显的结构特征使之与非抗原化学物质得以区别，所以关键 要看它是否能引起免疫应答。 1 。1 2 抗体 通过抗原免疫应答所产生的，能够与抗原发生特异性反应的蛋白质叫抗体， 世界卫生组织和国际免疫学联合会先后决定，将具有抗体活性以及与抗体相关的 一类球蛋白，通称为免疫球蛋白( i m m u n o g l o b u l i n ，i g ) ，所有的抗体都是i g 。抗 体是机体免疫力的一类重要物质基础，也是医学中用于疾病诊断、治疗、预防和 研究发病机理的极为重要的试剂及制剂，它存在于血清、粘膜分泌液及其它体液 由【3 1 lo 基f 催化会属沉积的信号放人生物分析方泫研究 1 1 3 抗原与抗体的反应 抗原与抗体的反应统称为免疫学反应。抗体可以与抗原或半抗原以非共价键 的方式结合，二者之间的相互适应性可以形象地用锁和钥匙之间的关系来比喻。 因此，抗原与抗体之间的反应是一种可逆反应，反应的动力包括离子键与氢键的 形成及疏水力与范德华力，所有这些作用力都要求抗原和抗体相距很近。 1 1 4 免疫分析中的抗体位点占据原理 当一种探测抗体被引入待测对象( 这里以半抗原为例) 的体系时，抗原所占 据抗体分子结合位点的份数不仅反映了控制结合反应的亲和常数，而且反映了混 合液中最终自由抗原的浓度，这一点很容易根据质量作用定律而获得： 【a b a g f a b 】= k f a g 上式很容易转换成抗体被占据的份数： 【a b a g 】 a b 】总= x f a g 】( 1 + k f a g ) 式中 a b a g 】、【f a b 】和 f a g 】分别代表反映平衡时被结合的抗体位点总浓 度、抗体未结合位点浓度及自由半抗原浓度，足为平衡常数。一般情况下，抗原 最终自由态的浓度与总抗原及抗体的浓度有关；当抗体的总浓度接近o 0 5 k 或 更小时，抗原最终自由态的浓度与总抗原的浓度非常相近，在这样的情况下，抗 体位点的占据率与样品体积无关。从本质上讲，几乎所有的免疫分析都基于探测 抗体与抗原反应后对其结合位点的占据率的测定。 1 1 5 免疫分析方法的分类 免疫分析法是基于抗原抗体的特异性反应而进行的一种分析方法。根据是否 有标记物的引入，免疫分析法可分为传统免疫分析法和标记免疫分析法。传统免 疫分析法包括免疫沉淀分析法、脂质体溶解分析法，细胞毒性试验、免疫粘连凝 集试验、免疫浊度分析法和直接免疫传感器等。这些传统免疫分析方法都遵循经 典试剂分析的思想，在分析过程中检测相不需要与过量试剂分离，然而遗憾的是 抗体缺乏高灵敏性试剂所应具备的分析信号反差，一般只能用于定性或半定量分 析，且灵敏度非常低。而依靠在分析体系中引入探针系统来实现检测的标记免疫 分析法，由于引入了灵敏的探针分子和新的测定原理，在可以达到更加灵敏的分 析结果的同时，也扩大了待测物的范围。当然，引入探针在大多数情况下不可避 免的带来了检测相与过量标记试剂的分离问题，因而标记免疫分析法又分为均相 免疫分析和非均相免疫分析法。通常来讲，均相免疫分析虽然不需要分离，但往 往灵敏度不高，非均相免疫分析法虽然需要分离手续，但可以极大地提高分析的 灵敏度，降低检测限，适合于检测含量很低的分析物。免疫分析发展至今，其方 法多种多样，各有特色。目前，在这些方法中，非均相免疫分析法依然是免疫分 硕卜学位论文 析的主流f 4 1 。图1 1 给出了非均相免疫分析的三种模式。 之一l 。纵 + 兰。+ 一萨 气+ + 乒。一妒一m m “n t i 呐d y = 川g e n l=lab e l 图1 1 使用标记抗原( a ) 或标记抗体( b ) 竞争免疫分析和使用标记抗体( c ) 的非竞争免疫分析 原理图 在标记免疫分析方法中，引入的标记物主要有放射性同位素、荧光素和酶三 大类，此外还有化学发光剂、金属离子。因此，可根据标记物和检测方法的不同， 将标记免疫分析方法分为放射免疫分析法、荧光免疫分析法、酶免疫分析法、化 学发光免疫分析法、表面增强拉曼散射免疫分析法、电化学免疫分析法等。 1 2 免疫分析方法的研究进展 免疫分析，是基于抗原对其抗体进行免疫结合进行的分析。抗体抗原反应 特有的高亲和性和高特异性使免疫分析成为同常检测内源和外源物质不可或缺 的工具【5 ，6 】。任何物质只要能获得相应的特异性抗体，即可用免疫分析进行检测。 可测定的对象包括：微生物的抗原和相应的抗体；具有免疫活性的免疫球蛋白、 补体、细胞因子等；血液凝固因子；以及临床化学测定中微量而难于分离的物质， 如蛋白质、激素、药物、毒品等。免疫分析方法分为非标记免疫分析和标记免疫 分析，标记免疫分析是现代免疫分析中的主要方法。 1 2 1 放射免疫分析法 用放射物标记抗原或抗体的放射免疫分析( r a d i oi m m u n o a s s a y ，r i a ) 是美 国科学家y a l o w 和b e r s o n 于1 9 5 9 年创立的一种微量分析法，它是将具有高灵敏 度的放射性核素示踪技术和特异性免疫化学技术相结合而建立的新方法【7 ，8 1 。该 技术利用核素标记物的放大效应，改善了待测物的检测下限，同时以抗体或抗原 作为结合试剂，大大提高了检测方法的特异性。r i a 中标记抗原或抗体所用的放 射性核素，最早也是最常使用的标记物【9 , 1 0 是1 2 5 i 。放射性标记法利用同位素标 记的高灵敏性和抗原抗体反应的高特异性相结合，精确敏感性好( n g 、p g ) ，样 品用量少，易规范化，是其他任何生物测定法所无法比拟的】。而且最近有人 基于催化金属沉积的信口- 放大生物分析方法研究 研究放射性标记在两相溶液中的检测，克服了溶剂互不相溶影响抗原抗体特异性 反应的灵敏度【l 引。然而，其在应用上的缺点也是显而易见的，如放射能的危 险性；放射性同位素的不稳定性；虽然r i a 涉及的放射性较小，但仍会面 临公众的反核的负面影响。 1 2 2 酶免疫分析法 以酶标记的酶免疫分析( e n z y m ei m m u n o a s s a y ，e i a ) 是继r i a 之后建立起 来的一项将酶反应的高效性与免疫反应的特异性有机结合的标记免疫学技术。 l9 6 6 年，以e n g v a l l 和p e r l m a n n 等为先驱，发展了酶免疫测定法，主要是利用 免疫复合物上的酶将特定的底物转化为特定的颜色，用分光光度计测定，从而测 得待测物的量 1 3 , 1 4 】。酶免疫法的检测原理与放射免疫法类似，通过测定结合于 固相的酶的活力来确定被测物的量。到目前为止，酶标记法所用的酶大多是辣根 过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。酶免疫分析的灵敏度接近放射免疫 技术，而且还可以借助于简单的仪器作定量测定，是目前使用广泛的免疫分析技 术。e i a 法包