（分析化学专业论文）含硫化合物类蔬菜中农药多残留快速分析方法的研究.pdf

山东大学硕士学位论文 摘要 农药残留问题是目前影响食品安全的重要问题，直被世界各国政府和 组织所关注i 而蔬菜中农药残留问题又是重中之重，因此蔬菜中农药残留检 测技术的研究也日趋重要。而葱蒜等百合科蔬菜由于大量硫化物干扰，使用 传统农药残留检测方法无法检测，因此有必要对葱蒜等蔬菜农药残留检测进 行研究。 本论文针对葱蒜类蔬菜中含硫化合物严重干扰农药残留检测的问题，研 究和建立了一种快速、高效、经济实用的葱蒜等含硫化合物类蔬菜中农药多 残留检测方法。本论文根据百合科蔬菜中硫化物产生的特点，在提取前利用 微波加热的方法，破坏蒜氨酸酶的活性，有效地避免了硫化物干扰物的产生， 然后用乙腈做溶剂匀浆提取，s p e 净化，g c m s 检测的方法。具体内容及 研究结果如下： 1 、研究了l 半胱氨酸、铜离子、冷冻、水浴加热、微波加热等不同条件 对蒜氨酸酶活性的影响，选择了水浴和微波加热两种最佳的蒜氨酸酶灭活的 处理条件。本研究表明，在样品未破损情况下，用l 半胱氨酸、铜离子溶液 浸泡的方法很难在短时间内使蒜氨酸酶完全失活：冷冻法虽然可以使蒜氨酸 酶失活，但温度升高后蒜氨酸酶仍然具有活性；加热法( 水浴和微波加热) 则可有效地使蒜氨酸酶完全失去活性，可以有效的排除掉硫化物的干扰，满 足实验的要求。1 2 、研究了9 9 种农药在水浴加热( 8 0 和沸水浴) 以及微波加热条件 下的稳定性，对两种加热方法进行了比较，选择出最佳的加热方法和加热条 件。通过实验表明，两种水浴加热方法在不同程度上造成了部分农药的损失。 而微波加热实验表明，微波加热在一定程度上也可以使少部分农药损失，但 控制好加热时间，农药的损失很少，不影响农药残留的定性定量，完全满足 农药残留检测的要求。 3 、对9 9 种农药残留的提取溶剂、提取方式、净化、浓缩等条件进行了 讨论。对不同溶剂的提取效率进行了比较，选取了提取效率最好、易于操作 的乙腈作为提取溶剂，用匀浆的方法进行提取：净化方式则采用f l o r i s i l 柱，用正己烷+ 丙酮( 9 + 1 ) 作为淋洗剂进行净化：在浓缩过程中根据不同需 要，结合旋转蒸发和氮吹法的不同特点，选择合适的浓缩方法。 山东人学硕卜学位论文 4 、对色谱条件进行了优化。确定了9 9 种农药g c m s 分析的色谱条件， 将所检测农药依据其在色谱柱上不同保留时间进行了分组，确定了各组分选 择离子，确定了定性、定量方法。 5 、对方法可靠性进行了确证。进行了9 9 种农药在不同样本中的回收率 及重现性试验，回收率在7 0 9 6 1 1 0 之间，相对标准偏差( r s d ) 在1 2 1 1 3 之间，最底检出浓度均小于0 0 2 m g k g ，满足我国规定的有关农药残留 在蔬菜中的最低残留限量( m r l ) 标准。 i i 关键词 含硫化合物：蔬菜；微波处理；农药多残留；g c m s 山东大学硕 j 学位论文 一 a b s t r a c t t h ep r e s e n c eo fp e s t i c i d er e s i d u e si nf o o dw h i c hi sc r u c i a lt oh u m a n sl i f ei s o n eo f t h es e r i o u s f o o ds a f e t yp r o b l e m st h a th a sg r e a t l ya t t r a c t e dg o v e m m e n ta n d o r g a n i z a t i o n sc o n c e r n p e s t i c i d er e s i d u e si nv e g e t a b l eh a v eh i g h e rt o x i c i t yt h a n t h a ti no t h e rf o o d s oi ti si m p o r t a n tt od e v e l o pa n a l y t i c a lm e t h o d sf o rp e s t i c i d e r e s i d u e s i n v e g e t a b l ei n c r e a s i n g l y b u tt h e r ea r em a n ys u l f o c o m p o u n d s i n a l l i u mp l a n t s ，w h i c hi n f l u e n c et h ed e t e c t i o no fp e s t i c i d e si ng a r l i ce t c t h e r e f o r e ， i ti sn e c e s s a r yt or e s e a r c haa n a l y t i c a lm e t h o df o rp e s t i c i d er e s i d u e si na l l i u m p l a n t s t h ep a p e rf o c u s e do nt h e s t u d yo fs u l f o c o m p o u n d st h a ti n f l u e n c et h e d e t e c t i o no fp e s t i c i d er e s i d u e si na l l i u mp l a n t sa n ds e t e du pa f a c i l i t ya n a l y s i s m e t h o dw h i c hi sr a p i d ，c o n v e n i e n ta n de c o n o m i c a lt ot e s tp e s t i c i d em u l t i r e s i d u e s i na l l i u mp l a n t ss a m p l e s t h ea n a l y t i c a lp r o c e d u r ew a sb a s e do np r e v e n t i n g f o r m a t i o no fs u l f u r - c o n t a i n i n gc o m p o u n d si na l l i u ms a m p l e sb ym i c r o w a v e i n a c t i v a t i o no ft h ee n z y m ea l l i i n a s e t h ea l l i u ms a m p l e st h a th a db e e np r e t r e a t e d w e r ee x t r a c t e dw i t ha c e t o n i t r i l ea n dc l e a n e db ys o l i d p h a s ee x t r a c t i o n , t h e n p e s t i c i d er e s i d u e si na l l i u ms a m p l e sw e r ed e t e c t e db yg a sc h r o m a t o g r a p h y m a s s s p e c t r o m e t r y t h ed e t a i l so f t h ec o n t e n t sa n dr e s u l t so f t h es t u d ya l ea sf o l l o w s ：一 1 t h ev a r i o u sc o n d i t i o n st h a td e c r e a s e da l l i i n a s ea c t i v i t y , i n c l u d i n gl e y s t e i n e ，c u 2 + i o n ，f r e e z i n g ，h e a t e db yw a t e r - b a t ha n dm i c r o w a v e ，h a db e e n s t u d i e da n dt w oe f f e c t i v em e t h o d sf o rd e a c t i v a t i n ga l l i i n a s es u c ha sh e a t e db y w a t e r - b a t ha n dm i c r o w a v eh a db e e nc h o o s e d t h er e s u l t so ft h i sr e s e a r c h i n d i c a t e dt h a tl c y s t e i n ea n dc u 2 + i o nc o u l d n ts u f f i c i e n t l yd e c r e a s ea l l i i n a s e a c t i v i t y i ns h o r tt i m e ，a l l i i n a s ec o u l db ei n h i b i t e da f t e rf r e e z e db u ti t sa c t i v i t y w o u l dr e s u m ea tr o o mt e m p e r a t u r e a l l i i n a s ea c t i v i t yc o u l db ed e s t r o y e db y w a t e r - b a t ha n dm i c r o w a v e t h em e t h o dt h a ts u i t e dt ot e s tp e s t i c i d em u l t i - r e s i d u e s c o u l de f f e c t i v e l ym i n i m i z et h ei n t e r f e r e n c e sc a u s e db ys u l f u rc o m p o u n d s 2 t h es t a b i l i t yo f10 0p e s t i c i d e sw h i c hh e a t e db yw a t e r - b a t h ( 8 0va n d b o i l b a t h ) a n dm i c r o w a v eh a db e e nc o m p a r e d ，a n dt h eo p t i m a lp r e t r e a t m e n t m e t h o dh a db e e ns e l e c t e d t h ee x p e r i m e n ts h o w e dt h a tp a r to fp e s t i c i d e sc o u l d i i i 山东大学硕卜学位论义 b ed e g r a d e db yw a t e r - b a t h a l t h o u g hp e s t i c i d e sh e a t e db ym i c r o w a v eh a dl i t t l e d e g r a d a t i o n ，p e s t i c i d er e s i d u e si ns a m p l ec o u l db ed e t e c t e da c c u r a t e l yi ft h e h e a t i n gt i m eb ym i c r o w a v eh a db e e nc o n t r o l e ds t r i c t l y t h e r e f o r ep r e t r e a t m e n t w i t hm i v r o w a v ew a sa p p l i e dt ot h ea n a l y s i so fp e s t i c i d er e s i d u e si na l l i u m p l a n t s 3 t h ee x t r a c t i o ns o l v e n t ，m e t h o da n dt h ec o n d i t i o n so f c l e a n i n gu pa n d e v a p o r a t i n gh a db e e nd i s c u s s e d c o n t r a s t i n ge x t r a c t i n g se f f i c i e n c y , a c e t o n i t r i l e w h i c hh a dg o o de x t r a c t i n g se f f i c i e n c yw a ss e l e c t e dt oe x t r a c tp e s t i c i d e sf r o m s a m p l ew i t hh o m o g e n i z e r f l o r i s i ls p ec o l u m nw a sd e t e r m i n e di nc l e a n i n g p r o c e s sw i t ha c e t o n e n - h e x a n e ( 1 ：9v v ) r o t a r ye v a p o r a t o ra n dn i t r o g e n e v a p o r a t o rw e r eu s e di nd i f f e r e n ts t e p s 4 c h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d t h eg c - m sc o n d i t i o n s p e s t i c i d e sw e r ed i v i d e di n t ot w og r o u p s a c c o r d i n gt ot h e i rr e t e n t i o nt i m ei nt h ec o l u m n ，a n do b j e c ti o n sw e r ec h o o s e d m e t h o d so fi d e n t i f i a b i l i t ya n dq u a n t i f yw e r ed e t e r m i n e d 5 t h er e l i a b i l i t yo ft h et e s tm e t h o dw a sv e r i f i e d r e c o v e r i e so f9 9p e s t i c i d e s w e r eo b t a i n e db yv a r i o u ss a m p l e s a l lp e s t i c i d er e c o v e r i e sr a n g e df r o m7 0t o 110 a n dr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n sw e r ei nt h er a n g e1 2 - 11 3 f o rs p i k e d s a m p l e s t h el i m i t so fq u a n t i f i c a t i o f ib e l o w0 0 2m gk g 。1w e r ea c h i e v e dw i t ht h i s p r o c e d u r e k e y w o r d s ： s u l f o c o m p o u n d s ；v e g e t a b l e s ； m i c r o w a v e p r e p a r a t i o n ；p e s t i c i d em u l t i r e s i d u e s ；g c m s i v 山东火学硕_ j ：学位论文 a e d a s e c d f a c e d a d e c d e l c d e l i s a f l d f p d g c g c m s g p c h p l c h p l c m s l o d l o q m a e m r l m s p d n p d r s d s f e s p e s p m e s i m u v 英文缩略 e l e m e n t s p e c i f i ca t o m i ce m i s s i o nd e t e c t o r ( 原子发射检测器) a c c e l e r a t e ds o l v e n te x t r a c t i o n ( 加速溶剂萃取) c a l i f o r n i ad e p a r t m e n to ff o o da n da g r i c u l t u r e ( 美国d l ：l 7 1 4 食品农业 部) c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( 毛细管电泳) d i o d e - a r r a yd e t e c t o r ( 二极管阵列检测器) e l e c t r o nc a p t u r ed e t e c t o r ( 电子捕获检测器) e l e c t r o l y t i cc o n d u c t i v i t yd e t e c t o r ( 电导电解检测器) e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( 酶联免疫测定) f l u o r e s c e n c ed e t e c t o r ( 荧光检测器) f l a m ep h o t o m e t r i cd e t e c t o r ( 火焰光度检测器) g a sc h r o m a t o g r a p h y ( 气相色谱仪) g a sc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y ( 气一质联用仪) g e lp e r m e a t i n gc h r o m a t o g r a p h y ( 凝胶渗透色谱) h i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( 液相色谱仪) h i 曲一p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y ( 液一 质联用仪) l i m i to f d e t e c t i o n ( 检测限) l i m i to f q u a n t i t a t i o n ( 定量限) m i c r o w a v ea s s i s t e de x t r a c t ( 微波辅助萃取) m a x i m u mr e s i d u el i m i t s ( 最大残留限量) m a t r i xs o l i d - p h a s ed i s p e r s i o n ( 基质固相分散) n i t r o g e np h o s p h o r u sd e t e c t i o r ( 氮磷检测器) r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( 相对标准偏差) s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n ( 超临界萃取) s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ( 固相萃取) s o l i dp h a s em i c r o - e x t r a c t i o n ( 固相微萃取) s e l e c t e di o nm o n i t o r i n g ( 选择离子扫描) u v d e t e c t o r ( 紫外检测器) v 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导 下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内 容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过 的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 关于学位论文使用授权的声明， 本人同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的 印刷件和电子版，允许论文被查阅和借阅：本人授权山东大学 可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文。 ： ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：苣盟导师签名：鳓期：醴f 山东人学硕t = 学位论文 第一章前言 1 1农药残留概述 随着世界人口的增加，人们对粮食和农产品的需要同益增加，为了满足 人们对农产品的需求，化学农药依然是保证农作物增产、稳产的最为经济有 效的手段。在当前农业生产中，农药是不可缺少的生产资料，扮演着越来越 重要的角色， 农药是一把双刃剑，它可以提高作物产量和保证农产品的质量，但同时 也对环境及人体健康产生了严重的危害。近年来，随着蔬菜面积扩大，保护 地面积的增加，蔬菜病虫草害发生不断加重，使得农药的使用量大增，随之 而来的农药残留问题日益严重，对人类健康造成严重危害。农药施用在作物 上后，除小部分对靶标生物起作用外，其余的农药留在农作物的表面或被农 作物吸收，随着雨水渗入地下或流入江河，造成农药残留【l 】。 农药残留( p e s t i c i d er e s i d u e ) ，是农药使用后一个时期内没有被分解 而残留于生物体、作物、土壤、水源、大气中的微量农药原体、有毒代谢物、 降解物和杂质的总称1 2 】。残存的数量称农药残留量，以m g k g ( 或m g l ) 表示。 农药残留不仅对人体有着直接的急性毒害，而且具有慢性毒害【3 l 。农药残留 容易通过各种途径进入动物体内，在动物体及人体内富集，对人体长期具有 慢性毒害作用【4 叫。如乐果是我国常用的农用杀虫剂之一，人体通过食物链间 接接触小剂量乐果的可能性很大，而反复的摄入小剂量乐果会对人的生殖系 统造成影响【7 捌。乐果还有可能诱发慢性粒细胞白血病【l o 1 1 1 ，研究认为接触 乐果会导致老年痴呆、p a r k i n s o n 综合症。再如乙草胺等除草剂做为一种植 物生长调节剂，对动物具有内分泌干扰作用，以及致畸、致突变作用，而且 易在动物体内富集，因此除草剂残留对人体健康具有潜在的危险盼1 3 】。 中国是一个传统的蔬菜生产大国，据2 0 0 5 年统计，全国蔬菜播种面积在 1 8 3 4 7 万公顷以上，蔬菜总产量超过6 0 0 0 万吨。蔬菜是人们日常生活中必不 可少的食物，也是十分重要的经济作物，我国不仅蔬菜种植面积大，而且蔬 菜品种极其丰富，达2 0 0 多个品种，已经成为我国仅次于粮食的第二大农作 物。蔬菜的生产离不开农药，据统计，农药的应用为蔬菜增加产量大于3 0 。 然而，蔬菜生长周期短，茬口多，生长采收旺季也是病、虫害发生旺季，农 药使用量较大，使用农药的频率高，加之违规使用农药，施药技术落后等原 山东人学硕 ：学位论义 因，蔬菜农药残留风险大，蔬菜收获期极易残留有农药【1 4 1 。许多国家已经限 制使用或禁用的高毒品种如甲胺磷、对硫磷、久效磷、甲基对硫磷、氧化乐 果、磷胺、克百威等在许多地方仍有大量的使用【”1 6 1 ，造成药害、环境污 染、甚至人畜中毒等严重后果。我国自2 0 0 1 年开始，农业部每年都要组织各 地质检中心对3 7 个城市和地区的蔬菜中2 0 多种农药残留污染状况进行例行 监测和调查，结果表明，农药残留状况不容乐观。农药残留超标现象屡有发 生。 由于病、虫产生抗性和农药市场变化等因素的影响，混配农药的生产和 使用量却呈快速增长趋势，在一些地区甚至出现了一些国家禁止使用的两种 以上杀虫剂混配的三元、四元混剂旧，相应的农药残留分析也由原来的单残 留分析发展到多残留分析。由于蔬菜中的组分多且复杂，对其样品中的农药 残留进行直接测定非常困难，因此对样品中农药残留进行富集、净化是当前 农药残留检测中的重要环节【l g 】。 ， 目前世界各国对农药残留污染问题的关注程度越来越高，不仅从保护消 费者的角度出发，而且也成为国际贸易的技术壁垒，因此不断加强各自的农 药残留检测能力【1 9 2 0 1 。随着经济全球化进程的加快和我国加入w t o ，我国农 产品将在国内和国际两个市场与国外同类产品进行竞争。为了保护国内农业 产业的发展和本国农产品的市场占有率，世界许多国家纷纷利用w t o 有关协 议，特别是贸易技术壁垒协定( t b t ) 和卫生与植物卫生措施协定( s p s ) ， 抵制国外产品，保护国内产业【2 。我国农产品多为劳动密集型产品，在价格 上有一定的比较优势，是传统的出口创汇产品。但近年来发达国家以质量安 全为由纷纷设置技术性壁垒，导致我国农产品出口屡屡受阻。尤其是在加入 w t o 之后，这种态势逐步加剧，如近几年我国蔬菜、茶叶、畜产品、蜂产品、 水产品等相继遭到美国、日本、韩国等国家和欧盟的封杀【2 2 l 。2 0 0 2 年以来， 欧盟对我国动物源性产品、日本对我国蔬菜产品及英国对我国蜂蜜产品输出 的限制，严重影响了我国农民和农业企业的利益。据统计，仅2 0 0 2 年上半年 我国出口蔬菜与去年同期相比就下降了近3 0 。由于我国农产品质量安全检 验检测水平与国外比存在着一定的差距，在农产品出口时，许多检测项目灵 敏度达不到要求，。到达贸易国口岸才查出问题，不但使出口企业蒙受损失， 也使贸易国对我国整个农产品质量安全水平产生怀疑；在国外农产品进入我 国时，许多有毒有害物质检不出，不能有效地实施技术壁垒。农产品的农药 2 山东人学硕t 学位论文 残留检测技术的发展，不仅成为保护人类身体健康的手段，更表现为国际贸 易中应对技术壁垒的一种重要手段。 我国从上世纪九十年代加强了农药残留检测工作，到目前为止，已取得 了很大进展，并制定了一系列的农药多残留检测方法标准，如 g b t s 0 0 9 2 0 2 0 0 3 2 3 1 、g b t s 0 0 9 1 4 5 2 0 0 3 2 4 1 、g b t 1 9 6 4 8 2 0 0 5 【2 5 】等国家标 准及n y t 7 6 1 2 0 0 4 2 6 1 、n y t 1 3 7 9 - 2 0 0 7 2 7 】等行业标准，可以对大多数农产品 进行较为全面的检测。 1 2 常见的样品前处理技术 农药残留分析是一项对复杂混合物中痕量组分的分析技术，它要求精细 的微量操作手段，其灵敏度高、特异性强、回收率高、重现性好、检出限低、 操作简单易行【2 8 2 9 1 。在农药残留测定之前，要有适合于各种蔬菜、食品和目 标物化学性质的萃取、挣化、浓缩等前处理步骤，这些前处理过程在分析中 起着决定性作用。建立多种农药残留分析的样品前处理方法要综合考虑农药 的理化性质、样品基质干扰、分析检测技术、方法的检出限和回收率等因素。 在样品检测过程中，上机待测液的净化程度是痕量、超痕量农药残留分析的 一个重要方面，特别是数量很大的多种农药残留分析，一个“干净”的上机 待测液可以使分离、定性、定量更容易，提高定性、定量的准确度和精密度。 而一个基质干扰很多的上机待测液，往往会使得分离、定性、定量变得很困 难，甚至可能得出错误的结论p o j 。因此，蔬菜中多种农药残留分析对样品前 处理要求很高：首先，要求样品前处理能从蔬菜中将所有要测定的农药提取 出来，并且有较好的回收率和精密度；其次，样品前处理能对提取液有较好 的净化效果，能有效消除基质干扰；再次，样品前处理步骤不能太多、太复 杂队3 2 1 。多种农药残留的分析对象数量多，品种复杂多样，且极性差别大。 对于蔬菜水果中多种农药残留分析，我国目前主要采用传统的溶剂萃取，液 一液分配，柱层析净化，前处理方法自动化程度低、提取净化的效率不高， 速度慢，环境污染严重。新开发的前处理技术其目的和结果就是要实现快速、 有效、简单和自动化地完成分析样品的制备过程。近年来已发展了许多新的 样品前处理方法，如固相萃取( s p e ) 、固相微萃取( s p m e ) 、超临界流体萃取 ( s f e ) 、凝胶渗透色谱( g p c ) 、微波辅助萃取( m a e ) 、加速溶剂萃取( a s e ) 、基 质固相分散( m s p d e ) 等，这些方法都大大简化了预处理过程1 3 3 1 。 3 山东大学硕士学位论文 1 2 1 固相萃取( s p e ) 技术 固相萃取技术是7 0 年代发展起来的一种样品前处理技术，起初主要用于 液相色谱分析的样品前处理。其原理是利用固体吸附剂将液体样品中的目标 化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再利用洗脱液洗脱或加 热解吸附，达到分离和富集分析物的目的。 上世纪8 0 年代以后，此项技术扩展到气相色谱法分析农药残留量的样品 前处理 3 7 。根据固相萃取柱中填料的不同，s p e 可分为以下几种类型：正相 s p e 、反相s p e 和离子交换s p e 等【3 5 1 。s p e 依据填料可分为吸附型、分配型和离 子交换型。其填料有硅胶、吸附树脂、c 8 ，c 价腈基、苯基、氨基等和其他 特殊填料。对水样和其他液体样品，在选择合适的萃取填料和洗脱液并优化 其他条件后，可使萃取、富集、净化一步完成，然后直接进行气相色谱法或 高效液相色谱法分析【3 6 】。w a n 简化了植物油中有机酚农药残留分析的硅胶柱 净化方法，减少了有机溶剂的使用【3 7 1 ，a 1 1 e s i a 等用c 1 8 柱分析高脂类食品中 有机磷农药残留，方法快速简单，重现性好【3 引。m i l l s 等比较了2 种不同的混 合柱在环境和临床化学中的应用【3 9 1 。m e y e r 等采用自动固相萃取检测水中除 草剂，方法简单易操作，取得了很好的成果m 1 1 2 2 固相微萃取( s p 胍) 技术 s p m e 是利用纤维涂层做吸附剂吸附目标分析物，再解吸分析的技术。它 是集采样、萃取、浓缩、进样于一体的样品前处理新技术【4 。固相微萃取的 选择性、灵敏度可通过改变石英纤维表面固定液的类型、厚度、p h 值、基质 种类、样品加热或冷却处理等因素来实现【4 2 1 。固相微萃取已经发展为与气 ( 液) 质联用仪相连，进一步扩展了其应用范剧4 3 1 。但是在多种农药残留分 析中s p m e 应用少，因为s p m e 对于挥发性差的农药分析效果不好，定量方面存 在不足，目前还没有从非极性到中等极性农药都有较好回收率的s p m e 纤维涂 层】 1 2 3 超临界流体萃取( s f e ) 技术 超临乔流体萃取一般以超临界状态的二氧化碳作为萃取剂，流出液中 的二氧化碳在常压下挥发，待测物用溶剂溶解后进行分析检测【4 5 】。超临界状 态的二氧化碳粘度低、传质速率快、流动性、渗透性好，所以萃取速度快， 萃取效果好。s f e 具有选择性好、前处理简单、分离时间短、避免了有毒有 机溶剂的使用，提取条件可控制等优点【4 6 1 。尤其是超临界流体具有很好的渗 4 山东大学硕一k 学位论文 透性，分析土壤和粮食样品具有明显的优势【4 7 4 引。其缺点是实验条件的选择 和优化比较困难，萃取体系的可选择性差，实验需要在高压下进行，仪器价 格昂贵。因为样品中的水分含量对s f e 萃取效果影响比较大，所以s f e 在蔬菜 水果中的多种农药残留分析应用有一定难度。最重要的是由于二氧化碳是非 极性物质，以超临界状态的二氧化碳作为萃取剂能提取的物质主要以非极性 物质为主虽然可以通过添加极性改性剂来改善，但是其提取物的极性范围 依然较窄，不能满足多种农药残留同时提取的要求【4 9 矧。 1 2 4 加速溶剂萃取( a s e ) 技术 加速溶剂萃取是一种在较高的温度和较大的压力下用溶剂萃取固体或 半固体样品的新颖样品前处理方法【5 1 1 。加速溶剂萃取的操作是将固体样品密 封于一个装满萃取溶剂的样品池中。在5 0 2 0 0 c ，3 0 0 p s i 压力条件下只需 要5 - 一l o m i n 就可以将样品萃取完成，然后由压缩气体将萃取液从样品池吹入 收集器。加速溶剂萃取利用升高温度和压力来增加物质溶解度和溶质扩散速 率，从而提高萃取的效率。加速溶剂萃取主要有如下优点：有机溶剂用量少、 快速、基体影响小、萃取效率高【5 2 5 3 1 。现己成熟的用溶剂萃取的方法都可用 加速溶剂萃取法替代，且使用方便、安全性好，自动化程度高。采用此技术 可以已在环境、药物、食品和聚合物工业等领域的残留检测中得到广泛应用 陟5 5 1 。这种方法已被美国环保局( e p a ) 推荐为标准方法。 1 2 5 凝胶渗透色谱( g p c ) 技术 凝胶渗透色谱技术是根据被分离物质分子大小的不同，通过具有分子筛 性质的固定相( 凝胶) ，使物质达到分离。凝胶渗透色谱法最初主要用来分离 蛋白质，但随着适用于非水溶剂分离的凝胶类型的增加，凝胶渗透技术应用 于农药残留净化得以发展。农药一般是小分子，由此可以把样品基质中大分 子杂质分离出来，所以很多方法使用g p c 来净化提取。如脂肪作为一种大分子 化合物，用凝胶渗透色谱容易将其与农药分离，所以对含有脂肪的样品的净 化g p c 具有独特的优势1 5 6 5 刀。但是g p c 只是一种净化技术，不能直接把农药从 蔬菜水果中提取出来，而且样品基质中小分子杂质是没有办法用g p c 分离的! 与s p e 等净化技术相比，凝胶净化技术具有净化容量大、可重复使用、适用 范围广、使用自动化装置后净化时间缩短、简便、准确等优点【5 8 5 9 1 。 1 2 6 微波辅助萃取( m a e ) 技术 微波辅助萃取技术是对样品进行微波加热，利用极性分子可迅速吸收微 5 山东大学硕士学位论文 波能量的特性来加热极性溶剂，达到萃取样品中目标化合物、分离杂质的目 的【6 0 1 。微波辅助萃取主要特点是：萃取质量高、选择性好、快速、节能、节 省溶剂，而且可以避免长时间的高温引起物质的分解，有利于萃取热不稳定 的物质。微波辅助萃取是一个很有前景的样品前处理方法【6 l “2 1 。但是微波辅 助萃取是对极性物质选择性加热，所以对非极性农药的萃取效果并不好，在 大量的多种农药残留分析中有一定局限性【6 3 l 。 1 2 7 基质固相分散( m s p d ) 技术 、 在s p e 的基础上i 出现了基质固相分散，由b a r k e r 于1 9 8 9 年首次提出【6 4 1 。 m s p d 不同于经典的s p e 技术，s p e 需要样品处于无粘性、无颗粒、均匀的液态， m s p d 的分析对象可以是固态、粘性液态样品；s p e 中有液化、离心、过滤等 步骤，m s p d 集萃取、净化于一步。其基本操作是将样品直接与适量的固体吸 附剂( 硅胶、f o r i s i l ，c 。等) 研磨，制成半固态，装柱，选择合适的溶剂淋 洗、洗脱。m s p d 将样品的提取和净化一步完成，避免了样品均化、转溶、乳 化造成的待测农药组分的损失，回收率高，、分离效果好，分析速度快。而且 还可以通过优化m s p d 减少与农药一起流出的共萃物，该方法己在食品分析领 域得到了广泛地应用f 6 ”6 1 。 1 3 常见的分析技术 测定农药残留的方法目前主要有两大类：生化法和仪器法。 1 3 1 生化法 生化法目前应用在农药残留速测中，最常用的主要有两大类： 酶抑制法。原理是根据有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制昆虫神经中枢 和周围神经系统中乙酰胆碱酶的活性，造成神经传导介质乙酰胆碱的积累， 影响正常传导，使昆虫中毒致死，根据这一昆虫毒理学原理而用在对农药残 留的检测中。如果蔬菜的提取液中不含有机磷或氨基甲酸酯类农药残留量 低，酶的活性就不被抑制，实验中加入的基质就被酶水解或少部分水解，水 解产物与加入的显色剂反应产生颜色；反之，如果蔬菜的提取液中含有一定 量的有机磷的氨基甲酸酯类农药，酶的活性就被抑制，实验中加入的基质就 不能被酶水解，从而不显色或颜色变化很小，用分光光度计测定吸光值随时 间的变化，计算出抑制率，就可以判断出蔬菜中含有机磷或氨基甲酸酯类农 6 山东人学硕十学位论文 药的残留情况f 6 7 6 引。酶抑制法是一种简便、经济、快速的检测方法，它一般。 是可将抽查的蔬菜样本先进行粗筛，将有残留问题的蔬菜再用分析仪器进一 步定性和定量分析【6 9 1 ，目前，我国已将此种方法制成相关标准方法【7 0 7 1 1 。 但该方法只能用于测定有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂，其灵敏度和所使 用的酶、显色反应时间和温度密切相关。这种方法最低检出限普遍较高，对 韭菜等含硫化合物蔬菜及部分含叶绿素蔬菜有假阳性或假阴性，易引起误 判，所以此类方法的应用具有一定的局限性【7 2 乃j 。 免疫分析法。有放射性免疫分析、酶免疫分析、多组份分析物免疫分析、 免疫传感器分析等【| 7 4 l 。最为常用的是酶联免疫法( e l i s a 法) ，它主要是以 抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的农药残留检测方法。该法利 用化学物质在动物体内能产生免疫抗体的原理，先将小分子农药化合物与大 分子生物物质结合成大分子，做成抗原，并使之在动物体内产生抗体，对抗 体筛选制成试剂盒，通过抗原与抗体之间发生的酶联免疫反应，依靠比色来 确定农药残留，它具有专一性强、灵敏度高、快速、操作简单等优点，试剂 盒可广泛用于现场样品和大量样品的快速检测，可准确定性、定量，其灵敏 度已接近仪器检测法【7 5 7 6 1 。但由于受到农药种类多，抗体制备难度大、在不 能肯定样本中的农药残留种类时检测有一定的盲目性，也存在假阳性的问 题，酶联免疫法的应用范围受到较大的限制。我国的一些科研机构目前在这 方面也取得了不错的进展，研制出一些酶联免疫农药检测试剂盒，具有不错 的灵敏度，但是还基本处于实验阶段，还没有形成产品，我国市场上酶联免 疫法成品试剂盒基本上依赖从国外进口。不过从发展来看，这种方法最有发 展前途，随着科学技术的发展，将来有可能成为农药残留速测的主力军 7 7 , 7 明。 1 3 2 仪器法 利用仪器进行农药残留检测是目前最主要的方法，常用仪器有气相色 谱仪( g c ) 、气质联用法( g c - m s ) 、液相色谱法( h p l c ) 、液质联用法( h p l c m s ) 等。仪器检测法具有高选择性、高分离效能、高灵敏度、快速的特点，可以 对每种农药进行准确定性、定量，是国际公认的农药残留检测方法，是农药 残留量检测最常用的方法【7 9 1 ，并且许多国家以仪器检测方法的检出限作为农 药残留限量在农产品及食品中的最低残留限量： ( 1 ) 气相色谱法( g c ) 采用气体作流动相的色谱法，用于挥发性农药的检测，具有高选择性、。 山东人学硕1 j 学位论文 高分离效能、高灵敏度、快速的特点，是农药残留量检测最常用的方法之一， 目前用于农药残留检测的检测器主要有电子捕获检测器( e c d ) 、微池电子捕 获检测器( u - e c d ) 、火焰光度检测器( f p d ) ；脉冲火焰光度检测器( p f p d ) 、 氮磷检测器( n p d ) 等 g o 8 1 1 ： ( 2 ) 液相色谱法( h p l c ) 采用液体作流动相的一种色谱法，它可以分离检测极性强、分子量大及 离子型农药，可用于不易气化或受热易分解的农药残留的检测。近年来，采 用新型高效固定相、高压泵和高灵敏度的检测器，柱前和柱后衍生技术、以 及计算机联用技术等，大大提高了检测效率、灵敏度、速度和操作自动化程 度。目前用于农药残留检测最多是紫外吸收检测器( u v ) 、二极管阵列检测 器( d a d ) 和荧光检测器( f l d ) 等【8 2 8 4 1 。 ( 3 ) 色质联用法( g c - m s ，h p l c - i s ) 气相或液相与质谱联用，质谱仪作为一个通用检测器使用。它既具备了 色谱的高分离效能优点，而且具备了质谱准确鉴定化合物结构的特点，可同 时达到定性、定量的检测目的，特别适合于农药代谢物、降解物的检测和多 残留检测【8 5 8 6 1 。随着电子技术及计算机技术的发展，多极质谱串联技术也 应用到农药残留检测中，和单极质谱仪相比由于具有更好的选择性和更高的 灵敏度，灵敏度已经完全达到了气( 液) 相色谱灵敏度，已逐渐取代气( 液) 相色谱成为最新的、通用的农药残留检测方法阶8 引。 ( 4 ) 超临界流体色谱( s f c ) 是以超临界流体作为流动相的色谱体系，超临界流体是指物质处于临界 温度和临界压力时的状态，介于气、液态之间，兼有气体和液体的某些物理 特性，因此，超临界流体色谱既有气谱的快速、高效、灵敏的特点，又有能 检测对热不稳定和大分子化合物的液谱的特点f 3 9 则。 ( 5 ) 毛细管电泳法( c e ) 该方法是利用毛细管及高电压( 1 5 - 3 0 k w ) 分离各种农药残留物，非常适 合于一些难于用传统色谱法分离的离子化样品的分离和分析，比h p l c 有高 1 0 - 1 0 0 0 倍的分析能力，而且所需之缓冲液具有不危害环境之特点，在短时 间( 3 0 m i n ) 内就可以完成定性及定量分析【9 1 9 3 1 。 8 山东大学硕 ：学位论文 1 4 本研究的目的和意义 中国是全