（分析化学专业论文）基于单分子膜自组装技术的压电免疫传感器的研究.pdf

t 一 j k 湖南大学分析化学硕士论文 李丹2 0 0 1 年6 月 基于单分子膜白组装技术的 压电免疫传感器的研究 ( 摘要) f 生物传感器是一种结合生物活性物质和传感器件的装置，它利用生物分子的 特异识别功能使这类传感器具有很好的选择性能，生物组分与待测物质反应，发 生能量变化，这些能量变化所产生的信号由传感器件转化成一种能进一步被处理 和显示的响应。很多种类的生物组分( 包括酶、抗体、抗原、核酸、独立受体、 完整的细胞、微生物、动植物组织) 已被用于这类传感体系，构成各种生物传感 器。 将压电化学与生物传感结合起来的学科是一门新兴的分支学科。压电传感器 除了可响应质量效应外，还可响应溶液的粘度、密度、介电常数、电导率等多种 信号，除了气相之外，当前的压电传感器还提供液相压电传感理论和应用技术， 尤其是用于生物大分子的测定。当异种蛋白( 称为抗原，a n t i g e n ，简称a g ) 侵 入生物体内时，体内能产生识别此类异物并将其排出的物质( 大分子量蛋白质， 称抗体a n t i b o d y ，简称a b ) ，抗原与抗体发生免疫反应，利用抗体( 或抗原) 对抗原( 或抗体) 的特异性识别功能和压电晶体的高灵敏质量响应可制成压电免 疫传感器。自8 0 年代以来，压电免疫分析已引起了人们的广泛关注并得到了迅 速发展。通常将抗体( 或抗原) 固定于晶体表面浸入样液时，与抗原( 或抗体) 产生免疫反应，使晶体表面质量负载增加。频率降低，其频移值与样液中抗原( 或 抗体) 含量成正比。压电免疫传感器具有结构简单、成本低廉、操作简便、高灵 敏度、高选择性、干扰小、响应时间快等优点，而且能够在线，易于和流动注射 分析技术结合并实现自动化，从而可进行连续测定。因此，压电免疫传感器已被 广泛用于解决生化研究、临床分析、环境和工业检测过程等领域。 2 湖南大学分析化学硕士论文 李丹 2 0 0 l 至! 旦 本文结合压电免疫传感器抗体( 抗原) 固定化方法的不同，研制了些新的 压电免疫传感器用于参考血清中的一些曼自鲤型定。具体内容如下：本文的第一 部分着重于用堇自垒固塞亟签的压电免疫传感器的研制以及利用压电石英晶体 对鱼壅厘廛的动力学研究；论文的第二部分着重于采用自缉鎏越苤包埋抗体的压 电免疫传感器的研究。具体内容主要包括以下几个方面： 第一部分：( i ) 利用压电石英晶体对其表面吸附物质质量敏感的特性，利用 蛋白a 与金电极之间强烈的吸附作用，而且蛋白a 可以与抗体的f c 片断结合而 不影响抗体的活性，在石英晶振表面固定转铁蛋白抗血清，研制了一种对于转铁 蛋白有特殊响应的压电免疫传感器，在3 9 2 7 9m e c l 范围内的参考血清中的转 铁蛋白进行了定量测定，获得很好的响应；利用石英晶体微天平技术在线监测了 参考血清在固定了转铁蛋白抗体的石英晶振上的吸附与解吸过程，测得了其抗原 抗体免疫反应的速率常数为2 1 4 x 1 0 7 ( m o l l ) 1 s ，结合常数为6 7 5 x 1 0 7 ( m o l l ) 。 i ，同时对利用蛋白a 固定抗体的石英晶体上的抗原抗体免疫反应的动力学过 程进行了研究。( 2 ) 同样利用蛋白a 与金电极之间的强烈吸附作用，在石英晶 振表面固定了触珠蛋白抗血清，研制了基于蛋白a 固定抗体的压电免疫分析法 测定了触珠蛋白，通过测量在固定了触珠蛋白抗血清的石英晶体上加入标准参考 血清前后的频率变化，发现在浓度i 2 7 - 3 1 7 m g l 时，频率与浓度之间有很好的 响应，故该压电免疫传感器可以对一定浓度范围内的触珠蛋白参考血清进行定量 分析。 第二部分：应用自组装技术，在石英晶振金电极表面自组一带羧基的巯基自 组单层膜，运用e d c 的作用，巯基自组单层膜的末端羧基同n h s 生成n h s 活泼酯中间体，它同蛋白质的伯胺配基反应形成的酰胺键，从而实现蛋白质分子 的共价固定。运用此方法在涂附有巯基自组单层膜的金电极表面固定了补体c ， 成分抗血清和高密度脂蛋白抗血清( h d l - a b ) ，研制了用于测定补体c ，成分和高 密度脂蛋白含量的压电免疫传感器，研究了它们的测定条件，比如巯基丙酸自组 时间、抗体稀释度、p h 值、离子强度等的影响以及单分子膜含水量的影响，实 验发现：在浓度2 3 4 2 3 2m g l 的范围内。补体c ，成分的含量与频率有很好的 线性关系：在浓度1 6 3 3 2 6m g l 的范围内，高密度脂蛋白的含量与频率有很好 的线性关系。产、， 塑堕盔堂坌堑些堂堡主堡壅 奎墨! 塑! 兰! 旦 一 s t u d i e s0 np i e z o e l e c t r i ci m m n n o s e n s o r f o rs e l f - a s s e m b l e d m o n o l a y e r st e c h n i q u e s ( a b s t r a c t ) b i o l o g i c a ls e n s o r s ，o rb i o s e n s o r s a l eam e a s u r i n gd e v i c e s ，w h i c hi n c o r p o r a t e b i o l o g i c a l l y a c t i v e s e n s i n ge l e m e n t s w i t he l e c t r o n i ct r a n s d u c e r s t h u s ，b i o s e n s o r s h a r n e s st h e b i o l o g i c a lr e c o g n i t i o np r o c e s s e sc r e a t e dt h r o u g he v o l u t i o n s ，p r o v i d i n g e n h a n c e ds e l e c t i v i t yc a p a b i l i t i e s t h eb i o l o g i c a lc o m p o n e n ti n t e r a c t sw i t ho rs e n s i n g s u b s t a n c eb e i n gi n v e s t i g a t e d t h et r a n s d u c e rr e c o g n i z e st h es i g n a la n dc o n v o r t st h e b i o l o g i c a le v e n ti n t oar e s p o n s et h a tc a nf u r t h e rp r o c e s s e da n dd i s p l a y e d ，s u c ha sa d i g i t a lo u t p u t av a r i e t y o fb i o l o g i c a lc o m p o n e n t s ( i n c l u d i n ge n z y m e s ，a n t i b o d i e s ， a n t i g e n s ，n u c l e i ca c i d s ，i s o l a t e dr e c e p t o r s ，w h o l ec e l l s ，m i c r o o r g a n i s m s ，a n dp l a n to r a n i m a lt i s s u e s ) h a v eb e e na p p l i e dt os e n s i n g s y s t e m i t i san e wb r a n c ht ob a n dp i e z o e l e c t r i cc h e m i s t r ya n db i o l o g i c a l s e n s i n g t e c h n o l o g y p i e z o e l e c t r i cs e n s o r sa r eh i g h l ys e n s i t i v et om u l t i p l es i g n a l ss u c ha st h e s u r f a c em a s sa n dt h ed e n s i t y , v i s c o s i t y , c o n d u c t i v i t y ，d i e l e c t r i ce f f e c to ft h el i q u i d t h e p i e z o e l e c t r i cs e n s o r sa r ee s p e c i a l l y s u i t a b l ef o ra n a l y s i so ft h ep r o t e i n sw i t hh i g h m o l e c u l a rw e i g h t w h e nt h ea n t i g e n ( b r i e fn a m e da g ) i n v a d e di n t ot h eo r g a n i s m ，a n d t h eb o d yc o i l p r o d u c eak i n d o fm a t e r i a l ( h i g hm o l e c u l a rw e i g h tp r o t e i n ，n a m e d a n t i b o d y , b r i e f n a m e da b ) t h a t c a nd i s t i n g u i s ht h i sa n t i g e na n de v a c u a t ei t ，t h ea n t i g e n a n da n t i b o d yt a k e p l a c e t h e i m m u n e r e a c t i o n u s i n gt h e i rh i g h l ys e n s i t i v i t y t o r e s p o n s e m a s s c h a n g e a n d s p e c i f i c i t y , i t c a nb ef a b r i c a t e da p i e z o e l e c t r i c i m m u n n o s e n s o r s s i n c e8 0 s ，r a p i dd e v e l o pa n dm o r ea t t e n t i o nt ot h ep i e z o e l e c t r i c i m m u n e - a n m y z e a sar u l e ，t h ei m m u n o s e n s o r si st oc o a tt h es u r f a c eo fc r y s t a lw i t h a n t i b o d i e so r a n t i g e n s ，i m m e r g e t om u s t e r s o l u t i o n ，b i n d i n g t ot h ei m m o b i l i z e d a n t i g e n so ra n t i b o d i e sa n dt a k ep l a c ei m m u n e - r e a c t i o n ，c a nc a u s eaf r e q u e n c yc h a n g e o f t h e q u a r t zc r y s t a l ，a n dt h ef r e q u e n c yc h a n g e sa r ep r o p o r t i o n a lt oc o n t e n to f a n t i g e n s 4 塑塑查兰坌塑些堂堡主丝塞 奎苎! 旦里! ! 鱼旦 o ra n t i b o d i e si n m u s t e rs o l u t i o n t h e p i e z o e l e c t r i c i m m u n o s e n s o r sa r e h i g h l y s e n s i t i v i t y ；e a s et od ! g i t i z ea n dr e a l - t i m eo u t p u t i tc a no n - l i n e ，c o n t i n u o u sd e t e r m i n e ， e a s et oc o m b i n ew i t ht e c h n i q u e so ff l o w i n j e c t i o na n a l y z ea n dr e a l i z et oa u t o m a t i o n s op i e z o e l e c t r i ci m m u n n o s e n s o r si sg r a d u a l l ya p p l i e dt os o m ef i e l d ss u c ha sb i o c h e m i c a lr e s e a r c h ，c l i n i c a la n a l y z e ，e n v i r o n m e n ta n di n d u s t r yp r o c e s sa s s a y a c c o r d i n g t od i f f e r e n tm e t h o do fi m m o b i l i z e da n t i g e n so ra n t i b o d i e s ，d e v e l o p e d s o m en e wp i e z o e l e c t r i ci m m u n n o s e n s o r st od e t e r m i n ep r o t e i n si nc o n s u l ts e r u m t h e d e t a i l e di n v e s t i g a t i o n sa r ea sf o l l o w s ： t h ef i r s tp a r to ft h ef o c u s e so nt h ed e v e l o p m e n to fp i e z o e l e c t r i ci m m u n o s e n s o r w h i c ht h ei m m o b i l i z a t i o no fa n t i b o d i e sw i t hp r o t e i naa n dt h es t u d y ，o nk i n e t i c so f i m m u n o r e a c t i o nu s i n gp i e z o e l e c t r i cq u a r t zc r y s t a l ，a n dt h es e c o n dp a r ti s p r i m a r i l y d i r e c t e dt ot h ed e v e l o p m e n to fp i e z o e l e c t r i ci m m u n o s e n s o rw h i c ht h ei m m o b i l i z a t i o n a n t i b o d yw i t hi e i f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r s ( s a m s ) t h ed e t a i l e di n v e s t i g a t i o n sa r ea s f o l l o w s ： t h ef i r s t p a r t o ft h ec o n s i s t so ft w o c h a p t e r s ( 1 ) t h ep i e z o e l e c t r i c i m m u n o s e n s o r sh a v eb e e nd e v e l o p e df o rd e t e r m i n a t i o no ft r a n s f e r r i n b yt a k i n g a d v a n t a g eo f t h es e n s i t i v i t yo f p i e z o e l e c t r i cq u a r t zc r y s t a lt ot h em a s so f t h em a t e r i a l s a d s o r b e do n t oi t u t i l i z i n gt h ei n t e n s i t ya d s o r b i n ge f f e c tb e t w e e nt h ep r o t e i naa n d g o l d e l e c t r o d e 。a n dt h a t ，t h ep r o t e i na c a nc o m b i n e dt h ea n t i b o d y sf c ，a n di ti sn o t i n f l u e n c et h ea c t i v eo fa n t i b o d y ap i e z o e l e c t r i ci m m u n o s e n s o rw a sd e v e l o p e db y i m m o b i l i z e d t r a n s f e r r i n ga n t i s e r u mo nt h es u r f a c eo fq u a r t zc r y s t a lt oe s p e c i a la n s w e r t r a n s f e r r i n g ，i tc a n b eg e ! g o o da n s w e rt od e t e r m i n e di nt h er a n g eo f 3 9 2 7 9 m g l ；t h e a d s o r p t i o na n dd e s o r p t i o no fc o n s u l ts e r u mo nt h eq u a r t zc r y s t a lm o n i t o r e dw i t ht r - a n t i b o d y , d e t e r m i n e dt h er a t ec o n s t a n to f i m m u n o - r e a c t i o nw a s 2 1 4 x 1 0 7 ( t o o l l ) x s 一 t h ea s s o c i a t i o nc o n s t a n to ft h ei m m u n o - r e a c t i o n ( k ) w a s6 7 5 x 1 0 7 ( m o l l ) t h e k i n e t i ce q u a t i o no ft h i sr e a c t i o nw a sd e r i v e d ( 2 ) s i m i l a r l y u t i l i z i n gt h e i n t e n s i t y a d s o r be f f e c tb e t w e e nt h ep r o t e i naa n dg o l d e l e c t r o d e ，ap i e z o e l e c t r i ci m m u n o s e n s o r w a sd e v e l o p e db yi m m o b i l i z e dh a p t o g l o b i n ( h p ) a n t i s e r u mo nt h es u r f a c eo f q u a r t z c r y s t a lt oe s p e c i a la n s w e r , i tc a nb eg e tg o o da n s w e rf o rt h ed e t e r m i n a t i o no f l i pi nt h e r a n g eo f 1 2 7 - 3i 7 m g i l l 湖南大学分析化学硕士论文李丹2 0 0 1 年6 月 i nt h es e c o n dp a r t ：s e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r s ( s a m s ) w i t h e a r b o x y lg r o u p sw e r e c o a t e do nt h e g o l d e l e c t r o d e so ft h e q u a r t zc r y s t a l r e s o n a t o r s b ya d s o r p t i o n o f m e r c a p t o p r o p i o n i ca c i d ( m p a ) t h ea l b u m i nm o l e c u l ew a s t h ec o v a l e n t l ya t t a c h e dt o t h ec r y s t a ls u r f a c ev ae d ca n dn h s t h er e s u l t ss h o wt h a tt h es a m s - c o a t e d q u a r t z c r y s t a l h a sab e t t e r o s c i l l a t i n g b e h a v i o ri n a q u e o u ss o l u t i o n s t h ep i e z o e l e c t r i c i m m u n o s e n s o r sw e r ed e v e l o p e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no ft h ec 3s e r u m ( c 3 ) a n dh i g h d e n s i t yl i p o p i o t e i n ( h d l ) ，t h ee f f e c to fe x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n ss u c h8 5t h et i m eo f m e r c a p t o p r o p i o n i c a c i dt o s e l f - a s s e m b l e d ，t h ea n t i b o d yd i l u t i o nr a t i o ，p h ，i o n i n t e n s i o na sw e l l t h ec o n t e n to f w a t e ri nm o n o l a y e r so nt h ef r e q u e n c y r e s p o n s ew e r e i n v e s t i g a t e d t h eq c m i m m u n o s e n s o rh a v eav e r yg o o dl i n e a r i t ym i n i o ni nt h er a n g e o f 2 3 4 - 2 3 2 m g lt od e t e r m i n ec 3s e r u m ，t h ep i e z o e l e c t r i ci m m u n o s e n s o rc a nd e t e c t t h eh d li nt h er a n g eo f1 6 3 3 2 6 m g l 6 湖南大学分析化学硕士论文李丹2 0 0 1 年6 月 绪言 压电化学与生物传感是一门新兴的分支学科，它利用以压电材料为基体的体 声波器件在厚度剪切模式振荡过程中与周边环境的相互作用，由器件超高频声波 的声电阻抗谱、频谱或相位等参数变化来对环境介质包括质量、粘弹性、导纳、 介电或流变特性、离子溶剂传输的物理、化学性能做出相关应答并转换成相应 传感检测信号，获取有关信息，以求得到对象的全面、动态、实时或在位的描述， 用于化学、生物学、药学、临床医学和环境科学等领域的传感检测【l 】。在众多的 化学与生物传感器中，压电质量传感器以其独特的特点颇受欢迎。应用于很多方 面。研究表明，研制简单、成本低廉的化学与生物传感器将比复杂的传统技术更 具实际应用价值。 压电传感技术作为一种新兴的高灵敏度传感技术，除能响应石英晶体表面的 质量变化外，溶液的粘度、密度、介电常数、电导率等多种实验参数也与其有关 z l 。由于其仪器装置价廉、操作简便、灵敏度高、能快速检测、可精确定量、可 数字化、能方便地实现实时输出，因此是一种理想生物传感器件。早在1 9 7 2 年， s h o n s 等口】便将压电石英晶体用于溶液中抗体活性的测定。自八十年代压电晶体 在液相振荡获得成功后，压电免疫分析已引起了人们的广泛关注并得到了迅速发 展，其应用涉及环境监测、药物分析、生命物质测试等多个领域口“i 。 1 压电传感器基本原理 生物传感器( b i o s e n s o r s ) 是一种结合生物活性物质和传感器件的测量装置， 生物传感器利用生物分子的特异性识别功能，使这类传感器具有很好的选择性， 很多种类的生物组分( 包括酶、抗体、抗原、核酸、独立受体、完整的细胞、微 生物、动植物组织) 已被用于生物传感体系，各种信号传感装置的包括电化学、 光化学、热化学和声学的传感器件等。生物敏化层，传感器件及检测环境等条件 决定了生物传感系统的整体应用性和灵敏度【”。通常，压电效应多发生在缺少对 称中心的晶体中，许多类型的晶体都具有压电效应。而石英的电学、机械和化学 7 湖南大学分析化学硕士论文李丹! 里旦! 生曼旦 特性使它成为分析应用中最常见的晶体类型。压电传感装置根据声波类型的不同 主要可分成两类【5 ：一类为体声波传感器( b a w ) ；另一类为表面生成声波传感器 r s g a w ) 。通常所研究的传感器为体声波传感器，都在压电基体内部传播，与压 电材料的相对表面的外部环境发生作用，而表面生成声波直接沿压电基体表面传 播或者在表面附近传播或邻近的液相中传播，在基体表面各种被测物的轻微扰动 均可与表面生成声波发生作用。但是，一般表面声波及一些具有较大剪切纵向位 移的声波传播能耗很高，这种在液相中纵向位移成分造成的高能量损失不利于 这些传感器在液相中应用【6 】。目前，有关压电声波传感器的应用研究仍主要集中 在厚度剪切模式( t s m ) 体声波传感器方面，对分析仪器尤其重要的是共振频率与 晶体总质量之间的比例关系，t s m 振动是对质量改变最敏感的模式。a t 切割的 晶体( a t - 切割的晶体是指与z 轴成3 5 。1 5 切割的石英片，它的温度系数几乎 为0 ，这表明在相当宽的温度范围内其振动频率稳定) 定向完全以t s m 模式振 动i q 。本论文提及的压电传感技术即指这种以a t 切割的石英晶体的t s m 体声 波传感技术。下面简单介绍一下有关压电传感技术的一些基本原理。 1 1 压电石英晶体传感器气相传感原理 1 9 5 9 年，s a u e r b r e y 7 】推导出p q c 上气相物质沉积的质量敏感性的经验方 程： 盯：一三垒。坐( 1 ) t p q p q a 其中a f 为检测到的频率飘移( h z ) ，f q 为石英晶体的基频( h z ) ，p q 为石英 晶体的密度( 2 6 4 8g c m 3 ) ，为石英晶体的剪切模量 2 9 4 7 l o “8 ( c ms 2 ) 】，a 为 石英晶体的面积( c m 2 ) 。把常数p q 和h 代入后，导出了适于a t 切型压电石英晶 体的关系式： a f = - c l a m( 2 ) 式中c l = 2 2 6 x 1 0 f 。2h zc m 2 g ，a m = a m a 为石英晶体表面单位面积上的质 量变化( g c m 2 ) 。 从式( 2 ) 可知，f 与a m 之间存在一个线性关系，这个简单的关系式便成了压 电传感器定量测试应用的理论依据。对于一个9m h z 的石英谐振器( 电极直径为 6m m ) 来说，其质量灵敏度约为0 6 6h z n g 。由此可见，石英晶体谐振器可用做 非常灵敏的质量检测工具，常称为石英晶体微天平( q c m ) 。每单位面积的石英晶 8 湖南大学分析化学硕士论文 李丹2 0 0 1 年6 月 体表面质量改变的同时也改变了共振频率，这就是p q c 分析应用的基础。但分 析物物理或化学吸附到p q c 表面时，它增加了石英晶体的质量，质量的改变即 被晶体振动频率的相应改变所确认。 近年来气相检测机制的发展集中在用有机化合物或生物物质修饰晶体表面。 1 9 8 3 年，g u i b a u l t 1 第一次应用气相直接检测，其中酶涂覆的p q c 用来检测气 相甲醛，n g e h n g w a i n b i 9 】等通过涂覆抗体的p q c 引入了气相免疫传感。w u 和w a n g m i 把嗅觉受体蛋白质固定在p q c 表面上通过检测液上气体对高粱酒进 行了质量评估。因此，p q c 在气相中的物质传感已是一门比较成熟的技术，正 用于广泛的科研和工程检测。 1 2 压电石英晶体传感器液相传感原理 在s a u e r b r e y 理论方程的基础上，经k i n g “】和g u i l b a u l t ”】等的工作，压电 传感器被广泛用于气相分析，主要是大气污染的监测。但是，p q c 生物传感应 用的重心是液相传感，由于压电声波在液相中的能耗大，压电传感器于液相中的 发展却比较缓慢，直到八十年代，液相压电传感器才得以迅速发展。 1 9 8 0 年，k a n a s h t m 和n o m u r a “i 第一次尝试用声学装置做液相传感器，他 们分别使用压电晶体单面接触溶液获得成功，而且n o m u r a 等第一次尝试定义液 相压电传感，p q c 在空气中的共振频率与整个晶体浸没在溶液中的频率响应进 行了比较，提出了液相中谐振频率变化是由溶液的密度及电导率变化引起的。尽 管该结论与实验结果能较好的吻合。但其缺点亦很明显，由于它不是建立在物理 模型的基础上，所以对每个不同的压电石英晶体均具有不同数值。 1 9 8 5 年，b r u c k e n s t e i n 和s h a y ”】，k a n a z a w a 和g o r d o n1 1 6 等分别提出了能 预测浸入液体介质中压电石英晶体频率变化的两个简单物理模型。k a n a z a w a 和 g o r d o n 等将压电石英晶体看成无能耗的弹性固体，将溶液看成纯粘性流体，在 不考虑石英晶体与液相间界面效应影响情况下，假设与p q c 接触的液体在p q c 表面形成了一个粘性边界层，此层质量被看作p q c 上的附加质量负荷，其质量 决定于溶液的粘度和密度。因此，频率改变再一次与溶液的粘度和密度的乘积有 关。 m a r t i n ”】等考虑了石英晶体表面吸附层和接触的牛顿流体的同时作用，应用 连续机电耦合模型，在质量和溶液性质作用都比较小的情况下，描述了质量作用 9 湖南大学分析化学硕士论文李丹 2 0 0 1 年6 月 的影响，等价于s a u e r b r e y 方程，等价于k a n a z a w a 和g o r d o n 关于石英晶体谐振 器于液相中的振动行为关系式。 姚守拙【l s l 等提出的液相压电传感器振荡频率理论指出液体的各物理参数包 括液体的密度、粘度、介电常数等对频移的影响，同时还发现溶液的电导也影响 p q c 的频率响应 现在，由于在液相中，响应很大程度上决定于p q c 表面涂附层与液相环境 之间形成的精确界面结构，如果溶液不是高粘度的，仅有一个电极与溶液接触， 实验结果将与b r u e k e n s t e i n 和s h a y , k a n a z a w a 和g o r d o n 等所预料的吻合。 总之，s a u e r b r e y 证明p q c 的频率决定于p q c 的物质参数和它的总质量f 1 ”。 这适用于气相沉积的刚性层行为。近年来溶液传感的进展表明流体动力层的粘弹 性与物质沉积影响频率响应，在液相中振动时，液层由于粘性阻力随p q c 振荡 而移动。 2 压电免疫传感技术研究进展 把压电效应应用于生物传感器就形成压电免疫传感器。由于r o e d e r e r 和 b a s t i a n n s l 2 q 最早提出液相压电免疫测定，用修饰了羊抗人i g g 抗体的表面声波 ( s a w ) 装置对o 0 2 2 5 - 2 2 5m g m l 浓度范围内的i g g 进行了测定，首次报道 了石英晶体微天平成功地在液相中的起振，实现了石英晶体微天平技术的一个重 大突破，从而开辟了其在液相环境研究的新领域，也更有利于进行生命活动的研 究。免疫分析、d n a 探针以及细胞生长的检测等多方面的研究都应用了这项技 术。这样，压电免疫传感器很快成为生物传感器的研究热点之一。 压电免疫传感技术一般是在压电石英晶体表面先固定上抗原抗体，响应抗原 抗体特异性免疫反应结合的待测物质引起的质量、密度和粘度等性质的变化。压 电免疫传感技术通常使用在石英晶体表面先修饰了抗原( 抗体) 的实验方法。一种 方法是测量修饰了抗原或抗体的石英晶体在气相干燥时的频率，然后浸入待测溶 液中温育反应一段时间，使待测物质与石英晶体表面修饰的抗原( 抗体) 充分结 合，当待测物和修饰在压电石英晶体上的抗原( 抗体) 相互作用时，就能够物理 地或化学地吸附在压电石英晶体上，因此增加了总质量，将晶体洗涤干燥后，测 量免疫反应前后的石英晶体的谐振频率变化。这种方法能定量测出固定抗原抗体 和反应结合的待测物质的量，因而该方法除了能测量待测物浓度、活性外，尚可 1 0 湖南大学分析化学硕士论文李丹 2 0 0 1 年6 月 用于免疫反应热力学常数的测量。该方法的缺陷在于测量过程中需多次洗涤、干 燥，比较繁琐。而且不能提供适时数据。另一种是液相压电免疫传感技术，它弥 补了上述的不足，将抗原( 抗体) 修饰的石英晶体置于检测池中直接响应结合的抗 体( 抗原) 引起的质量及界面粘弹性变化，可适时监控免疫反应过程，但非特异 性吸附较严重。 2 1 压电免疫传感器中抗原抗体的固定方法 免疫反应【2 l 】有多种多样，参与反应的分子种类更多，这就决定了其在振荡表 面的固定化形式有很多种。这些固定化过程也是一种电极表面的修饰过程，但它 又有自身的特殊要求：修饰层粘弹性越低越好( 理想状态是刚性层) ，生物相容 性好。减少非特异性吸附等；而且固定化层的形成与电极材料、电极表面状态的 关系密切( 受温度、溶液性质等因素的影响) ，不同的电极材料决定不同的固定 方法。综上所述：压电免疫传感器制作中，抗原抗体固定是影响传感器性能的一 个重要因素。抗原抗体的固定方式、数量及活性等直接影响传感器的重现性、检 测限、灵敏度及循环使用等性能。通常将生物分子固定于石英晶体电极表面或石 英晶体表面的惰性载体涂层主要有以下几种基本方法【2 2 1 ：( 1 ) 直接固定法，( 2 ) 戊二醛交联，( 3 ) 硅烷化连接法，( 4 ) 聚合物膜连接法，( 5 ) 非特异性吸附蛋白 间接固定法，( 6 ) 自组装单分子层( s a m s ) 技术，( 7 ) l b 膜技术，( 8 ) 生物紊亲 和素体系( b a s ) 。在许多情况下，可联合使用这些方法不管是那种操作，都 应在修饰之前清洗电极表面，以便除去任何可能干扰修饰过程的物质。 直接固定法一般是将电极用含生物分子的溶液涂覆或浸泡，从而使电极表面 生成具有识别功能的生物膜h a n e v e l d 2 4 】等通过物理吸附作用在镀金晶片表面固 定上葡萄球菌肠毒素b ( s e b ) ，用抗原抗体竞争反应来检测s e b 含量。m u r a t s u g u 2 q 等在研究人血清白蛋白( h a s ) 检测中也用到了抗h a s 抗体固定法。一些细胞 生长过程的动态监测也是将细胞吸附固定在电极上来进行的口6 1 直接固定法步 骤简单、快速，但是适应性不好，许多生物分子直接固定后会导致特异性反应不 能发生1 2 7 】，而且在固定过程中应注意非特异性吸附、脱附的发生。一般在固定化 后使用牛血清白蛋白( b s a ) 等惰性蛋白封闭非特异性吸附位点以减少干扰。 s h o n s 2 】将n y e b a rc 涂敷在石英晶体表面，用戊二醛交联固定了牛血清白蛋 白( b s a ) ，制各了第一个压电免疫传感器。随后，许多研究工作者利用交联方法 2 8 - 3 2 1 、硅烷试剂共价键合1 3 3 4 0 等研制成各种压电生物传感器。 湖南大学分析化学硕士论文李丹2 0 0 1 年6 月 硅烷化法是一种比较成熟、应用较多的方法。一般过程是：先使电极表面氧 化，然后与水等作用，形成富含- o h 的活性表面。例如：p d 、a l 电极的使用是 为了使电极表面氧化层容易得到，然后使用硅烷化试剂( 常用2 5 的t - 氨丙基 三乙氧基甲硅烷( a p t e ) 试剂的丙酮溶液) 得到含氨基或羟基的活性表面，最 后再直接进行生物体系的固定或使用双功能交联剂( 如戊二醛等) 连接p “。 y a m a g u c h i 等】用3 缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷( g p t m s ) 修饰电极表面， 然后与水生成富含羟基的表面，研究了d n a 通过氢健在其表面上的固定和通过 碳二亚胺共价键合在其表面的过程。t h o m p s o n 等l ”硼g p t m s 修饰铝电极表面， 以固定i g o 等蛋白。 电极表面的聚合物膜可以采用聚合物涂覆法和单体在电极表面的现场聚合法 来生成。在涂覆法中的应用主要采用聚乙烯亚胺( p e i ) 4 3 5 9 、甲基丙烯酸羟乙酯 和甲基丙烯酸甲酯共聚物( h e m a - m m a ) 阶”】、聚苯乙烯等。这些方法的 不足之处在于大多采用涂敷成膜技术。一般须一个液相到气相的成膜过程，膜厚、 均匀性较差或附着力不强，尤其在气相免疫测定中，如果测量过程中洗涤时间或 强度不均一，都会导致抗体( 抗原) 固定量的变化，从而使重复性、循环使用及灵 敏度等都受到影响。 非特异性吸附蛋白间接固定法是利用一些蛋白如：蛋白a 、蛋白g 和b s a 等可以紧密牢固地吸附在电极上( 主要是金电极) ，而且本身又可以结合或标记 上生物物质的特点来实现的。这种方法具有生物毒性小的优点，对活体测定有很 大的潜力。例如蛋白a ，它可以较牢固紧密地吸附在金电极上，而且蛋白a 一 般与抗体的f c 段结合而不影响抗体活性。蛋白a 与免疫球蛋白i g g 进行特异结 合，那么蛋白a 修饰电极可以用来直接测定免疫球蛋白i g g 等【“。5 】。 近年来，随着膜科学技术的不断进步，一些新的成膜技术开始用于压电免疫 传感器载体膜制备。l b 膜技术在生化研究中具有重要的作用，它在压电传感器 研究中可以直接固定作为受体膜，也可以用作其他物质的固定层，如蛋白质【“j 、 d n a 等。o k a h a t a 等 s t 】在银电极表面修饰上l b 膜，用来检测水溶液中具有生物 活性的化合物如：苦味、香味以及抗生紊等物质与类脂膜的选择性吸附作用。 e b a t o ! ”】等应用l b 成膜技术，将荧光素类酯用磷酯酰乙醇胺( d p p e ) 直接沉积到 压电石英晶体表面，并对抗荧光素i g g 抗体以及其f a b 片段与荧光素类酯结合的 湖南大学分析化学硕士论文 李丹2 0 0 1 年6 月 平衡键合曲线和动力学测量进行了定量分析和比较，这种l b 膜较通常的涂敷成 膜在成膜均匀性上有较大的改善。 巯基自组单层膜技术- “】是一种发展较成熟的成膜技术。应用它可以在电 极表面获得致密有序的单分子层，而且分子另一端可以带上不同的活性功能团， 因而可适用不同的修饰电极的要求。在压电传感器的研究中，金电极表面上硫醇 分子的应用很多【6 一一】，主要有两种途径：可以选择带合适的功能团( 如n h ：， c o o h ，o h 等) 的硫醇先进行自组装，然后再通过活性功能基团来固定抗体等； 也可以先将生物分子标记上巯基集团，最后通过自组装来达到固定的效果。如 g e d d e s 等【“】先用1 2 巯基十二烷基醇修饰金电极。经溴乙酸处理后，再用碳二亚 胺活化来连接i g g ，研究i g g 抗体的作用巯基自组单层膜已引起越来越多的 传感器工作者的注意，并已有一些巯基自组单层膜用于抗原抗体固定的报道 【6 7 粥。 生物紊和亲和素自7 0 年代引入免疫化学之后，形成了具有发展前途的b a s 体系【7 0 】。由于生物素与亲和素结合速度快、结合物稳定性高，生物素分子易于活 化，与蛋白质分子偶联率高而且不影响抗体的生物活性；而且此体系运用方式灵 活多变，适于不同的设计要求。近年来，b a s 在压电免疫传感器研究中应用颇 多，主要是b a s 本身的固定化问题以及应用b a s 固定生物物质的研究。由于b a s 具有高稳定结合性等特点，因此在压电免疫传感器中，应用b a s 可以提高生物 物质或体系的固定化效率。而且对于压电免疫传感器，b a s 在获得可更新的电 极表面或晶片重复利用等方面更具一定的潜力。 2 2 压电免疫传