（分析化学专业论文）基于纳米材料为基质固定生物分子的免疫传感器研究.pdf

y 1 0 1 5 9 3 2 基于纳米材料为基质固定生物分子 的免疫传感器的研究 分析化学专业博士研究生张凌燕 指导教师袁若教授 摘要 乙脑是由乙脑病毒引起、经蚊传播的人畜共患的中枢神经系统急性传染病患者愈后 不好。或者因呼吸衰竭而死亡：而先天性风疹综合症是胎儿时期就感染风疹病毒，该病毒可 导致胎) l , l b 生后高血压、先天性心脏病、脑炎、智力障碍等，严重危害人类接种流行性乙 型脑炎疫苗或风疹疫苗是人类预防这两种传染性疾病的强有力武器，而此两种疫苗的效价直 接影响接种效果目前，检测乙脑、风疹疫苗的方法主要有细胞培养感染剂量法、血凝抑制试 验、动物法、蚀斑减少中和试验法、酶联免疫吸附试验等前几种操作繁琐、灵敏度度低、 周期长、费用高、对操作者要求高，结果有一定的主观性，一般实验室难以操作而后者也 存在操作繁琐、特殊酶标记物不易获得、费用高等问题，因此急需寻求一种快速准确检测流 行性乙脑疫苗和风症疫苗效价的方法 以免疫分析技术为基础发展起来的免疫传感器，由于其技术具有分析灵敏度高、特异性 强、使用简便及成本低等特点大大地推动了免疫分析技术在医学、临床、生物、化学、环境、 农业、工业等方面的应用和发展在各种免疫传感器研究中，酶标记电流型免疫传感器因其 具有高度的特异性和极低的检出限而引起人们的兴趣酶标记电流型免疫传感器的原理主 要有竞争法和夹心法，通过检测标记物的量变监控免疫分析反应，该种类型的传感器非特异 性响应小，但检测过程较复杂、特殊酶标记物不易获得、费用高等问题，因此寻求具有灵敏 度高、快速、成本低、携带方便，操作简单、易数字化、能方便地实现实时输出和检测的无 酶标记电流型免疫传感器具有重要意义 以沉积在电极上的普鲁士蓝为氧化还原探针，利用电聚合技术及氨基与纳米材料强静 电结合作用，将纳米材料层层组装在普鲁士蓝修饰电极上利用其具有强吸附效应的特点将 抗体固定在电极上，然后用牛血清白蛋白封闭非特异性位点，最后以电极响应电流与抗原浓 度成反比的特性，制备了无酶标记的电流型免疫传感器；或以酶取代牛血清白蛋白封闭非特 异性位点，在固定过氧化氢浓度的条件下，直接测定抗原与抗体反应前后的电流变化，从而 制各了酶封闭非特异性位点的无酶标记电流型免疫传感器；或利用自组装、电聚合等技术， 制各了多层组装的电位型免疫传感器上述传感器利用纳米材料大的比表面积及良好的生物 兼容性，增大了固定在电极上的抗体量，并使抗体保持良好的生物活性，从而提高了传感器 的灵敏度此外，利用碳纳米管能促进酶直接电子转移的特点及复合纳米材料具有吸附定向 效应、吸附浓缩效应和量子尺寸效应，其比单独一种纳米颗粒更易于：形成连续势场，从而降 低电子在电极和固定化载体之间的迁移阻力，提高电子迁移率等优点，初步制得第三代电流 型免疫传感器 上述免疫传感器操作简单、灵敏度高、快速，可望作为一种生物制品效价检测的工具 本文第一部分详细研究了无酶标记电流型免疫传感器的研究 1 改变以往报道的电流型免疫传感器以酶标记，检测步骤复杂的缺点，将氧化还原性 很强的媒介体沉积在电极上，然后利用电聚合和层层组装技术组装纳米金，并以纳米材料特 殊的表面效应、量子尺寸效应和良好的生物相容性等性质固定了足量的抗体，并可使抗体保 持良好的生物活性，且因为纳米颗粒具有吸附浓缩效应，可以显著提高电极的电流响应的特 点，制备了基于双层纳米金聚邻苯二胺固定乙脑抗体并以普鲁士蓝为电子媒介体，再以牛血 清白蛋白封闭电极上的非特异性结合位点的无标记电流乙脑疫苗免疫传感器本章讨论了该 传感器制备时纳米金聚邻苯二胺层数、干扰等的影响，优化了反应时间、p h 、反应温度等 该传感器的线性范围1 1 1 0 - 8 _ 1 9 x 1 0 4 l gp f u m l ( 蚀斑单位) 2 详细研究了基于双层纳米银聚邻苯二胺固定抗体以普鲁士蓝为电子媒介体，并以牛 血清白蛋白封闭电极上的非特异性结合位点的无标记风疹疫苗免疫传感器通过循环伏安法 技术考察了电极表面的电化学特性，并对该免疫传感器的性能进行了详细的研究与传统风 疹疫苗效价检测方法的操作繁琐、灵敏度度低、周期长、费用高、对操作者要求高等缺点相 比，该免疫传感器具有灵敏度高、线性范围宽、响应时间快、稳定性好、可重复使用、选择 性高等特点 3 首次提出以辣根过氧化氢酶取代牛血清白蛋白封闭电极上的非特异性结合位点，制 各了双层纳米银聚邻苯二胺固定风疹抗体并以普鲁士蓝为电子媒介体的高灵敏风疹疫苗免 疫传感器该论文的特点是以辣根过氧化氢酶取代牛血清白蛋白封闭电极上的非特异性结合 位点，达到封闭非特异性结合位点的目的，又有放大电信号的功能，既是把电极上的位点充 分利用起来，制得的高灵敏免疫传感器 2 本文第二部分详细研究了无电子媒介体的电流型免疫传感器的研究 利用碳纳米管能促进酶直接电子转移的特点及复合纳米材料具有吸附定向效应、吸附浓 缩效应和量子尺寸效应，从而比单独一种纳米颗粒更易于形成连续势场，降低电子在电极和 固定化载体之间的迁移阻力，提高电子迁移率等优点，研究了以辣根过氧化氢酶封闭电极非 特异性结合位点而制各的辣根过氧化物酶抗体纳米金多壁纳米碳管修饰电极，其中利用 多壁纳米碳管的电化学特性及其对辣根过氧化物酶的直接电化学形为及共同对h 2 0 2 的电催 化，放大了电信号，提高电极的灵敏度及稳定性，从而初步制各制得第三代电流型免疫传感 器 本文第三部分详细研究了第三代酶传感器的研究 以固定在玻碳电极上的多壁纳米碳管为基底吸附辣根过氧化物酶，然后固定纳米金，最 后再结合一层辣根过氧化物酶，利用多壁纳米碳管对辣根过氧化物酶的直接电化学催化特性 及纳米金对蛋白质的强吸附能力及强的电子传导特性制备了第三代电流型酶传感器采用循 环伏安法，在无电子媒介体时，该传感器对h 2 0 z 仍能具有良好的催化活性，放大了电信号， 提高了该酶传感器的灵敏度：此外，不存在电子媒介体的渗漏与富积等问题，提高了电极的稳 定性实验证明该传感器在h 2 0 2 浓度为1 o x l o - 1 o x l 0 。m o l l 范围内有线性响应，线性相 关系数r 2 = 0 9 9 6 4 并探讨了电极的稳定性、寿命及重现性 本文第四部分详细研究了电位型免疫传感器的研究 1 尝试以层层自组装技术制备空间有序，纳米颗粒增大了固定的抗体量，且被纳米颗 粒吸附的抗体不易在测试溶液中流失，增加了蛋白质的稳定性，从而可提高检测灵敏度的原 理，研制了基于n a n o a u 增强多层自组装的电位型免疫传感器该传感器采用自组装和静电 吸附技术，先在电极上修饰一层薄膜。然后通过正负电荷静电吸附等技术将纳米材料固定在 电极上，构造了三明治n a n o - a u c o ( b p y ) _ | “电极，并以n a n o - a u 固定抗体的电位型乙脑疫苗 免疫传感器文中讨论了i i r r l o a u 粒子的优化离子强度、p h 的优化、回收率、重线性等 该传感器的线性范围8 1 x l o s 3 o x l 0 4 l g p f u m l e = 5 5 9 2 2 1 0 9 c 】+ 1 4 4 8 4 2 介绍了抗体固定在双层聚邻苯二胺金胶膜修饰的电极的电位型乙脑疫苗免疫传感 器的研究文中讨论了抗体固定方法选择、反应时间及p h 的优化、回收率等该传感器的线 性范围在i 1 1 0 8 2 0 x 1 0 6 l g p f u m l 关键词：电流型免疫传感器电位型免疫传感器电子媒介体无媒介体的电流型 传感器纳米材料 s t u d yo nt h ei m m u n o s e n s o rb a s e d o n b i o m o l e c u l ei m m o b i l i z e do nn a n o p a r t i c l e s a n a l y t i c a lc h e m i s t r yd o c t o rp o s t g r a d u a t e ：l i n g y a nz h o n g s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rr u o y u a n a b s t r a c t j a p a n e s ebe n c e p h a l i t i si sc a u s e db yt h ej a p a n e s ebe n c e p h a l i t i sv i r u s ap a t i e n t ，w h oi s i n f e c t e db yt h ej a p a n e s ebe n c e p h a l i t i sv i r u sw o u l dn o tc u r ee a s i l y , a n de v e nd i e j a p a n e s eb e n c e p h a l i t i se p i d e m i cs i t u a t i o nc a l lb ep r e v e n t e di fo n l yt h ed i f f u s i v er o u t ei sc u to f fb ys o m e m e a n s s u c ha sc l e a n i n gd e a da n g l ea n ds e e p e r ；d r e d g i n gc l o a c a e h o w e v e r , t h em o s te f f e c t i v e p r e v e n t i v em e a s u r ei s t oe n h a n c ei m m u n i t yo fh u m a naf e t u sw i l lh a v ee c t r o g e n yr u b e l l a s y n d r o m ei fh ei s i n f e c t e db yr u b e l l av i r u s ，w h i c hc o u l dc a u s em a n i f o l dm a c r o c e p h a l i at h a t i n c l u d e sc a r d i a cm u s c l em a n g l e ，e n c e p h a l i t i sa n dh y p e r t e n s i o n ，a n dt h el i k ea f t e raf e t u si sb o m t h u s ，i ti si m p o r t a n tf o rh u m a nb e i n g st oi n o c u l a t ea g a i n s tb o t hj a p a n e s ebe n c e p h a l i t i sa n d r u b e l l av a c c i n e a n dt h et w ou n i t sw i l ie f r e c ti n o c u l a t i o n t h e r ea r e ，f o ri n s t a n c e ，s o m em e t h o d st od e t e r m i n et h ec o n c e n t r a t i o no fj a p a n e s eb e n c e p h a l i t i sv a c c i n ea n dr u b e l l av a c c i n e ，s u c ha st h ep l a q u ef o r m i n gu n i t ，t h ec e l lc u l t u r e i n f e c t i o u sd o s e ，t h ea n i m a lt e s t i n g t h ef o u rm e t h o d sm e n t i o n e da b o v ea r es e m i q u a n t i t a t i v e a n a l y s e sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no f t h e s ev a c c i n e s ，a n de x h i b i tt h ed r a w b a c ko fl o ws e n s i t i v i t y , l o n g - t i m e ，h i g hc o s t ，t h ec o m p l e xo fo p e r a t i n gs t e p s ，a n ds o m e t i m e si tw i l lr e s u l tw i t hs u b j e c t i v i t yo f o p e r a t o r t h u s ，i ti si m p o r t a n tt od e v e l o ps i m p l e ，s e l e c t i v e ，f a s t , s e n s i t i v ea n dc h e a pm e t h o d sf o r t h ed e t e r m i n a t i o no f b o t hj a p a n e s ebe n c e p h a l i t i sv a c c i n ea n dr u b e l l av a c c i n e i m m u n o s e n s o r s ，b a s e do nc o n v e n t i o n a li m m u n o a s s a yt e c h n i q u e st h a ta r ec h a r a c t e r i z e db y t h ef e a t u r e sa ss i m p l e ，s e n s i t i v e ，a n dd i r e c td e t e c t i o nt e c h n i q u e sa n dr e d u c t i o n si ns i z e ，c o s ta n d t i m eo fa n a l y s i s ，i m p u l s et h ea p p l i c a t i o na n d d e v e l o p m e n to nc o n v e n t i o n a li m m u n o a s s a y t e c h n i q u e si nf o o di n d u s t r y , e n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n g ，b i o t e c h n o l o g y , p h a r m a c e u t i c a lc h e m i s t r y 4 a n dc l i n i c a ld i a g n o s t i c s a m o n gt h e s ei m m u n o s e n s o r s ，t h ea m p e r o m e t r i ei m m u n o s e n s o r sh a d a t t r a c t e dm o r ei n t e r e s t sr e c e n t l yf o rah i g h e rs e n s i t i v i t ya n dl e s sc o m p l i c a t e di n s t r u m e n t a t i o n h o w e v e r , a m p e r o m e t r i ci m m u n o s a n s o r sr e q u i r el a b e l i n go fe i t h e ra n t i g e no ra n t i b o d y , s i n c et h e t w or e a c t i o np a r t n e r sa r ee l e c t r o c h e m i c a l l yi n e r ta n dt h el a b e l i n ga m p e r o m e t r i ci m m u n o s e n s o r s w i t hl o n gp r e p a r a t i o nt i m e sa n dm o r er e a c t i o ns t e p sa r en e e d e d 。t h u s ，s e a r c h i n gf o ral a b e l f r e e ， s i m p l ea n ds e n s i t i v ea m p e r o m e t r i ci m m u n o s e n s o ri so f c o n s i d e r a b l ei n t e r e s ti no u rt e s t i nt h i st h e s i s ，al a b e l f r e ea m p e r o m e t r i ci m m u n o s e n s o ri s p r e s e n t e dw i t hb s ab l o c k i n g u n s p e c i f i cs i t e s p r u s s i a nb l u e ( p 8 ) a sa ne l e c t r o n i cm e d i a t o ri sd e p o s i t e do na ne l e c t r o d e ，t h e n m u l t i l a y e rn a n o p a r t i c l e sa r ea s s e m b l e do nt h em o d i f i e de l e c t r o d eb ye l e c t r o p o l y m e r i z a t i o n t h c h n i q u ea n dt h ee f f e c to fs t r o n g l ye l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o nb e t w e e nn a n o p a r t i c l e sa n da m i n o g r o u p s ，a n dt h e na n t i b o d yc o u l db eg r a f t e d0 nt h en a f i o - p a r t i c l e sf o rw i t he f f e c to fs t r o n g a d s o r p t i o n o ra l a b e l f r e e a m p e r o m e t r i ci m m u n o s e n s o r i s p r e s e n t e d w i t hh r pb l o c k i n g u n s p e c i f i cs i t e s a taf i x e dc o n c e n t r a t i o no fh 2 0 2 ，a n t i g e ni sr e a c t e dw i t ht h ea n t i b o d yl i n k e do n t h ee l e c t r o d e ，a n dt h ea m p e r o m e t r i cr e s p o n s ed e c r e a s e d t h u s ，t h ev a r i o u sv a l u eo f a m p e r o m e t r i c r e s p o n s e ( i ) a r ead i r e c tp r o p o r t i o nt ot h ec o n c e n t r a t i o no fa n t i g e n o ran o v e lp o t e n t i o m e t r i c i m m u n o s e n s o rc a nb ed e v e l o p e db a s e do ns e l f - a s s e m b l ya n de l e c t r o p o l y m e r i z a t i o nt h c h n i q u e a l l s e n s o r sm e n t i o n e da b o v ea r ew i t hh i g l is e n s i t i v i t yf o rn a n o - p a r t i e l e si n c r e a s ea ne f f e c t i v es u r f a c e a r e at oi m m o b i l i z ea n t i b o d y , w h i c he x h i b i t st h eh i i g h e ra c t i v i t y m o r e o v e r t h et h i r dg e n e r a t i o n i m m u n o s e n s o ri ss t u d i e di nt e r n so fc o m p o u n d so fn a n o - p a r t i e l ee x h i b i t se x c e l l e n tc a t a l y t i c a c t i v i t yt h a na n yo n en a n o - p a r t i c l ea l o n e t h em a j o rc o n t e n t so f t h i st h e s i sa r ea sf o l l o w s ： p a r to r e ：r e v i e w so ft h ed e v e l o p m e n ta n da p p l i c a t i o no ft h ea m p e r o m e t r i cb i o s e n s o ra n d n a n o p a r t i c l e si nr e c e n ty e a r s p a r tt w o ：t h es t u d yo nl a b e l f r e ea m p e r o m e t r i ci m m u n o s e n s o r s ( 1 ) i nc h a p t e ro n e ，al a b e l f r e ea m p e r o m e t r i ci m m u n o s e n s o rf o rf a s ta n ds e n s i t i v ea s s a yo f j a p a n e s ebe n c e p h a l i t i sv a c c i n ei sp r e s e n t e d a n t i s e r u mo f j a p a n e s ebe n c e p h a l i t i si si m m o b i l i z e d o n b i l a y e rn a n o - a u o p h e n y l e n e d i a r a i n ep o l y m e rf i l m w i t h d e p o s i t e dp r u s s i a nb l u ea sa n e l e c t r o n i cm e d i a t o ro nt h ep te l e c t r o d ea n db s ab l o c k i n gu n s p e c i f i c s i t e s t h ei m m u n o s e n s o r e x h i b i t sh i g hs e n s i t i v i t yf o rl l a n o a ui n c r e a s ee f f e c t i v es u r f a c ea r e at oi m m o b i l i z ea n t i b o d y , w h i c h e x h i b i t sh i g h e rb i o l o g i c a la c t i v i t y m o r e o v e bt h ec o m p o u n d so fn a n o p a r t i c l ee x h i b i t se x c e l l e n t 5 c a t a l y t i ca c t i v i t yt h a na n yo n en a n o - p a r t i c l ea l o n e t h ei m m u n o s e n s o rm a n i f e s t s a s p e c i f i c r e s p o n s et oj a p a n e s ebe n c e p h a l i t i sv a c c i n ei nt h er a n g e l 1 1 0 - s _ 1 9 x 1 0 6i gp f u m l ( p f u m li s p l a q u ef o r m i n gu n i ta n dl gi sc o m m o nl o g a r i t h m ) w i t had e t e c t i o nl i m i to f 6 x 1 0 4 i gp f u m lt h e c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n ti s0 9 9 5 5 t h ei n c u b a t i o nt i m e ，i n c u b a t i o nt e m p e r a t u r e ，p h ，r e p r o d u c i b i l i t y a n ds t a b i l i t yo ft h ei m m u n o s e n s o ra r ea l s os t u d i e d t h ep r e s e n tw o r ks u p p l i e sap r o m i s i n gt e s t m e t h o df o rb i o l o g i c a lp r o d u c t s ( 2 ) i nc h a p t e rt w o ，ag e n e r a li n t r o d u c t i o nt oan o v e ll a b e l f r e ea m p e r o m e t r i ci m m u n o s e n s o r f o rd e t e c t i o no fr u b e l l av a c c i n ei s d e v e l o p e db yi m m o b i l i z i n ga n t i - r u b e l l as e r u mo nb i l a y e r n a n o - a u p o l y m e r i z e do p h e n y l e n e d i a m i n ef i l mw i t he l e c t r o d e p o s i t e dp ba sa ne l e c t r o d et r a n s f e r m e d i a t o ro nt h ep te l e c t r o d e t h ei m m u n o s e n s o rp r o v i d e sal o wc o s t ，f a s tr e s p o n s et i m e ，h i g h s e n s i t i v ea n de a s eo f a p r e p a r a t i o nm e t h o df o rd e t e r m i n a t i o na n t i g e ni nb i o l o g i c a lp r o d u c t s ( 3 ) i nc h a p t e rt h r e e ，ah i g h l ys e n s i t i v ea m p e r o m e t r i ci m m u n o s e n s o ri sd e v e l o p e df o rt h e d e t e r m i n a t i o no fr u b e l l av a c c i n eb yi m m o b i l i z i n ga n t i s e r u mr u b e l l aa n dh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) i n s t e a do fb o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) b l o c k i n gs i t e sa g a i n s tn o n s p e c i f i cb i n d i n go ng o l d e l e c t r o d em o d i f i e db yb i l a y e ra gc o l l o i d sa n dp o l y m e r i z e do - p h e n y l e n e d i a m i n ef i l m sw i t h d e p o s i t e dp r u s s i a nb l u e ( p b ) a sa ne l e c t r o d et r a n s f e rm e d i a t o r t h ee x p e r i m e n ts h o w st h a t h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s ea m p l i f yt h ea m p e r o m e t r i cr e s p o n s es i g n a la n de n h a n c et h es e n s i t i v i t yo f t h ei m m u n o s e n s o r p a r tt h r e e ：s t u d yo nam e d i a t o r - f l e ea m p e r o m e t r i ci m m u n o s e n s o r ( 1 ) i nc h a p t e rf o u r , w eh a v ei n t r o d u c e das t u d yo nam e d i a t o r - f l e ea m p e r o m e t r i c i m m u n o s e n s o r t h es y s t e mi sb a s e do nl l a n o - a u m u l t i - w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s ( m w c n t ) c o a t e dg l a s s yc a r b o n ( g c ) d i s ke l e c t r o d et om e r g ea n t i b o d yw i t hu s eo fh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) t ob l o c ks i t e sa g a i n s tn o n s p e c i f i cb i n d i n gf o ra s s a yo fa n t i g e n t h eo b t a i n e dr e s u l t s d e m o n s t r a t et h a tt h ep r e p a r e di m m u n o s e n s o re x h i b i t sas i g n i f i c a n te l e c t r o c a t a l y t i c a c t i v i t yf o r h 2 0 2w i t h o u tm e d i a t o rw h i c ha m p l i f i e st h ea m p e r o m e t r i cr e s p o n s es i g n a l ，a n de n h a n c e st h e s e n s i t i v i t ya n ds t a b i l i t yo ft h ei m m u n o s e n s o r t h u s ，t h et h i r dg e n e r a t i o ni m m u n o s e n s o ri ss t u d i e d i nt e r n so fc o m p o u n d so fn a n o - p a r t i c l ee x h i b i t se x c e l l e n t c a t a l y t i ca c t i v i t yt h a na n yo n e n a n o p a r t i c l ea l o n e p a r tf o u rs t u d yo nt h et h i r dg e n e r a t i o nh y d r o g e np e r o x i d eb i o s e n s o r ( 1 ) i nc h a p t e rf i v e ，an o v e lm e d i a t o r - f l e ea m p e r o m e t r i cs e n s o rh a sb e e nd e v e l o p e d t h e 6 s y s t e m i sb a s e do nh o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e ( h r p ) m u l t i - w a l l e d c a r b o nn a n o t u b e s ( m w c n t ) c o a t e dg l a s s yc a r b o n ( g c ) d i s ke l e c t r o d e t om e r g eh r pw i t hn a n o - a u t h e e l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ro faf i l mo fm w c n to ng ci so b s e r r e da n dt h er e s u l t so ft h e e x p e r i m e n td e m o n s t r a t e st h a tt h ee l e c t r o d ea sp r e p a r e de x h i b i t sd i r e c te l e c t r o nt r a n s f e rb e t w e e n h r pa n dg ce l e c t r o d e ，a n de l e c t r o c a t a l y t i ca c t i o nt o w a r dh 2 0 2 ，w h i c ha m p l i f e st h ea m p e r o m e t r i c r e s p o n s es i g n a l ，e n h a n c e st h es e n s i t i v i t ya n ds t a b i l i t yo ft h es e n s o r t h eb i o s e n s o rh a ss h o w na s p e c i f i cr e s p o n s e t o h 2 0 2i n t h er a n g e l 0 1 0 。6t o1 0 x 1 0 一m o l lb yc v m o r e o v e r ，t h e r e p r o d u c i b i l i t ya n ds t a b i l i t yo f t h eb i o s e n s o ra r ea l s os t u d i e d p a r tf i v e ：s t u d yo nt h ep o t e n t i o m e t r i ei m m u n o s e n s o r ( 1 ) i nc h a p t e rs i x ，w e h a v ei n t r o d u c e dap o t e n t i o m e t r i ci m m u n o s e n s ob a s e do n l a y e r - b y l a y e rs e l f - a s s e m b l yo ff i l m so fn a n o a ua n dc o ( b p y ) 3 3 + f o rt h ed e t e r m i n a t i o no f j a p a n e s ebe n c e p h a l i t i sv a c c i n e n a n o - a ua n dc o ( b p y ) 3 ”i nav a r i e t yo fc h a r g es t a t e sa r e a s s e m b l e dl a y e r - b y - l a y e ri n t of i l m so nt h eg o l de l e c t r o d em o d i f i e db yl c y s t e i n et oi m m o b i l i z e a n t i - j a p a n e s ebe n c e p h a l i t i sf o r t h ea s s a yo fj a p a n e s ebe n c e p h a l i t i s v a c c i n et h ee l e c t r o d e m o d i f i c a t i o np r o c e s si sc h a r a c t e r i z e db ye l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p ye i s t h ef a c t o r s i n f i u e n c e i n gt h ep e r f o r m a n c eo ft h ep o t e n t i o m e t r i ci m m u n o s e n s o r a r es t u d i e di nd e t a i l t h e i m m u n o s e n s o re x h i b i t e sf a s tp o t e n t i o m e t r i cr e s p o n s ea n dt h e l i n e a rr a n g ei sf r o m8 1 1 0 8t o 3 0 x1 0 4l gp f u m l ( p l a q u ef o r m i n gu n i t ) w i t had e t e c t i o nl i m i to f3 5 x1 0 一l gp f u m 1 m o r e o v e r , t h ea n a l y s i e di m m u n o s e n s o re x h i b i t e sh i g hs e n s i t i v i t ya n dl o n g - t e r ms t a b i l i t y t h ep r e s e n tw o r k s u p p l i e sap r o m i s i n gt e s tm e t h o df o rb i o l o g i c a lp r o d u c t s ( 2 ) i nc h a p t e rs e v e n ，as t u d yo nt h ep o t e n t i o m e t r i ci m m u n o s e n s o rf o rd e t e c t i o no f j a p a n e s eb e n c e p h a l i t i s v a c c i n ei s d e v e l o p e db yi m m o b i l i z i n ga n t i b o d y o n n a n o a u p o l y m e r i z e d o - p h e n y l e n e d i a m i n ef i l m o nt h ep te l e c t r o d e t h ep e r f o r m a n c ea n df a c t o r si n f l u e n c i n gt h e p e r f o r m a n c eo ft h er e s u l t i n gi m m u n o s e n s o ra r es t u d i e d t h ei m m u n o s e n s o rs h o w sas p e c i f i c r e s p o n s et oj a p a n e s ebe n c e p h a l i t i sv a c c i n ei n t h er a n g e l 1 x 1 0 -