（分析化学专业论文）基于表面分子开关的生物传感器新方法研究.pdf

复旦大学博士学位论文 摘要 科学和技术发展最重要的挑战之一就是进一步实现对微观的控制和研究，这就 意味着要利用化学手段自下而上( b o t t o m - u p ) 来构建分子水平上器件和机器，即从 原子或分子开始建造微观结构。“自下丽上”是指以原子，分子为基本单元，根据 人们的意愿进行设计和组装，从而构筑成具有特定功能的器件。同时，随着微电子 技术和生物工程这两项高科技的互相渗透，分子开关实际上已为研制分子器件提供 了可能。所谓分子开关泛指结构上组织化了的具有“开关”功能的化学体系。它也 是指具有双稳态的量子化体系，当外界光、电、热、磁、酸碱度等条件变化时，分 子的形状、化学键的生成或断裂、振动以及旋转等性质会随之变化，通过这些几何 和化学的变化，能实现信息传输的功能。 分子水平上的开关需要一个外部刺激来引起电子和原子核的重排，3 种用来开启 化学体系功能的最重要的刺激是光能( 光子) ，电能( 电子或空穴) 和化学能( 以 质子、金属离子或特殊分子形式) 。最常见的光化学激发开关过程与光异构化和光 诱导氧化还原反应是相关的。如果输入的是电化学激发，当然就是氧化还原反应的 诱导反应，与化学激发相比，光化学和电化学激发的分子开关更容易发生且响应迅 速。利用电化学能代替化学氧化还原作用，具有开、关简便快捷的优势。况且，电 化学技术也是监测机器运行的有用方式，电极则是分子系统与宏观世界相连的最佳 方式。电场控制的表面分子开关可以用于蛋白质的可控吸附和分离再结合分子设 计、有机合成和高分子化学，还可以给这种表面引入亲疏水功能团或抗原抗体识别 对等，方便的实现亲疏水开关或者免疫开关表面。 本论文主要创新之处是基于自组装膜技术、电化学控制技术以及温敏聚合物材 料构建具有表面分子开关功能的仿生界面，从而利用这些智能化表面对生物分子及 其动态相互作用过程进行实时在线控制和检测。智能化表面( s m a r ts u r f a g e ) 通常是 指具有可操控开关功能的生物应用表面。智能化表面性质的可逆操控，是在外界激 励下发生的。它可以由聚合物、有序自组装膜、纳米材料( 特别是金属氧化物) 等 组成，激励它发生性质可逆转化的因素包括温度、光照、电场、p h 值、溶剂等等。 在这些外界激励下，表面分子可以发生可逆的构象转化、构型转化、氧化态的转化 等等，从而在宏观上，使整个表面呈现出亲疏水性、光学性质、带电性等性质的可 逆转化，即可呈现出“开关”的性质。本论文通过构建的低密度自组装膜，在表面上 形成电化学可操控的具有生物识别能力的亲疏水开关，从而实现了对抗生物素一链 霉亲和素功能蛋白间微观作用过程的快速、灵敏、可控检测和表征。进一步地，利 i 复旦大学博士学位论文 用温敏高分子材料p o l y ( n - i s o p r o p y l a c r y l a m i d e ) p n i p a a m 与抗b s a 抗体合成生物 复合物，构建了具有温度敏感开关功能的可再生免疫传感器。该方法可保持生物识 别体系的活性和环境，再生的抗原，抗体表面均可重复识别相应目标物，检测灵敏度 高、速度快，所构建的温敏开关免疫传感器可重复使用3 0 次以上，解决了目前免疫 传感器抗体表面仅能单次使用的弊端，同时为研究蛋白质蛋白质动态相互作用过程 提供了新手段。 本论文共五章内容，主要摘要如下： 第一章综述了表面分子开关的研究现状及其相关技术在生物传感器领域的应用 进展。分子自组装和高分子聚合物是构建分子开关的两条重要途径。自组装单分子 层是构膜分子与基底材料间发生物化作用而自发形成的一种热力学稳定、排列规则 的单层分子膜。这种构膜方式，可以容易的为表面引入各种各样的功能团，这就为 制备具有多种不同功能的智能化表面打下了很好的基础。温敏材料是指对温度可感 知且可响应并具有功能发现能力的一类材料。具有“温度开关特性的聚一n 异丙基丙 烯酰胺( p n l p a a m ) 是近年来引起研究兴趣的一类高分子材辩。利用它对温度响应 的敏感性，使其在药物缓释、免疫分析、生命科学等研究领域都有着广泛的潜力。 第二章介绍了基于人工自组装膜技术构建表面亲疏水开关发展生物传感器的新 方法。本章利用环糊精作为巯酸分子间距有效的调控手段，以乙醇作为高效的洗脱 溶剂，通过自组装方法在金电极表面构建了间距均一、性能稳定的巯基化合物低密 度薄膜，由此构建了具有亲疏水可逆开关的智能化表面生物传感器。以高密度自组 装膜表面的覆盖度为1 0 0 计算可知，a ，b ，t 三种环糊精分子构建的低密度自组装 膜表面的覆盖度分别为6 1 2 ，4 5 3 和2 9 2 。通过改变外加电压状况，使巯基 化合物构型发生改变，从而实现表面的亲水疏水性能的转换。通过质谱，核磁，交 流阻抗，q c m ，荧光等多种检测手段对膜表面可逆过程进行了实时监控。 第三章主要围绕此类亲疏水开关生物传感器进行抗生物素及链霉亲和素可控组 装的应用研究。本章采用荧光标记抗生物素，链霉亲和素功能蛋白分子作为研究对 象，通过改变外加电流正负情况使得低密度自组装膜表面具有亲疏水可逆转换性能。 在p h 值为7 4 的缓冲溶液中，两种蛋白质由于等电点的差异而带上了两种不同的电 荷，由于表面电荷作用及亲疏水性质的转换，两种蛋白质可以在外加电场作用下发 生可控组装行为。主要利用e q c m 实验和荧光光谱实验对两种蛋白质的可控组装进 行了实时监测，对于a v i d i n 蛋白在 b - c d 构建的低密度自组装膜上的组装过程，将 复旦大学博士擘往论文 其在负电压下组装3 0 分钟后它的荧光强度是正电压条件下的4 9 倍。对于 s t r e p t a v i d i n 蛋白来说，当外加正电压3 0 分钟后，在b c d 构建的低密度自组装膜表 面上蛋白组装量分别是负电压条件下同种组装膜的1 5 倍。利用微电极中获得的良 好分离分析效果，我们还初步尝试将之应用于微流控芯片体系，发展了一种利用“分 子开关”原理构建的蛋白质芯片 第四章是基于温敏聚合物的表面分子开关构建及抗原抗体可逆识别界面的研 究。本章主要研究温敏高分子材料p n i p a a m 与抗b s a 抗体合成的生物复合物 ( b i o c o n j u g a t e ) 组装到金表面与对应抗原b s a 识别时的可逆过程。由于这种温敏商 分子材料的存在，这个结合过程与抗体抗原直接结合的情况有很大变化，选择不同 分子量的聚合物进行构建，该材料对抗原结合过程中造成的空间位阻有所不同，结 合量可通过测定q c m ，交流阻抗法，天然p a g e 胶以及荧光标记抗原的光亮度加以 定量。当抗原抗体结合完毕后，改变溶液的温度，由于温敏材料分子量的差异，高 分子量时随着温度升高，抗体结合位点附近的高分子材料会团聚在已经结合的抗原 周围，而且会产生较大的空间力以及疏水力，从而将已经结合的抗原从抗体结合部 位顶开，使得所构建的温敏开关免疫传感器具有良好的再生功能。高温降至低温过 程中，免疫识别体系抗原抗体结合常数差别可以达到两个数量级。高分子量聚合物 构建的免疫开关传感器对于抗原抗体结合后表面的再生率最高可以达到8 9 以上， 跟通常文献中大量报道的有机溶液再生表面法( 再生率8 0 9 2 ) 相差：f i t j , ，而且 这个方法基本没有破坏生物识别体系的活性和环境。抗原抗体均可重复利用，这种 温敏开关免疫传感器可重复使用3 0 次以上，抗疲劳性较好。综上所述，这种基于温 敏聚合物的表面开关可以在免疫生物传感领域进行广泛的应用。 第五章工作围绕基于手性氨基酸抗体构建电容型手性免疫传感器进行相关研 究。利用自制手性抗体构建高选择性的新型电容型免疫传感器，设计了逆向竞争法 进行检测，得到了很好的响应，这一部分工作仍在进行中。构建的电容性手性免疫 传感器从所有的图表中可以看出这种传感器对于小分子的手性氨基酸具有很强的识 别和分析能力，检测限可以达到5p e , m l ，对氨基酸混合物中痕量d 型苯丙氨酸可以 达到0 0 0 1 的检测灵敏度。竞争法测定灵敏快速，既可以测定d 型、l 型苯丙氨酸对 电极表面半抗原与抗体免疫识别的抑制情况，还可以测定消旋体中单一构型( d 型) 氨基酸含量，此方法对于混合氨基酸体系中痕量的单一构型抗原检测限比标准的手 性色谱分析方法还要低一个数量级，具有高灵敏度、高选择性的特点，为无标记法 检测手性氨基酸提供了一种可行的检测方法。具有操作简便，重现性好，成本低廉 等一系列优点，对于手性物质的快速在线分析对于临床检测及手性药物分析等具有 复旦大学博士擘位论文 较大的意义。 第六章是对本论文工作的总结及对下一步工作的展望。 总之，本论文围绕表面分子开关进行了多种生物传感新方法的成功尝试。利用 自组装膜技术，温敏聚合物材料等结合外界不同触发条件构建了亲疏水表面开关、 温度敏感表面开关生物传感器，形成了具有良好生物相容性的仿生界面，将其应用 于蛋白质分子、抗原抗体体系等进行人工可操控的生物过程的考察与研究均获得了 良好的结果。 关键词：分子开关，亲，疏水性，温敏材料，聚- n 异丙基丙烯酰胺，免疫传感器再生 i v 复旦大学博士学位论吏 a b s t r a c t c o n t r o l l e ds t u d yo fm i c r o s c o p i cf i e l d si so f l eo ft h em o s ti m p o r t a n tc h a l l e n g e st os e i e n f i f i c a n dt e c h n o l o g i c a ld e v e l o p m e n t s c i e n t i s t su s ec h e m i c a la n db i o l o g i c a lm e t h o d st ob u i l dc o m p l e x m o l e c u l a r - l e v e ld e v i c e sf r o mt h eb u s i cb u i l d i n gb l o c k so fa t o m i co rm o l e c u l a rm i c r o s t r u c t u r e t h i ss t r a t e g y , k n o w n 船“b e t t o m - u p d e s i g na l l o w sf o rd e v i c e sw i t hs p e c i f i cs t r u c t u r eo rf u n c t i o n t ob eb u i l t o fp a r t i c u l a ri n t e r e s th a sb e e nt h ed e v e l o p m e n to fm o l e c u l a rs w i t c h e s ，w h i c hc o u l d s e r v ea st h ep r e c u r s o rt ot h ep r e p a r a t i o no fm o r ec o m p l i c a t e dm o l e c u l a rd e v i c e s m o l e ：c u l a r s w i t c h e sa r em o l e c u l e sw h i c ha r cc a p a b l eo f c h a n g i n gt h e i rb e h a v i o ri nac o n t r o l l e df a s h i o nb a s e d o ne x t e r n a ls t i m u l is u c ha sl i g h t , e l e c t r i c i t y , h 船t ，m a g n e t i cf i e l d s ，o rp h b yt a k i n ga d v a n t a g eo f s u c hs w i t c h l a gb e h a v i o ri ts h o u l db ep o s s i b l et or e a l i z et h et r a n s m i s s i o no f i n f o r m a t i o n s w i t c h i n gb e h a v i o rr e q u i r e sa l le x t e r n a is t i m u l i 幻o a u s ce i t h e ra l le l e c t r o n i ct r a n s r i o no ra s t r u c t u r a lr e a r r a n g e m e n t t h et h r e em o s ti m p o r t a n ts t i m u l ia r el i g h t ( a b s o r p t i o no fp h o t o n s ) ， e l e c t r i c i t y ( a d d i t i o no rr e m o v a lo f e l e c t r o n s ) a n dc h e m i c a le n e r g y ( b i n d i n go f p r o t o n s ，m e t a li o n s ， o ro t h e rs p e c i a lm o l e c u l e s ) t h em o s tc o m m o np h o t o c h e m i c a ls w i t c h e sa r er e l a t e dt o l i g h t - i n d u c e d i s o m e r i z a t i o na n d l i g h t - i n d u c o d o x i d a t i o na n dr e d u c t i o nr e a c t i o n s e l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d sc a na l s ob eu s e dt op r o d u c er e d o xt y p es w i t c h i n gb e h a v i o r m o r e o v e r , e l e c t r o c h e m i c a lt e c h n i q u e sa r eau s e f u lw a yt om o n i t o rt h eo p e r a t i o no fm o l e c u l a rm a c h i n e r y , w i t ht h ee l e c t r o d es e r v i n ga st h ec o n n e c t i o nt ot h em a c r o s c o p i cw o r l d a sa ne x a m p l e ，s u r f a c e e l e c t r i cs w i t c h e sc a l lb eu s e dt oc o n t r o lp r o t e i na d s o r p t i o na n ds e p a r a t i o n b yc o m b i n i n g m o l e c u l a rd e s i g n ，o r g a n i cs y n t h e s i s ，a n dp o l y m e rc h e m i s t r y , i ti sp o s s i b l et oi n t r o d u c eh y d r o p h i l i c o rh y d r o p h o b i cf u n c t i o n a lg r o u p so ra n t i g e n - a n t i b o d yc o m p l e x e st ot h es u r f a c er e s u l t i n gi na r e v e r s i b l es w i t c h 。 1 1 l i st h e s i si sb a s e do ht h eu s eo fnl o w - d e n s i t ys e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e ra n d t e m p e r a t u r e s o n s i t i v ep o l y m e rt ob u i l dab i o c o m p a t i b l es u r f a c e b yu s i n gt h e s ei a n o v a t i v e m e t h o d s , c o n t r o l l e di ns i t ud e t e r m i n a t i o na n dm o n i t o r i n gf o rb i o l o g i c a lm o l e c u l e sc o l l l db e c a r r i e do n t h ei n t e l l i g e n tm o d i f i c a t i o no fs u r f a c ep r o p e r t i e sa l l o w sf o rt h ed e t e c t i o no faw i d e r a n g eo fb i o i o g i c a ls p e c i e s n ef o c u so ft l l i sw o r kh a sb e e nt h ed e v e l o p m e n to fas e n s i t i v ea n d r e v e r s i b l es w i t c hf o rt h ed e t e c t i o no f s p e c i f i cb i o m o l e c u l e s b yu s i n g al o w - d n n s i t y 靶i f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r ( s a f ) t oe s t a b l i s hah y d r o p h o b i c h y d r o p h i l i cs w i t c hi th a sb e e n p o s s i b l et oa c h i e v et h er a p i da n dc o n t r o l l e dd e t e c t i o no fn v i d i na n ds u e p t e v i d i n r e v e r s i b l e c o n t r o io ft h es u r f a c ep r o p e r t i e sh a sb e e na c h i e v e dw i t hv a r i o u sm e t h o d s i n c l u d i n g ： p h o t o i l l u m i n a t i o n ，p o t e n t i a le f f e c t s , a n dt h e r m a ld r i v i n g b yu s i n gt e m p e r a t u r e s e n s i t i v ep o l y c i s l - 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a n t i b o d ys u r f a c et h a tc o u l ds u p p l y t h em o s te f f e c t i v ed i s s o c i a t i o no ft h ea n t i g e na n dr e g e n e r a t i o no fa n t i b o d yi n t or e u s eo ft h e i m m u n o s e n s o r s a sam o d e ia n t i b o d y - a n t i g e ns y s t e m b o v i n es e r n ma l b u m i n ( b s a ) a n dt h e c o r r e s p o n d i n ga n t i b o d y ( a n t i - b s a ) w e r ec h o s e n ar e v e r s i b l ep n i p a a m - a n t i b o d y ( a n t i - b s a ) c o n j u g ： u e ss u r f a c ew a se s t a b l i s h e db yt r i g g e r e dc o n t r o lo fe x t e r n a lt e m p e r a t u r e t h i st o o k a d v a n t a g eo ft h et h e r m a l t yt u n a b l ec o n f o r m a t i o n a lc h a n g e sf o rt h ep n i p a a m - c o n j u g a t e d a n t i b o d ys u r f a c e , a n dc e u l db eu s e df o rs w i t c h a b l ea n t i g e na s s o c i a t i o na n dd i s s o c i a t i o n t h e v i 复里走学博士学位论丈 t e m p e r a t u r ec o n t r o l l i n gs w a t e g yc o u l dr e a l i z e dt h er e g e n e r a t i o no ft h ei m m u n o s e n s o ro nw h i c h i m m o b i l i z e da n t i b s aa n t i b o d i e sr e t a i nt h ea c t i v i t ya n ds p e c i f i c i t yn e c e s s a r yt oc a r r yo u tm o l l t h a n3 0r e p r o d u c i b l ea s s a y sf o rb s a t h ed i s s o c i a t i o nr e a c h e s8 9 。w h i c hc a nc o m p a r ew i t h t h eg e n e r a ll l e o v e r ym e t h o d s t h ec o n t r o l l e db i n d i n ga n du n b i n d i n gw e t a gm o n i t o r e db yq u a r t z c r y s t a lm i c r o b a l a n c e ( q c m ) ，c o n f o c a lf l u o r e s c e n c e ，n a t i v ee l e c t r o p h o l l s i s ，l a s e r i n d u c e d f l u o r e s c e n c e , a n de l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c e t h e 矗f l l lc h a p t e rd e s c r i b e sah i g h l ye n a n t i o s e l e c t i v ea n ds e n s i t i v ei m m u n o s e n s o rf o rt h e d e t e c t i o no fc h i r a la m i n oa c i 出b a s e do nc a p a c i t i v em e a s u r e m e n t t h es e n s o rw a sp r e p a r e db y f i r s tb i n d i n gm e r c a p t e n c e t i ca c i dt ot h es u r f a c eo f ag o l de l e c t r o d e , f o i l o w e db ym o d i f i c a t i o nw i t h t y r a m i n eu t i l i z i n gc a r b o d i i m i d ea c t i v a t i o n s t e r e o s e l e c t i v eb i n d i n go fa na n t i - d - a m i n oa c i d a n t i b o d yt ot h eh a p t e n - m o d i f i e dz e n s o rs u r f a c er e s u l t e di nc a p a c i t a n c ec h a n g e st h a tw e r ed e t e c t e d w i t hh i g hs e n s i t i v i t yb yap o t e n t i o s t a t i cs t e pm e t h o d u s i n gc a p a c i t a n c em e a s u r e m e n t , d e t e c t i o n l i l i l i 协o f5p go fa n t i b o d y m lw f r ea t t a i n e d t 1 l ee x q u i s i t es t c r e ，o s e l c c t i v i t yo ft h ea n t i b o d yw a s a i s ou t i l i z e di nac o m p e t i t i v e s e t u p t o q u a n t i t a t i v e l yd e t e r m i n et h ec o n c e n t r a t i o no f d - p h e n y l a l a n i n ei nn o n r a c e m i cs a m p l e s t r a c ei m p u r i t i e so f d - p h e n y l a l a n i n ea sl o wa s0 0 0 1 c o u l db ed e t e c t e d t h i sm e t h o ds h o u l db eu s e f u ln o to n l yf o rt h ee n a n t i o s e l a c t i r ed e t e c t i o no f a m i n oa c i d sa sd e s c r i b e dh e r eb u ta l s of o ri n v e s t i g a t i n go t h e rt a r g e t s ( e 。，g d r u g s ) u s i n g a p p r o p r i a t ea n t i b o d i e s t h es i x t hc h a p t e ri st h e 瓤m m i a f yo f t h i st h e s i sa n dt h ef u t u r ep r o s p e c t sf o rr e l a t e dr e s e a r c h t h i st h e s i sr e p o r t so l lt h ed e v e l o p m e n to fs e v e r a ld i f f e r e n ts u r f a c em o l e c u l a rs w i t c h e sw h i c h c a nb eu s e da sb i o s e n s e r s u s i n gs e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r s ，h y d r o p h o b i c h y d r o p h i l i cs u r f a c e s w i t c h e sc a p a b l eo fr e s p o n d i n gt oe x t e r n a lt e m p e r a t u r ea n de l e c t r i c a ls t i m u l iw e r ep r e p a r e d 。 t h e s es w i t c h e sc o u l ds u p p l yas m a r ta n db i o c o m p a t i b l ei n t e r f a c et od e t e r m i n ea n da n a l y z e p r o t e i n sa n da n t i g e n - a n t i b o d yi m m u n es y s t e m s ，w h i c hm a yo p e na n e wp a r a d i g mf o rt h e d e s i g n o f f u n c t i o n a lb i o c o m p o s i t ef i l m s k e yw o r d s ：r e v e r s i b l e ，c o n t r o l l e d ，s u r 白c es w i t c h e s ，p n i p a a m ，h y d r o p h o b i c f h y d r o p h i l i