专题五1DNA粗提取与鉴定ppt课件

DNA的粗提取与鉴定,1,实验原理,1.DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14molL时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。,2,实验材料和用具,实验材料：1、鸡血细胞液（510ml）；2、体积分数为95%的冷酒精溶液（实验前置于冰箱内冷却24h）；3、蒸馏水；4、质量浓度为0g/ml的柠檬酸钠溶液；（抗凝剂）5、物质的量浓度分别为2mol/L和0015mol/L的NaCl溶液；6、二苯胺试剂。,3,实验用具：铁架台；铁环；镊子；三角架；酒精灯；石棉网；载玻片；玻璃棒；滤纸；滴管；量筒（100ml，一个）；烧杯；（100ml，一个，50ml、500ml各二个）；试管（20ml，二个）；漏斗；试管夹；纱布。,4,5,8、DNA的鉴定,DNA与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂,紫外灯照射法,A、配制染色剂，用蒸馏水配制万分之五的溴化已锭（EB）,B、将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上，再滴一滴EB溶液染色,C、将蜡纸放在紫外灯(260nm)下照射（暗室中），可见橙红色的荧光(DNA的紫外吸收高峰在260nm处),甲基绿（蓝绿色）,6,二、DNA的粗提取与鉴定的实验设计,（一）实验材料的选取,材料：新鲜的鸡血,注意：本实验中，要往鸡血中加入抗凝剂（柠檬酸钠溶液）,原则上只要含DNA的生物材料都可以，但是选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。,7,(1)先将新鲜的鸡血离心，获得鸡血细胞(2)在鸡血细胞中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,1、破碎细胞,讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？利用了什么原理？,2、过滤，获取含DNA的滤液,8,讨论：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质,答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质,9,讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？,答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离方案二利用了酶的专一性；方案三利用了DNA的稳定性。,10,（四）DNA的析出与鉴定,DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95），静置2-3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水,1、DNA的析出,11,12,2、DNA的鉴定,鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一只加入DNA丝状物，各加入二苯胺4ml试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色,13,（一）案例一：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取,三、实验案例,鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长,1、鸡血细胞做实验材料的原因,鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得,14,2、实验原理,DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14molL时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。,DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。,DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。,15,4、课前准备鸡血细胞液,取质量浓度为01g/ml的柠檬酸纳溶液（抗凝剂）100ml，置于500ml烧杯中。注入新鲜的鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用1000r/min（转每分）的离心机离心2min，血细胞沉淀于离心管底部。实验时。用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。）,过程,16,柠檬酸钠作用,防止血液凝固,作用机理,柠檬酸钠能与血浆中的Ca2+发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca2+大大减少，血液就不会凝固,鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液,注意事项,17,讨论：提取鸡血中的DNA时，为什么除去血液中的上清液？,答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，离心后除去的上清液是血浆,5、方法步骤,将制备好的鸡血细胞液5mL10mL，注入到50mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20mL，同时用玻璃棒充分搅拌5min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。,提取鸡血细胞的细胞核物质,18,19,讨论：,答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破,（1）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？,（2）用玻璃棒搅拌有什么意义？,答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA,（3）滤去的是什么物质？得到的是什么？,答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA,20,溶解细胞核内的DNA,将氯化钠的物质的量浓度为2mol的溶40mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态,沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14molL）,析出含DNA的粘稠物,21,22,讨论：加入蒸馏水的目的？,降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点，使DNA从NaCl溶液中析出,将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕,注意事项：,23,滤取含DNA的粘稠物,用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至500mL的烧杯中，含DNA的粘稠物被留在纱布上,将DNA的粘稠物再溶解,取1个50mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为2molL的溶液20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中,24,25,过滤含有DNA的氯化钠溶液,取1个100mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中,提取含杂质较少的DNA,在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积分数为95的溶液50mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA,26,27,答：因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出,悬浮于溶液中,讨论：,（2）观察丝状物呈什么颜色？,答：白色,（1）为什么要加50mL的冷酒精？,28,取两支20mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0015molL的溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化,DNA的鉴定,29,30,讨论：,答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色,（2）这一鉴定结果说明什么问题？,（1）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？,答：提取出的丝状物是DNA,（3）DNA的直径约为2010-10m，实验中出现的丝状物的粗细是否表示1个DNA分子直径的大小？,答：DNA分子直径只有2nm。丝状物是多个DNA子聚在一起形成的,31,32,答：整个实验共“两次蒸馏水，三次过滤，两次析出，六次搅拌”,6、讨论：,两次蒸馏水,第一次：细胞吸水胀破第一步第二次：使DNA黏稠物析出第三步,（1）此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出，几次搅拌？分别在哪一步？,33,过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关，第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要使用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，使用的纱布为12层,三次过滤,第一次：DNA存在于滤液里第一步第二次：DNA被留在纱布上第四步第三次：DNA存在于滤液里第六步,34,两次析出,第一次：用0.14molL的NaCI溶液含杂质多,第三步,第二次：用冷却的95的酒精,第七步,六次搅拌：第一、二、三、五、七步,其中除第八步外，其余均要朝一个方向搅拌，在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，这样才能保证得到完整的DNA,35,（2）为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？,答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质,36,1、在制备鸡血细胞液的过程中，加入柠檬酸钠的目的是（）A.防止凝血B.加快DNA析出C.加快DNA溶解D.加速凝血,练一练,A,37,2、DNA的溶解度最低时，NaCl的物质的量浓度为（）A2mol/lB0.1mol/lC0.14mol/lD0.015mol/l3、在向溶解DNA的NaCl溶液中，不断加入蒸馏水的目的是（）A加快DNA溶解的速度B加快溶解杂质的速度C减小DNA的溶解度，加快DNA析出D减小杂质的溶解度，加快杂质的析出,C,C,38,4、向溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液中不断加入蒸馏水,在这个过程中DNA的溶解度变化情况分别是A减小;减小B增大;增大C先减小后增大D增大;减小5、欲使溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液中的DNA析出，最有效的办法是A加蒸馏水B加矿泉水C加清水D加生理盐水,39,6、与析出DNA粘稠物有关的叙述，不正确的是A操作时缓慢滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度B操作时用玻棒轻缓搅拌以保证DNA分子的完整C加蒸馏水可以同时降低DNA和蛋白质的溶解度D当丝状粘稠物不再增加时，NaCl溶液的浓度可以认为是0.14mol/L,7、你能采用其他方法对DNA进行鉴定吗？,用甲基绿染液。结果丝状呈现绿色。,40,8、DNA遇二苯胺会染成（沸水浴）A硅红色B红色C紫色D蓝色,D,41,（二）案例二：以菜花为实验材料进行DNA的粗提取,1、课前准备,将新鲜菜花和体积分数为95的乙醇溶液放入冰箱冷冻室24h,2、提取DNA的具体步骤,取材：称取30g菜花，去梗取花，切碎,研磨：将碎菜花放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨10min,42,43,过滤：在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨液过滤到烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心，用1000r/min的转速，离心25min，取上清液放入烧杯中)。在4冰箱中放置几分钟后，再取上清液,沉淀：将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95的预冷乙醇溶液中，并用玻璃棒缓缓、轻轻地搅拌溶液(玻璃棒不要直插到烧杯底部)。沉淀35min后，可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转，将絮状物缠绕在玻璃棒上,44,观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明