（生物化学与分子生物学专业论文）精氨酸激酶折叠与去折叠机制研究.pdf

精氨酸激酶折叠与去折叠机制的研究 摘要 精氨酸激酶( a t p ：n - 精氨酸磷酸转移酶e c2 7 3 3 ) 是无脊椎动物中参与能 量代谢的一种重要磷酸激酶。以中国对虾的精氨酸激酶( 4 0 k d a ) 为模式蛋白，研 究了蛋白质在六氟异丙醇溶液中的去折叠机制以及诱导出的二级结构对蛋白质 再折叠的影响。 利用内源荧光、a n s 荧光、远紫外圆二色光谱以及酶活力测定等手段研究 了精氨酸激酶在1 ，1 ，l ，3 ，3 ，3 六氟异丙醇溶液中变性后结构与活性的变化。为避免 蛋白质聚沉的出现，实验中采用的变性剂浓度低于8 ( v v ) 。当六氟异丙醇浓度 范围为o 5 1 5 时，蛋白质的二级结构和内源荧光发射峰位都没有发生明显的 变化，而外源a n s 荧光强度则显著增强。继续提高变性剂浓度至6 后，内源荧 光发射峰位明显红移、二级结构含量增大、外源荧光减弱、酶活力完全丧失。比 较精氨酸激酶的失活与去折叠过程，结果表明酶的失活速度明显快于去折叠的速 度。内源荧光和外源a n s 荧光的变化证明：在0 5 1 5 六氟异丙醇浓度范围 内，蛋白质分子以一种结构相对稳定并类似于天然蛋白结构的熔球态中间体的状 态存在。这种熔球态中间体也是精氨酸激酶在去折叠过程中出现的一个平衡态中 间体。 在脲变性的精氨酸激酶中加入六氟异丙醇溶液，能诱导出大量的二级结构特 别是n 螺旋。折叠动力学研究表明，这些诱导出来的二级结构对精氨酸激酶的再 折叠产生阻碍作用，明显减缓了折叠的速度。而且当六氟异丙醇的诱导浓度为 5 时，这个阻碍作用是最显著的，而且再折叠过程中产生了部分不可见的聚沉， 蛋白质的活力丧失殆尽。可见，事先诱导的二级结构影响了蛋白质折叠的过程， 并导致了错误折叠的发生。 关键词：精氨酸激酶，熔球态，平衡态中间体，六氟异丙醇，折叠动力学，聚沉 精氨酸激酶折叠与去折叠机制的研究 a b s t r a c t a r g i n i n ek i n a s e ( a t p ：l a r g i n i n ep h o s p h o t r a n s f e r a s ee c2 7 3 3 ) ， p l a y sa ni m p o a a mr o l e i nc e l l u l a re n e r g ym e t a b o l i s mi ni n v e r t e b r a t e s a r g i n i n ek i n a s ef r o ms h r i m p ( f e n e r o p e n a e u sc h i n e n s i s ) w a st a k e na sa m o d e lp r o t e i nt os t u d yt h eu n f o l d i n gp r o c e s sa n de f f e c t so ft h ei n d u c e d h e l i c a ls t r u c t u r e so n r e f o l d i n g t h ed e n a t u r a t i o no fa r g i n i n ek i n a s e ( a k li nv a r i o u sc o n c e n t r a t i o n s o fl ，1 ，l ，3 ，3 ，3 一h e x a f l u o r o i s o p r o p a n o l ( h f i p ) h a sb e e ni n v e s t i g a t e d b y f o l l o w i n gt h em e t h o d so ff a r - u l t r a v i o l e tc i r c u l a rd i c h r o i s m ( c d ) s p e c t r a ， i n t r i n s i cf l u o r e s c e n c e a n sb i n d i n ga n d a c t i v i t ya s s a y t h ec o n c e n t r a t i o n o fh f i pe m p l o y e dw a su n d e r10 ( v v ) t oa v o i dt h ea g g r e g a t i o no f p r o t e i n i n0 5 1 5 h f i p s o l u t i o n s n or e m a r k a b l ec h a n g e so f s e c o n d a r ys t r u c t u r ea n df l u o r e s c e n c ee m i s s i o nm a x i m u mo fa kh a v e b e e no b s e r v e d ，w h i l e 血ea n si n c r e a s e do b v i o u s l y f u r t h e ra d d i t i o no f h f i pt o6 c a u s e das i g n i f i c a n tr e ds h i f to ft h ee m i s s i o nm a x i m u ma n d t h e a c t i v i t y o fe n z y m et o t a l l y l o s t c o m p a r i s o no fi n a c t i v i t y a n d u n f o l d i n gp r o c e s s s h o w e dt h a tm a r k e di n a c t i v a t i o no c c u r r e db e f o r e s i g n i f i c a n tc o n f o r m a t i o n a lc h a n g eo fa k t 1 1 ec h a n g e so fi n t r i n s i c f l u o r e s c e n c ea n da n si n t e n s i t ys h o w e dt h a tt h e r ee x i s t e dar e l a t i v e l y s t a b l em o l t e ng l o b u l es t a t eo fa ki nt h eh f i ps o l u t i o nr a n g i n gb e t w e e n 0 5 a n d1 5 ( v v ) a n dt h em o l t e ng l o b u l es t a t em a yb ean a t i v e 1 i k e a n f o l d i n ge q u i l i b r i u mi n t e n n 烈脓 t h ea d d i t i o no fh e x a f l u o r o i s o p r o p a n o lf h f i p ) c o n s i d e r a b l yi n d u c e d a - h e l i c e si nu r e a - d e n a t u r e da r g i n i n ek i n a s ef a k ) f o l d i n gk i n e t i c ss t u d i e s s h o w e dt h a tt h ef o l d i n gr a t e so ft h eu r e a d e n a t u r e da kw e r es i g n i f i c a n t l y d e c e l e r a t e da f t e rb e i n gi n d u c e di nv a r i o u sc o n c e n t r a t i o n so fh f i p t h e d e c e l e r a t i o no ff o l d i n gd i dn o tc o r r e l a t e l i n e a r l yw i t ht h eh f i p c o n c e n t r a t i o na n dam i n i m a lf o l d i n gr a t ea p p e a r e da st h ei n d u c i n gh f i p c o n c e n t r a t i o nw a s5 ( v v 1 w h e nt h ei n d u c i n gc o n c e n t r a t i o no fh f i p i n c r e a s e dt o10 ( v v ) 。t h ef o l d i n gr a t ea l s oi n c r e a s e dt oa b o u t6 0 o f i i 精氨酸激酶折叠与去折叠机制的研究 t h es e l f - r e f o l d i n ga k c o r r e s p o n d i n gw i t ht h em i n i m a lf o l d i n gr a t e b o t h t h er e ds h i f to fi n t r i n s i ce m i s s i o nm a x i m u ma n da n sf l u o r e s c e n c e r e a c h e dt h e i rp e a kv a l u e sw h e nt h ei n d u c i n gc o n c e n t r a t i o no fh f i pw a s 5 ( v v ) m o r e o v e r , a kl o s ti t sa c t i v i t yc o m p l e t e l ya tt h i sc o n c e n t r a t i o n t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eh f i p i n d u c e dh e l i c a ls t r u c t u r e si n d e n a t u r e ds t a t ep l a yan e g a t i v er o l ei np r o t e i nf o l d i n ga n dt h eh e l i c a l s t r u c t u r e si n d u c e da t5 ( v v ) h f i pa c ta st h em o s te f f e c t i v eb a r r i e rf o r a kt of i n di t sn a t i v es t r u c t u r e t h ee x c e s s p r e o r g a n i z e d h e l i c a l s t r u c t u r e sn o to n l yh a m p e r e dt h e f o l d i n gp r o c e s sb u ta l s ou l t i m a t e l y b r o u g h ta b o u tc h a n g e si nt h et h r e e d i m e n s i o n a lc o n f o r m a t i o na n d b i o l o g i c a lf u n c t i o no fa k k e y w o r d s ： a r g i n i n ek i n a s e ，m o l t e ng l o b u l es t a t e ，e q u i l i b r i u mi n t e r m e d i a t e ，h f i p ， f o l d i n gk i n e t i c s ，a g g r e g a t i o n i i i 精氨酸激酶折叠与去折叠机制的研究 主要符号对照表 a d p二磷酸滕萤 a k精氨酸激酶 a n s1 一苯氨基萘一8 一璜酸 a t p三磷酸豫营 c d煎二色光谱 c k肌酸激酶 h f i p 六氟异丙醇 m g髂球态 p a g e 聚丙爨酸胶凝胶瞧泳 p f部分折叠态 s d s十二烷撼磺酸钠 s e c 篱 阻瑟j 菏 v i 独创性声明 本人声明蹶呈交懿学馁论文怒本太在导爆指鼯下进行的研究工作及取褥的磷究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成暴，也不包含为获褥激姿盘鲎或其传教育机构的学位或证书丽使 用_ 过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己农论文中作了明确的说 明并表示谢意。 学位论文作者签名： 签字目期：够易年二月7 五日 学位论文版权使用授权书 本学豫 淦文佟喾完全了解澎姿盘蓥有关保警、蕊矮学绞论文熬甄定，鸯投保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授 权遗鎏基壁霹叛涛学位论文的衾罄或嫠分蠹客缡入套关数据露遴行检索，可以采耀影 印、缩印或扫描等艇制手段保存、汇编学位论文。 ( 髹密熬学位论文在熬蜜后逶耀本授投褰) 文馋一：特恧 签字基麓：多。哆年二月 2 ，匿 导群签名： 学位论文作者毕业厩去向： 工僚单位：瘩钐瘤等丧多韵确哟 透谖地址： 签字目期 泡话：l 多，始移7 邮编：乡f 乒d 拶。 精氨酸激酶折叠与去折叠机制的研究 1 1 蛋白质折叠 第一章引言 1 1 1 蛋白质折叠研究的意义 对任何一种蛋白质来讲，特定的氨基酸残基顺序以及特定的空间构象是其发 挥其生物学功能的基础。目前人们可以很容易地测定出蛋白质的氨基酸残基顺序 但是人类对于组成蛋白质的氨基酸残基是如何形成一定的空间构象还没有很好 的理解。蛋白质折叠的主要问题就是一级结构和高级结构( 包括二级、三级、四 级结构) 的关系。 根据前人的研究结果，现在已经提出了遗传信息流向的中心法则。在这个遗 传信息流向的中心法则中，人们对于复制、转录、逆转录、翻译等已经了解的比 较清楚。不仅如此，随着d n a 测序技术迅猛发展，目前人们已经基本完成了不 少物种的d n a 测序工作。例如，a c t i n o m y c e t es t r e p t o m y c e sc o e b c o l o ra 3 ( 2 ) ， e s c h e r i c h i ac o l ik - 1 2 2 1 等基因组的测定以及水稻基因组 3 1 和人类基因组部分染色 体上的d n a 的碱基顺序【4 】的测定。随着测序技术的提高以及时间的推移，必将 有更多的基因组被测定。基因组的测定工作的成果可以大幅度提高人们对遗传信 息的了解。但是，基因组测序的结果并不能解释多肽是如何折叠成具有一定空间 构象的蛋白质的。遗传信息本来是储存于一维空间的线形或者环状d n a 分子中 的( 也有些生物体的遗传信息储存于r n a 分子中) ，经过转录、翻译成一维空 间的线形多肽链，只有在多肽链经过折叠，变成具有三维空间结构的、能够发挥 生物学功能的蛋白质以后，才算是完成了一个完整的遗传信息传递过程。如图1 所示。( 图1 - 1 是引自p l o t k i n 等发表的论文【5 1 。) 由于蛋白质的结构和功能是密切相关的，那么知道了蛋白质的结构就可以很 好地预测蛋白质的功能。这使得测定蛋白质的结构成为了一个很重要的课题。要 以目前的研究方法( 晶体x 光衍射技术、核磁共振技术、三维电镜重组技术等) 来解析这么多蛋白质的空间结构，工作量和难度都是很大的。如果能够从蛋白质 的一级结构推测出蛋白质的空间结构，那么将会大大加快对于蛋白质空间结构的 精氨酸激酶折叠与去折叠机制的研究 认识。遮藏要求凌稻女够攫努圭| 热研究蛋白蒺是麴傍旗一级结稼据叠减麓级肇幸鼋 的，遗憾的是目前关于赞白质折爨机制的认识还非常肤浅。所以加强对摄白质折 霾机制酌研究实为必要。 网1 - 1 渍传信息从一维空间到三维空问的转变 生物科学的迅猛发殿，带动了一大批相关产业的兴趣，越采越多的生物技术 产品被用于医药、农业、化工等生产以及人们的日常生游中，比如各种綦因工程 药物、痰苗、酶制剂和食品添加剂等。典中在商业化生产中用原核生物( 如大肠 耪萤) 或蠢低等龚核生秘( 魏酵蹲) 赢效表达重缀蛋白袋产品是最掌霓秘最经济 的方法之一。但是许多基因工程的重组餐白产物是以无生物学活性的聚沉( 包涵 体) 形式存在豹，翔鹰谴褥这些寝达褥戮豹蛋丞疆产餐羧复本应该其有静生耱学 活性是生产中的关键技术之一。由于这些无生物学活性的产物往往是不派确折叠 造成戆，有关蛋自质新叠理论的研究成粜登然能对予恢羹无活洼鬣白质的活性怒 到很好的指导作用。 一般而言，药物是通过其与生物体内的受体相互作用而起效的。多数受体的 本霞是蛋自凄，舞莱了然了受钵豹空阕缝穆，在魏墓礁之上指导药熬熬没诗，裁 有可能设计出特异性更高、毒副作用更小的药物，而且逐有可能大大加快新药的 研铡速度并大箍液降 羲凝药研究豹成本季强风险。通过褥鬣自囊拼叠辊理酌研究翁 2 精氨酸激酶折叠与去折叠机制的研究 缝莱指等薪药彩和薪蛋爨质靛骚裁已经取褥了燕大透鼹，量盛矮蓠景广满潮。 随麓人类黩学水平的提高，人们对于疾病的发生机理有了越来越多的认识， 现在人们已经认识到了有些疾病的发生是由于缀白质的不正确折叠导致的。本成 该爱确援叠夔蛋白屡鸯予影成了不正确瓣辑叠产生了镄误的立体梅象，这些蛋囱 质不能发挥本_ 陂该具有的功能，甚至还可能成为有毒的强白质，导致了疾病的发 生p 1 。1 9 9 7 年谗委尔奖获褥者s t a n l e y b 。p m _ s i n e r 提出p r i o n 一粪蛋自豢在一缀终 构不改变的情况下出现不同的折叠方式( 不同的空间结构) 而引起有关疾病，初 步解释了诸如牛海绵、捩脑病( b o v i n es p o n n f o r me n c e p h a l o p a t h y ，b s e ) 、入窥 一雅氏瘸( h u m a nc r e u t z f e l d t - j a k o bd i s e a s e ，c j d ) 等一系列神经性疾病的病因【8 】。 闳此蛋囱质折叠的研究在医学上亦有重大的理论和应用意义。鬣白质折藏机理的 磅究结聚，将能够絮助认识这些疾病弱致病捉毽，荠为寻找有效鲍治疗方法提供 理论指爵。 i 。1 1 2 爱皇豢李嚣叠綦嚣究的凝述 对于蛋白联折叠机制的研究可以追溯到十九世纪二十年代，但是真正激发人 们对蛋l 匀质折叠机制研究热情的事情还是在a n f i n s e n 游人详细研究了变性牛胰 竣糖核黢酶a 焱还露条传下鸵褥扳叠过程，发瑷该酶霹默皇发辑叠为天然构象， 四对二硫键完全正确装配，酶活性几乎完全恢复，基于此提出了“蛋白质折叠的 信惑包愈在氨蒸黢颓序中”，帮蛋鑫囊静一缀缭牵奄决定商缀结稳煞著名程说翻。 一直以来，这是一个基本的具有重要理论意义和实践意义的生物学问题f 。 尽管说a n f i n s e n 的假说“蛋白质折掇的信息包含在氨基酸顺序中明得到了很 多蟾证搬支持，健是这个假说莠不能聪决下瑟豹问题：氮基酸残基蹶露是如傍决 定蛋白质折叠的。这个问题由于蛋白质的两个特点而变得特别商趣 1 q ：首先，凝 鑫疆戆主链组戏是一禅翡，那么餐篷燕翅憾蔑定整个砉蓐叠豹? 荚次，一条多默链 有可能采取的构象的数目大如天文数字，那么一个特定的顺序鼹怎样在有限的时 阈内巅达其特定的天然结构状态的昵? 这后一个问题其实就麓已经主宰折叠硬 究三十多年的所谓l e v i n t h a t 悖论( l e v i n t h a lp a r a d o x ) ：如果多肽链中的每一个 残基通过随机折叠的方式达到藏天然构象状态，所需的时间是极长的，但是蛋囱 3 精氨酸激酶折叠与去折叠机制的研究 质折叠所需要的时问通常在毫秒到秒的量级上，因此肯定有一种有效的方式来解 决这个悖论口”。不过关于这个有效方式的寻找到目前为止也还没有定论。正因 为这两个问题并没有定论，而且还由于蛋白质折叠问题是一个很重要的问题，也 是很复杂的问题，所以吸引了许多不同领域的科研工作者从各个不同的角度来论 述这两个问题，同时也使得蛋白质折叠机制研究成为当前涉及生物学、化学、物 理学、生物信息学以及计算机科学等多学科交叉的研究领域之一。 1 1 2 1 蛋白质的体内折叠 在体内，新生肽链在核糖体上合成后，需要进行正确的折叠、定位、加工以 及组成一些复合体。蛋白质分子中氨基酸的排列顺序不仅决定了蛋白质的空间结 构，还指导了蛋白质分子的一系列加工过程。新生肽链要实现正确的折叠、定位、 加工以及组成正确的复合体，就要依赖于蛋白质分子在细胞内的折叠过程，依赖 于氨基酸序列本身所包含的信息以及细胞因子对这些信息的识别和调控 1 4 - 1 6 。 尽管目前还无法研究在生物合成过程中肽链的折叠状况，但通过对蛋白质体 外折叠的研究，除非是被某些因素所抑制，否则肽链在合成的过程中将会自发地 折叠。由于蛋白质分子的折叠是一个协同过程，因此在折叠结束时要达到一个有 活力的天然态蛋白状态，必须具备一条完整的肽链，而折叠不完全或不正确的蛋 白质也容易聚合或者被蛋白酶所降解1 7 】。另一方面，过膜蛋白在被转运前需要 保持不完全的折叠状态。对于一些寡聚蛋白，每个亚基自身的折叠也会影响到其 他亚基的折叠情况，这比单体蛋白质分子的折叠更加地复杂。 因此，蛋白质在体内折叠时应该满足以下条件：( 1 ) 在整个肽链合成完毕之 前，新生肽链的不成熟折叠或分子问的相互作用应该被抑制；( 2 ) 某一蛋白质分 子在折叠过程中产生的中问态能被保护，以防止降解作用或其它与折叠相互竞争 的作用：( 3 ) 过膜进入细胞器或分泌出去的蛋白质分子的折叠要这一过程结束后 才能进行；( 4 ) 寡聚蛋白亚基的折叠要相互调节以形成寡聚复合体。 在关于细胞内新生肽链的折叠是在合成完成后才开始的，还是边合成边折叠 的这一问题上，目前存在着一定的分歧1 8 】。一些研究者认为折叠应该在肽链合 成全部完成后才开始，另外一些研究者则认为折叠是随卷肽链的合成同步进行 4 精氨酸激酶折叠与去折叠机制的研究 的，随着肽链的延长，分子具有的天然态构象就越多。邹承鲁提出了一个新生肽 链折叠的模型 1 射。他认为新生肽链的折叠很可能是在翻译过程的早期就已经开 始，随着肽链的延伸，其空间构象不断地进行调整，直到肽链合成完毕，空间结 构进行最后调整，从而达到天然的构象状态。其根据主要是：( 1 ) 体外变性伸展 的蛋白质分子再折叠成天然状态的速度太慢，不能满足快速生物合成的需要。完 全去折叠的蛋白质的体外再折叠一般需要分钟到几小时1 2 们，而体内蛋白质的合 成速度则非常快，如大肠杆菌中合成出具有活性的b 一半乳糖苷酶的时间只要 8 0 一9 0 秒口1 1 ，鼠血清蛋白体内折叠的时间是3 0 秒左右吲；( 2 ) 体外折叠研究发现 一些多肽或蛋白质的n 末端片段能够自发形成一定的二级结构 2 3 , 2 4 ，其中一些 蛋白质分子的n 末端片段的构象与其在天然蛋白质分子中相应片段的构象十分 相刨2 5 1 。腺苷酸激酶的1 4 5 片段能够紧密地结合m g a t p ，说明1 - 4 5 片段的肽 链已经就具有类似于它在天然态中的空间构象口6 1 。b e r g m a n 和k u e h l 2 7 1 也根据他 们的试验结果提出了新生肽链的折叠是从n 末端开始，边合成边折叠的。 同在体外一样，在体内蛋白质的折叠总是同错误折叠及聚沉竞争的。不完全 折叠的蛋白质容易被蛋白酶降解。很早就发现细胞提取物可以帮助体外的蛋白质 折叠。同体外折叠的情况不同，细胞可以通过分子伴侣、折叠酶等方式将蛋白质 折叠过程的旁路可能性降到最低【2 8 2 9 。目前已经有一些蛋白质如荧光素体内折叠 研究的详细报斟3 0 j 1 1 。 分子伴侣最早由l a s k e y 提出，并随后被推广 3 2 , 3 3 。在体内，分子伴侣可能 以此在蛋白质折叠途径中发挥作用，最终释放出折叠好了的天然态蛋白质。分子 伴侣倾向于与一些天然蛋白质内部才有的序列结合起来区别折叠好的和未折叠 的蛋白质【3 4 。 折叠酶包括脯氨酰顺反异构酶( p p i ) 和二硫键异构酶( p d i ) ，有时也称为分子 伴侣。由于脯氨酸残基在结构上的特殊性，其肽键在蛋白质中可以以顺式的形式 存在，几率约为7 【35 1 。脯氨酰顺反异构一般是以一定的速度进行，在体内可以 被p p i 催化，有时可能是蛋白质折叠的限速步骤【3 6 】。在许多蛋白质中，二硫键对 于稳定三级结构及亚基的装配式重要的。p d i 是二硫键依赖的折叠得关键因素。 这方面的先驱性工作是由c r e i g h t o n 在牛胰蛋白酶抑制剂上完成的” 。 5 精氨酸激酶折叠与去折叠机制的研究 1 1 2 2 蛋白质的体外折叠 ( 一) 维系蛋白质结构以及驱动蛋白质折叠的作用力 关于维系蛋白质结构的作用力，目前普遍接受的观点认为，非共价相互作用 是稳定蛋白质三维结构的主要作用力。蛋白质内部主要存在以下四种类型的非共 价相互作用：范德华相互作用、带电集团之间的静电相互作用、极性基团之间的 相互作用( 氢键) 和非极性基团之间的疏水相互作用。 蛋白质内部残基之间的范德华相互作用与残基和水之间的相互作用几乎相 同，因此它对蛋白质结构的稳定性贡献不大口8 1 。在直到某些蛋白质的折叠时， 带电基团之间的静电相互作用可能起着重要的作用 3 9 】，但是由于天然蛋白质中 带电基团并不丰富，因此通常认为静电相互作用在稳定蛋白质构象中不是十分重 要的【帅】。在早期对蛋白质结构的研究中，人们一直认为分子内氢键是稳定蛋白 质构象、驱动蛋白质折叠的决定因素。但在1 9 5 9 年，k a u z m a n n e 4 1 1 以模型化合物 为例，首次阐明了非极性基团的内埋是蛋白质稳定的重要原因。 根据组成蛋白质的氨基酸残基的侧链基团性质，可以将它们分为带电、极性 和非极性三类，疏水的非极性氨基酸在蛋白质中约占6 0 。这些疏水残基被水排 斥，自发地聚集在蛋白质分子内部，就形成了与水隔离的有机相“。因此，疏 水相互作用被认为是驱动蛋白质折叠起始的主要作用力。但是蛋白质的折叠过程 并不仅仅是将非极性残基埋入内部，将极性残基暴露在外面的简单排列过程。实 际上即使对于内埋于分子内部的疏水性氨基酸来说，由于主链上n h 和c = o 基 团的存在，其主链部分形成氢键的几率仍然很大。如果这些残基在分子内部不能 形成氢键，那么这些残基与水溶剂形成氢键的趋势将使蛋白质结构不稳定【4 3 1 。 另外，单独的疏水相互作用无法解释蛋白质结构的特异性和高度专一性。晶体结 构表明，球形蛋白质的内部排列很紧密，与有机分子形成的晶体十分相似。蛋白 质分子内部氨基酸的特定排列是蛋白质结构专一性的基础m 】，这些排列与氢键 的形成紧密相关。典型蛋白质的内部通常是有序地排列着的侧链基团，他们之间 以氢键相连，就像一块块拼合完整的立体拼板。蛋白质内部排列的有序性决定了 它功能的专一性和特异性，这也是为什么埋在分子内部的残基保守性更好的原因 4 5 1 6 精氨酸激酶折叠与去折叠机制的研究 综上所述，疏水相互作用是启动蛋白质折叠并形成内部疏水核心的驱动力， 而与氢键形成有关的分子内部特定的排列是决定蛋白质结构特异性的重要因素。 天然蛋白质稳定构象是在疏水相互作用存在的同时，最大限度满足氢键的形成而 达到的能量最低状态 4 6 4 8 】。 ( 二) 蛋白质折叠研究中的模式分子： 作为蛋白质折叠的模式分子应该具备以下几个特点：1 ) 它在一定小件下的 变性和复性反应应该是可逆的，这是研究蛋白质折叠与去折叠行为的前提；2 ) 要有足够明确的结构组成信息，包括一级结构、二级结构和三级结构信息；3 ) 结构要相对简单。最好已有该蛋白质的基因，可以通过突变和重组技术研究折叠 信息 4 9 1 。常用的模式蛋白质主要有核糖核酸酶t 1 、核糖核酸酶a 、a 一乳清蛋白、 脱辅基肌球蛋白、细胞色素c 、胰蛋白酶抑制因子、肌酸激酶、溶菌酶以及碳酸 酐酶等。随着折叠研究的深入，一些更为简单的多肽成为研究的热点，这些天然 蛋白质的片段或是人工合成的新肽链对研究折叠过程中残疾问相互作用对局部 构象决定由重要意义 5 0 - 5 2 。 1 1 3 蛋白质折叠的研究方法和技术手段 现在研究蛋白质折叠问题主要从两个大方向着手：平衡态的研究和动力学研 究。平衡态研究主要是研究蛋白质不同折叠条件下分子构象特点，从而解释蛋白 质折叠的途径和机制。通常通过改变蛋白质的所处环境的条件使蛋白质处于去折 叠或再折叠的不同平衡状态，然后利用物理学或者生物化学等方法描述相应状态 下的蛋白质分子结构特点以及生物学特征。它的实质是将蛋白质折叠的连续过程 分解成一个个不连续的过程，然后通过这些不连续过程的特征去推测蛋白质折叠 过程应该具有的特征。它是研究蛋白质折叠中问体、蛋白质折叠多态性的有力方 法。由于现在还不能很好地模拟体内( i nv i v o ) 环境，所以目前大多数的实验结 果还只能是体外( i nv i t r o ) 环境下的研究结果。用于研究蛋白质折叠平衡态的技 术方法有很多，例如：圆二色谱法、荧光光谱法( 内源荧光、外源荧光等) 、核 磁共振技术、红外光谱及拉曼光谱法、紫外差吸收光谱法等。 7 精氨酸激酶折叠与去折叠机制的研究 除了用传统的生物物理学手段以外，蛋白质工程技术也是研究蛋白质折叠机 制的重要手段【5 3 1 。这是一种特别重要的策略，因为这种方法能够观察折叠反应 的过渡态( t r a n s i t i o ns t a t e ) 的性质。这种方法的本质其实是检验残基顺序中个别 残基的突变对折叠和去折叠动力学的影响。这种方法已经被用来详细地研究一系 列明显呈二态动力学( t w o s t a t e k i n e t i c s ) 折叠模式的小蛋白质的折叠，其结果提 供了有力的证据表明在折叠过程中的限速步骤涉及到围绕着少数关键残基形成 天然态样( n a t i v e - l i k e ) 【5 4 。这种方法还为折叠的“核化一凝聚”机制( n u c l e a t i o n - c o n d e n s a t i o n m e c h a n i s m ) ，即一旦关键的相互作用形成了疏水核心大部分的蛋白 质结构就可以迅速形成，提供了有说服力的证据5 5 1 。 折叠动力学研究则是研究改变了蛋白质所处环境后蛋白质结构随时间变化 的情况。但是由于蛋白质折叠过程有快有慢，而有些过程发生得很快，因此现有 的技术难以观察、得到结果。各种技术手段都有一定的局限性，因此动力学研究 结果常常受技术手段的限制而具有一定的局限性。 以前受技术的限制，人们只能以大量的蛋白质分子为一个整体研究蛋白质的 折叠问题，现在已经可以用新的技术手段研究单个分子的折叠情况。当用一个蛋 白质分子群体为对象时，观察到的结果实际上是一个群体相互作用后的结果，是 以统计学为基础的，所以传统的以大量分子存在的群体为对象并不能分辨许多可 能的折叠途径，也不能观察到非累积的中间体折叠状态( n o n a c c u m u l a t i v e i n t e r m e d i a t ef o l d i n gs t a t e s ) 5 6 o 现在已经发展出了两种可以用于研究单个蛋白质 分子折叠的技术：荧光共振能量转移( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r , f r e t ) 5 7 】和力光谱学( f o r c es p e c t r o s c o p y ) 1 5 8 , 5 9 。尽管说用荧光共振能量转移技 术研究单分子蛋白质折叠仍然处于初级阶段，但是还是取得了有意义的成果。例 如，s c h u l e r 等人f 删用f r e t 研究三种蛋白质的单分子折叠情况的结果暗示着在 蛋白质折叠过程中存在着能量障碍。力光谱学方法，如原子力显微镜法( a t o m f o r c em i c r o s c o p y ，a f m ) ，已经被应用于研究单分子的蛋白质t i t i n 的折叠问题研 究6 2 1 。进一步的研究发现，用机械力变性蛋白质和用化学方法变性蛋白质是 不同的【5 “。相信用机械力光谱法研究蛋白质折叠问题会有很多有意义的结果。 表1 1 列出了常用的研究蛋白质折叠动力学过程的方法【6 3 】： 8 藕氨酸激酶折叠与去折叠枫铷的研究 液1 1 常用的研究蛋白质折叠动力学过樱的方法 奎 精氨酸激酶折叠与去折叠机制的研究 1 1 4 蛋白质折叠的主要假说和模型 ( 1 ) 框架模型( f r a m e w o r km o d e l ) 按照这种模型 6 4 , 6 5 ，蛋白质的折叠是按等级顺序折叠的，蛋白质折叠过程分 为几个阶段：结构不稳定、相互之间独立存在的二级结构单元首先形成；随后这 些二级结构单元相互靠近、接触，从而形成稳定的二级结构框架；最后按照这些 二级结构框架提供的信息，折叠出现了蛋白质的三级结构。框架结构的核心内容 是：蛋白质在折叠过程中存在三种层次的结构，二级结构、折叠型( f o l d i n g p a t t e r n ) 和三级结构，它们一次形成了蛋白质折叠的三个阶段。框架模型的核心是二级结 构的形成和稳定对于蛋白质的折叠起着决定性作用，且二级结构的形成是独立于 三级结构间的相互作用的。如果三级结构先形成了，那么它们不一定是天然的结 构。u v e r s k y 和f i n k 在分析了4 1 种天然态及部分折叠态的构象特征以后发现折 叠过程种在亲水体积减少和二级结构增加之间有良好的相关性。他们还发现并没 有证据表明致密的中间体缺乏二级结构或者在很伸展的状态下存在着高度有序 的二级结构1 6 6 】。这似乎是表明框架模型走到了尽头，不过框架模型可以看作是 核化一凝聚机制的一种扩展，在其中的二级结构，尤其是n 一螺旋，过度地稳定。 在这种情况下，变性态中明显的残余结构被扩展到中间体状态，速度决定的过渡 态涉及到这些二级结构元件的锚定以及围绕着锚定表面的堆积相互作用的巩固 6 7 】。 ( 2 ) 疏水塌缩模型( h y d r o p h o b i cc o l l a p s em o d e l ) 疏水相互作用【6 8 _ 7 0 1 可以理解为体系中的水分子作用于体系内的非极性的分 子或者基团使它们聚集在一起以减少与水分子的接触。这种假说认为疏水相互作 用是蛋白质折叠的决定性的相互作用。相对于其它更多的特异性的相互作用来 说，非特异性疏水相互作用可以更快形成，这是由疏水相互作用的非特异性的本 质决定的。所以在折叠的起始阶段，蛋白质首先通过疏水相互作用将非极性侧链 内埋于一个较为松散的压缩结构中形成疏水塌缩，然后进一步地调整形成高级结 构。该模型强调了疏水效应在蛋白质折叠中的作用。但是过多的非特异性的疏水 相互作用会阻碍多肽链和侧链的重排【6 7 】。 1 0 精氨酸激酶折叠与去折叠机制的研究 ( 3 ) 扩散一碰撞- 粘合机制( d i f f u s i o n c o l l i s i o n - a d h e s i o nm o d e l ) 该模型 7 1 - 7 3 1 认为蛋白质的折叠起始于伸展肷链上的几个位点，这些位点上能 形成二级结构单元或者疏水簇，称为微结构域( m i c r o d o m a i n ) 。这些局部结构以 非特异性的布郎运动扩散、碰撞、粘附，导致大的结构生成而增加了蛋白质的稳 定性。然后再进一步折叠形成无活性的高度有序的中间体，最后转变为有活性的 完整天然态。该模型已经成功地被应用于解释蛋白质折叠动力学的许多特征。 f 4 ) 成核一凝聚一生长模型( n u c l e a t i o n c o n d e n s a t i o n - g r o w t hm o d e l ) ： 在生物学可行的时间范围内，蛋白质要折叠成其天然态构象必需要尝试其可 能的结构数目；这可以通过核化( n u c l e a t i o n ) 实现，核化可以减少蛋白质搜寻 到达天然态构象所需的途径的数量。这种模型认为肽链中某一区域可以形成“折 叠晶核”，以此为核心，整个肽链继续折叠成天然构象。折叠核的形成是依赖于 一些在进化中保守的氨基酸残基的。核化一凝聚作用调用了在过渡态中的长程和 其它天然的疏水相互作用来稳定别的弱的二级结构。而过渡态也由于远程的三级 结构和二级结构的组合得以形成稳定的折叠7 4 1 。该模型 7 4 - 7 6 1 可能适用于一些两 态折叠过程。 尽管说现在已经有很多的模型和假说被提出来用于解释蛋白质折叠问题，然 而还没有一种普遍使用的模型和机制，因为所有的这些模型或者假说都只是从一 部分实验事实出发提出来的。b a l d w i n 和r o s e 根据大量的研究成果将蛋白质折 叠途径总结为两种形式：等级折叠机制( h i e r a r c h i cm e c h a n i s m ) 和核化机制 ( n u c l e a t i o n m e c h a n i s m ) 。所谓等级折叠 7 7 _ 7 引是指在蛋白质折叠过程中，折叠起始 于局部序列和稳定性边际的结构，这些局部的结构相互作用形成复杂性逐步增加 的中间体并最终成长成为天然的构象。符合等级折叠机制的模式蛋白质有：a 乳 清蛋白( q - l a c t a l b u m i n ) 、脱辅基肌球蛋白f a p o m y o g l o b i n ) 、核糖核酸酶h ( r n a s e h ) 、芽胞杆菌r n a 酶( b a m a s e ) 和细胞色素c ( e y t o c h r o m ec ) 等。然 而在蛋白质折叠中也存在着非等级折叠机制，例如，在b - l a c t o g l o b u l i n 的再折叠 研究中就发现存在着非等级折叠机制【7 9 1 。所谓的非等级折叠机制( n o n - h i e r a r c h i c m e c h a n i s m ) 是指这样一种过程，折叠过程中三级相互作用不仅仅稳定局部结构， 精氨酸激酶折叠与去折叠机制的研究 而且还在实际上决定着它们【8 。核化折叠机制的主要特征：折叠的过渡态只涉 及几个与核化有关的残基；参与核化的残基散布在氨基酸序列中；没有动力学中 间体。符合核化机制的蛋白质有胰蛋白酶抑制因子i i 和热休克蛋白b 等。从实 验的角度来看，这两种折叠机制的最大区别在于折叠过程中有无中间体的存在。 目前多数人对折叠机制的理解倾向于等级折叠机制，而认为那些符合核化机 制的蛋白质折叠实验并不能充分证明折叠中间体不存在，可能的原因是这些蛋白 质的折叠中间体出现于折叠的极早期过程中，以现有的方法还没有捕捉到。这一 方面反应了蛋白质折叠机制问题的复杂性，但是从另外的角度看，也可以理解为 蛋白质折叠问题依然是一个很值得研究的课题，对蛋白质折叠问题的研究必将出 现很多富有意义的成果。 1 1 5 蛋白质折叠的中间体 目前大多数关于蛋白质折叠的研究结果是从一些比较小的、单结构域的、可 以迅速折叠的蛋白质上得到的。不过现实之中更多的蛋白质是比较大的( 含有超 过1 0 0 个氨基酸残基) 、多结构域的蛋白质，这些蛋白质的折叠往往是不完全符 合那些小的蛋白质的折叠规律的。尽管说那些决定蛋白质折叠的基本规则可能是 普遍适用的，但是那些大的蛋白质分子的折叠过程中可能还是存在着不同于小的 蛋白质分子折叠的单亚基或者多亚基的折叠中间体【8 1 斟】。 关于蛋白质折叠实验研究的一个重要方面是检测和描述蛋白质部分折叠状 态，包括在动力学实验中观察到的稳定存在的平衡态和过渡态中间体。对于几种 蛋白质而言，在温和的变性条件下普遍存在部分折叠的平衡态中间体，称之为熔 球态中间体 8 5 ，8 6 。熔球态是目前研究最为广泛的一种中间体结构，主要指那些 具有与天然态相似的紧密程度，但其结构的稳定性，尤其是侧链基团的稳定性与 天然态相差较大的一类中间体结构 8 7 】。 熔球态中间体被认为是蛋白质折叠过程中普遍存在的一类结构【6 ”。其主要 特征如下：含有丰富的二级结构；具有相对松散的三级结构。虽然熔球态中间体 的三级结构堆积较松散，但其疏水核心仍然存在，且与天然态类似，二级结构的 1 2 精氨酸激酶折叠与去折叠机制的研究 相对位置也基本未变，只是一些区域( 包括疏水核在内) 具有更大的运动性。此外， 一些蛋白质可以形成多亚基的熔球态中间体，说明熔球态不仅保留着类天然的卷 曲三级结构，其四级结构也没有完全破坏，由此看来一维氨基酸序列对三维蛋白 结构的编码信息在熔球态中间体出现时就已大部分表现出来8 8 】。另外，熔球态 中间体还具有特定的表面性质，这是指熔球态中间体具有大量暴露的疏水表面【8 9 和与天然态类似的结合单克隆抗体的能力【蚓。大量暴露的疏水表面表明熔球态 中间体的三级结构的特异排列被破坏，整体构象较天然态松散，疏水内核有较大 的运动性，更易被溶剂所接近，这也是熔球态中间体对疏水荧光染料a n s 有很 强亲和力的原因，而且熔球态自身有形成非共价聚合体的倾向 9 1 】。与天然态类 似的结合单克隆抗体的能力则表明熔球态中间体具有相当数量的类天然表面。在 熔球态中间体中，类天然疏水核的存在表明非极性基团之间的疏水相互作用并无 明显的破坏，所以疏水相互作用仍是维系熔球态稳定的主要因烈8 ”。由于熔球 态中间体在结构上的不完整性，因此它们绝大多数不具有特定的生物活性。熔球 态中间体的紧密程度也类似于天然态。通过小角度x - 光散射和粘度测定 9 2 l 、分 子筛凝胶过滤m 和脲梯度电泳9 4 1 等实验方法，均证实熔球态中间体的表观体积 接近于天然态。但是最近的研究发现，对于不同的