（微生物学专业论文）magnetospirillum+gryphiswaldense+msr1铁吸收调节蛋白furlike基因克隆及功能分析.pdf

中文摘要 趋磁细菌是一类能在胞内合成纳米磁小体的原核微生物探讨其大量培养条件、磁小体合成 机制以及磁小体的应用策略，成为目前人们关注的熟点趋磁细菌胞内铁元素含量最高可达3 ， 超过非磁细菌( 如：ec o l d 的1 0 0 倍它们具有商效的铁吸收系统和适宜的调控机制，既能够 保证细胞主动吸收大量的铁离子又能有效地限制铁离子的毒副作用，保证细胞正常的生长和代 谢。铁吸收调控蛋白( f u r ) 是铁代谢的全局调控因子，研究趋磁细菌的向，基因，对阐明铁吸收 和磁小体合成机制具有重要意义。 本文以m a g n e t o s p i r i l l u mg r y p h i s w a l d e n s em s r - i 材料，采用 e m b l 3 和柯斯质粒p k c 5 0 5 为 载体，构建了m s r 1 的两个基因组文库。以趋磁螺菌胍m a g n e t o t a c t l c u mm s 1 中推测的u r 序 列做探针( d i g - m m f u r ) ，从文库中钓出含有m s r - 1 正i r 基因的3 6 3 3 b p 片段，经测序并在n c b l 中比对发现，该片段含有4 个o r f s 。其中，o r f 2 长度为4 2 0 b p ，是编码1 3 9 个氨基酸的血， 其上游是一个编码4 0 6 个氨基酸的2 ，2 峭基丙烷双加氧酶( 2 - n i t r o p r o p a n ed i - o x y g e n a s e ，n p d ) 的基因，下游编码2 个未知蛋白的序列。经分析显示，f u r 含有一个h h d h 保守结构域和一个 保守的金属离子结合位点。对蛋白高级结构预测表明：尽管该蛋白与已知p s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a 的f u r 氨基酸同源性只有2 7 - 3 ，但二者n 端结构在空间构型上极为相似，该结构是与d n a 结 合的区域；c - 端则差异较大将m s r i 的加基因在体外表达成功，发现其虽然可以与大肠杆菌 f u r - b o x 结合，但在功能上不能互补大肠杆菌的 | r 突变体 为进一步分析f u r 的功能，构建了自杀载体( f u r ：k a n ) ，经同源重组双交换获得肛 g r y p h i s w a l d e n s e f u r 突变体( d f h - i ) 电镜观察显示，d f h - i 丧失合成磁小体的能力，而胞内聚 孵基丁酸f m - m ) 颗粒有所增加。原子吸收光谱分析表明：无论是在含低铁还是高铁的培养基中， d f h - 1 胞内铁含量始终维持在0 0 3 7 的水平，低于野生型菌株1 0 倍以上；d f h 1 的生长可以 耐受1m mh 2 0 2 ，比野生型耐受h 2 0 2 的能力增加了5 倍。 本文首次克隆了趋磁螺菌m s r 1 的f u r 基因并分析了它的功能。研究结果证明：趋磁螺菌 与非磁细菌的f u r 蛋白的g 端结构上存在显著差异，导致它们的功能有所不同。m s r - 1 的血r 基因突变，削弱了细胞对铁的吸收，不能合成磁小体。推测m s r 1 的f u r 的功能与非磁细菌不同， 为细胞铁吸收的正调控因子。血r 突变体胞内铁含量降低但对h z 0 2 耐受性增强和环境中一定浓度 的铁( 2 0 # m 以上) 和低氧条件，有利于促进趋磁螺菌细胞生长和磁小体台成的事实说明，f u r 在趋磁细菌细胞内对铁和氧代谢的调控是偶联的。 关键词：m a g n e t o s p i r i l l u m g r y p h i s w a l d e n s e m s r 1 ，铁吸收调节蛋白，基因组文库，磁小体， 基因敲除 a b s t r a c t t h es o - c a l l e dm a g n e t o t s c t i cb a c t e r i aa r ep r o k a r y o t e sw h i c hc a ns y n t h e s i z em a g n e t i cp a r t i c l e s ( m a g n e t o s o m e s ) i nc y t o p l a s m a tp r e s e n t t h eb i o - m i n e r a l i z a t i o np r o c e s sa n dp o t e n t i a lu s e so f m a g n e t o s o m eh a v ei n t r i g u e ds c i e n t i s t st oe l u c i d a t et h em e c h a n i s mo fm a g n e t o s o m ef o r m a t i o na n dt o d e v e l o pt h eb a t c hc u l t u r et e c h n i q u e t h e r ei su pt o3 i n t r a - c e l l u l a ri r o nc o n t e n ti nm a g n e t i c b a c t e r i a ，1 0 0 - f o l dm o r et h a ni nec o i l ，w h i c hi n d i c a t e st h e r e f o r et h a ta ne f f e c t i v es t r a t e g yh a sb e e n i n v o l v e di nc a p t u r e i n gi r o na sw e l la sr e s t r i c t i n gt h et o x i ce f f e c t so fi r o n f e r r i cu p t a k er e g u l a t o r ( f u r ) i sag l o b a lc o n t r o lf a c t o rt ok e e pi r o nh o m e o s t a s i si no t h e rb a c t e r i a , s u c h ec o i l i n v e s t i g a t i o no f m a g n e t o t s c t i cb a c t e r i a f u rf u n c t i o ni se x p e c t e dt oc l e a ro u tt h em e c h a n i s mo fi r o n - u p t a k ea n d m a g n e t o s o m es y n t h e s i s i nt h i ss t u d i e s , t w og e n o m i cl i b r a r i e so fm a g n e t o s p i r i l l u mg r y p h i s w a l d e n s em s r 一1w e r e c o n - q r u c t e du s i n g e m b l 3a n dc o s m i dp k c 5 0 5 勰v e c t o r s r e s p e c t i v e l y a3 6 3 3 b po fd e s i r e d f r a g m e n tw a si s o l a t e df r o mt h ec o sl i b r a r yw i t h 丘rn e c l c o t i d e sp r o b eo f mm a g n e t o t a c t i c u mm s - 1 ( n a m e dd l o - m m f u r ) 4o r f sw e r et e n t a t i v e l yi d e n t i f i e db yo r ff i n d i n g sa n db l a s ta l i g n m e n t o nn c b lo r f 2c o n s i s t so f4 2 0 b pa n dc o d e sf u rp r o t e i n ( m g - f u r ) c o n t a i n i n 9 1 3 9a m i n oa c i d r e s i d u e s o r f ii sl o c a t e do i lt h eu p s t r e a mo ff u rg e i l e ，w h i c he n c o d e sah y p o t h e t i c a l 乏 2 - - n i t r o p r o p a n ed i o x y g e n a s eg u n e ( n p d ) c o n t a i n i n g4 0 6a m i n oa c i dr e s i d u e s s e q u e n c ea n a l y s i s s h o w e dt h a tf u rp r o t e i no fm s r - 1c o n t a i n e dah i g h l yc o n s e r v e dh - d - h - dm o t i fa n dam o d i f i e d f e z * z n “b i n d i n g s i t e h - t e r m i n u ss t r u c t u r eo f m g - f u rw a sp r e d i c a t e dt ob ec l o s e l ys i m i l a rt ot h a to f p s e u d o m o n a sa u r e g l y l o s a ( p a - f u ob ys w i s s - m o d e lw h i c ha c t s 勰t h ed n a b i n d i n gm o t i f , e v e i l t h o u g hs e q u e n c eo fm g - f u ri sa l i g n e dt ob e2 7 3 i d e n t i t yw i t hp a - f u r h o w e v e r , s t r u c t u r eo f c - t e r m i n u sw a su n a b l et ob es h o w nd u et ot h el o ws i m i l a r i t y t h e f u rg e n eo fm s r 1w a se x p r e s s e d s u c c e s s f u l l y me c o l ia n dg e lr e t a r d a t i o na s s a ys u g g e s t e dt h a tm g f u rw e r ea b l et ob i n dt of u r - b o x o f ec o l i b u t i t d i d n t c o m p l e m e n t ec o i l f u r m u t a n t ( h 1 6 8 1 ) t od e t e r m i n e dm g - f u rf u n c t i o n ，as u i c i d ep l a s m i d ( p s u p 2 0 2c o n t a i n i n gt h ed i s r u p t e d f u r ：k a n ) w a sc o n s t r u c t e da n daf u ，m u t a n to fm g r y p h i s w a m e n s ew a so b t a i n e db yh i - c o n j u g a t i o n r e c o m b i n a t i o n , d e s i g n a t e dd f h 1 n om a g n e t o s o m eb u tm o r c8 - p o l y h y d m x y b u t y r a t e ( p 耶) p a r t i c l e sc o u l db eo b s e r v e di nd f h 1u n d e rt h et r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ，c o m p a r e d w i t ht h ew i l dt y p es t r a i nm s r - 1 a n a l y s i so fi r o nc o n t e n ti n d i c a t e dt h a ti tw a sk e p tc o n s t a n t l ya b o u t 0 0 3 7 l e v e li nd f i - i 一1 ，g r o w ni nt h er e g a r d l e s so fl o wo rh i g h - i r o nc o n d i t i o n s ，w h i c hw a s1 0 - f o l d l e s st h a nt h a to fm s r - 1 h o w e v e r , d h t - 1w e r ea b l e1 0r e s i s tl m m h y d r o g e n - p e r o x i d e ，5 - f o l dm o r e t o l e r a n c et h a nt h ew i l dt y p es t r a i nm s r - 1 i nt h e s es t u d i e s a f u rg e n ew a sc l o n e da n dc h a r a c t e r i z e di n 脱g r y p h i s w a l d e n s e f u ro fm s r 1 w a sd i s t i n g u i s h e df r o mt h o s eo fi l o o m a g n e t i cb a c t e r i ad u et ot h ed i v e r s i t yo fc - t e r m i n u s t h e d i s r u p t i o no f f u rg e n ea f f e c t e ds e r i o u s l yi r o nu p t a k ea n dc o n s e q u e n t i a l l yr e s u l t e di nt h ed e f i c i e n c yi n m a g n e t o s o m ef o r m a t i o n f u ra c t e dp r e s u m a b l ya sap o s i t i v er e g u l a t o ro ni r o nu p l a k ei nm s r 一1 t h e e n h a n c e dr e s i s t a n c et oh 2 0 2w a sr e s u l t e df r o mt h el o wi n t r a - c e l l u l a ri r o nc o n l c n tl o wo x y g e na n d h i g hi r o nw e r ea b l et op r o m o t em s r - ig r o w t ha n dm a g n e t o s o m es y n t h e s i s t h o s ef a c t ss u g g e s t e d t h a tb a l a n c ew a st i g h t l yk e p ti nh a r m o n yb e t w e e ni r o nm e t a b o f i s ma n dt h eo x i d a t i v es t r e s sb yf u r p r o t e i n k e yw o r d s ：m a g n e 幻s p i r i l l u mg r y p h i s w a l d e n s em s r 1 ，f e r r i cu p t a k er e g u l a t o r ( f u r ) ，g e n o m i c h i b 】m r y , m a g n e t o s o m e a b b r e v i a t i o n a m p ：a m p i c i u i n a p ：a p r a m y c i n a t p ：a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e b p ：b a s ep a i r s c i a p ：a i k a 【i n ep h o s p h a t a s e ，c a l fi n t e s t i n a l d i g ：d i g o x i g e n i n d n a ：d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d n t p ：d e o x y r i b o n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e e d t a ：e t h y l e n e d i a m i n et e t r aa c e t i ca c i d i p t g ：i s o p r o p y l t h i o 一8 - d - g a l a c t o s i d e k a n - k a n a m y c i n k b ：k i l o b a s c s ( p a i r ) k d a ：k i l o d a l t o n m c s ：m u l t i p l ec l o n i n g s i t e s m r n a ：m e s s e n g e rr n a o r f ：o p e nr e a d i n g f r a m e o r i ：o f i g i no fr e p l i c a t i o n p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r b s ：r i b o s o m eb m d m gs i t e r e p ：r e p l i c o n r n a ：r l b o n u c l e i ca c i d r n a s e ：r i b o n u c l c a s e r p m ：r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e s d s ：s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s l m ：s o d i u m - l a c t i cm e d i af o rc u l t u r i n gm a g n e t i cb a c t e r i a s s c ：s t a n d a r ds a l i n ec i t r a t e t c ：t e t r a c y c l i n e t r i s ：t r i s ( h y d m x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e x - g a h5 - b m m o - 4 - - c h l o m - 3 - i n d o l y l - b - d - g a l a c t o s i d e g e u es y m b o l b a ：b - l a c t a m a s er e s i s t a n c eg e n e f u r ：f e r r i cu p t a k er e g u l a t o r 妣：b - g a l a c t o s i d a s eg e n eo f e c o l i n p d ：z2 - n i t r o p r o p a n ed i o x y g e n a s e 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：多镧 时间：翮年彳月。侣 | 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中困农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 导师签名 巷弘 时间：砷年么月日 时问：五州叩年占月厂日 中国农业大学博士论文 研究背景综述 第一章趋磁细菌的研究进展( 论文研究背景综述) 外磁场如地磁场影响生物的生活习性，例如鸽子，蜜蜂等生物方向定位性等。事实上，许多 生物体组织内含有磁小体，如海生软体动物甲贝、蜜蜂的腹部、家鸽的头部、海豚、蝴蝶、藻类 甚至在脊椎动物及人脑的海马组织中均含有磁铁矿颗粒( v e t o , ) ( k r i s c h v i n k , j l e t a l ，1 9 7 8 ：g o d d , j l 甜a 1 。1 9 7 8 ；w a l c o t t , c e t a l ，1 9 7 9 ；t o r t e s ，d ee t a l 。1 9 6 8 ：r r t s c h v i r l k j l 1 9 9 7 ；k r i s c h v i n k , j l e t a l 。1 9 9 2 ) 。b l a k e m o r e 于1 9 7 5 年首先在淤泥中发现并分离了磁细菌磁细菌的陆续发现引 起了科学家对生物的趋磁性、磁小体合成机制和磁小体应用的普遍研究热情。磁细菌不是分类学 名词、而是一类能够沿地磁场运动的原核微生物总称( b l a k e m o r e ，r p ，1 9 7 5 ) 。几乎所有的磁细 菌都能在胞内合成由囊膜包被的磁性颗粒即磁小体( m a g n e t o s o m e ) ；其成分主要是f e 3 0 4 或f b s 4 ( b a l k w i n , d le t a l 。1 9 8 0 ) 。大多磁细菌存在于水体淤泥环境，这与其微好氧特性是密切相关的。 虽然磁细菌已发现3 0 余年，但其研究进展却相当缓慢，尤其是磁小体的合成机制仍不清楚。 1 1 、趋磁细菌的特征 1 1 1 趋磁细菌的形态、分布及系统发育 趋磁细菌( m a g n e t o t a c t i cb a c t e d a ) 是一类形态多样( 球形、杆状、弧形、螺旋形等) ( 图1 - 1 ) ， 营养要求苛刻的异养型原核生物( b l a k e m o r e ，r p ，1 9 8 2 ) 。趋磁细菌大小为：螺菌长4 - 6 t t m 。宽 0 2 5 - 0 7 5 1 j j n ，培养时间较长的可达2 0 t t m ；弧菌( m v - 1 ) 长1 - 3 t t m ，宽0 2 - 0 a f t r a ：球菌直径1 - 2 t t m ； 杆菌宽l l x m ，长5 s t t m 。尽管趋磁细菌形态多种多样，但它们有很多共同的特征：革兰氏阴性， 含鞭毛、能运动微好氧或厌氧，能合成胞内磁小体。 图1 - 1 不同形态的趋磁细菌( d s c h i l l e r , 1 9 9 9 ) f i g 1 1 t h ev a r i o u sm o r p h o l o g i c a lm a g n e l o t a c t i c u mb a c t e r i a 趋磁细菌分布极其广泛：从南半球到北半球，乃至赤道等不同地理位置的不同区域的池塘河 流、湖泊、海洋，土壤甚至是火星的陨石上等均发现有磁细菌存在( b l a k e m o r e ，r ee t4 f j1 9 8 0 , b a z y l i n s k i , d ae t 口l1 9 8 8 ；f r a n k e l ，r b e ta l ，1 9 8 1 ；s p a r k s ，n h c ，e ta t , 1 9 8 9 ；s p a r k s ，n h ce t 中国农业大学博十论文 研究背景综述 a 1 ，1 9 8 6 ；卫杨保等，1 9 9 4 ；f a r i n a ，m e t a l ，1 9 9 0 ；f a s s b i n d e r , j w - e ，e t a l ，1 9 9 0 ；范国昌等1 9 9 6 ) 。 但从分布位置来看，大多数磁细菌分布于水体环境3 5 4 7 米深的有氧无氧的交界面( o x i c - a n o x i c t r a n s i t i o nz o n e ) ( b a z y l i n s k y ，d a ，2 0 0 4 ) ：并且为严格的微好氧或厌氧的只有在窄微氧范围才能合 成磁小体。微好氧以及营养苛刻特性也是限制其分离纯培养和遗传操作困难的主要因素。迄今， 从不同环境中分离近3 0 株趋磁细菌( 包括纯化的、未纯化的、不能培养的) ；而已得到纯培养的 趋磁细菌有趋磁球菌( m c - i ) 、趋磁弧菌( m v - i ，m v - 2 ，m v - 4 ) 和趋磁螺菌( m a g n e t o s p i r i l l u m m a g n e t o t a c t i c u mm s - 1 ，m a g n e t o s p i r i l l u mg r y p h i s w a l d e n s em s r 1 ，m a g n e t o s p i r i l l u ms p s t r a i na m b - 1 ， m a g n e t o s p i r i l l u ms p m g t - 1 ) 等( m o e n c h ，t t 。1 9 7 8 ) 。 图1 - 2 趋磁细菌的系统进化图( s p 血g ，s ，e ta l ，1 9 9 5 ) f i g 1 - 2 p h y l o g e a c t i c f l e eo f m a g n e t a t a c t i e b a c t e r i a 趋磁细菌并不是一个独立的分类学名词，它是所有具趋磁性的细菌的总称。在新版的伯杰氏 系统细菌学手册上趋磁细菌分别被纳入m a g n e t o s p i r i l l u m 和m a g n e t o b a c t e r i u m 属，其中 m a g n e t o s p i r i l l u m 中有两个种m a g n e t o s p i r i l l u mm a g n e t o t a c t i c u m 和m a g n e t o s p i r i l l u m 2 中国农业大学博士论文研究背景综述 g r y p h i s w a l d e n s e 为该属标准菌株。最初，趋磁细菌m s - 1 ，m g t - 1 和a m b - 1 归入a q u a s p i r i l l u m 属内( m a r a t e a , d ，e ta 1 ，1 9 8 1 ) s c h l e i f c r 发现m s r 一和a q u a s p i r i l l u mm a g n e t o t a c t i c u m 形态和亚 显微结构相似它们的1 6 sr d n a 并测序发现两者间的序列同源性达9 4 1 ，建议设立一个新属 m a g n e t o s p i r i l l u m 属，标准株为m a g n e t o s p i r i l l u mg r y p h i s w a l d e n s es p n o v m s r - 1 ( s d t l e i f e r , k h e t a 1 9 9 1 ) 趋磁细菌对营养的苛刻要求及微好氧、厌氧等特性，导致目前分离纯化趋磁细菌仍然 十分困难。s p r i n g 等人采用与1 6 sr r n a 序列互补的片段和荧光全细胞杂交方法把非纯培养的趋 磁细菌多种群鉴别到单个细胞水平，这为研究趋磁细菌的分类提供了新的方法。通过对趋磁细菌 少数已分离的菌株进行分类地位的确定及对部分未纯化的趋磁细菌进行1 6 sr d n a 或1 6 sr r n a 的序列分析从而确定它们的系统进化位置( 图1 2 ) 。 s c h u l e rd 等分离到m s m - 1 ，m s m - 3 ，m s m - 4 ，m s m - 6 ，m s m - 7 , m s m - 8 ，m s m - 9 等7 个趋磁螺菌 菌株，并比较它们与m a g n e t o s p i r i l l u mm a g n e t o t a c a c u m 和m a g n e t o s p i r i l l u mg r y p h i s w a m e n s e 的 1 6 s r r n a 的相似性，发现m s m 3 和m s m _ 4 与m m a g n e t o t a c t i c u m 和胍g r y p h i s w a l d e n s e 的相似 值低于9 7 5 ，因而有可能属于该属中的新种( s c h i l l e r , d ，e l a l , 1 9 9 9 ) 。d e l o n g 等对r r n a 序列 的小亚单位系统进化进行了分析。发现合成f e 3 0 4 类型的趋磁细菌同变形细菌的a 亚门有关，而 产生f b s 类型的非纯培养趋磁细菌则与变形细菌d 亚门的硫酸盐还原细菌有关。这表明趋磁细 菌的起源是多线系的，并且合成f e 3 0 型和f b s 4 型的趋磁细菌是各自独立进化的( d e l o n g , e f ， e l a , 2 5 9 ) 。 1 1 2 磁小体的性质与特点 趋磁细菌细胞内含有呈一条或多条链状排列的磁小体链( m a g n e t o s o m ec h a i q ) 。磁小体的特点 是：囊膜包被、成份均一、大小一致、形态和胞内排列方式具有种属特异性( b a z y l i n s k i ，1 9 9 5 ) 。 这表明磁细菌合成磁小体的合成过程又称为生物矿化作用( b i o - m i n e r a l i z a t i o n ) 受到的严格的调 控( l o w e n s t a m , h 九。1 9 8 1 ) 。 磁小体的成分成分主要是铁氧化物或铁硫化物( f e 3 0 4 或f e 3 s 4 ) ( m a n n , s ，e ta 1 ，1 9 9 0 ；f r a n k e l , r b ，e t a , 1 9 7 9 ；h e y w o o d ，b re t 4 1 9 9 0 ) ：有些趋磁细菌合成的磁小体含f c s ，但f c s 是合成 f e 3 s 4 的前体物( p 6 s f a i , m ，e ta l ，1 9 9 8 ) 。迄今为止，只发现一株细菌的磁小体既有铁氧化物又有 铁硫化物成分，但该菌目前还不能分离纯培养( b a z y l i n s k i ，d a ，e t 4 01 9 9 3 ；b a z y t i n s k i , d ae t a 1 9 9 5 ) 。由此可见，磁小体的成分组成同样也是受到严格调控的化学过程；磁小体的成分高度均 一：即磁小体晶体内部几乎没有其他金属离子和蛋白而且磁小体的成分不会因为培养条件和培养 基组成变化而改变( m e l d m m , f c 。e t a l ，1 9 9 3 ) 。 磁小体的形态不同趋磁细菌菌株产生的磁小体形态是多样的；如立方体、八面体形、棱面柱 形，泪滴状( 或子弹形) 等( 图1 - 3 ) 。但是在同一菌株或同一细胞内，磁小体的形态是专一的并具 有种属特异性( b a z y l i n s k i , d a ，1 9 9 5 ；t o w e ，k m ，e t 4 l1 9 8 1 ；b a z y l i n s k i , d a ，e t a l ，1 9 9 4 ；m a n n , s ，e t a l ，1 9 8 4 ；b u t l e r ，r f ，e t a l ，1 9 7 5 ) 晶体结构有平截六面体棱柱形和平截八面体棱柱形等( 图 1 - 4 ) 。 3 中国农业大学博十论文研究背景综述 蹦1 3 趋磁细菌的磁性颗粒的形态结构( s c h u l e rd t 9 9 9 ) f i g 1 3 t h e v a r i o u ss h a p e o f m a g n e t o s o m e s 嚣鞋奇鸯 o j o t 4 n * h t 蝌n 褂一t 1 h 珥 a 埘嘲吲1 1 1 日目”删i 州小1 q 目”舢 吲讲 l 图1 4 磁小体晶体结构( b a z y l l n s k i b r ，2 0 0 4 ) f i g 1 - 4 ，c r y s t a ls t m c i t l t c so f m a g n e t o s o m e s 磁小体大小大小均匀，一般为4 0 1 2 0 n m ；其大小属于永久单磁畴( s i n g l em a g n e t i cd o m a i n ) 范 围。更小的晶体成为超级顺磁物而并非永久磁性物。尽管同一细胞内的磁小体大小可能不一致， 但其大小分布范围却很小、长宽比率是相同的( d i a z r i c c i ，j c ，e ta 1 ，1 9 9 2 ；d e v o u a r d ，b c t4 ， 1 9 9 8 ) ， 囊膜包被囊膜使磁小体能以单颗粒形式存在，很少聚集在一起。大多数趋磁细菌中的磁小体呈 链状( 单链或多链) 沿细胞长轴排列而形成生物磁条而能感应微弱的地磁场。f r a n k e l 等发现位于细 胞两端的磁小体通常比中间的磁小体小，他由此推测磁小体链是由中间向两端“生长”( f r a n k e l ， r b ，e f 口l 1 9 8 1 ) 。 - 4 中国农业大学博士论文研究背景综述 l 1 1 a 趋磁性( m a g n e t o t a x i s ) 在大多数趋磁细菌胞内，磁小体呈单，多链状排列。磁力相互作用使其呈链状排列同时形成双 极磁力矩。磁力矩与地磁场的相互作用使得细胞能够克服热力学的布朗运动，因而趋磁细菌总沿 地磁力线而运动到一定的栖息地( 既不吸引也不排斥5 ( 1 f i n , & e ，e t a ，1 9 9 8 ) 。 实际上，趋磁细菌并不顺或逆磁场梯度游动。观察表明，趋磁细菌在水滴中有两种运动方式： 双向运动和单向运动。双向运动一以趋磁螺菌( m a g n e o s p i r i l l u ms p p ) 为例，细菌可以沿或逆磁力线 运动。并可随时改变方向或顺或逆；单向运动一以海洋趋磁球菌为例，细菌总是只沿磁力线的某 一个方向( f r a n k e l , r b ，1 9 8 4 ) 。在北半球( 地磁南极5 ，大多数趋磁细菌总是顺地磁场磁力线向 北运动；在南半球( 地磁北极) ，则逆地磁场磁力线向南运动。其原因是：在北半球，磁场方向 沿地平面向下倾斜；而南半球则沿地平面向上倾斜，因此南北半球的趋磁细菌总是沿淤泥向下运 动( 氧浓度递减5 从而寻找到适宜的氧浓度栖息地。 大多趋磁细菌栖息于水体环境的有氧，无氧的交界面。在水体环境中，营养物质总是垂直递增； 而氧则垂直递减的。趋磁性如何引导细菌至严格的微好氧地带昵? 趋磁性与趋氧性是否有关联? 实验证明，趋磁细菌( f b 0 4 磁小体5 的趋磁性与趋氧性总是相关的。趋氧性即在氧梯度环境中， 细菌总能迁移到生存最适的氧浓度地带；单向运动的趋磁细菌能改变其运动方向而至还原性环境 ( 低氧浓度5 。因此，趋磁性，趋氧性( m a g n c t o - a e r o t a x i s ) 是相关联的、一致的、协同作用的( b l a k e l n o r e , rp e t a l , ，1 9 8 0 5 。 趋磁细菌中存在两种趋磁趋氧机制，即极性或轴性趋向机制( 图1 5 ) 。极性趋磁，趋氧性机 制单向运动，即细菌总是沿磁场的某一个方向运动( 南或北) ，如趋磁球菌；轴性趋磁趋氧 性机制一双向运动，即细菌能够沿磁场的两个方向运动( 南和北) ，如趋磁螺苗( b l a k e m o r e ，r p ， da ，1 9 8 0 ) 。正是由于趋磁细菌体内含有这种强磁性的铁化合物颗粒，使它对磁场敏感，表现出 趋磁性行为而且其运动方向总是和外界磁场的磁力线方向保持一致( f r a n k e l , r b ，甜a ，1 9 9 7 5 。 这类细菌还有另一种趋性行为即趋氧性，它们总是聚集在某一氧浓度适合的环境中，因而猜测趋 磁性是为了避免高浓度氧的毒害作用的假说。 图1 - 5 极性和轴性趋磁，趋氧性运动( b ，b a z y l i n s k i2 0 0 4 ) f i g1 5 m a 驴岫嘣 a c t i cs w i m m i n go f m a g m cb m m i l 5 中国农业大学博士论文研究背景综述 1 2 、磁小体的合成机制 一般认为磁小体合成过程包含铁的吸收、积累、沉积和生物矿化等步骤。因此，要想阐明磁 小体合成机制就必须了解磁细菌是如何调控铁离子的吸收运输，积累储存，以及合成f e 3 0 4 或 f e ，s 4 颗粒的过程，甚至蛋白如何参与控制磁小体的形态的。 l 2 1 铁元素的吸收 生物体绝对需要铁元素，因为铁参与很多重要的生理生化反应；如光合作用、固氮作用、呼 吸作用和t c a 循环等( b e m e r t , h ，e ta 。1 9 9 7 ) 。当然铁的作用依赖于吸附它的蛋白和酶的催 化作用，如铁硫氧还蛋白、血红素等。在生理条件下，铁主存在两种离子形态：氧化态f g + 和还 原态f 皆+ 。根据配体的作用，两种形态均可以被微生物所吸收。 尽管铁是地壳中含量最多的元素之一( 含量第四) ，但铁元素主要以固态的氧化物和水化物 形式存在。因此，生物体获取铁元素很困难。尽管f 矿溶解率相对较高( 1o 1 m ，p h 7 0 ) ；但由于 0 2 的氧化作用因而外环境中铁主要以f c 3 + 形式存在，其溶解率特低( 1o 1 8 m ，p h 7 o ) 。 就e c o l i 而言，每个细胞约含有1 0 5 1 0 6 个铁离子因此环境中自由铁离子不足于满足生物体 正常代谢活动( b r a u n , v 。1 9 9 8 ) 。因此细菌必须具有高效的吸收机制才能满足正常代谢需要 ( f r i d 融i 。1 9 9 5 ) 就趋磁细菌而言，高效的铁吸收系统是合成磁小体的前提g - g t 。可以采取 三种方法来溶解铁氧化物：1 ) 降低p h 值增加f e 3 + 港t 解率；2 ) 还原妒为f 矿；3 ) 利用f 矿 鳌合物( g u c r i n o t , ml 。e t a l ，1 9 9 4 ) 。 1 2 1 1 鳌合物介导铁f e ”吸收 铁载体( s i d c r o p h o r e s )铁载体是一类能专一性结合f e ( ) 的，低分子量的鳌合物。其特点： 低分子量( o 5 1 0 k d a ) 、高专一性，高亲和性( k 。矿1 0 。依据其分子配体结构的不同，铁载体 可分为四类：儿茶酚根类( c a t e c h l o a m s ) 、羟胺类( h y d r o x a m a t c s ) 、羟吡啶类( h y d r o x y p y n d o n a t e s ) 、 羧胺类( a m i n o c s f b o x y l a t e s ) 。已鉴定和特征分析的5 0 0 多种的铁载体中，大部分属于儿茶酚类和 羟胺类两种铁载体。而了解最为清楚的是e c o i 合成的肠杆菌素( e n t e r o b a c t m ) 和铁色素 ( f c = r r i c h r o m e ) ( 图l 劫。尽管铁载体的种类和结构是多种多样的，但其合成铁载体前体物却大体 相同即；柠檬酸、氨基酸、d i h v d r o x y b e n z o a t e 和杼a e y l - n 5 - h y & o x y o m i t h m e ( a n d r e w ss c ，e t a ，2 0 0 3 ) 。大部分铁载体含有环状多肽。当然这些多肽是通过非核糖体的形式合成的。虽然铁 载体是小分子物质，但其具有极性的特点使得铁载体不能以自由扩散的方式