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高梁多酚提取工艺及抗氧化活性研究 摘要 本实验研究了高粱多酚的最佳提取工艺条件，以及高粱多酚提取物的抗氧化 活性，为高粱资源的开发利用提供科学依据。全文分为六章，作者的主要贡献有 以下四个方面： 1 、通过正交实验优化得到的高粱多酚提取工艺条件为：提取温度5 0 ；p h 值为4 ，液料比为2 0 ，超声功率1 5 0 w ，时间1 5m i n 。采用层析法纯化高粱多 酚提取物时，最佳的动态吸附参数为：高梁多酚提取液浓度o 5 0 m m l ，吸附 流速为2b v h ，用4 5 的乙醇溶液洗脱样品。 2 、以水和甲醇为溶剂提取高粱籽粒中的多酚类化合物，测定了提取物中的 总酚含量、还原力、f e 2 + 络合能力以及提取物对d p p h 、a b t s 、羟基自由基的清 除能力。结果表明，高粱籽粒提取物中总酚含量范围为3 8 7 3 8 8 7 ；高粱籽 粒甲醇提取物对d p p h 和a b t s 自由基的清除能力以及还原力均高于水提取物， 但水提取物的络合力高于甲醇提取物。高粱籽粒提取物对定位和非定位羟基自由 基介导的2 脱氧核糖均有保护作用，其保护机理呈多样性。 3 、采用琼脂糖凝胶电泳法研究了纯化后的高粱多酚提取液对羟基自由基诱 导质粒d n a 损伤的影响。结果显示：纯化后的高粱多酚提取液对羟基自由基诱 导d n a 损伤具有保护作用。 4 、通过测定萌发前后1 3 种高粱提取物的多酚含量、单宁含量以及抗氧化活 性，可以得出的实验结果为：萌发对改变高粱提取物总酚含量、单宁含量和抗氧 化活性的作用不明显。 关键词：高粱；多酚；抗氧化；羟基自由基 r e s e a r c ho ne x t r a c tio nt e c h n oio g ya n d a n tio xid a n ta c tivitie so fs o rg h u mpio y p h e n oi a b s tr a c t t h eo p t i m i z e de x t r a c t i o nt e c h n o l o g yc o n d i t i o n sa 1 1 da n t i o x i d a n ta c t i v i t i e so f s o f g h u mp o l y p h e l l 0 1w e r es t u d i e d ，p r o v i d i n g l es c i e n t i f i cb 淞i sf o rt h ed e v e l o p m e i l t a n du t i l i z a t i o no fs o 啦u m t l l ec o n t e n to ft h j sa n i c l ec o n s i s t e do fs i xc h a p t e r s ，a 1 1 d t h ea u t l l o r sc o n t 曲u t i o n sa r ei nt l l ef 0 1 l o w i n gf o u ra s p e c t s 1 o n h o g o n a le x p e r i m e i l t sw e r ep e r f b m e d 觚dn l er e s u n ss h o w e dm eo p t i m a l c o n d i t i o i l so fe x 仃a c t i o na u sf o l l o w s ：5 0 o fe x 吮t i n gt e i 】1 p 蹦她r e ，4o f p hv a l u e ，2 0 r a t i oo fe x 恤i c t i n gs o l v e i l ta l l dm a t e r i a l ，15 0w a t t so fu l 仃a s o n i cp o w e r 觚dl5 m i no f e x 仃犯t i n gt i m e w h e i lt l l es o 唱h 啪p 0 1 y p h e l l o le x n a c t sw e r ep l l r i f i e db ym a c r o p o r o u s a d s o 而e n tr c s i n ，m eo p t i m u mc o n d i t i o n so fd y n 锄i c 幽r p t i o nw e r e0 5m m lo f c o n c e n t r a t i o no fs 0 啦m np 0 1 ) ，p h e n o le x 缸犯t s ，2b v l lo fa d s o 印t i o nv e l o c i 吼a n d d e s o 印t i o na g e i l to f4 5 e t h a i l o ls 0 1 u t i o n 2 p 0 1 y p h e n o lc o m p o u n d sw e r ee x 仃a c t e d 矗0 mm es o f 曲啪g 阳a t sb yw a t e ra l l d m e m a i l 0 1 t 0 t a lp h e n 0 1 i cc o n t e n t ，r e d u c i n gp o w c h e l a t i n ga c t i v 皈d p p hr a d i c a l s c a v 胁百n ga c t i v i t 弘a b t sr a d i c a lc a t i o ns c a v e i l 百n ga c t i v i t ya i l di n l l i b i t i o no f h y d r o x y lr a d i c a l 一m e d i 砷e d2 一d e o x y - d 啊b o s ed e 伊a d a t i o no fm ee x 仃a c t s 丘d mt h e s o r 曲u m 目o a t sw e r ed e t e 咖i n e d t b t a lp h e n o l i cc o n t e mi nt h ee x t r a c t sv a r i e df b m 3 8 7 t o3 8 8 7 d p p hr a d i c a ls c a v e i l 百n ga c t i v i 劬a b t sr a d i c a lc a t i o ns c a v e i l 西n g a c t i v i t ya l l dr e d u c i n gp o w e ro fm e t h a i l o le x 缸a c t sw e r eh i 曲e rm a i lt h o s eo fw a t e r e x 臼a c t s ，w h i l ew a t e re x 仃a c t se x h i b i t e dh i g h e rc h e l a t i n ga c t i v i t yc o m p a r e dw i m m e t h a i l o le x t r a c t s ni sa l s of o u n d e dt h a ts o 呜h 啪g r o a t se x t r a c t sc o u l di n l l i b i tt h e s i t e s p e c i f i c a i l d n o n s i t e s p e c i f i ch y d r o x y l r a d i c a l 一m e d i a t e d2 - d e o x y d 一曲o s e d e 铲a d a t i o n ，锄dt h ei i l h i b i t i o nm e c h 觚i s mw a sv 撕e d 3 i h ee f r e c t so fp u r i 矗e ds o r g h u me x t r a c t so n 行e er a d i c a l i n d u c e dd n ab r e a k s w e r es t u d i e du s i n ga g a r o s eg e le l e c t m p h o r e s i se x p e r i m e n t s t h er e s u l ts h o w e dm a t i i t 1 1 ep u r i f i e ds o f 曲u me x t r a c t se x l l i b i t e dp r o t e c t i n ge f j e e c t so n 丘e er a m c a l i n d u c e d d n ab r e a k s 4 t o t a lp h e n o lc o n t e n t ，t 猢i nc o n t e n t 觚da n t i o x i d a i l ta c t i v i t yo ft h e13k i n d so f s o r g h u me x 仃a c t sb e f o r ea 1 1 da r e rg e 肌i n a t i o nw e r ed e t e m i n e dr e s p e c t i v e l y a n dt h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h eg e 彻i n a t i o nh a dn oe s s e n t i a le 虢c t0 nt l l et o t a lp h e n o lc o n t e n t ， t a n n i nc o n t e n t ，a n da j l t i o x i d a i l ta c t i v i t yo ft l l es o 喀h 啪e x t i t s k e yw o r d s ：s o 喀h u m ；p o l y p h e n o l ；a 1 1 t i o x i d a l l t ；h y d x y lr a d i c a l l i i 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。 本人允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研 究所等机构将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库或其它 相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名： 圣聋指导教师签名：丝 20 0 8 年6 月5 日20 0 8 年6 月5 日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：互彳 20 0 8 年6 月5 第一章绪论 1 1 高梁多酚的研究背景 随着人类文明的不断发展，“健康 问题达到了前所未有的重视程度。人们 希望通过合理、健康的饮食或医疗措施来达到抵御疾病和延缓衰老的目的。其中 衰老和抗衰老便成为了人们关注的话题和科研工作者研究的热点。而根据自由基 学说则认为引起衰老的根本原因是：活性氧自由基攻击生命大分子，导致蛋白质 损伤、酶失活、膜脂过氧化、碳水化合物和核酸损伤；同时这些也是引起疾病的 重要原因【1 】。对正常的生理情况，体内的自由基不断产生，但也不断的被清除， 使之维持在一个正常的生理水平上，过多的自由基则会损伤机体。当细胞的正常 代谢过程受到辐射等外界不良因素的影响后，会刺激产生多余的活性氧自由基， 威胁生物体的健康。因此寻找合适的外源抗氧化剂，清除体内多余的自由基，对 治疗疾病和预防衰老是有益的。 外源抗氧化剂的的获取途径有：合成法和从生物体内提取的方法。虽然合 成抗氧化剂相比天然抗氧化剂有它自身的优点，但由于合成抗氧化剂的不安全 性，使人们对天然抗氧化剂寄予了厚望。天然抗氧化剂有时也称为生物抗氧化剂， 主要是指在生物体内合成的具有抗氧化作用或诱导抗氧化产生的一类物质。生物 体可以是植物、动物，也可以是微生物。其中植物多酚则是一类广泛存在于自然 界，且来源丰富的天然抗氧化剂。 植物多酚不仅是一类丰富的可再生资源，广泛的存在于植物的叶、目、皮、 果肉内；而且它与人们的生活息息相关。植物多酚作为一类具有生物活性的天然 化合物，它会对人的消化、营养、健康产生影响，不仅如此它也与生畜生长质量， 农作物抗病虫害等密切相关【2 1 。因此，无论从可再生资源的利用及发展绿色化学 考虑，还是从与人类的关系角度看，植物多酚是一类很值得人们关注、研究和开 发利用的天然产物。 高粱是一类富含多酚类化合物与单宁酸等抗氧化成分的植物【3 】。很早以前， 人们就发现富含单宁的高粱口感不好一有涩味，有人形象的比喻为“鸟不食植 物”。所以在很长一段时间，高粱中含有的单宁被人们所排斥。随着人们生活水 平的不断提高以及对自身健康的越加关注，高粱中单宁的一些其它特性开始被人 们发现：如患有慢性腹泻的病人食用含有单宁高粱的米粥有明显的疗效，即单宁 的收敛固脱作用；同时也发现单宁对癌症与心血管疾病有较好的预防和改善作用 等。正是基于这样背景条件，高粱作为一类多酚来源的资源近年来逐渐引起了国 内外不少研究者的频频关注。 1 2 高梁多酚的研究现状 1 2 1 高梁多酚提取、纯化工艺的研究概况 对高粱多酚的研究和应用离不开对其的提取、纯化。目前溶剂提取法是提取 高粱多酚最常用的方法。常用的溶剂提取法有浸渍、渗漉、微波萃取法、回流及 连续回流、索氏提取、液泛提取等。对高粱多酚的提取使用最多最早的方法是浸 渍法。但随着科技的进步，使对更快更高效的提取高粱多酚方法的需求非常迫切， 一些别的提取方法也开始出现。1 9 9 8 年伍明等人就设计用液泛提取法提取高粱 壳中红色素，并比较了该法与浸渍法、回流提取法及索氏提取法的提取效果。2 0 0 0 李存雄等人研究了浸提法提取高粱多酚工艺条件对提取率的影响【4 1 。 用溶剂提取出来的多酚是一个组分复杂的体系，单宁、低分子量多酚、简单 酚、黄铜类化合物，甚至糖类和色素等其它物质包含在内。所以对高粱多酚的分 离纯化是研究多酚生物学活性必不可少的步骤。虽然天然产物的分离纯化方法有 许多，但目前国内外对高粱多酚的分离纯化主要采用大孔吸附树脂层析法和葡聚 糖凝胶色谱法【5 。9 】。 1 2 2 高梁多酚含量测定研究概况 比色法是测定高粱多酚最传统也最常用的方法。不同的比色法测定的原理 不同，使用的标准品也不同，所以测定显示的结果也不同。测定高梁多酚的方法 有f o l i n 酚法、普鲁士蓝法、f o l i n d e n i s 法、香草醛法、正丁醇盐酸法等，具体 见表1 1 。 2 表1 1 常用的测定高粱多酚的比色法1 0 1 方法标准品 指刁i 试剂提取荆 反应时问 测定物质来源 普鲁：l 蓝儿茶素氯化铁的甲醇l m i n酚类化合物 p n c e 等( 1 9 9 7 ) i j 法 盐酸溶液 f o l i n 酚法儿茶素， f 0 1 i n 酚试剂甲醇 末食子酸l 的盐酸甲 醇溶液 f o l i n d 舶i s 单宁酸 f o l i n d 锄i s 法试剂 香草醛法儿茶素4 的盐酸， 1 的香草 醛甲醇溶液 1 h酚类化合物k a l u 勰等( 1 9 8 0 ) 2 h 【1 2 l 冰5 h所有的还原m a ) 【s 等( 1 9 7 2 ) 性物质 川 甲醇2 4 h无色花青n i p 等( 1 9 7 1 ) 1 1 4 1 素，原花青p r i c e 等( 1 9 7 8 ) 【1 习 l 的盐酸甲 2 蛐 素( 单宁) 醇溶液 正丁醇盐纯化的原盐酸正丁醇 甲醇 酸法花青素溶液 i s o 法单宁酸枸橼酸铁铵 蛋白质沉 淀法 相对聚合 度法 单宁酸氯化铁，碱 性试剂 二甲基甲酰 胺 甲醇 2 0 m i l l原花青素p o 衙等( 1 9 8 6 ) 【6 】，a t e 啪n 等 ( 1 9 8 3 ) 【1 7 】 1 h原花青素 i s 0 9 6 4 8 ( 1 9 8 8 ) 【1 8 1 1 5 m i i i 原花青素h a g e n n a ( 1 9 7 8 ) t 1 9 】 盐酸正丁醇甲醇，1 的2 0 m i i l无色花青 b u t l 呱1 9 8 2 ) i 刎 溶液，4 盐盐酸甲醇溶素，花青素， 酸，o 5 的液 原花青素 香草醛乙酸 溶液 注：表示该方法的标准品未报道。 虽然比色法测定高梁多酚方便且经济实惠，但由于其测定的仅是多酚类化合 物和总相对含量，对具体一类多酚物质的含量不能确定，仪器法可以弥补比色法 的这一缺陷，所以仪器法在测定高粱多酚含量也越来越被人们关注。目前使用的 测定高梁多酚的仪器法有高效液相色谱法、液质联用法、质谱法、核磁共振法和 红外法等【2 1 矗4 1 。 1 2 3 高梁多酚抗氧化活性评价法的研究概况 常用评价高粱多酚抗氧化活性强弱的方法有：d p p h 法、a b t s 法、与铁离 子的络合法和还原力等。虽然每种评价方法的原理不同，但都能从不同侧面反应 高粱多酚的抗氧化能力，而且各种方法之问也存在一定的相关性。c h o iy 等人报 3 道：总酚含量与a b t s 自由基的清楚能力之间有较高相关性( r 2 = 0 9 9 7 3 ，p d = c 以书c e = a 木b 。试验指标各因素的变化情况可以通过比较表2 2 的均 值1 和均值2 的大小反映。在确定适宜操作条件时，对于f 检验中在a = 0 2 5 不显著 的因素，适宜的水平可以是任意的。所以本试验中为提高高粱多酚提取率，适宜 的操作条件为：温度5 0 ，时间1 5m i n ，p h 值为4 ，液料比为2 0 ，超声功率1 5 0 w 。 即最优试验方案为a l b 2 c l d 2 e 1 。 2 3 4 动态吸附实验结果 图2 7 表示的是样品流速对吸附率的影响结果，由图可知：流速在1 4 b v i l 间吸附率随流速的增大而下降，综合考虑工作效率和吸附效果，采用2 b i l l 较为 适当。 o1 2 3 45 流速( b v h ) 图2 7 样品液流速对吸附率的影响 样品浓反( m g m l ) 图2 8 样品液浓度对吸附效果影响 由上样浓度对吸附效果的影响的图2 8 可得出：多酚浓度过高或过低均不利 于其在层析柱上的吸附。在实验范围内，当多酚提取液浓度为o 5 0 m 咖l 时， l s a 2 1 树脂对多酚的吸附率达到最大值，因此选择o 5 0 m m l 作为多酚提取液 上柱时的初始浓度。 1 6 筋 毗 的 吩 一蠢一静莲毯 2 3 5 动态解吸实验结果 3 吕 凹 3 趟 爱 鑫 踊 3 量 凹 3 越 装 伽 ：垂 ol23456 洗脱体积( b v ) 图2 9 洗脱体积对总酚洗脱效果的影响 0l234567 洗脱体积( b v ) 图2 1 0 洗脱体积对单宁洗脱效果影响 从动态解吸曲线图2 9 和2 1 0 可以看出，不同浓度乙醇溶液对高粱多酚和单 宁物质的洗脱均从1 b v 时开始被检测到，且2 b v 时检测值达到最大。当洗脱剂为 5 b v 后几乎不在有多酚或单宁物质被洗脱下来。对多酚物质的洗脱从图中可知4 5 和6 0 的乙醇溶液的洗脱速度相差不是太大，且两者的洗脱速度都较3 0 的乙 醇溶液快。而对于单宁物质的洗脱则是4 5 的洗脱速度最快，6 0 的次之，3 0 的较慢。 计算用5 b v 体积的三种浓度乙醇溶液洗脱样品所得的多酚和单宁的洗脱 率，结果见图2 1 1 。由图2 1 1 可知，3 0 乙醇洗脱时多酚的洗脱率最高，4 5 和 6 0 乙醇洗脱时多酚的洗脱率变化不大；但用4 5 的乙醇洗脱单宁的洗脱率最 高，6 0 的次之，3 0 的相对最弱。综合考虑乙醇对单宁和总酚的洗脱效果，本 试验选用4 5 的乙醇作为纯化高粱多酚的洗脱剂。 1 7 2 l 8 6 4 2 0 1 o 0 o o l l l l o o o o 2 4 小结 l o o o o 一9 0 o o 乎 嚣 蟹 褰8 0 0 0 7 0 0 0 3 0 乙醇4 5 乙醇6 0 乙醇 不州浓度乙醇 图2 1 l 不同浓度乙醇对洗脱效果的影响 本章用超声辅助有机溶剂水复合体系提取高粱多酚，研究了影响多酚提取率 因素。首先确定最佳的提取剂及其浓度为6 0 的丙酮，然后以6 0 的丙酮为提 取剂，考察了超声时间、温度、超声功率、料液比和p h 因素等因素对提取率的 影响，在此基础上，采用正交实验对高粱多酚的提取工艺进行了优化，最佳工艺 条件为：提取温度5 0 ；时间15m i n ，p h 值4 ，液料比为2 0 ，超声功率1 5 0 w 。 通过l s a 一2 1 大孔树脂的动态吸附和解吸实验，确定了用层析法提纯高粱提 取物的工艺条件：上样的最适浓度为o 5 0 m m l ，流速为2b v h ；用4 5 的乙 醇洗脱样品时，洗脱速度较快、洗脱效果较好。 参考文献 【1 】彳i 碧，狄莹植物多酚 m 】北京：科学出版社，2 0 0 0 ，1 2 2 宋立江，狄莹，行碧等植物多酚研究与利用的意义及发展趋势【j 化学发展，2 0 0 0 ，1 2 ： 1 6 1 1 7 0 3 】千红育，李颖高梁营养价值及资源的开发利片j j 食品研究与开发，2 0 0 6 ，2 7 ( 2 ) ：9 l 一9 3 【4 刘成梅，游海天然产物有效成分的分离与应用 m 北京：化学f ：业出版社， 2 0 0 2 14 4 9 5 力柞珍，i i 艳丽，徐风英等超卢波提取小材中的5 口拉伯、i ，乳聚糖的研究林产化学 与工业，2 0 0 4 ，2 4 ( 3 ) ：1 0 3 - 1 0 6 【6 】林秋分，王凌云，李药兰等a b 一8 大孔吸附树脂分离长瓣金莲花总黄酮【j 】暨南大学学 报( 自然科学版) ，2 0 0 3 ，2 4 ：5 5 5 8 【7 】冯建光，谷文英大孔树脂对大豆异黄酮的吸附与洗脱性能【j 】无锡轻工业大学学报， 2 0 0 3 2 2 ：8 2 8 5 【8 】吴素芳，曹炜，姚亚萍等油菜蜂花粉提取物对羟基自由基介导2 脱氧核糖损伤的抑作用 【j 】食品科学，2 0 0 6 ，2 7 ( 1 0 ) ：5 4 4 5 4 8 【9 】国植，徐莉原花青素：具有广阔前景的植物药【j 】国外医药植物药分册，1 9 9 6 ，1 l ( 5 ) ： 1 9 6 2 0 4 【1 0 】蹦c em l - ，s c o y o cs v ，b u n e rl g ac r i t i c a le v a l u a t i o n0 fn l ev a m l l i nr e a c t i o n 私锄 嬲s a yf o rt 锄i ni ns o 咄u mg r a i l l 【j 】j 0 u m a lo f a 鲥c u l t u r ef 0 0 da n dc h e i l l i s 时，1 9 7 8 ，2 6 ： 1 2 1 4 1 2 1 8 1 9 第三章高梁多酚提取物抗氧化活性评价 3 1 前言 自由基生物医学研究认为，人体内的活性氧自由基不仅能够引发脂质过氧 化，而且可以损伤机体的组织与器官，进而导致动脉粥样硬化、肿瘤、肾病、糖尿病以 及衰老等多种疾病的发生与发展【l 】。流行病学研究发现，人类长期摄入一定量的 抗氧化剂可以有效地降低心脑血管疾病和癌症发病率【2 】。由于人们担心化学合成 的抗氧化剂可能有一定毒副作用，因此，从日常食物中寻找抗氧化剂具有重要的 意义。 多酚类化合物是广泛存在于植物界的一类具有多种生理功能的活性物质，抗 氧化功能是其最主要的功能之一。它不仅具有很强的清除自由基能力，还可以通 过抑制氧化酶和络合过渡金属离子等方面起到抗氧化作用【3 】。高粱又名蜀黍，是 世界五大谷类作物之一，也是我国最早栽培的禾谷类作物之一，至今仍在我国北 方广泛种植。近年来研究发现，高粱的外种皮中含有大量的多酚类化合物，包括 酚酸、黄酮类化合物和原花青素等，这些化合物具有很强的抗氧化活性【4 】。刘 睿等也对高粱外种皮的原花青素进行了分离、纯化和抗氧化方面的研究【5 】。尽管 国内外对高梁的抗氧化活性进行了一定的研究，但主要集中在高粱外种皮方面的 研究，对高梁籽粒的抗氧化作用研究较少。本文以主产于我国北方地区的三种高 粱的籽粒为对象，研究了高粱籽粒提取物的抗氧化活性，旨在为开发高梁抗氧化 功能食品提供依据。 3 2 材料与方法 3 2 1 材料与试剂 材料：本试验所用高粱品种分别为：通杂1 2 0 ( t z l 2 0 ) ，种皮颜色呈黑红色； 通杂1 0 7 ( t z l 0 7 ) ，种皮颜色呈红色；通杂1 0 5 ( t z l 0 5 ) ，种皮颜色呈白色，均由 内蒙古通辽市农业科学研究所提供。 2 0 试剂：d p p h ( 1 ，l 一苯基一2 苦肼基自由基) ；a b t s ( 2 ，2 一联氮一3 乙苯二噻唑6 磺酸) ；铁试剂( 向t o z i n e ) ；2 脱氧核糖、儿茶素均为s i 舯a 公司产品。香草醛； 没食子酸；无水碳酸钠；铁氰化钾；三氯乙酸；过硫酸钾；三氯化铁；磷酸氢二 钠；磷酸二氢纳；e d t a n a 2 ；v c ；硫代巴比妥酸等均为国产分析纯试剂。 仪器：7 2 1 分光光度计( 上海精密科学仪器有限公司) ；h h 2 数显恒温水浴锅 ( 国华电器有限公司) ；电子分析天平( 北京塞多利斯天平有限公司) ；低速大容 量多管离心机( 上海安亭科学仪器场) ；s n d 一2 0 0 0 超声波直插式处理仪器( 广 州市辛诺科超声设备有限公司) 。 3 2 2 样品处理 将高梁籽粒研磨，过4 0 目筛网。准确称取三种高梁籽粒粉各5 克，每种高粱 平行称取2 份，然后分别加入l o o l n l 蒸馏水和8 0 的甲醇( w ) ，1 0 0 0 w 超声提 取3 m i n ，4 0 0 0 印m 离心2 0 m i n ，将上清液过滤后在4 0 下减压浓缩成小体积，真 空冷冻干燥得到高粱提取物的冻干粉。准确称取上述水提取物和甲醇提取物各 1 0 m g ，分别用5 m l 蒸馏水和8 0 甲醇溶解，配成浓度为2 m 咖l 的高粱籽粒提取 液，置于4 冰箱保存待用。 3 2 3 总酚含量的测定 采用f 0 i n c i o c a l t e u 法测定【6 】。准确吸取1 0 0 肛l 的提取物，加入2 0 0 l 稀释一 倍的酚试剂，混匀，再加入1 0 2 m l 碳酸钠溶液，用蒸馏水定容至5m l ，摇匀， 室温避光反应4 0 m i l l ，4 0 0 0 印m 离心j o m i n ，上清液在7 6 0 r l l i l 处测吸光度。结果以 1 0 0 9 提取物中含有相当没食子酸的克数表示。 3 2 4d p p h 自由基清除实验 参考文献【6 1 方法并进行适当改进。吸取一定体积高粱提取液或1 m m lv c 溶 液置于1 0 m l 试管中，加入o 0 2 5 m m ld p p h 甲醇溶液3m l ，摇匀后室温下避光 静置1 h ，然后测定溶液在5 1 5 n i l l 处的吸光值。以样品的加入量对d p p h 清除率作 图，可以得到清除5 0 d p p h 自由基时所需高粱提取物和v c 的浓度，即i c 5 0 值。 d p p h 自由基清除率( ) = ( 1 a 并品a 对照) l o o a 样品一样品管的吸光值 a 对照一对照管的吸光值 3 2 5a b t s + 自由基清除实验刀 配制终浓度为7 m m o ，a b t s 和2 4 5m m o l l 过硫酸钾的混合液，室温避光条 件下静置过夜，制得a b t s 自由基储存液，使用时用水稀释至7 3 4 1 1 i i l 处吸光度为 o 5 9 6 土o 0 2 的应用液。移取不同体积的高梁提取液或l m m l v c 溶液，加入3m l a b t s + 应用液，充分混合，室温下避光反应3 0 m i n 后测定其在7 3 4 m 处的测吸光 度。以样品的加入量对a b t s + 清除率作图，得到清除5 0 的a b t s + 所需提取物 和v c 的浓度，以i c 5 0 值表示。 a b t s + 清除率( ) = ( 1 a 样品a 对照) 1 0 0 a 样品一样品管的吸光值 a 对照一对照管的吸光值 3 2 6 还原力的测定1 吸取2 0 0 p l 高粱提取液，1 m l2 0 0 n 埘o l p h 6 6 的磷酸缓冲溶液，1 m l1 铁氰 化钾溶液，混合后置于5 0 水浴反应2 0 m i n 。然后加入1 m 1 l 1 0 三氯乙酸溶液终 止反应，4 0 0 0 r p m 下离心1 0 m i n ，取上清液2 m l ，加2m l 蒸馏水，o 1 的三氯化 铁4 0 0 “l ，混匀后在7 0 0 1 1 m 下测定吸光度。以v c 作为对照品，结果以每克提取物 相当于v c 的毫克数表示。 3 2 7f e 2 + 络合能力的测定州 将5 0 “l 提取液和2 5 p l 浓度为1 m m o 儿的硫酸亚铁溶液混合，加入 5 0 i l l 5 m m o l l 的铁试剂，充分摇匀，室温下反应1 0 m i n 后用甲醇定容至3 m l ，在 5 6 2 姗下测定吸光度。高粱提取物的络合能力以每克提取物相当于e d t a - n a 2 的 毫克数表示。 3 2 8 非定位羟基自由基介导2 一脱氧核糖裂解的保护实验哺1 吸取一定量的高粱提取液，5 0 p l6 0 n 姗o l l2 一脱氧核糖，1 0 0 p l1 m m o l l e d t a f e c l 3 ，1 0 0 灿1m m o 儿v c 和1 0 0 p l1m m o l lh 2 0 2 ，用2 0 0 1 1 1 m o l lp h7 4 磷酸盐缓冲溶液定容至1 m l ，置于3 7 水浴锅中反应l h ，取出后分别加1m l1 0 三氯乙酸溶液和1 硫代巴比妥酸，在8 0 水浴中反应1 5 m i n ，冷却后在5 3 2 m 下 测定其吸光度。 羟基自由基清除率( ) = ( 1 a 样品a 对照) 1 0 0 a 辑品一样品管的吸光值 a 对照一对照管的吸光值 3 2 9 定位羟基自由基介导2 一脱氧核糖裂解的保护实验1 反应体系中除不加e d t a 外，其余步骤及数据处理同3 2 8 3 3 结果与分析 3 3 1 高梁籽粒提取物的总酚含量 任何一种溶剂不能将高梁籽粒中抗氧化成分全部提取出来，考虑到高粱中的 抗氧化成分主要是多酚类化合物，在甲醇和水中具有较高的溶解度【1 0 1 ，本文以水 和甲醇为溶剂，采用第二章所述的方法提取高粱籽粒中的多酚类化合物，并对 提取物中的总酚含量进行了测定，结果见表3 1 。 由表3 1 可知，三种高粱水提取物得率均显著高于甲醇提取物，其主要原因 是高粱的水提取物中含有大量的水溶性物质如糖和蛋白质。以甲醇为溶剂不仅能 够有效地提取高粱籽粒中的多酚类化合物，而且可以避免蛋白质和糖类化合物的 溶出，因此，高粱甲醇提取物的得率虽然比水提取物的低，但是总酚含量显著高 于水提取物。例如：通杂1 2 0 甲醇提取物的总酚含量为3 6 9 6 ，水提取物的仅为 1 4 9 0 。 表3 1 高粱籽粒提取物的总酚含量 由表3 1 结果可以看出，不同品种高粱籽粒提取物的总酚含量差异较大，以 甲醇提取物为例，通杂1 0 7 甲醇提取物的总酚含量高达3 8 8 7 ，通杂1 0 5 的仅为 5 4 9 ，这与通杂1 0 5 高粱中的总酚含量低有关( 数据未列出) 。在采用水和甲醇 提取高粱籽粒中的多酚类化合物时，本文采用大功率超声波提取法，该法能够在 常温条件有效地提取高粱籽粒中多酚类化合物，避免因加热而引起淀粉糊化，增 加介质的黏度，进而影响到有效成分的溶出。 3 3 2 高籽梁粒提取物对d p p h 的清除作用 d p p h 自由基已被广泛用于测定植物提取物的抗氧化活性。在有机溶剂中， d p p h 是一种稳定的自由基，呈紫红色，5 1 5 姗处有强吸收【1 1 】。当溶液中存在抗 氧化剂时，抗氧化剂能够给d p p h 自由基提供氢原子和电子使其发生退色，吸光 值变小，其颜色变得越浅表明抗氧化剂的抗氧化能力越强。因此，通过测定样品 对d p p h 自由基的清除能力可以反映其抗氧化活性的强弱。样品对d p p h 自由基的 清除能力一般以i c 5 0 值表示，i c 5 0 值越小表明样品的抗氧化能力越强。 由图3 1 可见，三种高梁籽粒醇提取物和水提取物的i c 5 0 存在显著差异，同一 品种高粱甲醇提取物的i c 5 0 均小于水提取物，表明甲醇提取物对d p p h 自由基的 清除能力大于水提取物。其中通杂1 0 7 甲醇提取物的i c 5 0 最小，其清除d p p h 自由 基的能力最强。三种高粱中，通杂1 0 5 籽粒提取物的i c 5 0 显著高于其他两种高粱， 该结果表明，通杂1 0 5 的籽粒提取物对d p p h 自由基的清除能力远低于通杂1 2 0 和 通杂1 0 7 。通过比较三种高粱籽粒提取物的i c 5 0 可知，无论是水提取物还是甲醇 2 4 提取物，对d p p h 自由基清除能力的大小依次为通杂1 0 7 ，通杂1 2 0 和通杂1 0 5 。但 是，三种高粱籽粒提取物对d p p h 自由基的清除能力均小于v c 。 3 暑 鼋 譬 图3 - 1 高梁籽粒提取物对d p p h 自由基的清除作用 3 3 3 高梁籽粒提取物对a b t s + 自由基的清除作用 a b t s 经氧化后生成相对稳定的蓝绿色a b t s + 水溶性自由基，水溶性抗氧化 剂与a b t s 自由基发生反应后使其溶液退色，退色越明显表明该物质的抗氧化能 力越强【1 2 1 。 。一历一叼 翼 1 z 加m1 = 翻删1 = 翻讲m1 2 1 a 7 w1 2 1 0 5 m1 2 1 0 目 ，、t 图3 2 高梁籽粒提取物对a b t s + 自由基的清除作用 由图3 2 可知，高粱籽粒的水提取物和甲醇提取物对a b t s + 均有清除作用， 其中通杂1 0 7 高粱籽粒甲醇提取物的i c 5 0 最低，表明通杂1 0 7 高梁籽粒甲醇提取物 对a b t s + 的清除能力最高，相反，通杂1 0 5 水提取物的i c 5 0 最高，其对a b t s + 的 o j暑暑t1)on譬 清除能力最低。三种高粱籽粒甲醇提取物和水提取物对a b t s + 的清除能力大小次 顺序均为t z l 0 7 t z l 2 0 t z l 0 5 。 3 3 4 高梁籽粒提取物的还原力 抗氧化剂的抗氧化能力与其还原力有关，还原力越大，抗氧化能力越强。抗 氧化剂能够在一定的条件下将f 。3 + 还原为f c 2 + ，因此，根据f c 3 + 还原为f e 2 + 的多少 来间接可以评价各种提取物的抗氧化能力【1 3 】。图3 为高粱籽粒提取物的还原力测 定结果。 4 0 0 3 5 0 3 0 0 儡2 5 0 瓷 g2 0 0 r1 5 0 隧 吲1 0 0 5 0 0 t z l 2 0 m t z l 2 0 、 t z l 0 7 m t z l 0 孙f t z l 0 5 m t z l 0 5 v v 图3 - 3 高梁籽粒提取物的还原力 由图3 3 可知，通杂1 2 0 的甲醇提取物、通杂1 0 7 的甲醇和水提取物均具有较 高的还原力，l 克通杂1 2 0 的甲醇提取物的还原力与3 3 7 5 m g 的v c 相当，相反，1 克通杂1 0 5 的甲醇和水提取物的还原力低于5 0 m g v c 的还原力。通过比较三种高梁 甲醇提取物和水提取物还原力发现，通杂1 0 7 和通杂1 0 5 甲醇提取物和水提取物的 还原力相当，而通杂1 2 0 甲醇提取物的还原能力为水提取物的4 5 倍。另外，本实 验发现，尽管通杂1 2 0 和1 0 7 的水提取物总酚含量差异较小，但是，二者的还原力 相差较大，1 克通杂1 0 7 水提取物的还原力与3 2 7 m g 的v c 相当，1 克通杂1 2 0 时提取 物的还原力仅与7 5 m g 的v c 相当。由此可见，高粱籽粒提取的还原力不仅与其多 酚类化合物的含量有关，而且可能与其它还原性物质有关。 3 3 5 高梁籽粒提取物对f e 2 + 的络合作用 在生物体内，f e 2 + 与过氧化氢等活性氧反应生成毒性更大的羟基自由基，引 发生物膜发生脂质过氧化反应。当抗氧化剂与f e 2 + 发生络合反应后，降低了介质 中f e 2 + 的有效浓度，从而减轻自由基对生物膜的氧化损伤作用【6 1 。 1 0 0 鲁6 0 e 荟4 0 婚 2 0 0 t z l 2 0 m t z l 2 0 、t z l 0 7 m t z 伯7 、 ，t z l 0 5 m t z l 0 5 w 图3 - 4 高梁籽粒提取物对f e 2 + 的络合力 图3 - 4 给出了高粱提取物对f e 2 + 络合能力的测定结果。高粱籽粒提取物对 f e 2 + 均有一定的络合能力，水提取物的络合能力均高于甲醇提取物，其中通杂1 0 7 高粱籽粒水提取物的络合能力是甲醇提取物的6 4 倍。在还原力和自由基清除实验 中发现，同一品种高粱籽粒的甲醇提取物的作用均高于水提取物，但络合实验的 测定结果却相反，尤其是通杂1 0 7 的甲醇提取物对d p p h 和a b t s + 的清除能力高于 其他品同的高粱籽粒甲醇提取物，但是其络合能力远低于通杂1 2 0 和1 0 5 的提取 物。通杂1 0 5 高粱籽粒的甲醇和水提取物均具有较高的络合能力。由此可见，高 粱籽粒的水提取物中含有能够有效络合f e 2 + 的化合物。 3 3 6 高粱籽粒提取物对定位和非定位羟基自由基介导2 一脱氧核糖 裂解的保护作用 以f e i l t o n 反应产生的羟基自由基为模型，研究了高梁籽粒提取物对非定位和 定位羟基自由基介导2 脱氧核糖裂解的保护。在非定位羟基自由基的保护实验 中，由于e d t a 与铁离子形成了络合物，f e n t o n 反应生成的羟基自由基在溶液中 2 7 以“游离”形式存在，如果抗氧化剂对羟基自由基有抑制作用，表明该抗氧化剂 可能通过直接清除羟基自由基来保护2 脱氧核糖【1 4 】。 。 4 0 琴 。3 0 褂 饕2 0 1 0 0 t z l 2 0 mt z l 2 0 wt z l 0 7 mt z l 0 7 、 ，t z l 0 5 mt z l 0 5 w 图3 5 高梁籽粒提取物对非定位羟基自由基介导2 脱氧核糖裂解的保护作用 由图3 5 可知，高粱籽粒提取物对非定位羟基自由基有显著的清除作用，呈 量效关系。当反应体系中加入1 0 0 p l 高粱籽粒提取物后，对羟基自由基的清除率 差别不大，当加样体积增加到3 0 0 此时，甲醇提取物对羟基自由基的清除率明显 高于水提取物。尽管通杂1 0 5 的甲醇提取物和水提取物对d p p h 和a b t s + 自由基的 清除率低于通杂1 2 0 和1 0 7 ，但对羟基自由基的清除率均高于后两种高粱，这可能 与通杂1 0 5 对f e 2 + 有较高的络合能力有关。 在定位羟基自由基介导的2 脱氧核糖保护实验中，由于体系中不加e d t a ， 因此铁离子能够直接结合到2 一脱氧核糖分子上，并在特定的位点产生羟基自由 基，使2 脱氧核糖分子发生裂解。抗氧化剂可以通过络合f e 2 + 和清除羟基自由基 双重机制来保护2 脱氧核糖【1 4 】。 由图3 6 可知，高粱籽粒提取物对定位羟基自由基介导2 脱氧核糖的裂解有 保护作用。在同一样品的甲醇和水提取物中，同一提取物在不同的浓度下呈现不 同的保护机制，以三种高粱籽粒的水提取物为例，当在反应体系中加入1 0 0 p l 时， 三种高粱的水提取物对非定位羟基自由基的抑制作用均高于定位羟基自由基，高 梁籽粒水提取物主要通过清除羟基自由基途径来保护2 脱氧核糖；当在反应体系 中加入3 0 0 “l 时，三种高粱的水提取物对定位羟基自由基的抑制作用均高于非定 位羟基自由基，此时，高粱籽粒水提取物主要通过络合f e 2 + 途径来保护2 脱氧核 糖。然而，三种高粱籽粒的甲醇提取物对2 脱氧核糖的保护机制呈现比水提取物 更为复杂的规律。 7 0 6 0 5 0 4 0 锝3 0 笾 蜒2 0 1 0 0 3 3 小结 t z l 2 0 m t z l 2 0 w t z l 0 7 m t z l 0 7 、 ，t z l 0 5 m t z l 0 5 w 图3 6 高梁籽粒提取物对定位羟基自由基介导2 脱氧核糖裂解的保护 三种高粱籽粒的水提取物和甲醇提取物对d p p h 、a b t s + 和羟基自由基