（分析化学专业论文）基于纳米金银修饰的免疫球蛋白和甲胎蛋白免疫电极的研究.pdf

西南大学硕士毕业论文 摘要 基于纳米金银修饰的免疫球蛋白和甲胎蛋 白免疫电极的研究 分析化学专业硕士研究生朱强 指导教师柴雅琴、袁若教授 摘要 电流及电位型电化学免疫传感器是将免疫分析技术与电化学传感器相结合的一种新的 免疫分析方法，是基于测量电流、电位变化来进行免疫分析的生物传感器。抗原或抗体在敏 感膜上的结合或继后的反应引起电流、电极电位或膜电位发生改变，而且这种变化与待测物 浓度之间存在线性关系。与其它免疫传感技术相比，该方法具有灵敏、快速、成本低、携带 方便，操作简单、易数字化、能方便地实现实时输出和检测。 免疫球蛋白g ( 1 9 g ) 是人体血清中含量最高的抗体，占血清中免疫球蛋白的7 0 8 0 ， 是唯一能通过胎盘的免疫球蛋白，具有抗菌、抗病毒、抗毒素的特性，在机体免疫防护中起 着重要作用。正常人血清中的甲胎蛋白( a f p ) 含量在2 0n g m l 以下，如果血液中a f p 呈 现较高浓度，往往是几种恶性病如精原细胞癌、原发性肝癌的的重要特征之一，此外，一些 患有非癌疾病如毛细管扩张失调、遗传酪氨酸血症、急性病毒性肝炎、肝硬化等的病人也观 察到a f p 浓度有上升的现象。a f p 已经成为l 临床检验上的一项重要指标。研究l g g 和a f p 的检测方法具有重要的理论意义和实际意义。 本文利用纳米金、纳米银材料，采用多种电极材料运用包埋、沉积、吸附等手段固定 抗体，直接测定抗原与抗体反应前后的电流、电位变化，主要内容如下： 】利用滴涂于铂盘表面的n a t i o n 膜中负电性的磺酸基与a n t i 1 9 0 分子中的氨基阳离子 之间的静电作用实现抗体的结合，同时通过负电性的纳米金增加抗体的固定量，最后在修饰 电极的表面涂敷一层明胶( g e l a t i n ) 薄膜进行固定，制成g e l a t i n a n t i 1 9 g a u n a f i o n p t 膜，制 得非标记免疫传感器。用循环伏安法( c v ) 和交流阻抗法( n y q u i s t ) 对电极逐层修饰过程 进行了表征，并对免疫传感器的性能进行了研究。该传感器测定i g g 的最低浓度为2 0 n g m l ，标准曲线的线性范围在5 9 6 0n g m l ，回归方程为：e = 一2 2 + 3 1 7 l o g i g g 响 蓖南大学硕士毕业论文 摘要 应时间为5m i n 此传感器制备过程简单、稳定性好、灵敏度商、具有良好的选择性，用于 生物样品分析，结果令人满意。 2 利用电沉积方法将纳米级的金溶胶沉积在玻碳( g c ) 电极表面，再自组装固定甲胎蛋 白抗体( a n t i a f p ) ，研制成a f p 免疫传感器。研究了电极修饰过程中的纳米金沉积时间、 抗体吸附时间、测试液p h 值、温度等实验条件和参数对传感器性能的影响。该传感器在 a f p 浓度为2n g m l 6 0n g m l 的范围内有良好的线性关系并且制作简单，响应快，能 满足实际测定的要求。 3 以明胶纳米银复合膜为固定介质的免疫电极的研究。明胶纳米银复合膜被用来固定 i g g 抗体，经戊二醛处理后的复合膜不仅能够长时间保持抗体的活性，还具有良好的稳定 性：表面修饰该膜的铂电极通过电位法能够较灵敏的检测人体血清中i g g 的浓度。实验中 使用了常见的人免疫球蛋白g ( h i g g ) 作为示例，在h i 酶浓度在l 6 3 1 n g m l 的范围内电 位变化与h i 西浓度的对数值呈现良好的线形关系，相关系数为0 9 9 8 0 ，电极响应时间 1 2 0 天。将电极用于人体血清样品的检测，结果令人满意。 4 结合聚氯乙烯( p v c ) 膜的稳定、均一等特点和纳米粒子对蛋白质的良好的相容性 和吸附作用，实现甲胎蛋白抗体( a n t i a f p ) 的固定并保持其活性，制得甲胎蛋白( a f p ) 敏 感膜，将膜固定在p v c 管顶端，利用电位仪检测其在不同浓度的甲胎蛋白抗原( a f p ) 血 清中的电位变化值。在a f p 浓度为3 2n g m l 1 9 0 5n g m l 的范围内电位变化值与a f p 浓度的对数值有良好的线性关系，回归方程为：a e = 4 5 3 8 8 l o g a f p , t - 2 4 7 8 ，检测限为1 0 n g m l 相关系数为o 9 9 5 1 。这种p v c 膜免疫电极具有成本低，易批量制作，响应快，重 现性好等优点，并且适宜作为一次性检测用品。 关键词：免疫传感器免疫球蛋白甲胎蛋白纳米金纳米银 2 西南大学硕士毕业论文摘要 s t u d i e so ne e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o e l e c 仃o d e f o rd e t e c t i o no f h l g g a n d 0 【- f e t o p r o t e i n a n a l y t i c a lc h e m i s t r y m a s t e rp o s t g r a d u a t e ：q i a n gz h u s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o r ：y a q i nc h a i r u oy u a n a b s t a c t i m m u n o g j o b u l i ng ( i g g ) i so n eo ft h em o s ti m p o r t a n ta n t i b o d i e si nh u m a ns e r u m t h ec o n t e n t o fi g ga r en e a r l y7 0 一8 0 i ni m m u n o g l o b u l i n i ti sau n i q u ei m m u n o g l o b u l i nt h a tc o u l dg e t a c r o s sp l a c e n t a 1 9 gp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei np r o t e c t i o no fh u m a nh e a l t h ，w h i c hc a na t t a c k b a c t e r i u m ，v i r u sa n dt o x i n * f e t o p r o t e i ni nh u m a ns e r u mi sn o r m a l l ye x c r e t e dd u r i n gf e t a la n d n e o n a t a ld e v e l o p m e n tb yt h el i v e r , y o l k s a c ，a n di ns m a l la m o u n to ft h i sp r o t e i np r o d u c e df r o m i n t e s t i n e sa n ds t o m a c h a f pl e v e l sd e c r e a s er a p i d l ya f t e rb i r t h ，a n df o rn o r m a la d u l t ，t h e p r o d u c t i o no fa f pi sa l m o s tc o m p l e t e l ys w i t c h e do f fa n dt h el e v e l sa r eb e l o w2 0n g m l t h e e l e v a t e ds e r u ma f pt oa b n o r m a l l yh i g hv a l u e so c c u r si ns e v e r a lm a l i g n a n td i s e a s e s ，u s u a l l y i n c l u d i n gn o n - s e m i n o m a t o u st e s i c u l a r c a n c e ra n dp r i m a r y h e p a t o c e l l u i a rc a r c i n o m a a l s o ， e l e v a t e ds e r u ma f pc o n c e n t r a t i o n sh a v eb e e nf o u n di np a t i e n t sw i t ho t h e rn o n - c a n c e r o u sd i s e a s e s ， s u c ha sa t a x i at e l a n g i e e t a s i a , h e r e d i t a r yt y r o s i n e m i a , n e o n a t a lh y p e r b i l i r u b i n e m i a ，a c u t ev i r a l h e p a t i t i s ，c h r o n i ca c t i v eh e p a t i t i s ，a n dc i r r h o s i s i ti sv e r yi m p o r t a n ti nc l i n i cd e t e r m i n a t i o n e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o rh a st h e a d v a n t a g e s o f i m m u n i t yt e c h n o l o g y a n d e l e c t r o c h e m i c a lt e c h n o l o g y t h ed e t e c t i o no ft h ei m m u n o a s s a yi sb a s e do nt h ec h a n g ei nt h e a m p e r o m e t r i co rp o t e n f i o m e t r i cr e s p o n s eb e f o r ea n da f t e ra n t i g e n - a n t i b o d yr e a c t i o n t h es h i f to f r e s p o n s ee x h i b i t sal i n e a rd e p e n d e n c eo nt h ec o n c e n t r a t i o no fa n a l y t e s t h i sm e t h o di sh i g h l y s e n s i t i v e ，i n e x p e n s i v e ，e a s y t o u s ea n dp o r t a b l e i nt h i sa r t i c l e ，w eh a v ec o n s t r u c t e ds e v e r a l i m m u n o e l e c t r o d e si m m o b i l i z e da n t i b o d yo n t os u b s t r a t ee l e c t r o d eb a s e do nn a n o a ua n dn a n o a g p a r t i c l e sa sm a t r i x e s t h ed e t a i l e dm a t e r i a l sa r es h o w na sf o l l o w s ： 1 ah i g h l ys e n s i t i v ep o t e n f i o m e t r i ci m m u n o s e n s o rh a sb e e nd e v e l o p e df o rf a s td e t e c t i o no f h u m a nl g gb a s e do nn a t i o n ，g o l dn a n o p a n m e sa n dg e l a t i na sm a t r i x e so n p l a t i n u md i s k e l e c t r o d e t h ea s s e m b l ep r o c e d u r ew a sc h a r a c t e r i z e db yc y c l i cv o l t a m m e t r ya n de l e c t r o c h e m i c a l 3 西南大学硕士毕业论文 摘要 i m p e d a n c et e c h n i q u e t h ed e t e c t i o ni sb a s e do nt h ec h a n g eo fe l e c t r i cp o t e n t i a lb e f o r ea n da f t e r t h ea n t i g e n 。a n t i b o d yr e a c t i o n c o m p a r e dw i t ht h en o r m a lm e t h o d s ，t h i ss t r a t e g yc o u l da l l o wf o r a n t i b o d yi m m o b i l i z e dw i t hah i g h e rl o a d i n ga m o u n ta n db e t t e rr e t a i n e di m m u n o a c t i v i t y a sa m o d e li m m u n o s e n s o r , i ts u c c e s s f u l l yd e t e c t e di g gi nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g e5 9 6 0n g m lw i t h ad e t e c t i o nl i m i to f2 , 0n g m l f u r t h e r m o r e ，t h e r ea r es e v e r a ld i s t i n c ta d v a n t a g e ss u c ha sd i r e c t ， r a p i d ，s i m p l ea n dw i t h o u tm u l t i p l es e p a r a t i o n - l a b e l i n gs t e p s 2 g o l dn a n o p a r t i c l e sw e r ee l e c t r o d e p o s i t e do nt h es u r f a c eo f g l a s sc a r b o n ( g c ) e l e c t r o d e ，t h e n a n t i - a f pw a sa b s o r b e d b yg o l dn a n o p a r t i c l e st op r e p a r eab i o s e n s o r t h ee f f e c to f e l e c t r o d e p o s i t i o nt i m ea n da b s o r p t i o nt i m eo nt h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ro fb i o s e n s o rw a s s t u d i e d o t h e re x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n ss u c ha sp ha n dt e m p e r a t u r ew e r es t u d i e dt o o t h ec u r r e n t r e s p o n s eo ft h eb i o s c n s o ri si nl i n e a rr e l a t i o n s h i pw i t hc o n c e n t r a t i o no fa f pi nt h er a n g eo f2 n g m l 6 0n g m l t h i sa p p r o a c hh a ss o m ea d v a n t a g es u c ha ss i m p l y , as h o r tr e s p o n s et i m e a n das a t i s f i e dd e t e c t i o nr a n g e 3 w er e p o r tan e wt y p eo fp o t e n t i o m e t r i ci m m u n o s e n s o rf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fh u m a ni g g g e l a t i n s i l v e rf i l ma sg e n t l ec a r r i e rw a su s e dt oi m m o b i l i z ea n t i l g go nt h es u r f a c eo f p l a t i n u m d i s ke l e c t r o d e g l u t a r a l d e h y d ew a se m p l o y e dt oi m p r o v et h ec h a r a c t e ro fc o m p l e xf i l m t h e i m m u n o e l e c t r o d ec a nm a i n t a i nb i o a c t i v i t ya n dt h ed e t e c t i o no fl g gi s v e r ys e n s i t i v e l y t e s t s r e v e a l e dl i n e a r i t yf o rh l g gi nt h e r e s p o n s er a n g ef r o m 1t o6 31 n g m lw i t hac o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n to fo 9 9 8 0 t h ea s s a ya l s od e m o n s t r a t e st h a tt h ei m m u n o e l e e t r o d ee x h i b i t sf a s t r e s p o n s e ( 6 0 司4 0 2 0 0 0 5l5 253 5 c 1 9 i g g ( n g m l ) 图1 4 电极的不同固定方法对传感器性能影响的比较。a ，g e l a t i n a n t i - l g g a u n a f i o n p t 电 极：b g e l a t i n a n t i 1 9 g n a f i o n p t 电极：c g e l a t i n a n t i - l g g a u p t 电极 西南大学硕士毕业论文 第一章：基- y - n a t i o n 和纳米金及明胶修饰的电位型高灵敏i g g 免疫传感器的研究 1 2 3 膜的响应时间 图1 5 为免疫电极在4 0n g m l 的i g g 溶液中电位响应对时间变化的曲线。 从数据可知，膜电位值在5m i n 内趋于稳定，因此测定时采用反应时间为5m i n 。 5 0 4 0 3 0 葛 写2 0 1 0 0 o1234567 t i m e ( m i n ) 图1 s 膜电位响应时间图 1 2 4 免疫电极的工作范围 用1 0m m o l 的p b s ( p h7 4 ) 将i g g 配成不同浓度的标准溶液，取修饰好 的电极按1 1 4 法实验。结果表明见图1 6 ，电位值随抗原浓度的变大而变化， 其电位差值与浓度的对数呈“s ”形。如图1 7 所示，在5 9 6 0n g m l 范围内， 电位差值与浓度的对数呈良好的线性关系，回归方程为：e = 2 2 + 3 1 7l o g 【i g g 】，r = 0 9 9 6 4 ，检测下限为2 0n g m l 。 0l234 c ，i g e g g 】( n g m l ) 图1 6 电位响应值与浓度的对数关系曲线 9 西南大学硕士毕业论文第一章基于n a t i o n 和纳米金及明胶修饰的电位型高灵敏i g g 免疫传感器的研究 1 0 0 7 5 舌5 0 q 2 5 0 05l52 53 5 c r l o g t l g o 】( n g m l ) 图1 7 电位响应值与浓度对数的标准曲线 1 2 5 电极的选择性 在含有4 0n g m li g g 的p b s 溶液中，加入不同浓度的白喉内毒素、乙肝表 面抗原、牛血清白蛋白作为干扰物质，进行对比实验。结果表明，电位变化值和 在未加干扰物前基本相同，说明此电极选择性较佳。 1 2 6 免疫传感器的再生 传感界面的再生是发展实用免疫传感器中非常重要的一环。由于抗原一抗体 结合性强，反应后不易再分开，要使免疫传感器能重复使用，就要用一些试剂将 抗原一抗体复合物解离或从传感器表面全部清洗下来，前者还需不损害固相抗原 或抗体的活性。实验发现，采用0 2m o l l 的甘氨酸盐酸缓冲溶液( p h2 8 ) 清 洗，电极可重复使用达1 2 次。用o 1m o l l 的h 3 p 0 4 或n a o h 溶液超声清洗， 传感器只能再生2 3 次。因为强酸强碱可使蛋白质变性，破坏与电极的作用力， 超声则使电极表面的所有蛋白脱落。 1 2 7 免疫传感器的重现性和稳定性 同一只传感器分别对4 0n g m l 的i g g 标准溶液进行2 0 次相同条件下的连续 测定，测定结果的标准偏差为4 o 。对于采用相同条件制作的5 支传感器，其 响应的标准偏差小于3 2 。说明该电极有较好的重现性( 表1 1 ) 。将电极置于 5m l1 0m m o l 磷酸缓冲溶液中连续测定3h ，该传感器仍保持有9 8 的活性。 电极悬挂于p b s 缓冲溶液上方4 c 保存。3 0 天后，该电极的响应下降7 8 三 个月后，仍保持8 7 的活性，说明该电极有较好的稳定性。 西南大学硕士毕业论文第一章基 于n a t i o n 和纳米金及明胶修饰的电位型高灵敏1 9 6 免疫传感器的研究 表1 1 免疫传感器的重现性 1 3 免疫电极机理的探讨 利用电位直接测量来检测免疫化学反应。原理是先将抗体固定在基体电极 上，然后用相应的抗原与之结合，抗体膜中的离子迁移率随之发生变化，从而使 电极上的膜电位发生变化。膜电位主要由d o n n a n 电位( 表面电位) 和膜内扩散 电位组成，其变化值与待测物浓度之间存在对数关系，因此根据电位的变化值即 可求出待测物浓度。图1 8 为免疫电极在不同浓度的i g g 的铁氰化钾中的交流阻 抗图。实验结果表明，在高频部分呈现出良好的膜本体阻抗半圆，并在低频部分 观察到w a r b u r g 阻抗，并且膜本体阻抗随溶液中抗原的浓度的增加而增加，进 一步说明免疫电极受扩散控制。 一4 0 0 0 3 0 0 0 j 2 0 0 0 葡 一1 0 0 0 0 03 0 0 06 0 0 09 0 0 01 2 0 0 0 z r e a l f j 图1 8 电极膜在不同浓度l g g 中的n y q u i s t 图a ，0 ：b ，4 0n g m l ；c ，8 0n g m l 1 4 结论 以n a t i o n 、纳米金和明胶固定a n t i i g g 制备的免疫传感器具有如下特性：制 作过程简单，不需酶标，制作成本低：电位响应差值较大，灵敏度较高；具有宽 的工作范围和较低的检测限；寿命较长。因此，采用该法制备的免疫传感器在健 康检测、医学检测等方面具有潜在的应用价值。 西南大学硕士毕业论文 第一章基于n a t i o n 和纳米金及明胶修饰的电位型高灵敏l g g 免疫传感器的研究 参考文献 1 】j a n a t aj ，a m c h e ms o c 1 9 7 5 ，9 7 ：2 9 1 4 2 s i m p s o ndl ，k o b o srk ，a n a l c h e m 1 9 8 3 ，5 5 ：1 9 7 4 【3 f o n o n gt r e c h n i t z g a ，a n a l c h e m ，1 9 8 4 ，6 ：2 5 8 6 【4 】k e a t i n gmy r e c h n i t zga ，a n a lc h e m ，1 9 8 4 ，5 6 ：8 0 1 f 5 1 司士辉，生物偌秽器，北京：化学工业出版社，2 0 0 3 ，6 8 6 6 李伟，李幼荣潘宁，茔纺功霉学撼2 0 0 1 ，1 7 ：6 3 9 7 】h a g eds ，s e n g u p t aa ，a n a l c h e m 2 0 0 4 ，7 6 ：5 9 8 2 【8 f e n gcl ，x uyh ，s e n s a c t u a t o r s ，2 0 0 0 ，6 6 ：1 9 0 【9 】丁兆红，赵常志，辛军华，冯春梁，冠户帮苊尤笋化笋擎掘2 0 0 1 ，2 4 ：3 8 6 【1 0 】s l o tjw g e u z e hj ，e u p j = c e l l b i o ，1 9 8 5 ，3 8 ：8 7 西南大学硕士毕业论文第二章以纳米金为介质的无标记甲胎蛋白免疫传感器的研究 第二章以纳米金为介质的无标记电流型甲胎蛋白免疫传感器的 研究 人体中的甲胎蛋白( a f p ) 通常在胎儿时期产生，大部分由肝脏、卵黄产生， 少部分由肠、胃分泌而成。婴儿出生后血液中的a f p 含量迅速下将，成年人 几乎不再分泌a f p ，正常人血清中a f p 的含量在2 0n g m l 以下，如果血液中 a f p 呈现较高浓度，往往是几种恶性病如精原细胞癌、原发性肝癌的的重要特 征之一，此外，一些患有非癌疾病如毛细管扩张失调、遗传酪氨酸血症、急性病 毒性肝炎、肝硬化等的病人也观察到a f p 浓度有上升的现象【”。a f p 已经成为 临床检验上的一项重要指标。 文献报道了多种a f p 传感器，a i z a w a 3 - - 4 、陈洪渊 5 - 6 1 、俞汝勤7 q 1 等研究 小组都报道过多种a f p 传感器，其中的电流型传感器大多是用过氧化氢酶、葡 萄糖氧化酶标记的方法。本文采用金溶胶为固定介质及响应增强物质，用计时电 流的方法测定a f p ，实现了无标记测定，实验证明此传感器有较低的检测限，较 快的检测速度和适宜的线性范围。 2 1 实验部分 2 1 1 主要仪器和试剂 c h l 6 6 0 a 型电化学工作站( 上海c h i 公司) ；i m 6 e 型交流阻抗测试系统( 德 国z a h n e re l e k t r i k 公司) ：a b 2 0 4 s 天平( 瑞士m e t t e rt o l e d o 公司) ： b r a n s o n i c2 0 0 超声清洗仪( 德国b r a n s o nu l t r a s c h a l l 公司) 。 a f p 抗体( a n t i a f p ，单克隆) 、a f p 抗原( 多克隆) 、胚胎抗原( c e a ) 和前列腺 癌抗原( p s a ) 均购自郑州博赛生物试剂公司：免疫球蛋白g ( i g g ) n h 成都生物制品 研究所提供；牛血清白蛋白( b s a ) 和氯金酸、柠檬酸三钠购自s i g m a 公司，纳 米金的制备参照文献1 9 】。其他试剂如k h 2 p 0 4 、n a 2 h p 0 4 、k c i 均为分析纯试剂， 实验用水均为二次去离子水。 2 1 2 a n t i - a f p 的固定 将玻碳( g c ) 电极经金相砂纸打磨，a a 1 2 0 3 粉抛光打磨后，用超声清洗5 m i n ，纳米金在玻碳电极上的修饰按参照文献i i ，将抛光洗净的g c 电极置于粒 径为1 6n i n 的金溶胶中于+ i 5v 的电位下沉积7 5 0s ，完成后再静置于金溶胶中 5r a i n ，取出冲洗掉电极表面吸附不牢固的纳米金，再将其放入a n t i a f p 溶液中 静置吸附7h 即可，取出冲洗，置于p b s ( 磷酸缓冲溶液，p h7 0 ) 中备用，电极 修饰过程如图2 1 所示。 西南大学硕士毕业论文第二章以纳米金为介质的无标记甲胎蛋白免疫传感器的研究 吸附a n t i - a f p特异性结合a f p 图2 1a n t i a f p 固定在纳米金修饰的玻碳电极上的示意图 2 1 3 检测方法 利用循环伏安法( c v ) 和交流阻抗法( e i s ) 进行电极制备过程的表征，计时电 流法用于对a f p 的检测，三种方法均采用三电极体系，参比电极为饱和甘汞电 极，对电极为p t 电极。被修饰的玻碳电极作为工作电极。电极表征在2 5m m o l l f e ( c n ) 6 4 - f 3 - + 0 1m o l l k c i + 0 1m o l l p b s ( 磷酸缓冲溶液，p h7 0 ) 溶液中进行， 循环伏安法电位区间为0 3 + o 7v ，扫描速率1 0 0m v s ，交流阻抗法频率范 围为1 0 。2 1 0 6 h z ，应用电位5m v ；在o 1m o lv b s ( p n7 4 ) 中利用计时电流法测 定抗原a f p ，电位区间为0 - 3 + 0 4 v ，步长为0 5s 。 2 2 结果和讨论 2 2 1 电极制各的条件优化 图2 _ 2 为金溶胶在g c 电极表面沉积不同时间的循环伏安曲线。从图2 可以 看出，峰电流随着带负电的纳米金的沉积量的增加逐渐降低，在7 5 0s 以后变化 很小，说明此时玻碳电极上的纳米金沉积基本达到最大，所以选择7 5 0s 作为沉 积优化时间。图2 3 为纳米金修饰后的玻碳电极在a n t i a f p 中吸附不同时间的 循环伏安曲线。a n t i a f p 中的n h 2 能与纳米金稳固的结合，由于抗体是非导电 性物质，随着抗体在电极表面的增加对电流的阻碍作用增大，f e ( c n ) 6 4 4 3 - 电对的 峰电流随之降低。由图3 可知结合7h 后，峰电流不再明显变化，说明抗体固载 达到最大值，因此选用7h 为优化的抗体结合时间。 西南大学硕士毕业论文第二章以纳米金为介质的无标记甲胎蛋白免疫传感器的研究 图2 2 纳米金溶胶在g c 电极上沉积时间的循环伏安图 图2 3 修饰纳米金的电极在a f p 抗体中的结合时间的循环伏安曲线 2 2 2 免疫传感器制各过程的表征 在2 5m m o lf e ( c n ) 6 4 棚+ 0 1m o lp b s 溶液中，用f e ( c n ) 6 4 们。电对作为“探 针”，在o 3 + 0 7 v 的电位范围内扫描，所得不同电极的c v 图如图2 4 ( a ) 所示。曲线a ，f e ( c n ) 6 4 怕在裸g c 电极氧化还原峰分别为：e p 。= o 2 6v ，e p 。= 0 1 5 v ， i p a i 。= l ，为f c ( c n ) 6 4 凸的可逆氧化还原电对。曲线b ，裸g c 电极上 沉积纳米金后，电流值明显降低，表明纳米金已经修饰在电极表面并与同样带负 电的f e ( c n ) 6 4 “相排斥，从而阻碍了电子的传输。曲线c ，修饰了纳米金的电极 在吸附a f p 抗体后，由于抗体是非导电性物质，电流响应值仍是降低。曲线d ， a f p 抗原和a f p 抗体结合成复合物进一步阻碍了电子的传输。图2 4 ( b ) 交流 阻抗图进一步表征了电极的修饰过程。曲线a 为裸g c 电极的阻抗图，近似一条 西鸯大学硬士攀渡论文第二章鞋麴米金为舟袋麴笼掾记军骆蛋白免疫转耩瓣鹩研究 直线，表明电子传递到电极表面必受扩散控制；当电极表面沉积了纳米众( 曲线 b ) ，出现高的膜本体阻抗( r 。t = 2 5 0 0n ) ；曲线c ，溺电极修饰了抗体和纳米金， 抗体的覆盖使阻抗值增加( r m = 3 3 0 0q ) ；当电极表顾抗体与抗原反应结含成复 合物后，其黻挽进一步增大( r e t = 3 5 0 0 竭( 魏线d ) 。由以上结果表明，修镣电极 兹c v 图与交流疆莸圈结采一致，a n t i - a f p 菝成功翡弱定在电较表瑟。 图2 4 不同电极在2 5 m m o l f e ( c n ) 6 4 s + o 1 m o l p b s 溶液中c v 图( 图a ) 和e i s 图( 豳b ) a 裸g c 电极；b 沉积纳米金后的g c 电极；c 吸附a n t i - a f p 届的g c 电极；d 在2 0n g m l 的 a f p 孵肖1 0 m i n 后的g c 电极。 2 2 。3 受疫传戆器静噙应往髓 抗原抗体的结合情况受到抗原抗体的亲和力、p h 值、温度等的影响。当 a n t i a f p 与抗原发生特异性识别结合后，形成的抗原抗体复合物堆积于电极表 面，会阻塞电子传输通道，引起电化学信号的变化，计时电流法通过比较通过电 援熬电流毽瓣变纯，可比较抗爨撬诲结会程度的裹 蕊。p b s 是湿帮麴缓狰溶液， 常零被餍来稀释盘清，困魏实验逸羯o 1t o o lp b s 侮必捡溅a f p 浓度静滚麓。 2 2 3 1 p h 和瀛度对电极性能的影响 图2 5 ( a ) 是p h 对电极响应的影响。由图可知，p h 为7 4 时传感器表面 的抗体与抗原结合达到最大量，产生的抗原抗体复含物阻塞电极表面，使电流值 这委最小。鞠2 5 ( b ) 表明滠发瓣邀投响应鹃影响揍援。出图可知，3 s 为最 佳篷，考惑翻较嘉温度影响羁传戆嚣弱使溺寿会，邋露选用2 0 俸兔实毅溺定 条件。 西南大学硕士毕业论文 第二章啦纳米金为介质的无标记甲胎蛋白免疫传感器的研究 图2 5 在含有2 0n g m l a f p 的0 l m o l 的p b s 中p h 值( a ) 和温度( b ) 对a f p 免疫传 感器响应性能的影响。 2 2 3 2 免疫传感器的主要响应性能 在上述优化条件下，考察了传感器在0 1 m o lp b s ( p h7 4 ) 中对a f p 的响 应性能( 图2 6 ) 。由图可知，电极在4 0s 响应值就基本达到稳定，在a f p 浓度 为2n g m l 6 0n g m l 范围内，抗原浓度与响应电流值呈线性关系，其回归方 程为i ( n a ) = 1 3 5 c a r p + 8 0 3 8 ，相关系数0 9 9 3 0 ，检测限为o 5n g m l 。 图2 6a f p 免疫传感器的响应曲线 2 2 4 传感器的再生和特异性 由于组装得到的膜具有良好的稳定性，在工作时不会引起膜性质的明显改 变，因此可重复再生。当测定完后，通过4m m o l 尿素溶液洗脱电极表面生成的 西南大学硕士毕业论文第二章以纳米金为介质的无标记甲胎蛋白免疫传感器的研究 a f p 抗原抗体复合物，使电极更新。用此方法再生可重复使用5 次，5 次的相对 标准偏差为6 0 。在含有2 0n g m l a f p 的p b s 中分别加入相同浓度的抗原类 似物c e a 、p s a ，常见抗原i g g 、b s a ，电极响应无明显变化，说明该传感器具 有良好的选择性。 2 2 5 初步应用 用该传感器测定加有6 个含有不同浓度a f p 的样品溶液，用标准加入法进 行测定，其回收率值在9 8 3 1 0 4 2 之间，表明此传感器能较好满足测定的 准确性需要；若要应用于l | 缶床检测，还需要进一步的对电极的各种参数进行严格 检测。 参考文献 1 】y a n gss ，c h e n gks ，g a s t r o e n t e r o l , 2 0 0 2 ，3 7 ：6 2 6 2 】j a v a d p o u rn ，c a n c e r , 1 9 8 0 ，4 5 ：2 1 6 6 3 】x u emd ，a i z a w am ，s e n s a c t u a t o r s ，1 9 9 6 ，3 5 ：4 5 8 【4 】k i mej ，a i z a w am ，s e n s a c t u a t o r s ，2 0 0 1 ，7 9 ：8 7 5 】j u h x ，c h e n hy ，e l e c t r o a n a l y s i s , 1 9 9 9 ，1 1 ：1 2 4 6 】y bh ，j uxj ，a n a l b i o c h e m ，2 0 0 4 ，3 3 l ：9 8 7 】楚霞，沈国励，俞汝勤，高等学接纪学学规1 9 9 6 ，6 ：8 7 0 【8 】王存嫦，沈国励，俞汝勤，化学学掘2 0 0 2 ，7 ：1 2 8 4 【9 】唐点平，袁若，柴雅琴，西精孵瘟才学学掘2 0 0 4 ，2 9 ：8 4 3 1 0 】l i nxq ，m i a oq ，c h i n e s ec h e m i c a l l e t t e r s ，1 9 9 9 ，1 0 ：1 5 7 西南大学硕士毕业论文第三章以明胶纳米银复合膜为固定介质的免疫电扳的研究 第三章以明胶纳米银复合膜为固定介质的免疫电极的研究 免疫检测是基于抗原和抗体之间存在高度的特异性【l 2 】。在各种检测方法中， 电化学传感器因其检测过程简单、响应速度快、耗费低而备受关注i ”，成为使用 较多的传感器。这些传感器既具备传统的放射免疫检测法( r m a ) 和酶联免疫 检测法( e l i s a ) 的高度特异性，检测限低的优点，又有其特别的优势，可以重 复使用，适合于检测的实时化，自动化。在电化学传感器的研究中，生物活性物 质在电极上的固定方法是影响传感器的性能的关键因数。 h i g g 是人体内最重要的抗原之一，因而被选作本实验的研究对象。纳米银 粒子( a g n a n o p a r t i c l e s ) 对蛋白质的固定已经得到了广泛的认同1 4 5 j ，纳米银粒子被 用来固定免疫球蛋白g 抗体( a n t i h l g g ) ，且能与明胶形成均一的复合膜1 6 i 。明 胶有良好的生物相容性和特殊的三维网状结构【7 1 ，能够为嵌于其网眼中的生物活 性物质提供温和的亲水环境，长时间保持其生物活性1 。为提高复合膜的热稳定 性和溶解稳定性，使用了戊二醛来改善复合膜的性能i 弘l o 。实验表明，经戊二醛 处理后的复合膜不仅能够长时间保持抗体的活性，还具有良好的稳定性：表面修 饰该膜的铂电极通过电位法能够较灵敏的检测人体血清中i g g 的浓度。该固定方 法简单，价廉，制得的h k g 免疫电极有较好的性能。 3 1 实验部分 3 1 1 主要仪器和试剂 c h l 6 6 0 a 型电化学工作站( 上海c h i 公司) ；i m 6 e 型交流阻抗测试系统( 德 国z a h n e re l e k t r i k 公司) ；a b 2 0 4 s 天平( 瑞士m e t t e rt o l e d o 公司) ； b r a n s 0 n i c2 0 0 超声清洗仪( 德国b r a n s o nu l t r a s c h a l l 公司) ：电极电 位和d h 值用m p 2 3 0 p h 计( 瑞士m e t t l e r t o l e d o 公司) 及p h s - - 3 c 型酸度计( 上 海大中分析仪器厂) ：2 3 l 型玻璃电极( 上海康宁电光技术有限公司) ；2 3 2 型甘 汞电极( 上海康宁电光技术有限公司) 。 人免疫球蛋白g 抗体( a n t i h l g g ，单克隆) 、人免疫球蛋白g 抗原由成都生 物制品研究所馈赠：甲胎蛋白( a f p ) 、胚胎抗原( c e a ) ；b 1 前列腺癌抗原( p s a ) 购 自郑州博赛生物试剂公司；乙肝表面抗原( h b s a g ) 购自上海科化生物试剂公司： 人体血清样本由西南师大校医院提供；明胶( g e l a t i n ) 来自中国化学品公司( 分 析纯) ；k f e ( c n ) 6 ，k 3 f e ( c n ) 6 购自四川化学试剂公司：银溶胶的制备参照文献 【1 l l ，其他试剂如k h 2 p 0 4 、n a 2 h p 0 4 、k c l 均为分析纯试剂，实验用水均为二次 去离子水。 西南大学硕士毕业论文 第三章以明胶纳米银复合膜为固定介质的免疫电极的研究 3 1 2 实验方法 3 1 2 1 免疫电极的制备 以电极线性响应范围为优化目标函数，采用正交实验法选择最佳膜组成，得 最佳电极膜组成为：1 体积的a n t i - h l