（分析化学专业论文）基于富勒烯c60构建新型荧光探针用于生物活性物质的检测.pdf

山东师范大学硕士论文 摘要 在生物体中，各种生物活性分子是细胞、组织和器官不可缺少的组成部分， 并且参与细胞增殖与分化、生命遗传、细胞新陈代谢等活动。因此，在生命科学 的研究中，对核酸、酶、蛋白质、肽等生物活性分子的研究占有重要的地位。近 年来对检测细胞中生物活性分子方法的研究越来越多。荧光法简单易行，便于操 作，具有高灵敏度、高选择性的特点。荧光探针分子可以与活细胞内的生物活性 分子作用生成强荧光物质，借助于激光共聚焦成像技术，实现细胞内待测活性分 子的“可视化”，从而对它们在生命体内进行“实时在线”的检测。因此，近年来对 用于检测细胞内活性物质的荧光探针的研究发展迅速。 本论文主要以提高探针的响应速度、灵敏度以及选择性为主要出发点，以荧 光检测技术为研究手段，基于荧光探针与酶或过氧化氢等生物活性物质特异性作 用后荧光光谱性质的改变从而实现对特定物质的检测。论文的主要内容如下： 在第一章中，综述了两个方面的内容：( 1 ) 富勒烯的结构及性质，富勒烯及 其衍生物在生物学及医学方面的应用和在生物体内的毒性研究。( 2 ) 生物活性物 质的研究发展，包括胰蛋白酶的作用和自由基的生理、病理作用及检测技术的研 究发展。 在第二章中，基于光致电子转移机理，设计合成了一种新型的荧光探针 ( c 6 0 f l ) 用于直接检测胰蛋白酶。该探针包含两个部分：荧光素作为荧光基团和 电子供体，富勒烯( c 6 0 ) 作为电子受体和胰蛋白酶类底物。当胰蛋白酶存在时，由 于胰蛋白酶与探针c 6 0 f l 中的c 6 0 部分相互作用抑制了荧光素电子沿桥联向c 6 0 的转移，导致探针分子中荧光素荧光恢复。探针可以对胰蛋白酶产生直接且瞬时 的响应。实验结果显示了在最佳实验条件下，体系的荧光增强与胰蛋白酶的浓度 在4 4 0 1 0 。7 0 4 1 0 巧gm l l 范围内成比例关系。该方法的检测限是4 0n g m l - 1 。在多种蛋白、酶、活性氧自由基以及其他生命活性物质共存的情况下，该 探针对胰蛋白酶具有极好的选择性。该探针的良好性质有助于研究发展在生物背 景下用于检测酶的荧光探针。 在第三章中，以富勒烯和荧光素为原料，基于过氧化氢特异性催化水解磺酸 酯，设计合成新型荧光探针a 和b ，用于定位检测线粒体中的过氧化氢。基于 光致电子转移机理( p e t ) ，荧光素的荧光被富勒烯猝灭。当过氧化氢存在时，特 山东师范大学硕士论文 异性水解打断富勒烯和荧光素之间的磺酸酯键，光致电子转移效应不能发生，荧 光素被释放出来，荧光素的荧光恢复，从而可以实现对过氧化氢的定量检测。目 前，有些实验还正在进行中。 关键词：富勒烯，荧光素，胰蛋白酶，过氧化氢，荧光探针 分类号：0 6 5 7 3 2 山东师范大学硕士论文 a b s t r a c t v a r i o u sb i o - a c t i v em o l e c u l e sa r ei n d i s p e n s a b l ec o m p o n e n to fo r g a n i s m t h e ya l s o t a k ep a r ti nv a r i o u sl i f ea c t i v i t i e s t h u s ，s t u d i e so nb i o a c t i v em o l e c u l e si n c l u d i n g n u c l e i ca c i d ，p r o t e i n ，p e p t i d e ，a n do t h e rb i o a c t i v ei n g r e d i e n t sp l a ya l li m p o r t a n tr o l e i nl i f es c i e n c e i nr e c e n ty e a r s ，m o r ea n dm o r es t u d i e sf o c u so nd e t e c t i n gb i o a c t i v e m o l e c u l e s a m o n gt h e s em e t h o d s ，u s i n gf l u o r e s c e n tp r o b e sh a sm a n ya d v a n t a g e ss u c h a sh i g hs e n s i t i v i t y , h i g hs e l e c t i v i t ya n de a s yt oo p e r a t e b e s i d e s ，f l u o r e s c e n tp r o b e s c a l li n t e r a c tw i t hb i o a c t i v em o l e c u l e st of o r ms t r o n g l yf l u o r e s c e n ts u b s t a n c e s w i t h t h eh e l po fc o n f o c a lm i c r o s c o p i ci m a g i n g ，v i s u a l i z i n ga n dr e a l t i m ed e t e c t i n go f b i o a c t i v em o l e c u l e sc a nb ea c h i e v e d t h u s ，s t u d i e so nf l u o r e s c e n tp r o b e sf o r d e t e c t i n gi n t r e c e l h l a rb i o - a c t i v em o l e c u l e sh a v eg r e a t l yd e v e l o p e di nr e c e n ty e a r s b a s e do nt h ec h a n g e si ns p e c t r u mc h a r a c t e r so ft h ef l u o r e s c e n tp r o b e sr e a c t i n gw i t h e n z y m e so rb i o a c t i v em o l e c u l e s ，w eh a v ea c h i e v e dt h ed e t e c t i o no ft h e s ei n g r e d i e n t s t h em a i nc o n t e n t so ft h i st h e s i sw e r es h o w na sf o l l o w s ： i nc h a p t e ro n e ，w eh a v es u m m a r i z e dt w oa s p e c t s ：( 1 ) t h es t r u c t u r ea n dp r o p e r t i e s o ff u l l e r e n e ，t h ea p p l i c a t i o n so ff u l l e r e n ea n di t sd e r i v a t i v e si nb i o l o g ya n dm e d i c i n e ， a n dt h e i rt o x i c i t yt oo r g a n i s m s ( 2 ) t h ed e v e l o p m e n to fs t u d yo nb i o a c t i v es u b s t a n c e s ， i n c l u d i n gt h ef u n c t i o no ft r y p s i n ，t h ep h y s i o l o g i c a la n dp a t h o l o g i c a lr o l e so fr o sa n d t h ed e v e l o p m e n to ft h e i rd e t e c t i o nt e c h n o l o g i e s i nc h a p t e rt w o ，an o v e lf l u o r e s c e n tp r o b e ( c 6 0 f l ) w a sd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d f o rd i r e c td e t e r m i n a t i o no ft r y p s i n ，w h i c hw a sb a s e do nt h ep h o t o i n d u c e de l e c t r o n t r a n s f e r ( p e t ) i tc o n s i s t so ft w os e p a r a t e df u n c t i o n a lm o i e t i e s ：t h ef l u o r e s c e i n p e r f o r m sa saf l u o r o p h o r ea n da ne l e c t r o nd o n o ra n dt h ef u u e r e n e ( c 6 0 ) a c t s 嬲a t l e l e c t r o na c c e p t o ra n dt r y p s i ns u b s t r a t ea n a l o g u e i nt h ep r e s e n c eo ft r y p s i n ，t h ep r o b e e x h i b i t e df l u o r e s c e n c ei n c r e a s ed u et ot h ei n h i b i t i o no fe l e c t r o nt r a n s f o r m a t i o nb y c o m b i n a t i o nt h ec 6 0s e c t i o no fc 6 0 f lw i t ht r y p s i n t h er e s p o n s eo ft h ep r o b et o t r y p s i nw a s d i r e c ta n dt r a n s i e n t e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h ei n c r e a s ei n f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yi sp r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no ft r y p s i nw i t h i nt h er a n g e o f4 4 0 10 。7t o7 0 4 10 5gm l u n d e rt h eo p t i m i z e de x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s t h e d e t e c t i o nl i m i to ft h ep r o p o s e dm e t h o dw a s4 0n gm l 一t h em e t h o dh a de x c e l l e n t s e l e c t i v i t yf o rt r y p s i no v e ro t h e re n z y m e sa n dm o s tb i o l o g i c a ls p e c i e s t h e r e m a r k a b l ep r o p e r t i e so fc 6 0 一f lh e l pt oe x t e n dt h ed e v e l o p m e n to ff l u o r e s c e n tp r o b e s f o ri n v e s t i g a t i n ge n z y m e si nab i o l o g i c a lc o n t e x t 3 山东师范大学硕士论文 i nc h a p t e rt h r e e ，n o v e lf l u o r e s c e n tp r o b e saa n db ，w h i c hw e r eu s e df o rt h e d e t e r m i n a t i o no fh y d r o g e np e r o x i d ei nt h em i t o c h o n d r i ao fl i v i n gc e l l s ，w e r ed e s i g n e d a n ds y n t h e s i z e dt h r o u g ht h er e a c t i o no ff l u o r e s c e i nw i t hf u l l e r e n e b a s e do n p h o t o i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e r ( p e t ) ，f u u e r e n ec a nq u e n c ht h e f l u o r e s c e n c eo f f l u o r e s c e i n i nt h ep r e s c e n c eo fh y d r o g e np e r o x i d e ，t h es u l f o n i ce s t e rb o n dw a s c l e a v e da n dt h ef l u o r e s c e n c eo ff l u o r e s c e i nw a sr e c o v e r i e d t h e r e f o r e ，h y d r o g e n p e r o x i d ec a l lb ed e t e c t e dq u a n t i t i v e l y c u r r e n t l y , t h ee x p e r i m e n t sa r eo n g o i n g k e yw o r d s ：f u l l e r e n e ，f l u o r e s c e i n ，t r y p s i n ，h y d r o g e np e r o x i d e ，f l u o r e s c e n tp r o b e c a t e g o r yn u m b e r ：0 6 5 7 3 4 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其他需要特别声 明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 刘移翩繇磊令缘 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权登 越可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 童) 芬 签字日期：2 0 0 9 年岁月引日 导师签字： 毛掣菜 签字日期：2 0 0 9 年歹月；1 日 山东师范大学硕士论文 第一章绪论 第一节富勒烯( c 6 0 ) 的性质及研究应用 富勒烯作为碳元素的第三类同秉异形体，具有独特的笼状结构，它的发现是 本世纪自然科学发展史最重要的突破之一。1 9 8 5 年英国科学家k r o t o 和美国科学 家c u d 与s m a l l e y 在研究星际尘埃中长链碳分子时，用大功率激光轰击石墨进行 碳的团簇研究时发现 6 0 2 富勒烯的存在，并且预言其结构是娄似于足球的笼状结 构 ”。1 9 9 0 年德国科学家k r a t s c l m a e r 和美国科学家h o f f m a n 采用电弧法成功制 备了毫克量级的【6 0 】富勒烯【“，为进一步研究富勒烯的物理化学性质及其应用研 究奠定了基础。富勒烯c s o 以其独特的结构和性质倍受人们重视，它已成为当今 物理、化学、材料及生命科学研究者共同关心的课题。 l 富勒烯c 曲的结构特点及物理化学性质 1 1 富勒烯的结构特点 富勒烯分子( c 6 0 ) 为6 0 个碳原子组成的三十二面体笼状结构，见图1 ，分子 结构形状象个足球，分子具有很高的对称性，属i h 点群。c m 分子直径约o7 1n m ， 内腔直径约0 3r t m ，可容纳各种原子和小的分子基团。 圈1c 6 0 的球棍模型 富勒烯分子中6 0 个碳的化学环境相同，每个碳原子分别与相邻的三个碳原 子形成c - c 键。这些c c 键彼此相连，共形成十二个五元环和：十个六元环 其中五元环和六元环共边的c c 键( 5 ：6 键1 较长，键长为l4 5a ，两个六元环共 边的c c 键( 6 ：6 键傲短，键长为14 0a ，亦即6 ：6 键具有较多的双键性质。富 勒烯有封闭壳层的电子结构，e 电子云分布在富勒烯的内外表面，形成三维共轭 体系。但由于五元环具有较大的张力，不易形成双键，故分子中电子的离域程 山东师范大学硕士论文 度不高，分子的芳香性并不明显。由于整个笼完全由近似s p 2 杂化的碳原子组成， 具有较强的亲电能力，因此富勒烯更多地表现出缺电子多烯的性质。 1 2 富勒烯的物理及化学性质 富勒烯c 6 0 独特的分子结构决定了它独特的物理化学性质。c 6 0 为黑色粉末， 密度为1 6 54 - o 5g c m 3 ，熔点 7 0 0 c 。c 6 0 分子是非极性、含有大兀键的球形 分子，易溶于含有大尢键的芳香性溶剂中，如c s 2 、苯、甲苯等。c 6 0 在不裂解 的情况下能升华，生成热y o a r - c o - - 2 2 8 0k j t o o l ，电离势为2 1 6 1e v ，电子亲合 势为2 1 6 2 1 8e v 。 c 6 0 具有能量较低的最低空轨道，可以容纳六个电子，是一个优良的电子受 体【3 】；c 6 0 通过光诱导产生单线态氧的效率高达1 0 0 ，被喻为“单线态氧的发生 器f 4 】；c 6 0 极易与游离基反应，被喻为“吸收游离基的海绵”【5 】；c 6 0 有3 0 个彼 此共轭的双键，因而c c , o 分子具有缺电子芳香烃的一些性质，可以发生氧化还原 反应、亲核加成反应、亲电加成反应、自由基加成反应、环加成反应、聚合反应 等一系列化学反应【6 】，是药物设计的理想基体，可以根据需要接上多种基团，被 喻为药物设计中的“化学针插 。c 6 0 的这些特性引起了生物学家，药物学家、化 学家的浓厚兴趣。在过去的十余年中，富勒烯及其衍生物的生物学及医学研究已 经取得了一些令人鼓舞的结果。 、 2 富勒烯及其衍生物在生物学和医药方面的应用 各种以富勒烯为代表的富勒烯衍生物的合成和生物活性的研究，已经使富勒 烯衍生物在生物化学、生物医药和药物学方面的应用取得了巨大的成功，有些富 勒烯衍生物可有望应用于临床。 2 1 抗氧化和神经保护作用 神经衰退病变，例如帕金森病，阿尔茨海默病和肌营养不良性侧索硬化症的 病因可能是由于谷氨酸受体的过度激活，从而导致产生过量的氧自由基、n o 自 由基。富勒烯表面有大量的共价双键，很容易被自由基侵袭，是目前最有效的自 由基清除剂。因此，羟基化或羧基化的富勒烯具有抗氧化和神经保护的作用。1 9 9 5 年，c h i a n g 等g t t j 报道了水溶性富勒醇具有消除由黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶产生的 超氧阴离子自由基的功能。1 9 9 7 年，d u g a n 等人8 】研究了羧酸富勒烯作为神经保 山东师范大学硕士论文 护剂的机理。l a i 等人【9 1 研究发现在狗小肠移植手术后，富勒醇在移植中具有清 除自由基的活性，弱化放血引起支气管收缩，其中氧自由基起着重要作用。2 0 0 0 年，w e i j a o 课题组通过实验证实六磺酸基富勒烯清除自由基抑制血浆中脂质过 氧化，可以预防动脉粥样硬化并抑制粥样斑块增生【1 0 j 。 富勒烯及其衍生物能有效清楚生物体内氧自由基，而同时很多的疾病与自由 基相关，这为我们开发新型的药物提供了良好的思路。 2 2 抑制蛋白和酶的活性 最初认识到富勒烯类化合物可以用于生物医药是在2 0 世纪9 0 年代初。 f r i e d m a n 等人1 1 , 1 2 1 分别从理论和实验上预测和证明了一些水溶性富勒烯衍生物 能够抑制人体免疫缺陷病毒蛋白酶( h u m a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u sp r o t e a s e ， h r v p ) 。1 9 9 3 年s r d a n o v 等人制得了具有生物活性的水溶性富勒烯衍生物 二氨基二羧酸二苯基富勒烯，有效地阻断了病毒蛋白酶( h i v p ) 的活性。富勒烯衍 生物同样也可以抑制氧化酶的活性，w a n g 等人【1 4 】深入研究了一种富勒醇化合物 c 6 0 ( o h ) 1 8 0 5 的急性、慢性、生化、基因等方面的毒性。小鼠体外试验研究表明 该化合物可降低内质网的氧化酶的活性，对各氧化酶活性的抑制具有浓度依赖 性。富勒烯的衍生物还可以抑制合成酶异构体。k r y s t i a n 等人【15 】报道丙二酸一c 6 0 通过对三种n o 合成酶异构体的可逆抑制，抑制瓜氨酸和n o 的形成。丙二酸c 6 0 、 还可以抑制鸟氨酸的合成。2 0 0 2 年，c h r i s t o p h e r 等人【1 6 1 报道了三氨基富勒烯加 成物作为高效钙调蛋白的拮抗剂，它可抑制神经元的n o 合成酶。 2 3 抗菌活性 已有许多研究表明富勒烯衍生物具有抗菌作用。t s a 0 等【1 刀研究了三羧酸富 勒烯针对2 0 多种不同细菌，如：葡萄球菌、链球菌、肠球菌( 革兰氏阳性) 、肺炎 克雷白杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌伤寒沙门氏菌( 革兰氏阴性) 的效应。研究表 明所有的革兰氏阳性菌都可以得到有效抑制，特别是对化脓性链球菌a 2 0 。通过 对富勒烯衍生物的抗菌机制的研究发现富勒烯衍生物对细菌的抑制主要是出于 它对细菌壁的破坏而引起的。已知细菌的变异过程中很少有细胞壁的变化，所以 这就有可能合成出具有长效的富勒烯抗菌药物。 2 4 切割d n a 和光动力学治疗 山东师范大学硕士论文 d n a 链的完整性和连续性是细胞正常生长的物质基础。c 6 0 及其衍生物可以 和单链d n a 、双链d n a 或带“发夹 结构的双链d n a 发生作用，在光照条件 下，d n a 链上的鸟嘌呤( g ) 处可发生选择性断裂。实验发现将衍生物1 a 或1 b ( 图 2 ) 分别与超螺旋的p b r 3 2 2d n a 共同培养，经光照后，d n a 被切断。衍生物1 b 切割d n a 具有专一性，断裂处常发生在鸟嘌呤碱基处1 1 8 , 1 9 。将c 6 0 衍生物l a 和 l b 与细胞共同培养并用光照射时，呈现细胞毒性，但当处于黑暗中时对细胞无 任何影响。为了进一步观察化合物1 a 和1 b 中c 6 0 的作用，用与l a 和1 b 分子中 侧链相类似的化合物作同样的实验，发现它们没有生物活性。c 6 0 及其衍生物的 这种作用给肿瘤治疗带来了新的途型2 0 川。 图2 含极性侧链的c 6 0 水溶性衍生物l ( a ：r = c o ( c h 2 ) 2 c 0 2 h ，b ：r = c o ( c h 2 ) 2 c 0 2 h 。n e t 3 ) 此外，包含金属富勒烯衍生物也可以作为造影剂、放射性药物和示踪剂，在 核生物医学应用方面有许多潜在的用途。 3 富勒烯及其衍生物对生物体的毒性研究 富勒烯及其衍生物能抑制酶活性且具有切割d n a 和损伤细胞的功能，对人 体健康有潜在的威胁，所以富勒烯衍生物在体内的传送、分布、代谢和排泄等成 为了非常重要的研究内容。但现有的实验证明富勒烯衍生物的毒性是较低的。 n e l s o n 等人【2 2 1 在老鼠皮肤上涂覆富勒烯以观察其致癌性，研究结果表明在 所用的剂量下，涂覆7 2 小时后老鼠表皮d n a 的合成或鸟氨酸脱羧酶的活性没 有产生有害的影响，涂覆2 4 周后没有引起皮肤癌变。z a k h a r e n h 等人【2 3 】研究发 现富勒烯和富勒烯醇没有遗传毒性。s c r i v e n s 等人【2 4 】研究了富勒烯悬浮液与人角 质化细胞的相互作用，发现富勒烯被细胞吸收但没有导致急性中毒。y a m a g o 等 人【2 5 】报道了将1 4 c 标记的羧酸富勒烯衍生物标记物口服给小鼠，发现富勒烯衍生 物不能被动物的胃肠道吸收，但是采用静脉注射或腹腔注射则可以被很快转移到 8 山东师范大学硕士论文 各种组织中。羧酸富勒烯在静脉注射7 天后，除部分被肝脏摄取外，大部分分布 在老鼠的骨骼肌和毛发中，且有逾越血脑屏障的能力。m o u s s a 等人【2 6 】通过电镜 观察，富勒烯进入老鼠体内1 4 天后，主要沉积在肝细胞以及脾、肺等内脏组织 的网状内皮细胞中，大脑中几乎不存在。t a b a t a 等人【2 7 】研究发现将富勒烯聚乙 二醇衍生物注射到接种皮肤癌的老鼠中，该衍生物在肿瘤部位的积累比正常皮肤 多2 倍左右，光照后肿瘤生长速度明显减慢直至最后消失，其作用随光照强度与 富勒烯聚乙二醇衍生物浓度增大而增强，比光敏剂p h o t o f r i n 的效果好得多。而 且该衍生物对正常皮肤、小鼠体重及血液中一些酶含量无影响。他们还发现富勒 烯一聚7 , - - 醇衍生物绝大部分在2 4 h 就可排出。c a g l e 等人【2 8 】发现富勒烯衍生物 主要分布在骨、肝脏和脾中，肌肉和皮毛中较少，且不能通过血脑屏障。c h e r t 等人【2 9 】研究发现富勒烯磺酸衍生物c 6 0 【( c h 2 ) 4 s 0 3 n a 4 6 具有一定的毒性。当老鼠 腹腔注射量大于5 0 0m g k g 体重时，即可导致死亡。组织学检查表明，受损老鼠 的肾小管被严重破坏。这些研究结果表明富勒烯衍生物的毒性可能与富勒烯球上 加成的官能团的性质有关系。 富勒烯衍生物的体内分布与富勒烯所连接基团有关，所以可在富勒烯上接上 不同的基团，合成出不同的靶向药物或药物载体。另外，可以利用某些富勒烯衍 生物具有逾越血脑屏障的功能，开发出抗脑肿瘤药物。 9 山东师范大学硕士论文 第二节生物活性物质的研究发展 生命现象是生物体内发生的极其复杂的生物化学过程的综合结果。生物体内 存在着许多对生命现象具有重要影响的微量或痕量的活性物质，具有特殊的生理 功能，当与机体作用后能引起各种生物效应。因此，在生命科学的研究中，对多 种生物活性物质包括自由基及核酸、蛋白质、酶、肽等生物活性分子的研究占有 重要的地位。 1 胰蛋白酶 酶是活细胞产生的一类具有催化功能的生物分子，又称生物催化剂。在酶的 作用下，许多生物化学反应过程可以在温和的条件下( 如室温、常压和水溶液中) 以很高的速率和效率进行。所以，酶是维持生命体内正常的生理活动和新陈代谢 的基本条件。 胰蛋白酶( t r y p s i n ，e c 3 4 2 1 4 ) 属碱性蛋白酶，是人和动物肠道中一种重要 的蛋白水解酶，属于丝氨酸蛋白酶( s e r i n e p r o t e a s e s ) 家族，等电点为1 0 1 ，分子量 约为2 3 8 0 0 ，在胰腺泡组织中表达【3 0 1 。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分 解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。胰蛋白酶是 由胰腺腺泡细胞分泌的消化酶，它以非活性的胰蛋白酶原的形式被分泌出来，在 十二指肠部位接受肠激酶的激活作用，其n 端第1 6 2 3 位序列为a p f d d d d k 的 活化肽( t a p ) 被切除，成为具有活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶能高度特异地水解精 氨酸或赖氨酸的羧基参与形成的肽键、酰胺键和酯键，是对底物选择性最高的蛋 白酶之一。其高度专一性表现为对碱性氨基酸一端的选择，属于族专一性( 基团 专一性) ，水解活性敏感度为酯键 酰胺键 肽键。胰蛋白酶由2 2 3 个氨基酸残基 组成，其单一肽链含有六对二硫键【3 l 】。胰蛋白酶有两个大小几乎相等的桶状结构 域，各自由六条反向平行的p 折叠组成，二硫键 2 2 ，1 5 7 连接着这两个结构域。 胰蛋白酶的催化部位位于这两个结构域之间的分界面上，第1 9 5 位丝氨酸s e r 、 5 7 位组氨酸h i s 、1 0 2 位天冬氨酸a s p 组成了胰蛋白酶的活性部位，它们形成一 个催化三联体，第1 0 2 位天冬氨酸a s p 分享了第5 7 位组氨酸h i s 咪唑环上的质 子，提高了h i s 的碱性，并使咪唑环处于一定的方向，更有利于它与底物联系， 另外还提高了第1 9 5 位丝氨酸s e r 的亲核性。胰蛋白酶氨基末端结构域中含有四 l o 山东师范大学硕士论文 个表面环状结构，其中钙离子结合环( 第6 3 8 4 位氨基酸残基) 在结合一个钙离子 后，引起了构象的某些变化，可以防止自溶作用并使酶分子更为稳定。胰蛋白酶 羧基末端结构域含有三个表面环状结构，其中自溶环( 第1 3 6 1 6 0 位氨基酸残基) 为酶分子提供一个疏水口袋，口袋中埋藏着起关键作用的第1 6 位异亮氨酸1 1 e 和第1 9 4 位天冬氨酸a s p 之间的盐键。这些环状结构对酶的催化活性有很重要的 影响作用。胰蛋白酶c 末端吨螺旋结构对整个酶分子的正确折叠和稳定性起重 要的作用。 2 活性氧自由基 自由基( f r e er a d i c a l ) ，也称为游离基，是指具有未配对价电子( 即具有奇数 电子) 的原子、原子团、分子或离子。自由基主要包括活性氧( r e a c t i v eo x y g e n s p e c i e s ，r o s ) 和活性氮( r e a c t i v en i t r o g e ns p e c i e s ) 两大类。活性氧包括：超氧阴离 子( 0 2 1 ) 、羟自由基( o h ) 、过氧化氢( h 2 0 2 ) 、单线态氧( 1 0 2 ) 、脂质过氧化物等。 活性氮以n o 分子为主，包括n o 合成和代谢过程中生成的含氮自由基。它们参与 许多重要的生理生化反应。 2 1 自由基的产生及消除 生物在长期进化自然选择过程中获得了高效而安全的生物氧化机制，即通过 线粒体细胞色素氧化酶( c c o ) 由还原型细胞色素c 接受4 个电子还原成水的过程 来完成。即使在高度进化的生物机体内也总要有少部分氧经呼吸链旁路反应生成 氧自由基。活性氧自由基主要是0 2 和h 2 0 2 ，它们是亚细胞结构和代谢的主要产 物。在亚细胞器中，如线粒体、内质网、浆膜、胞浆等结构中的氧化还原反应中 均能产生0 2 和h 2 0 2 。 在正常生理状态下，体内会不断产生自由基，但在体内也不断地被清除。当 机体抑制机制减弱或自由基生成量增加时，在生物组织内存在有效的清除自由基 的酶类和低分子化合物而加以清除，即所谓氧应激反应( o x i d a t i v es t r e s s ) 。一般 说来，对寿命较长g 0 2 。、h 2 0 2 等清除主要由s o d t 3 2 1 、过氧化氢酣3 3 1 、谷胱甘肽 过氧化物酶、谷胱甘肽转硫酶( g s t ) 等的增加来实现。而对于o h 、1 0 2 等短寿命 的自由基主要由低分子化合物发挥作用，如维生索a 、e 、k 、b l 、c 、胡萝卜素、 黄酮类以及某些未知物质。 山东师范大学硕士论文 2 2 自由基的生理作用 许多研究表明，活性氧自由基在生物体衰老与疾病，以及正常的免疫代谢与 细胞信号转导等过程中都起着重要的生理作用。自由基的生理作用包括：( 1 ) 活 性氧能提高吞噬细胞和中性粒细胞的杀菌功能【3 4 】；( 2 ) 与人体中的一些激素、酶 及蛋白的合成有关，如参与前列腺素、凝血酶原和胶原蛋白的合成；( 3 ) 具有解 毒作用。机体对外来物质的解毒作用主要在肝脏中进行，有0 2 。参加【蚓；( 4 ) 与生 殖和胚胎发育有关【3 5 】；( 5 ) 在调节细胞增殖与分化过程起重要作用。低浓度的活 性氧如0 2 “和h 2 0 2 可以促进一系列正常细胞的生长，是细胞维持生存和生长不 可缺少的因子【3 6 3 7 】；( 6 ) 可调节机体代谢，参与机体免疫和环核苷酸的生物合成。 研究显示n o 与机体的特异性免疫反应关系密切，在机体的免疫过程中发挥了重 要作用【3 8 捌，而且n o 还是重要的细胞内信使分子【删。在正常生理情况下，生物 体中适当水平的活性氧自由基可以维持机体良好的免疫应答，而且它们参与了机 体生理活动的某些有益环节，因此在正常的生命过程中，自由基具有重要的生理 作用。 2 3 自由基的危害 自由基具有很强的生物活性，在肿瘤和其它许多疾病的发生过程中起重要作 用。自由基在人体内通过一系列级联反应产生或消亡，它可以激活癌基因，在细 胞内参与肿瘤细胞凋亡、生存、增殖相关的信号转导，修饰关键酶或蛋白并改变 其功能，从而导致肿瘤的发生，同时对组织、器官造成损伤，产生多种病理变化。 目前研究表明，活性氧自由基几乎和人类常见的几种主要疾病都有关系。心 脏病是人类死亡率最高的一种疾病。z w e i e r 等人提出心肌缺血再灌注时产生了氧 自由基，半醌自由基和含氮自由基【4 1 ，4 2 】。恶性肿瘤，即癌症，威胁人类生命的主 要疾病之一。活性氧水平( r o s ) 提高是辐射和化学致癌过程中，特别是癌变早期 阶段的共同特点。几乎所有的致癌因素在启动或促进细胞癌变过程中都会产生大 量的包括活性氧在内的多种形式的自由型4 3 1 。1 9 8 0 年，t o t t e r 研究认为组织癌变 的重要原因是自由基对核区的损害，同时大部分的致癌物质均有经微粒体细胞色 素p 4 5 0 加氧产生自由基引起癌变的作用【4 4 1 。 自由基是人类和动物衰老的重要诱n t 4 5 1 。衰老是生物体生长后期的生物学的 1 2 山东师范大学硕士论文 退行性变化。随着年龄增长，机体内各种有害物质的积累必定会导致生物体的衰 老。多价不饱和脂肪酸( p u f a ) 发生过氧化作用而形成一种高度复杂的共轭结合 和交联的物质脂褐素，自由基起着交联剂的作用，这种无活性色素在细胞中的 不断积累会进而使细胞失活，推进衰老的发展。 最近出现一些关于艾滋病和自由基关系的报道，自由基与艾滋病的关系可从 两个方面来看，一方面艾滋病细胞产生，氧自由基减少，可能使免疫杀伤能力降 低，艾滋病人容易感染各种疾病；另一方面，氧自由基可以刺激艾滋病毒复制， 导致病情加重。帕金森综合症是一种以中枢神经系统多巴胺能神经元功能障碍 为病因的神经功能紊乱症，近年研究表明自由基与这种疾病的关系非常密切【4 7 1 。 在神经系统，早老性痴呆症，震颤麻痹症等疾病都有氧自由基的参与；在循环系 统，动脉粥样硬化，血栓的形成，心肌缺血再灌注损伤的发病过程中氧自由基起 着重要作用；肝炎和糖尿病与自由基密切相关；白内障的形成和视网膜的损伤是 自由基和脂质过氧化的直接结果；在免疫反应的炎症中，巨噬细胞呼吸爆发释放 大量氧自由基。由此可见，从人类死亡率最高的心脑血管疾病，到人类最可怕的 癌症，以及近年来对人类造成巨大威胁的艾滋病，均和自由基有着密切关系。 2 4 自由基的检测技术的研究发展 随着活性氧对生物体的损伤作用逐步获得公认，对其检测已不仅仅局限于化 、 学和模拟生物体系内，而更多的转向生物活体内活性氧的存在、作用以及病变时 含量变化的研究。然而，可实用的自由基检测方法的匮乏一直是阻碍自由基生物 作用研究的最大瓶颈。因此发展高灵敏度、高选择性，能同时动态跟踪重要活性 氧及其定量的分析与检测技术是分析化学、生命科学发展中最具挑战性的前沿课 题之一。 目前，测定自由基的方法主要有电子自旋共振法( e s r ) 或电子顺磁共振法 ( e p r ) 1 4 8 1 、高效液相色谱法( h p l c ) 【4 9 1 、化学发光法( c l ) 【5 0 ，5 、电化学方法【5 2 ，5 3 1 、 荧光法等。相比于以上方法，荧光法简单易行，便于操作，具有高灵敏度、高 选择性的特点。荧光探针分子可以在不破坏生物活性的情况下进入细胞，与活细 胞内的目标物结合生成强荧光物质，并通过借助于激光共聚焦成像技术，实现细 胞内待测活性物质的“可视化”，从而对它们在生命体内进行“实时、在线的 检测。近年来，生物成像在活细胞的生物分子检测上取得了重大进展，而荧光探 1 3 山东师范大学硕士论文 针由于具有高灵敏度、实时监测等优点也成为生物成像最主要的工具。 2 0 0 3 年，t e b u o n a g a n o 等人1 5 5 1 设计合成了荧光探针a p f 和h p f ( 图3 ) ，h p f 能 够专一性检测羟基自由基，而a p f 同时对次氯酸阴离子和羟基自由基产生荧光信 号响应，将二者联用可以用来选择性地检测次氯酸阴离子，并且通过细胞实验证 明a p f 和h p f 可以抵抗光诱导的自动氧化，检测刺激状态下嗜中性白细胞产生的 次氯酸阴离子。2 0 0 7 年，该课题组口”基于类似原理设计合成了荧光探针m i t o a r 和m i t o h rr 图4 ) ，两种荧光探针对生物体系内高活性氧自由基如o h ，o c i 具有 较好的选择性。 0 。取汐。牛0 u 拦0o，、 卣密。卣。( 一x = o 髂) 图3 探针a p f 和h p f 检测活性氧自由基的机理 h r , 9 s 弋一、。 。 o n o r e s c | e n t 图4 探针m i t o a r ，m i t o h r 结构及其对活性氧自由基的响应机理 2 0 0 3 年，e r i c aw e m e r l 5 7 1 根据h o m o v a n i l l i ca c i df h v a ) 在过氧化物酶催化下可 以特异性的被过氧化氢氧化成荧光二聚体，根据荧光变化可以灵敏地检测过氧化 氢。如图5 所示。 删 山东师范大学硕士论文 c o o h i c o o h c o o h i l m q c h 2 争一o h o h m h o m o v m i l f i c i d f l u o r e s c e n td i m e r ( n o nf l u o r e s ce n t ) 图5 h v a 与过氧化氢的反应机理 2 0 0 4 年，本课题组【5 踟基于超氧阴离子自由基的脱氢反应，设计合成了荧光探 $ - f p b t ( 图6 ) ，高选择性地检测超氧阴离子自由基。2 0 0 7 年，本课题组基于氧 化基理设计合成了一种新型的荧光探针d b z t c ( 图7 ) ，能够专一的、定量的检测 细胞内超氧阴离子的含量。该探针能对活细胞内微摩尔级的超氧阴离子浓度的变 化产生响应。 0 ：。 - _ = = _ 2 - ( 2 - p 蜘d i l ) - b e n z o t h i a z o l i n e 2 - ( 2 。p y r i 础) b e n z o t h i a z o l 图6 探针p b t 与超氧阴离子自由基的反应机理 d b z l d b z l | c 们酗e 图7 探针d b z t c 与超氧阴离子自由基的反应机理 2 0 0 4 年，n o b u a k is o h 等人【删基于荧光共振能量转移机理( f r e t ) 设计合成了 一种新型荧光探针( 图8 ) ，羟基自由基引起d n a 链的断裂，导致了f r e t 的“开 关”转换，引起荧光光谱的变化，从而实现了对羟基自由基的定量检测。 山东师范大学硕士论文 t a m r a 黧慧，7 q m t 。n o k l ，。，t - f 。一啊：一一 图8 探针检测羟基自由基的机理 2 0 0 4 年c h r i s t o p h e rjc h a n g 等1 6 1 1 将荧光素的3 、6 位的羟基用片呐酮硼取代。 合成了选择性测定细胞内过氧化氢的光学探针p e r o x f l u o r - i ( p f l ) ( 图9 ) 。将活h e k 细胞样品用p f l 孵育，外加过氧化氢可直接在荧光显微镜下观察到细胞的荧光成 像，证实了探针对过氧化氢的选择性识别。2 0 0 5 9 ，该课题组f 6 2 基于相同原理设 计合成了用于检测过氧化氢的p e r o x y r e s o r u f i n 1 ( p r i ) 和p e r o x y x a m h o n e - i ( p x l x 虱i o ) 。p r l ，p f i ，p x l 这三种荧光探针分别在红光绿光，蓝光波长范围 对过氧化氢产生荧光响应。通过激光共聚焦显微成像及双光子成像技术，将该系 列探针应用于活h e k 细胞及海马趾神经细胞样品中检测过氧化氢。2 0 0 6 年，该课 题, g t 6 3 l 以香豆索为供体，p f i 为受体，设计合成了基于f r 卫t 的比率荧光探针 k p f l ，随h 2 0 2 浓度不断增大，探针的荧光光谱发生变化。2 0 0 7 年，该课题组【叫 合成了单面用片呐酮硼取代的荧光探针p c r o x yg r e e nif p g i ) 和p e r